CAPITOLUL III

EXPLORAREA FUNCIEI DE DETOXIFIERE

A FICATULUI

III.1. Determinarea gruprilor sulfhidril libere plasmatice (GSH)

III.1.1. Determinarea grupelor SH totale (proteice i libere)
i a grupelor SH neproteice libere (GSH-ul), n sngele
integral (metoda J.SEDLAK)
III.1.1.A. Determinarea grupelor SH (proteice + libere) totale
III.1.1.B. Determinarea grupelor SH neproteice (libere): GSH
III.2. Dozarea produilor de descompunere a peroxizilor lipidici
(TBARS) cu acid tiobarbituric - Dozarea malon dialdehidei
(MDA)

77

CAPITOLUL III

EXPLORAREA FUNCIEI DE DETOXIFIERE A FICATULUI

Una din cele mai importante funcii ale ficatului este cea de detoxifiere.
Procesul continuu de sintez, testare i introducere n practica
medical a unor noi medicamente a avut ca rezultat creterea reaciilor
toxice de diferite tipuri. Numeroi ageni medicamentoi (de sintez sau de
origine vegetal) pot produce leziuni hepatice.
Orice compus (xenobiotic) propus spre a fi folosit n practica medicl
trebuie:

s nu fie toxic

s fie eliminat din plasm

s poat fi administrat i.v. sau per os

Pentru cele mai multe xenobiotice eliminarea din plasm decurge

logaritmic. Prin dozri seriate ale concentraiei n plasm se poate stabili
viteza de eliminare i respectiv clearence-ul.
Cl=0.693x Vd/t/2.
Unde: Vd-volumul de distribuie; t/2= timpul de njumatire
Dintre testele utilizate pentru investigarea funciei de detoxifiere testul
eliminrii acidului hipuric, dup ncorporarea unei soluii de benzoat de
sodiu administrat i.v. sau oral a fost cel mai des utilizat. n prezent s-a
abandonat folosirea acestui test.
Pentru explorarea epuraiei hepatice a unor substane din plasm
mult timp s-a utilizat testul cu BSP (bromsulfonftalein) n care se

78

urmrete viteza de eliminare a colorantului dup administrarea i.v, dar

datorit unor efecte secundare nedorite (periflebite, reacii anafilactice), dar
i a riscului ridicat acest test nu mai este folosit .

Exist i ali colorani utilizai pentru explorarea funciei de epuraie

hepatice atunci cnd este necesar stabilirea unui diagnostic diferenial n
cazul unei afeciuni cronice ce intereseaz parenchimul hepatic sau a unei
hepatotoxiciti produse de xenobiotice.
n funcie de colorantul folosit se stabilete cantitatea de colorant
administrat, volumul de prob recoltat i modul de citire.

Colorant
Rou Bengal
Azorubin S
Fuxin

Cantitate
administrat
1,5 mg/kg corp
4 ml sol.1 %,i.v.
20 ml sol. 5%, oral

Valori de referin
4mg/l dup 45 minute
10-12% eliminare n urin
10% eliminare urinar

Probele se recolteaz la 3 i respectiv 45 de minute de la administrare.

Se citesc la = 570 nm absorbanele la 3 i 45 de minute.
Calculul rezultatelor:
A1x100/A2=retenie%
Unde A1 - absorbie prob 1
A2 - absorbie prob 2
1.

Testul de excreie a

131

I-rou Bengal indic o obstrucie biliar

complet, dac <10 % din radioactivitatea total apare n scaun n

decurs de 48-72 ore, i o obstrucie incomplet dac valoarea
acestuia este >10%. Obstrucia complet se constat la toi sugarii
cu atrezie biliar i la 20% dintre cei cu colestaz

79

sever i

hepatit

neonatal.

Dac

fenobarbital excreia de

se

administreaz

colestiramin

131

I-rou bengal crete n caz de hepatit

neonatal , dar nu i n caz de atrezie a cilor biliare extrahepatice.

