Pentru intrebari legate de tematica abordata in cadrul lucrarii practice va adresati

cadrelor didactice de predare la lucrari, la urmatoarele adrese de mail:

1) SL Dr. Grecu Daniela – mail: grecu.daniela@umft.ro

2) As. Univ. Dr. Bujor Cristiana – mail: bujor.cristiana@umft.ro
3) As. Univ. Chis Aimee – mail: chis.aimee@umft.ro
4) As. Univ. Moatar Alexandra – mail: moatar.alexandra@umft.ro

LUCRARE PRACTICA NR. 8

DETERMINAREA ENZIMELOR IN LICHIDE BIOLOGICE

Enzimele sunt proteine care catalizează majoritatea reacţiilor biochimice din organism.
Deși majoritatea enzimelor sunt localizate și acţionează intracelular, totuși ajung în circulaţie
în cantităţi mici, ca urmare a turnoverului celular normal (reînnoire fiziologică a unor
țesuturi). Accelerarea turnoverului celular (procese de creştere, neoplazie), creşterea sintezei
intracelulare de enzime (inducţie enzimatică) sau leziunile celulare, determină creşterea
activităţii plasmatice a acestor enzime.
Pentru determinarea activității enzimelor în sânge, se recoltează sânge venos, de
obicei, în recipient fără anticoagulant (cu sau fără accelerator al coagulării). La recoltarea
sângelui venos se poate utiliza și recipientul cu dop verde (conține heparină ca anticoagulant).
Transportul probelor de sânge către laborator trebuie realizat cât mai repede de la recoltare
(aproximativ 4 ore de la recoltare) deoarece, în unele cazuri, activitatea enzimatică scade
odată cu trecerea timpului (exemplu, transaminazele). În laborator, eșantionul de sânge se
prelucrează prin centrifugare, obținându-se ser/plasmă. Determinarea propriu-zisă se
realizează din serul/plasma astfel separate. După centrifugare, probele de sânge sunt
inspectate vizual pentru a se observa prezența hemolizei. Sunt refuzate de la testare probele de
sânge hemolizate deoarece hemoliza produce rezultate fals crescute în cazul unor determinări
(ex. transaminaze, LDH). Sunt și enzime a căror activitate se poate determina în urină. Un
exemplu în acest sens îl constituie amilaza.

1. Determinarea activităţii enzimelor în sânge. Testul optic

1
 În prezent, cele mai utilizate metode de determinare a activităţii enzimelor sunt
metodele cinetice. În metodele cinetice mersul reacţiei se urmăreşte continuu, cu ajutorul
spectrofotometrului. În plus, determinările cinetice sunt mai simple şi mai rapide.

Din categoria metodelor cinetice, face parte testul optic, introdus de Warburg şi
Christian în anul 1936. Prin test optic se înţelege determinarea în ultraviolet a activităţii
enzimelor care au drept cofactor enzimatic NAD+ sau NADP+. Aceste enzime sunt implicate
în transferul de hidrogen În principiu se măsoară direct oxidarea NAD(P)H sau reducerea
NAD(P)+:

XH 2 + NAD+ X + NADH + H +

Acest lucru este posibil deoarece în spectrul de absorbţie al celor două forme, redusă şi
oxidată, există o diferenţă: NADH absoarbe puternic în domeniul 300–370 nm pe când NAD+
absoarbe foarte puţin. De obicei se lucrează la 340 nm.

2,0 ( ____ )NAD+

cm = 17800
la 260 nm E11M

cm = 0
la 340 nm E11M
Absorbţia

1,0
( - - - )NADH

220 260 300 340 380 420

l (nm)

Spectrul de absorbţie al NAD+ şi NADH

Determinarea presupune realizarea unui amestec de reacție între serul de testat (unde
este prezentă enzima) și reactivi specifici (conțin substratul asupra căruia acționează enzima,

2
alte enzime, daca este cazul și soluții tampon ce asigură pH-ul optim pentru reacție).
Spectrofotometric, se urmăreşte, o anumită perioadă de timp, modificarea absorbţiei de
radiație la 340 nm. Dacă în reacție se consumă forma redusă NADH/NADPH, se va observa o
scădere a absorbției de radiație la 340 nm iar dacă din reacție rezultă forma redusă
NADH/NADPH, se va observa o creștere a absorbției de radiație la 340 nm. Variația
absorbției de radiație pe minut (DE/min) este direct proporţională cu activitatea enzimei
determinate.

Se pot utiliza trei variante ale testului optic, prin aceasta existând posibilitatea
determinării aproape a tuturor enzimelor cu semnificaţie în laboratorul clinic.

