1.

MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DETERMINARE A ACTIVITĂŢII

ENZIMATICE
2. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII γ- GT
3. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII TRANSAMINAZELOR SERICE
4. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII COLINESTERAZEI SERICE NESPECIFICE

Obiective

1. Cunoaşterea modalităţilor de exprimare a activităţii enzimatice

2. Însuşirea principiilor de determinare a activităţii gama-GT, transaminazelor,
colinesterazei serice nespecifice
3. Cunoaşterea intervalului de referinţă pentru gama-GT, transaminaze,
colinesterazei serice nespecifice
4. Cunoaşterea valorii diagnostice pentru determinarea activităţii gama-GT,
transaminazelor, colinesterazei serice nespecifice

Rezumat

► Exprimarea activităţii enzimatice se poate face în mai multe moduri: unităţi

internaţionale (UI), activitate specifică, activitate moleculară şi katal.
► Determinarea activităţii γ - GT se bazează pe formarea p- nitroanilinei, compus
colorat în galben.
► Valoarea de referinţă pentru γ -GT la bărbaţi este 8-50U/ l, iar la femei 8-36U/ l.
► Activitatea γ -GT creşte în ser în colestază, la alcoolici şi după administrarea de
barbiturice.
► Transaminazele sunt enzime din clasa transferaze, subclasa aminotransferaze.
► Se cunosc două tipuri de transaminaze: ASAT= aspartat amino transferaza sau
GOT=glutamat oxaloacetat transaminaza; ALAT= alanin amino transferaza sau
GPT= glutamat piruvat transaminaza
► Determinarea activităţii celor două transaminaze se bazează pe formarea
piruvatului şi reacţia acestuia cu 2,4 dinitrofenilhidrazina.
► Valoarea de referinţă în ser pentru ASAT este până la 0-46 U/ L, iar pentru ALAT
este de 0- 50 U/ L.
► Valoarea de referinţă a celor două transaminaze în salivă variază în limite foarte
largi.
► Colinesterazele sunt enzime din clasa hidrolazelor, subclasa esteraze.
► Acetilcolinesteraza are rol major în transmiterea influxului nervos, iar
colinesteraza nespecifică este indicator al funcţiei proteosintetice a ficatului.
► Determinarea activităţii colinesterazei serice nespecifice se bazează pe hidroliza
butiriltiocolinei la tiocolină.
► Valoarea de referinţă în ser pentru colinesteraza nespecifică este de 4500- 10000
UI/L.

Introducere

Lucrările practice de enzimologie trebuie să înceapă cu aprofundarea

metodelor de determinare a activităţii enzimei respective şi stabilirea condiţiilor care
să asigure viteza maximă de reacţie. Spre deosebire de majoritatea analiţilor
biochimici, cantitatea de enzimă nu poate fi cuantificată în moli sau mg de enzimă,