2. Testul excreiei colorantului Cardio-Green
n prezent cel mai utilizat test este cel care folosete colorantul
Cardio-Green. Acest test este lipsit de riscuri, dar prezint un pre
de cost ridicat.

Colorantul se livreaz n soluie organic concentrat, dilundu-se n

ser fiziologic, extemporaneu. Se administreaz la o concentraie de 5mg/ml
pentru o doz de 50 mg/kg corp sau 1 ml/10 kg greutate.

Mod de lucru:
1. Se recolteaz o prim prob de snge (proba preinjecie) sau prob
martor.
2. Se administreaz colorantul, dup care se recolteaz a doua prob
de snge din braul opus dup 20 de minute. Retenia colorantului
se citete direct n serul obinut din cele dou probe.
Citirile se efectueaz la 805 nm n cuve de 1ml.
Reactivi
Ser din prima recoltare
Colorant
Ser din a doua recoltare

Martor
1 ml
-

Standard 50%
1 ml
1ml
-

Standardul este echivalent cu 50% retenie.

Calculul rezultatelor:
Retenie %= Ap/As x 50
Unde Ap= absorbia probei

80

Proba
1 ml

As = absorbia standardului
Interpretarea rezultatelor:
Dup 20 de minute retenia este de un maxim 4%, echivalent cu o
vitez de absorbie a colorantului de 18-26%/minut. n afeciuni hepatice
ndeprtarea colorantului se face mai lent funcie de gradul de afectare al
ficatului. n ciroza hepatic avansat, viteza de dispariie a colorantului
scade sub 11%/minut. n hepatita alcoolic testul este anormal la 90%
dintre pacieni.
Se nregistreaz o excreie modificat

a colorantului n cazul

sindromului Dubin-Johnson (cretere tardiv 1,5 pn la 2 ore). De asemenea

excreia este afectat n cazul sindromului Rotor.
n afar de de testele ce se bazeaz pe eliminrile de colorani mai pot
fi utilizate:

Testul cu antipirin

Metoda de clearence hepatic bazat pe dozarea

14

CO2 n aerul

expirat.

Determinarea grupelor SH totale (proteice i libere) i a

grupelor SH neproteice libere (GSH-ul)

3. Testul cu antipirin:
Antipirina nu se fixeaz pe proteinele plasmatice i difuzeaz n toate
compartimentele organismului (plasm, lichid interstiial, ap celular).
Medicamentul este captat n ficat, metabolizat i eliminat sub form de
metabolii ce pot fi detectai n urin sub form conjugat.
4. Metoda de clearence hepatic bazat pe dozarea

14

CO2 n aerul

expirat.
Se utilizeaz substane marcate

14

C n catenele laterale metil sau etil a

unor compui (aminopirin, cafein, fenacetin). n urma metabolizrii se

81

elibereaz moleculele

14

CO2 care se elimin prin respiraie. Prin captarea

14

CO2 din aerul expirat i dozarea radioactivitii se poate aprecia capacitatea

ficatului de a metaboliza compusul medicamentos.

82

III.1. DETERMINAREA GRUPRILOR SULFHIDRIL

LIBERE PLASMATICE (GSH)

Numeroase lucrri din ultimii ani au demonstrat rolul cheie al

glutationului n procesul de detoxifiere. Tripeptidul glutation (GSH) sau
gama-glutamil-cisteinil-glicina, se gsete n eritrocite, ficat creier i alte
esuturi, n concentraii variabile. Este rapid metabolizat, T1/2 fiind de 2-4 ore.
Funcia fiziologic esenial a GSH-ului este faptul c intervine n
procesele de oxido-reducere celular, trecnd din forma redus n forma
oxidat, reacii catalizate de glutation-peroxidaz (GPx)-Se-dependent i
respectiv glutation-reductaza-FAD-dependent.
Cistein
Glicin NH CO CH

