Universitatea de tiine Agronomice i Medicin Veterinar

Facultatea de Biotehnologii
Anul II

MALAT-DEHIDROGENAZA
Referat

Coordonator:Asistent Universitar DR. Vasilica Simion

Stundet:Ene Ionela
Grupa 6204

Bucuresti
2015

CUPRINS

Introducere
Cap 1: Caracteristici a activitatii enzimatice malat-dehidrogenaza
1.1 Structura si evolutie
1.2 Izoenzimele malat-dehidrogenazei
Cap2: Metode de determinare a activitatii enzimatice malat-dehidrogenaza
2.1.Determinarea activitatii aspartate aminotransferazei(ASAT)-GOT-metoda
Merck
2.1.1.Principiul metodei
2.1.2.Aparatur
2.1.3.Reactivi
2.1.4.Mod de lucru
2.1.5.Calcularea rezultatelor
2.1.6.Observaii
2.1.7.Intervale de referin
2.1.8.Interpretarea rezultatelor
2.2.
Cap3: Utilizari a activitatii enzimatice malat-dehidrogenaza
Concluzii
Bibliografie

Introducere
Enzimele sunt proteine sau proteide fr de care celule vii nu pot nfptui reacii
complexe ntr-un timp scurt, la temperatura mediului nconjurtor.Ele sunt
substane care catalizeaz reaciile biochimice din organism, avnd un rol esenial
n biosinteza i degradarea substanelor din materia vie, ntlnindu-se n toate
organismele animale, vegetale i n microorganisme, mai fiind denumite din
aceast cauz biocatalizatori.Fr enzime , procesele biochimice s-ar desfura cu
viteze foarte mici.
1

Rol in cadrul organismelor:

Descompunerea moleculelor mari
Accelereaz procesele metabolice
Coordoneaz unele etape ale ciclului metabolic.
Tipuri de enzime :
Dup reactivitate:
Apoenzim - enzim, care devine activ numai la unirea cu anumite
substane de natur non-proteic;
Coenzim sau cofactor - substan de natur non-proteic, ce-i confer
activitate enzimatic apoenzimei;
Holoenzim - macromolecula rezultat n urma unirii coenzimei cu o
apoenzima.
Dup tipul reactiei catalizate:
Oxidoreductaza
Transferaza
Reductaza
1 http://ro.wikipedia.org/wiki/Enzim%C4%83

 Liaza
Izomeraza
Ligaza
Cap1: Caracteristici a activitatii enzimatice malat-dehidrogenaza
Malat dehidrogenaza este o enzima care catalizeaza reversibil oxidarea
malat-ului formand oxaloacetat folosind reducerea NAD+ la NADH. Aceasta
reactie face parte din mai multe cai metabolice, incluzand Ciclul acidului citric (
Ciclul Krebs ).
Malat-ul este un anion al acidului malic, acesta fiind intalnit in metabolismul
fiecarei celule vii. Acidul malic participa ca ion la Ciclul Krebs rezultand prin
deshidratarea acidului fumaric de catre fumuraza, fiind mai apoi dehidrogenat la
acid oxalilacetic de malat dehidrogenaza.
Malat dehidrogenaza este totodata implicate si in glucogeneza, sinteza
glucozei din molecule mai mici. Piruvatul in mitocondrii este actionat de catre
carboxilaza piruvatului pentru a forma oxaloacetat, un intermediar al acidului
citric. Pentru a obtine oxaloacetatul din mitocondrie, malat dehidrogenaza se
reduce la malat si traverseaza membrane interioara a mitocondriei . O data ajuns
in citosol, malat-ul se oxideaza inapoi in oxaloacetat prin malat dehidrogenaza
citosolica . In final fosfoenolpiruvat carboxichinasi (PEPCK) transforma
oxaloacetatul in Fosfoenolpiruvat (PEP).
1.1.Structura si Evolutie
In majoritatea organizmelor malat dehidrogenaza exista ca o molecula
homodimera3ydr este asemanatoare cu lactat dehidrogenaza ca structura. Este o
molecula proteica mare cu subunitati cantarind intre 30 3i 35 kDa .
Pe baza secventelor de aminoacizi, se pare ca Malat dehidrogenaza a deviat in
doua grupe principale filogenetice care se aseamana fie izoenzimei mitocondriale,
fie izoenzimei citoplasmatice/ cloroplaste .
Datorita faptului ca identitatea de secventa a malat dehidrogenazei in mitocondrie
este mai strans legata de stramorsi sai procarioti, in 3ydrogen33e cu izoenzima

citoplasmatica, teoria conform careia mitocondriile si citoplasmaticele au fost

dezvoltate prin endosimbioza este plauzibila. Interesant este faptul ca secventele de
aminoacizi ale Malat Dehidrogenazei in cazul microorganismele Archae sunt mai

asemanatoare cu cele ale Lactat Dehidrogenazei decat secventele de aminoacizi ale