1
fiind estimată indirect, în funcţie de activitatea ei sau de viteza reacţiei catalizată de
enzima respectivă.
Pentru determinarea activităţii enzimelor cel mai frecvent se utilizează
metodele colorimetrice şi spectrofotometrice de analiză.
Metodele colorimetrice se bazează pe măsurarea intensităţii culorii substanţei
care se formează prin interacţiunea substratului sau a produsului de reacţie cu un
reactiv specific care se adaugă în probă după stoparea reacţiei enzimatice.
Metodele spectrofotometrice de analiză se bazează pe absorbţia luminii (Legea
Lambert-Beer) în domenii determinate ale spectrului, de către substratele sau produşii
de reacţie (uneori chiar de cofactorii enzimatici). Spectrele acestor substanţe au
maximul de absorbţie la o lungime de undă determinată.
Pentru eliminarea factorilor de eroare, la determinarea activităţii unei enzime
este necesar să se efectueze, pe lângă proba cu enzimă activă şi un martor în care
enzima se inactivează în prealabil.
Deşi metodele de determinare a activităţii catalitice diferă de la o enzimă la
alta, există unele principii comune care se respectă în toate cazurile.
1. Pentru determinarea practică a activităţii unei enzime se va realiza
întotdeauna o probă de analizat şi un martor. În probă, enzima acţionează asupra
substratului transformându-l în produs de reacţie, iar în martor enzima nu acţionează
asupra substratului.
2. Întrucât viteza de reacţie se raportează întotdeauna la unitatea de timp este
necesar ca procesul catalitic să se desfăşoare într-un interval de timp bine determinat,
fiind necesară cronometrarea timpului de reacţie din momentul în care enzima intră
în contact cu substratul (perioada de incubaţie), iar oprirea reacţiei se face de regulă
prin modificarea bruscă a pH-ului mediului de incubare.
3. În unele metode de analiză, reactivul de culoare folosit pentru dozarea
produsului de reacţie sau a substratului rămas netransformat poate fi şi un factor care
blochează procesul catalitic (de exemplu, soluţia de dinitrofenilhidrazină utilizată ca
reactiv de culoare în determinarea activităţii aminotransferazelor).
4. Este necesară respectarea următoarelor condiţii care să se apropie cât mai
mult de condiţiile naturale în care enzima respectivă acţionează in vivo: menţinerea
constantă a temperaturii şi a pH-ului mediului de reacţie; substratul să fie în
concentraţie optimă, pentru ca viteza de reacţie să nu depindă de concentraţie de
substrat; produsul de reacţie să fie colorat pentru a putea fi dozat spectrofotometric.

MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ȘI DETERMINARE

A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Exprimarea activităţii enzimatice, indiferent de metoda folosită la

determinarea acesteia, se poate face în mai multe moduri:
► Unitatea internaţională (UI) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează
transformarea unui micromol de substrat în condiţii standard (de temperatură, pH,
forţă ionică) într-un minut:

1UI= μmol substrat (S)/ min

2
► Activitatea specifică se obţine prin raportarea UI la mg proteină. Este utilizată
pentru evaluarea gradului de puritate al unei enzime, crescând în timpul purificării şi
devenind maximă şi constantă atunci când enzima este în stare pură:

1UI/mg enzimă (E)= μmol substrat (S)/ min/mgE

►Activitatea moleculară sau molară (număr de turnover (TN) reprezintă numărul

de molecule de substrat transformate de enzimă într-un minut de către o singură
moleculă de enzimă, când acesta reprezintă factorul limitant al vitezei. Este folosită
pentru a compara activităţile diferitelor enzime. Activitatea moleculară a unei enzime
cu un singur centru activ poate fi calculată din valoarea vitezei maxime (Vmax) şi din
masa moleculară.

►Katalul, o nouă unitate de activitate enzimatică recomandată de Comisia de

Enzimologie, este definită ca fiind acea cantitate de enzimă care transformă un mol de
substrat într-o secundă în condiţii standard de reacţie. În funcţie de viteza de reacţie,
pentru exprimarea activităţii enzimatice, se pot folosi şi submultiplii, de exemplu
micro-, nano-, picoKatal (μmol/s, nmol/s, pmol/s).

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII
GAMAGLUTAMILTRANSFERAZEI (Γ- GT)

Introducere

Gamaglutamiltransferaza este o glicoproteină prezentă în principal în

membranele celulelor implicate în absorţie şi secreţie. Rinichiul şi pancreasul au cea
mai bogată activitate a γ- GT, dar datorită greutăţii ficatului, considerăm că ficatul, în
special la nivelul canaliculelor biliare, conţine cea mai mare cantitate de enzimă.

1. Principiu

γ -glutamiltransferaza (γ- GT) catalizează transferul grupărilor glutamil de pe

un donor de tip glutamil (γ-glutamil-p-nitroanilida) pe un acceptor de tip peptidă sau
aminoacid (glicil- glicina). În urma reacţiei se formează p- nitroanilina, colorată în
galben cu maxim de absorbţie la 405nm (εmM=9.9).