2X

CH2

NH

COOH

CO

CH2 SH

CH2
-glutamil

CH2

GPx(Se)
+

G-S-S-G

H 2O 2

+ 2 H 2O

GSH-reductaz (FAD)
NADP+
NADPH+ H+

CH NH2
COOH

=GSH

Este considerat ca un scavenger de radicali liberi i peroxizi lipidici,

ce pot rezulta n urma procesului de peroxidare lipidic a acizilor grai
polinesaturai din fosfolipidele membranare, peroxizi ce conduc la un
prejudiciu celular major.
GSH-ul mai ndeplinete i alte roluri:

83

pstreaz funcia normal a enzimelor cu grupe SH, a hormonilor

cu grupe S-S- (insulina, vasopresina, oxitocina);

-

pstreaz stabilitatea structurii teriare i cuaternare a proteinelor;

particip

sub

form

de

coenzim,

structura

enzimelor:

glioxalaza, formaldehid-DH etc.

particip n transportul transmembranar al aminoacizilor alturi

de
- GT

Acest tripeptid se gsete n echilibrul dinamic cu gruprile sulfhidril

(-SH) libere plasmatice, care cuprind albumina, cisteina, i alte proteine
coninnd aceast grupare. Aceast determinare corespunde cu cea a tiolilor
proteici.
Reactivi:
1. Tampon fosfat, pH 8,0: Se dizolv 0,68 g NaH 2PO4 . H2O n 50 ml
H2O, apoi se adaug 0,4675 g NaCl dizolvat n 50 ml NaOH 0,1 N.
2. Rectivul de culoare. Se dizolv la cald 40 mg acid bis 2-nitrobenzoic
(DTNB) n 100 ml tampon fosfat.
Mod de lucru:
Reactivi
Ser
Tampon fosfat
Reactiv 2

Prob (ml)
0,15
3,5
0,5

Martor (ml)
0,15
4
-

Se citete absorbia probei fa de martor la = 410 nm.

Calculul rezultatelor:
Ap/Am x 2,06= g/ml GSH
Se poate face i o curb de calibrare cu concentraii cunoscute de
GSH.

84

Interval de referin:
Aduli 370-450 g/ml GSH

85

III.1.1. DETERMINAREA GRUPELOR SH TOTALE (PROTEICE I

LIBERE) I A GRUPELOR SH NEPROTEICE LIBERE (GSH-ul), N
SNGELE INTEGRAL (metoda J.SEDLAK)

Principiul metodei:
Dozarea

spectrofotometric

se

bazeaz

pe

metoda

ELLMAN,

reactualizat de J.SEDLAK, dup care acidul 5,5DTNB (5-5-ditio-bisnitrobenzoic-acid) este redus de ctre grupele SH ale GSH-ului, la acid 2nitro-mercaptobenzoic, de culoare galben, colorimetrabil la 412 nm,
conform reaciei:

GSH + S

NO2

NO2

G-S-S

COOH

COOH

+
S

NO2

HS

COOH

NO2
COOH

5,5DTNB

Ac. 2-nitro-mercaptobenzoic
(galben)

Reactivi:
1. GSH (40 mg%), n tampon TRIS 0,2 M, pH=8,2;
2. Tampon TRIS (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) 0,2 M,
pH=8,2 i 0,4 M, pH=8,9
3. Soluie DTNB 0,01 M (99 mg n 25 ml metanol absolut);

86

4. Soluie acid tricloracetic (TClA) 10%;

5. Snge total recoltat pe heparin;
6. Metanol absolut.

III.1.1.A. Determinarea grupelor SH (proteice + libere) totale

n dou eprubete de centrifug se pipeteaz:
Reactivi
TRIS, pH=8,2
Metanol absolut
DTNB 0,01 M
Snge total, heparinizat

Prob (ml)
0,2
2,0
0,1
0,01

Martor (ml) (Blanc)