Variantele tehnice ale testului optic

a. Testul optic simplu

Este aplicabil în situația în care, enzima pe care o determinăm este NAD+ sau
NADP+ dependentă. O astfel de enzimă este lactat dehidrogenaza (LDH). Ea catalizează
reacţia:

pH=7.5
piruvat + NADH + H+ lactat +NAD+
pH=9.0

În funcție de pH-ul la care se lucrează se va observa, la 340 nm, fie scăderea

absorbției de radiație (pH = 7,5), fie creșterea absorbției de radiație (pH=9,0). Variația
absorbției de radiație pe minut va fi direct proportională cu activitatea LDH în probă.

b. Testul optic cuplat cu o reacţie indicatoare

Este aplicabil enzimelor care nu implică direct coenzima NAD/NADP. Enzima de

determinat catalizează formarea unui produs, iar acesta urmează să fie determinat prin
intermediul unei alte enzime NAD+-dependente. Această variantă a testului optic se aplică la
determinarea transaminazelor (ALAT, ASAT).

Determinarea alanin aminotransferazei ALAT (GPT)

Determinarea constă în două etape:

- etapa I: ALAT, catalizează reacţia:

alanina + acid alfa-cetoglutaric ↔ acid piruvic + acid glutamic

3
 Acidul piruvic rezultat sub acțiunea directă a ALAT intră într-o a doua reacţie,
catalizată de LDH, enzimă NAD+-dependentă.

- etapa a II-a: reacţia indicatoare (catalizată de LDH, enzimă NAD+-dependentă):

acid piruvic + NADH+H+ ↔ acid lactic + NAD+

Amestecul de reacție include soluție tampon, a-cetoglutarat, LDH, alanină, NADH şi

ser (conține ALAT).

Se măsoară variaţia absorbţiei pe minut care va fi direct proporţională cu activitatea

ALAT.

Determinarea aspartat aminotransferazei ASAT (GOT)

- etapa I: enzima de determinat ASAT catalizează reacţia:

acid aspartic + acid alfa-cetoglutaric ↔ acid oxalacetic + acid glutamic

- etapa a II-a: reacţia indicatoare este catalizată de malat dehidrogenază, enzimă NAD+-
dependentă:

acid oxalacetic + + NADH+H+ ↔ acid malic + NAD+

Se măsoară variaţia absorbţiei pe minut care va fi direct proporţională cu activitatea ASAT.

c. Testul optic cuplat cu o reacţie auxiliară şi o reacţie indicatoare

În cazul în care produsul final al reacţiei enzimatice nu poate fi măsurat direct printr-o
reacţie indicatoare, este necesar să se intercaleze o reacţie auxiliară, catalizată de un alt sistem
enzimatic. Varianta se aplică la determinarea creatin kinazei în ser.

Determinarea creatin kinazei (CK)

- etapa I: enzima de determinat, creatinkinaza, catalizează reacția:

creatină + ATP creatin-P + ADP

- etapa a II-a: ADP format în prima etapă, intră în cea ce-a doua reacție, cea auxiliară,
catalizată de enzima piruvatkinază:

4
 fosfoenolpiruvat + ADP piruvat + ATP

- etapa a III-a: piruvatul format în cea de-a doua etapă, intră în cea de-a treia reacție, cea
indicatoare, catalizată de LDH, enzimă NAD+- dependentă:

piruvat + NADH + H + lactat + NAD+

Se măsoară variaţia absorbţiei pe minut care va fi direct proporţională cu activitatea

CK.

2. Calculul activităţii enzimatice

În metodele cinetice, se stabileşte absorbţia de radiatie la diferite intervale de timp şi

se calculează variaţia ei pe minut. Apoi, folosind un factor calculat în funcție de volumul de
ser folosit, de volumul final de reacție și de un coeficient de absorbție propriu substratului, se
obține activitatea enzimei. Factorul este calculat de producătorul reactivilor și se regăsește în
prospectul care însotește kitul de reactivi.

3. Unităţi enzimatice
Rezultatele activității enzimelor se exprimă în unităţi internaţionale (UI), unde o UI
se defineşte ca fiind cantitatea de enzimă ce transformă 1 μmol de substrat/minut în condiţii
optime. În determinările din produse biologice activitatea enzimatică se raportează la 1 litru
(UI/L). Deoarece condiţiile de reacţie nu sunt întotdeauna standardizate, valorile normale
utilizate în practica medicală diferă.

4. Enzime de importanţă clinică

Fosfataza alcalină (ALP)

Catalizează eliberarea fosfatului de pe o serie de substraturi şi are activitate maximă la
pH alcalin. Activitatea cea mai mare se înregistrează în oase, ficat, placentă şi intestin. La
adult, aproximativ jumătate din activitatea serică a ALP este de provenienţă hepatică şi
cealaltă jumătate de provenienţă osoasă. Doar o mică parte are origine intestinală.
Valori crescute ale activităţii ALP se întâlnesc:
· pe durata sarcinii, datorita izoenzimei placentare
· la copii în perioadele de creștere, datorită creşterii activităţii osteoblastice.