3
2. Reactivi şi aparatură

1. Substrat în Tris- HCl

2. Acid acetic 1N
3. Ser
4. Eprubete
5. Pipete de 1, 2,10ml, pipetă semiautomată 20 µl, 1000µl
6. Spectrofotometru

3. Tehnica de lucru

Reactivii se pipetează în eprubete conform tabelului de mai jos:

Tabel 5

Reactivi (ml) Probă Martor

Substrat în Tris-HCl 0,3 0,3
Ser 0,02 -
se agită; se incubează 20 minute la 25ºC
Acid acetic 1N 1,5 1,5
Apă distilată - 0,02
se agită; se incubează 30 minute la temperatura camerei
se citeşte extincţia probei faţă de martor la 405nm

4. Calcul

1UI γ-GT este cantitatea de enzimă care catalizează transferul unui μmol acid
glutamic de pe donor pe acceptor la temperatura de 25ºC în timp de 1 minut;
activitatea enzimatică se exprimă în U/l.

Activitatea γ GT (U/l)= 460 · E405nm

5. Interval de referinţă:

γ -GT (bărbaţi): 8-50U/L

γ -GT (femei): 8-36U/L

4
6. Valoare diagnostică

Activitatea γ -GT, enzimă hepatocitară, creşte în colestază (obstructivă sau

non-obstructivă cauzată de afectarea polului biliar hepatocitar) şi moderat în citoliză
(determină creşterea permeabilităţii membranare sau chiar distrucţia membranară).
Creşterea activităţii γ -GT în colestază (când valorile ei depăşesc de 10-50 de
ori valorile de referinţă), reprezintă cel mai sensibil test în colestază. Activitatea γ -
GT creşte sub influenţa unor substanţe medicamentoase (fenobarbital, clorpromazină)
sau a alcoolului, precum şi în hipertiroidism. Este un marker al alcoolismului cronic
care se normalizează in 4-8 săptămâni de la întreruperea consumului de alcool.
Creşterea sincronă a fosfatazei alcaline şi a γ -GT este specifică sindromului
de colestază. Creşterea izolată a activității fosfatazelor alacaline are loc într-o
patologie osoasă (izoenzima osoasă), iar ridicarea izolată a nivelului seric al activității
γ-GT este prezentă în cazul inducţiei enzimatice alcoolice sau medicamentoase.
Scorul fibrotestului, un test care indică fibroza hepatică, calculat pe baza
rezultatelor a 6 parametri din sânge include şi valoarea activităţii γ -GT -ului seric.

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII TRANSAMINAZELOR SERICE

ASPARTAT-AMINO-TRANSFERAZA (ASAT)
ALANIN-AMINO-TRANSFERAZA (ALAT)

Introducere

Transaminazele sunt enzime din clasa transferaze, subclasa aminotransferaze.

Transaminazele participă la metabolismul aminoacizilor fiind două enzime
hepatocitare markeri ai citolizei.

ASAT = aspartat amino transferaza sau GOT = glutamat oxaloacetat

transaminaza
ALAT = alanin amino transferaza sau GPT = glutamat piruvat transaminaza

5
 Ambele transaminaze catalizează transferul unei grupări amino de la un
aminoacid la un α-cetoacid, în prezenţa piridoxal-fosfatului (vitamina B6), cu
formarea cetoacidului corespunzător aminoacidului iniţial şi a aminoacidului
corespunzător cetoacidului iniţial.

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ASAT

1. Principiu

ASAT sau GOT catalizează transferul grupării amino de la acidul L- aspartic

(Asp) la acidul alfa cetoglutaric (α - Kg), cu formare de acid L- glutamic (Glu) şi acid
oxalilacetic (OAA). Oxalacetatul trece spontan în piruvat, care prin reacţia cu 2,4-
dinitrofenil hidrazina formează 2,4- dinitrofenil hidrazona colorată, cu maxim la
546nm.