0,2
2,1
0,1
-

Eprubetele se agit intermitent timp de 30 minute la temperatura

camerei. Proba se centrifugheaz timp de 10 minute la 4000 rotaii/minut.
Supernatantul se fotocolorimetreaz la 412 nm, comparativ cu martorul.
Rezultatul se raporteaz fie la o curb etalon, construit cu diferite cantiti
de GSH (concentraii ntre 0-10 x 10 -5M grupe SH), fie la o anumit
concentraie de GSH ce se ncadreaz pe curb. Apoi se raporteaz la 1 ml
snge.
III.1.1.B. Determinarea grupelor SH neproteice (libere): GSH
Reactivi
Snge total, heparinizat
Ap distilat
Acid TClA 10%

Prob (ml)
0,1 (ser = 0,5 ml)
1
2

Martor (ml) (Blanc)

-

Proba se agit intermitent timp de 15 minute, apoi se centrifugheaz

la 4000 rotaii/minut timp de 15 minute. Supernatantul s-a utilizat mai
departe la reacia de culoare:
Reactivi
Supernatant
Ap bidistilat
TRIS 0,4 M, pH=8,9

Prob(ml)
1,0
4,0

87

Martor (ml)
1,0
4,0

DTNB

0,2

0,2

Dup 10-15 minute se citete extincia probei fa de martor la 412

nm. Grupele SH proteice se calculeaz scznd din valoarea grupelor SH
totale valoare grupelor SH libere, neproteice. Rezultatele se exprim n g ()
GSH/ml snge total i se raporteaz la aceiai curb etalon, construit cu
cantiti cunoscute de GSH i grupe SH.
Calcul
Grupe SH proteice = Grupe SH totale

- grupe SH neproteice

Raportare la curba etalon: Ext.P...... X g GSH

X g GSH (de pe curb)...................0,1 snge (sau ser)
Y g/ml GSH = X g / 0,1 ml snge
Raportare la un punct de pe curba etalon:
Ext. P
Ext.Et

x Conc. Et..................................... 0,1 ml snge

Y ..................................... 1,00 ml

W g GSH/ml snge = Y / 0,1

Valori de referin:
Ser: 50 200 g/ml (0,05-0,2 mg/ml GSH)
Snge total: 150 300 g/ml (0,15-0,3 mg/ml)
Calcularea factorului de pant Fp s-a efectuat conform datelor i
graficului de
Extmai jos, care a fost construit cu aceste date:
412 nm
Conc.GSH
g GSH () n
Fp
Ext. 412 nm
Ext.
amestecul de reacie
0,30
Fp 149,60 0,07
10
142,8
0,25
20
0,125
160,0
0,20
28
0,180
155,5
0,15
36
0,250
144,0
0,10
40
0,275
145,45
0,05Fp = 149,60
Media

..

5 10 15 20 25 30 35 40
1,075 x 10-6 -SH
2,15 x 10-6 -SH

88

GSH
n amestecul
de reacie

Grupe SH
g x 10-6
1,075 x 10-6
2,15
3,01
3,87
4,30

Observaii: Fiecare laborator i va calcula valoarea factorului de

pant (F p) nainte de nceperea dozrilor pentru glutation.
Interpretarea rezultatelor:
n intoxicia acu cu etanol se evideniaz o inhibare a sintezei de
glutation (GSH).
Intoxicaia cu tetraclorur de carbon (CCl 4) genereaz la nivel hepatic un
intens proces de lipoperoxidare determinnd scderea marcant a sintezei de
glutation hepatic (GSH).
Compuii de tip chinonic (menadiona, paraquatul, aloxanul etc.) prin
oxidare genereaz anioni superoxizi pentru metabolizarea crora, de ctre
GSH-Px (glutation peroxidaz), este nevoie de consumarea consecutiv a
GSH i a nucleotidelor piridinice (NADH2).
Acetaminofenul (paracetamolul) este oxidat la nivel hepatic ntr-un

