Dozarea activităţii lactat dehidrogenazei serice

Pentru determinarea activităţii LDH se măsoară scăderea absorbanţei NADH, la 365 nm,
pe unitatea de timp (minute).
Conform indicaţiilor comisiei de nomenclatură I.U.B. (“International Union of
Biochemistry”), activitatea unei enzime se poate exprima fie în unităţi internaţionale enzimatice
(UI), fie în unităţi catalitice noi.
a) O unitate internaţională de activitate enzimatică reprezintă cantitatea de enzimă care
catalizează transformarea unui micromol (1 µmol) de substrat în timp de un minut, în condiţii
optime de pH şi de concentraţie de substrat, la temperatura de 25°C.
b) O unitate catalitică (1 “Katal”, 1 Kat) este cantitatea de enzimă care catalizează
transformarea unui mol de substrat în interval de o secundă, în condiţii optime de pH şi de
substrat şi la temperatura de 25°C.
1 UI (1 µmol/min) = 1/60 µKat (= 16,67 nKat)
1 Kat = 6 x 107 UI
În practică se utilizează frecvent submultipli acestor unităţi: miliunităţi (1 mU, 1 mKat),
microunităţi (1 µU, 1 µKat), sau nanoutităţi (1 nU, 1 nKat).
Alţi parametri utilizaţi pentru caracterizarea enzimelor sunt: activitatea specifică şi
activitatea moleculară.
Activitatea specifică reprezintă numărul de unităţi de activitate enzimatică per miligram de
proteină şi este o expresie a gradului de puritate a unei enzime. Conform noilor unităţi de
măsură, activitatea specifică reprezintă viteza de transformare a unui mol de substrat într-o
secundă per kg proteină (Kat/Kg proteină).
Activitatea moleculară (sau “raportul de trasnformare”) este dată de numărul de molecule
de substrat transformate în timp de un minut de către o singură moleculă de enzimă.
Cea mai frecvent folosită formă de exprimare a activităţii enzimatice, fie în activitatea de
cercetare, fie în laboratorul clinc medical, este aceea de unităţi per miligram proteină (U/mg) şi
respectiv unităţi per mililitru (U/ml) – utilizată în cazul enzimelor din fluidele biologice (cazul
LDH serică).

Aparatură necesară:
- spectrofotometru UV-VIS

Reactivi necesari:

Soluţii stoc: - tampon fosfat disodic, pH=7.5, 100 mM;

- NADH+H+, 10 mM;
- piruvat, 10 mM;
- ser sangvin proaspăt.

Tehnica de lucru:
- se etalonează transmisia 0 şi 100% faţă de apă distilată (in cazul spectrofotomerului Jasco
se da comanda AUTOZERO);
 - se alege lungimea de undă de 365 nm;
- se prepară soluţiile de lucru pentru determinarea activităţii enzimatice a LDH serice prin
diluarea concentraţiilor stoc.

Soluţiile de lucru au următoarele concentraţii finale în cuva de reacţie:

- tampon fosfat disodic, pH=7.5, 50 mM;
- NADH+H+, 0.1 mM;
- piruvat, 1 mM

- se calculează volumul fiecărui reactant, astfel încât volumul total de reacţie să fie de 2000
μl.
- se introduc în cuvă volumele corespunzătoare din fiecare reactant cu excepţia piruvatului;
- se adaugă 50 μl de ser sangvin proaspăt;

Notă: Deoarece serul sangvin conţine şi alte dehidrogenaze NAD- dependente, linia de bază
prezintă o pantă care reflectă consumul de NADH datorită activităţii acestor enzime. Se
înregistrează astfel o variaţie iniţială de absorbanta în interval de 1 minut.

- se notează valoarea absorbantei iniţiale cu A 1 şi valorea de absorbanta A 2 la un interval de

timp de 1 minut ;
- se declanşează reacţia prin introducerea piruvatului (substratului specific pentru LDH) în
cuva de reacţie;
- se urmăreşte modificarea absorbantei timp de 1 minut;
- se notează cu A3, respectiv A4, valorile de absorbanta care indică consumul de NADH timp
de 1 minut, ca urmare a actvităţii LDH.
- se determină activitatea enzimatică a LDH serice în unităţi de activitate enzimatică/ minut
(U/ml).

Mod de calcul:
- se determină variaţiile de absorbanta, ΔA1, respectiv ΔA2, pe baza formulelor:

A1-A2
ΔA1/min =
min
A3-A4
ΔA2/ min =
min
- se determină ΔA/min care reprezintă consumul de NADH datorat activităţii LDH serice:

ΔA=ΔA2/min-ΔA1/min

ΔA/min x Vt

ε x d xVp
εmM x d x Vp
 [U/ml] =

unde: U/ml = activitatea enzimatică a LDH serice

-Vt= volumul total din cuva de reacţie exprimat în ml;
-ε mM = coeficientul de absorbanta milimolară a NADH+H+ la 365 nm (3.4);
-d = lăţimea cuvei (1 cm);
- Vp= volumul de ser din care se determină LDH (exprimat în ml).