2. Reactivi şi aparatură

1. Soluţie tampon-substrat: tampon fosfat 100mM, pH 7,4; acid aspartic 100mM;

acid alfa-cetoglutaric 2mM
2. Reactiv de culoare: 2,4- dinitrofenilhidrazina 1mM
3. Soluţie NaOH 0,4N
4. Ser
5. Eprubete
6. Pipete de 1, 2,10ml, pipetă semiautomată 1000µl
7. Spectrofotometru

3. Tehnica de lucru

Reactivii se pipetează în eprubete conform tabelului de mai jos:

6
Tabel 6

Reactivi (ml) Probă Martor

Soluţie tampon- substrat 0,5 0,5
Ser 0,1 -
Apă distilată - 0,1
se agită; se incubează 30 minute la 37C
Reactiv de culoare 0,5 0,5
se agită; se incubează la 20 minute temperatura camerei
NaOH 0,4N 5 5
se agită; se incubează la 5 minute temperatura camerei
se citeşte extincţia probei faţă de martor la 546 nm

4. Calcul

Corespondenţa între valoarea extincţiei citită la 546nm şi activitatea

enzimatică (mU) este redată în tabelul de mai jos:

Tabel 7

E546nm mU/ml E546nm mU/ml

0,02 4 0,16 34
0,04 8 0,18 40
0,06 11 0,2 48
0,08 16 0,22 57
0,1 19 0,24 67
0,12 24 0,26 80
0,14 28

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ALAT

1. Principiu

ALAT sau GOT catalizează transferul grupării amino de la alanină (Ala) la

acidul alfa cetoglutaric (- Kg), cu formare de acid L- glutamic (Glu) şi acid piruvic.
Acesta reacţionează cu 2,4- dinitrofenil hidrazina şi formează 2,4- dinitrofenil
hidrazona colorată cu maxim de absorbţie la 546nm.

7
2. Reactivi şi aparatură

1. Soluţie tampon- substrat: tampon fosfat 100mM, pH 7,4; D-L alanină 200mM;
acid alfa-oxoglutaric 2mM
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazina 1mM
3. Soluţie NaOH 0,4N
4. Ser
5. Eprubete
6. Pipete de 1, 2,10ml, pipetă semiautomată 1000µl
7. Spectrofotometru

3. Tehnica de lucru

Reactivii se pipetează în eprubete conform tabelului de mai jos:

Tabel 8

Reactivi (ml) Probă Martor

Soluţie tampon substrat 0,5 0,5
Ser 0,1 -
Apă distilată - 0,1
se agită; se incubează 30 minute la 37C
Reactiv de culoare 0,5 0,5
se agită; se incubează la 20 minute temperatura camerei
NaOH 0,4N 5 5
se agită; se incubează la 5 minute temperatura camerei
se citeşte extincţia probei faţă de martor la 546nm

4. Calcul

Corespondenţa între valoarea extrincţiei citite la 546nm şi activitatea

enzimatică (mU) este redată în tabelul de mai jos:

Tabel 9
E546nm mU/ml E546nm mU/ml
0,025 2 0,2 29
0,05 5 0,225 34
0,075 9 0,25 39
0,1 12 0,275 45
0,125 16 0,3 52
0,150 20 0,325 59
0,175 24 0,35 68
0,375 77

5. Interval de referinţă

GOT / ASAT (ser): până la 46 mU/ml

GPT /ALAT (ser): până la 50 mU/ml
Valorile GOT şi GPT salivare variază în limite foarte largi.