89

metabolit toxic (N-acetil-benzochinonimin), care la doze reduse este

detoxifiat prin conjugarea cu GSH. n supradozaj, dac nivelul metabolitului
toxic depete posibilitatea ficatului de a forma conjugai glutationici,
datorit capacitii depite a ficatului de a sintetiza GSH, se produce
necroz hepatocitar sau chiar insuficien hepatic fatal.
Medicamente precum (benzodiazepinele, izoniazida, hidralazina, alfametil-dopa, nitrofurantoina, clorpromazina) sau xenobiotice (DDT, aflatoxine)
sunt considerate ageni depletivi ai GSH (scad nivelul de GSH).
n suprancrcarea hepatic cu cupru (boala Wilson) se constat niveluri
sczute ale GSH hepatic, datorit consumului antioxidanilor n cursul
epurrii excesului speciilor reactive de oxigen generate.

90

III.2. DOZAREA PRODUILOR DE DESCOMPUNERE A

PEROXIZILOR LIPIDICI (TBARS) CU ACID TIOBARBITURIC
DOZAREA MALON DIALDEHIDEI (MDA)

Principiul metodei:
Acidul tiobarbituric (TBA) reacioneaz la fierbere cu malon dialdehida
(MDA), compus rezultat din descompunerea peroxizilor lipidici, formnd un
aduct ce poate fi dozat spectrofotometric la 532 nm (Ohkawa i colab.,1979)
sau fluorimetric, cu excitaie la 515 nm i emisie la 553 nm (Kosugi i
colab., 1989).
Reactivi:
1. Soluie de acid tricloracetic 40% preparat n HCl 0,1 M (ATA)
2.

Soluie acid tiobarbituric 0,1 M preparat n Tris maleat 0,26 M,

pH= 7, se prepar extemporaneu

3. Ser, plasm sau omogenat

Modul de lucru:
1. La 1 ml prob (ser sau plasm) se adaug 187,5 l soluie ATA,
apoi 100 l soluie acid tiobarbituric.
2. Se incubeaz la 90 C pe baie de ap timp de 30 minute
3. Se adaug 312,5 l ap distilat
4. Se centrifugheaz la 4000xg timp de 10 minute. Se separ
supernatantul.
5. Se citesc extinciile probelor fa de un martor ce conine toi
reactivii de lucru cu excepia materialului biologic.
Calcularea rezultatelor:

91

Pentru calculare se ine cont de valoarea coeficientului de extincie

molar a aductului MDA- acid tiobarbituric a crui valoare este =1,56M-1cm-1.
Rezultatele se exprim n mol MDA/ ml ser.
Formula de calcul: Ep*14,24 mol/ml ser, unde Ep reprezint extincia
probei.

Valori de referin:
2-4 nmoli/ml
Interpretarea rezultatelor:
Nivelul MDA crete n:

cazul consumului de alcool fie pe perioade scurte de timp sau lungi.

Alcoolul sau metaboliii si deregleaz balana intrahepatic spre
autooxidare, acionnd mpreun ca prooxidani sau reducnd
nivelul antioxidant. Administrarea unor xenobiotice la consumatorii
cronici de alcool crete semnificativ gradul de peroxidare lipidic.
Lipoperoxidarea accentuat de alcool nu afecteaz numai ficatul ci
i mucoasa gastric, dar i alte esuturi ce metabolizeaz slab
etanolul (miocard, sistem nervos central, testicule).

hepatite ischemice

ischemia-reperfuzia din transplantul hepatic

suprancrcarea cu fier primar (hemocromatoza ereditar) sau

secundar (porfiria cutanat tardiv, talasemia major)

Datele actuale din literatura de specialitate arat c intensificarea

procesului de lipoperoxidare determin pe lng lezarea membranelor
celulare i subcelulare , i un posibil efect procarcinogen (efectul genotoxic
al compuilor aldehidici ai peroxidrii).

92