Malat Dehidrogenazei in cazul altor organisme . Acest lucru ar putea indica o
oarecare posibila legatura evolutiva intre Malat dehidrogenaza si Lactat
dehidrogenaza.
Fiecare subunitate a dimerului Malat dehidrogenaza are doua domenii distincte
care variaza ca structura si functionalitate. O structura paralela pliate2 constituie
domeniul, in timp ce
patru 3ydrogen3 pliate si o structura helix3 cuprinde NAD+ situs de
legare. Subunitatile sunt tinute impreuna prin legaturi de 3ydrogen extinse si
interactiuni hidrofobe.
1.2.Izoenzimele Malat Dehidrogenazei
Dupa cum stim izoenzimele sunt enzime care difera din punct de vedere al
secventei amino acizilor dar care catalizeaza aceleasi reactii chimice. Aceste
enzime afiseaza de obicei, diferiti parametri cinetici sau diferite proprietati de
reglementare.
In cazul Malat Dehidrogenazei exista mai multe izoenzime, insa exista doua
izoenzime principale in cazul celulelor eucariote. Una este intalnita in matricea
mitocondriala participand ca enzima principala in ciclul acidului citric prin
catalizarea oxidari malat-ului . Cealalta este intalnita in citoplasma, asistand
Malat aspartatul de transfer, cu schimburi de reducere echivalente, astfel incat
Malat sa treaca prin membrana mitocondriala pentru a fi transformat in
oxaloacetate pentru viitoarele procese celulare.
2 http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_sheet

3 http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha_helix

Oamenii si majoritatea celorlalte mamifere exprima urmatoarele doua Malat

Dehidrogenaze :
4

(tabel 1 )

Cap2. Metode
enzimatice

ACTIVITII

Malate Dehidrogenaza 1,
NAD (citoplasmatica)
Identificatori
Simbol
MDH1
Entrez
4190
HUGO
6970
OMIM
154200
Ref Seq
NM_005917
UniProt
P 40925
Altele
EC numar
1.1.1.37
Pozitie
Chr.2 p23
Malate Dehidrogenaza 2,
NAD (mitocondriala)
Identificatori
Simbol
MDH2
Entrez
4191
HUGO
6971
OMIM
154100
RefSeq
NM_005918
UniProt
P 40926
Altele
EC numar
Pozitie
Chr7 cen-q22

(tabel 2 5)

de determinare a activitatii
malat-dehidrogenaza

2.1.DETERMINAREA
ASPARTAT
AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)-

(GOT) -metoda Merck

4 http://en.wikipedia.org/wiki/Malate_dehydrogenase
5 http://en.wikipedia.org/wiki/Malate_dehydrogenase

21.1Principiul metodei:

Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizeaz urmtoarea reacie:

COOH
|
CH2
|

COOH
|
CH2
|

CH2
+
|
C=O
|
COOH
acid
-cetoglutaric

CH-NH2
|
COOH
acid
aspartic

ASAT

COOH
|
CH2
|
CH2
|
HC-NH3
|
COOH
acid
glutamic

COOH
|
CH2
|

C=O
|
COOH
acid
oxalacetic

Oxalacetatul format este transformat n malat de ctre NADH+H n reacia

catalizat de MDH (malat dehidrogenaz) conform reaciei:
COOH
COOH
|
|
C=O
HC-OH
|
MDH
|
CH2
NADH + H+
NAD+
CH2
6http://www.umfiasi.ro/ProgrameEuropene/Emediqual/Prezentari%20Scoala%20de
%20Vara/EVALUARI%20BIOCHIMICE%20IN%20EXPLORAREA%20HEPATICA.pdf

|
COOH
acid oxalacetic

|
COOH
acid malic

Se msoar viteza de diminuare a cantitii de NADH+H pe msur ce trece n

NAD,prin scderea absorbiei n UV. Ea este direct proporional cu activitatea
enzimei ASAT.
2.1.2.Aparatur:
Spectrofotometru
Cronometru
2.1.3.Reactivi:
1. Soluie substrat: aspartat 200 mM n tampon fosfat 100 mM i pH =7,4
2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH +H 0,2 mM, LDH 10mg/l, MDH 10
mg/l n tampon fosfat 100 mM pH=7,4
2.1.4.Mod de lucru:
n momentul nceperii determinrilor se amesteca soluia 1 cu 2 (4 pri reactiv 1
cu 1 parte reactiv 2 ).
Amestec de reactivi 1+2 (l)
1000
Ser (l)
250
Se agit bine i se citesc extinciile la lungimea de und de 366 nm n cuve de 1
cm.
Citirea se face din minut n minut timp de 3 minute la 25 C
2.1.5.Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la numrul de minute
citite. Se noteaz cu (A/min). Concentraia ALAT n U/l = ( A/min) x 1520.
2.1.6.Observaii:
Dac valoarea ( A/min) crete mai mult de 0,08 se recomand diluarea a 0,1 ml
prob cu

0,9 ml ser i se nmulete rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua i la 30 C i 37

C.
2.1.7.Intervale de referin:

Brbai
Femei

25 C
pn la 18 U/l
pn la 15 U/l

30 C
pn la 25 U/l
pn la 21 U/l

37 C
pn la 37 U/l
pn la 31 U/l

2.1.8.Interpretarea rezultatelor:
Permeabilitatea membranei celulare hepatice crete gradat funcie de suferin.
Investigaiile biochimice evideniaz creteri n ser a unor enzime celulare (ALAT,
ASAT, LDH,etc.).Nivelul seric al acestor enzime de leziune, variaz n funcie
denumrul de hepatociteafectate, de gravitatea lezrii fiecrei celule, de viteza cu
care s-a produs leziunea i de viteza deeliminare din ser (t 1/2) a enzimelor
respective.
Dozarea ALAT i ASAT rmne cea mai util i sensibil investigaie biochimic n
caz de afectare hepatocelular acut (viral, toxic, medicamentoas), valori 500
U/l sugernd acest diagnostic.7

7 http://www.umfiasi.ro/ProgrameEuropene/Emediqual/Prezentari%20Scoala%20de
%20Vara/EVALUARI%20BIOCHIMICE%20IN%20EXPLORAREA%20HEPATICA.pdf