5
 · tranzitoriu, postprandial, datorită izoenzimei intestinale ( recoltarea probelor de sânge
pentru determinarea activităţii ALP se face dimineaţa, pe nemâncate).
· în afecţiuni hepato – biliare si ale parenchimului hepatic
· în afecţiuni osoase, în procesul de vindecare după fracturi

Transaminazele (ALAT/GPT; ASAT/GOT)

ALAT se găseşte în concentraţia cea mai mare în ficat, existând în concentraţii mai
reduse şi în muşchii scheletici, miocard şi rinichi. ASAT se găseşte în concentraţii
descrescătoare în: miocard, ficat, muşchi scheletici, rinichi şi hematii.
Creşteri ale transaminazelor apar in:
· bolile hepatice care decurg cu leziuni ale hepatocitelor (sindromul de citoliză
hepatică); de exemplu, în hepatita virală acută activitatea transaminazelor este, de
regulă, de 10-20 de ori mai mare decat limita superioara a normalului (LSN) iar
ALAT>ASAT; creşterile pot atinge si de 100 x LSN; creşteri moderate apar după
consumul de alcool (mai ales ASAT) şi după administrarea unor de medicamente
(opiacee, neuroleptice, paracetamol, etc).
· infarctul miocardic acut: doar activitatea ASAT creste
· afecţiuni musculare, în traumatisme severe (strivire)

Gamaglutamil transferaza (GGT, γ-GT)

Această enzimă catalizează transferul grupării γ-glutamil de pe un peptid pe un alt
peptid sau pe un aminoacid. Cantităţi importante se găsesc în ficat şi pancreas iar activitatea
serică este determinată în primul rând de GGT din ficat, fiind crescută în afecţiunile hepatice,
în special cele însoțite de obstrucţia căilor biliare.
Alcoolul şi unele medicamente determină creşterea activităţii serice a GGT prin
creşterea sintezei hepatice a enzimei (inducţie enzimatică). Majoritatea alcoolicilor prezintă
valori crescute ale activităţii serice a GGT dar acestea se normalizează la 2-3 săptămâni după
încetarea consumului.

Creatin kinaza (CK)

Această enzimă catalizează fosforilarea reversibilă a creatinei, cu formarea unui
compus macroergic, creatin-fosfatul. Concentraţii mari ale CK se găsesc în muşchii scheletici,
miocard şi creier. Enzima are trei izoenzime: CK-BB, CK-MB şi CK-MM.

6
 CK-BB se găseşte în special în creier, CK MM se găseşte în muşchii scheletici şi
miocard iar CK-MB se găseşte în proporţie mai mare în miocard (25 - 46%) şi mult mai puţin
în muşchii scheletici (< 5%). În mod normal izoenzima CK-BB nu traversează bariera
hemato-encefalică, nefiind prezentă în ser la subiecţii normali.
La persoanele sănătoase, 96-100% din activitatea CK total în ser este dată de CK-MM
şi depinde în primul rând de masa musculară a persoanei.
Determinarea activităţii serice a CK este utilizată în primul rând în diagnosticul
infarctului miocardic acut şi a unor afecţiuni musculare, determinarea izoenzimelor (mai ales
CK-MB) servind diagnosticului diferenţial. În IMA, cresterea CK totală este însoțită de CK-
MB.

Amilaza
Amilaza catalizează hidroliza amidonului. Este o enzimă cu masă moleculară relativ
mică care provine în special din pancreas şi glandele salivare. Datorită mărimii relativ mici a
moleculelor, amilaza este filtrată glomerular şi apare în urină.
Determinarea activităţii amilazei serice este utilizată mai ales în diagnosticul
pancreatitei acute. Cu cât valorile sunt mai ridicate, cu atât probabilitatea diagnosticului de
pancreatită acută este mai mare (la valori de peste 10x LSN). De menţionat că amilaza serică
poate fi normală în aproape 20% din cazurile de pancreatită acută.

Lipaza
Catalizează hidroliza triacilglicerolilor şi este prezentă în concentraţii mari în
pancreas. Deoarece 20% din pacienţii cu pancreatită acută pot avea amilază serică normală,
determinarea activităţii lipazei serice tinde să înlocuiască determinarea amilazei. În plus,
lipaza serică este normală în afecţiunile glandelor salivare.

Colinesteraza
Sub această denumire sunt grupate enzime ce catalizează hidroliza esterilor colinei cu
diverşi acizi organici.
Activitatea colinesterazei este scăzută mai ales în intoxicaţiile cu organofosforice, dar
și în bolile hepatice însoțite de afectarea funcției de sinteză.

Lactat dehidrogenaza ( LDH)

7
 LDH catalizează transformarea reversibilă a L-lactatului în piruvat. LDH este foarte
răspândită, fiind prezentă în aproape toate ţesuturile, dar mai ales în ficat, miocard, rinichi,
muşchi scheletici, eritrocite, plămâni, etc. Se cunosc 5 izoenzime, cu distribuție diferită în
țesuturi. Activitatea serică a LDH (LDH totală) are specificitate redusă şi este crescută într-o
serie de afecţiuni: infarctul miocardic acut, afecţiuni hepatice, anemii hemolitice, afecţiuni
musculare.