8
6. Valoare diagnostică

Gradul creşterii activităţii transaminazelor depinde de: numărul de celule

afectate, severitatea leziunilor celulare, irigarea zonei respective, prezenţa unei bariere
inflamatorii, timpul de înjumătăţire (17 ore pentru ASAT şi 45 ore pentru ALAT).
ASAT este prezentă în toate ţesuturile, în special în muşchiul cardiac,
scheletic, ficat şi rinichi. Din acest motiv, nivelul ridicat de ASAT în ser este un
marker al infarctului miocardic şi renal, al afecţiunilor hepatice şi ale muşchilor
scheletici.
ASAT şi ALAT cresc mai mult de 10 ori intervalul de referinţă în: hepatite
virale A, C, E acute, hepatită alcoolică, medicamente (paracetamol, carbamazepină),
droguri, ciuperci, cocaină.
Creşteri moderate ale ASAT şi ALAT apar în: hepatite cronice B, C, D,
steatoză hepatică, boală celiacă, boala Wilson, hemocromatoză, sindrom metabolic.
În boală parondontală, activitatea transaminazelor creşte în salivă şi lichidul
gingival, ca urmare a distrugerii ţesutului parodontal. Activitatea transaminazelor
creşte de asemenea în carii şi gingivite ca urmare a modificărilor metabolice din
gingiile inflamate. Nivelul seric normal al transaminazelor, pledează pentru faptul că
creşterea transaminazelor salivare are ca origine distrucţiile gingivale.

Valoarea diagnostică a raportului ASAT/ ALAT

La subiecţii normali, raportul GOT/ GPT (coeficientul de Rittis) este 1,33.

În citoliza hepatocitară predomină creşterea activităţii ALAT.
Există două excepţii în care raportul ASAT/ALAT > 1: hepatita alcoolică şi
ciroză hepatică. Acesta scade în leziunile inflamatorii ale ficatului, datorită creşterii
accentuate a GPT. Leziunile necrotice duc la creşterea GOT şi implicit la creşterea
raportului GOT/GPT. Hemoliza determină creşterea GOT-ului.

Scorul FibroTest pentru fibroza hepatică include ALAT, folosit şi în evaluarea

numită ActiTest importantă în diagnosticul leziunilor necrotico-inflamatorii din
hepatită.

9
 DETERMINAREA ACTIVITĂŢII COLINESTERAZEI
SERICE NESPECIFICE

Introducere

Colinesterazele sunt enzime din clasa hidrolaze, subclasa esteraze. Rolul lor
este variabil în funcţie de localizare:
Acetilcolinesteraza din terminaţiile nervoase colinergice cu specificitate
absolută pentru acetilcolină are rol major în transmiterea influxului nervos.
Pseudocolinesteraza sau colinesteraza nespecifică, cu specificitate relativă,
este un indicator al funcţiei proteosintetice a ficatului şi al intoxicaţiei cu
organofosforice.

1. Principiu

Pseudocolinesteraza eliberează acid butiric prin hidroliza butiriltiocolinei

(substrat sintetic) la tiocolină. Tiocolina reacţionează cu DTNB- ul (acidul 5,5’-
ditiobis- nitrobenzoic) şi formează un compus colorat în galben cu maxim de
absorbţie la 412nm.

2. Reactivi şi aparatură

1. Tampon fosfat pH 7.08

2. Butiriltiocolina 1mM
3. DTNB- reactiv de culoare
4. Ser dil 1/10
5. Eprubete
6. Pipete de 1, 2ml, pipetă semiautomată 1000µl

10
7. Spectrofotometru

3. Tehnica de lucru

Reactivii se pipetează în eprubete conform tabelului de mai jos:

Tabel 10

Reactivi (ml) Probă Martor

Tampon fosfat cu substrat 0.2 0.2
Ser 1/10 0.2 -
se agită; se incubează 10 minute la temperatura camerei
DTNB 2.0 2.0
Apă distilată - 0.2
Se citeşte extincţia probelor faţă de martor la 405nm.

4. Calcul

Activitatea enzimei (U/L)= Ep x 8800

5. Interval de referinţă

Colinesteraza nespecifică: 4500- 10000 U/L

5. Valoare diagnostică

Scăderi marcate ale activităţii colinesterazei serice nespecifice apar în:

insuficienţa hepatică, ciroza hepatică, intoxicaţia cu organo-fosforice.
Scăderi moderate ale activităţii colinesterazei serice nespecifice apar în:
denutriţie proteică, ficat de stază din insuficienţa cardiacă.
Creşteri ale activității colinesterazei serice nespecifice apar în sindromul
nefrotic, hipertiroidism, hiperlipoproteinemii.

11