UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR

Facultatea de Biotehnologii
Specializarea Biotehnologii Industriale

Lipaza

Coordonator,

Student: Babata Silviu

Asist. univ. dr.VASILICA SIMION

Grupa 6202

BUCURETI
-2014-

CUPRINS
Introducere pag 3
Capitolul I Caracteristici generale...... pag 5

1.1 Prezentarea enzimei......... pag 5

1.2 Tipuri de reactii catalizate ....................................................................................... pag 5
1.3 Specificitatea lipazelor......................... pag 7
1.4.Substratul............................................................................................................. ...pag 9
Capitolul II Metode de determinare a activitatii lipazei ................. ..pag 11
Capitolul III Utilizari .... pag 14
Concluzii....................................................................................................................... .pag 16
Bibliografie.............pag 17

Introducere

Enzimele sunt utilizate in practica de mii de ani, inainte ca natura si rolul lor in reactii sa fie
intelese. Un exemplu in acest sens este obtinerea branzeturilor cu ajutorul cheagului. Utilizarea
acestui procedeu este atat de veche incat data descoperirii lui a fost uitata. In Orient preparatele

enzimatice brute, obtinute din fungi ce se formau pes uprafata orezului alimentar, erau folosite de
multe sute de ani in conservarea, condimentarea si modificarea de consistenta a diferitelor
produse alimentare.
Enzimele au fost denumite prima data cu termenul de fermenti,in 1897, cand Buchner, prin
distrugerea peretilor celulelor de drojdie obtine un mojarat care catalizeaza fermentatia alcoolica
si a demonstrat pentru prima oara ca enzimele pot functiona independent de celule. In prezent se
cunosc aproximativ 3200 de enzime diferite care s-au obtinutin stare pura, sau sub forma de
preparate cu diferite grade de puritateaproximativ 1000-1500.
Enzimele sunt prezente in toate organismele vii si se gasesc intoate tipurile de celule animale,
in fluidele corporale (sange, limfa, lichidcefalorahidian, lichid intestinal), in unele secretii
specifice pentru diferite organe (stomac, pancreas, rinichi), la plante si in toate virusurile si
microorganismele care populeaza diferite zone ale Pamantului. La plantele si la animalele
superioare, enzimele se gasesc in toate celulele vii ale acestora, insa distributia lor variaza dupa
natura tesutului din care fac parte celulele.
Exista mai multe tipuri de enzime cum ar fi: enzime de fermentatie, enzime amilolitice,
enzime celulozolitice, enzime proteolitice, enzime pectinolitice si enzime lipolitice.
Prin actiunea lor catalitica, enzimele fac posibila, in conditii compatibile cu viata,realizarea
unei intregi serii de reactii chimice, care in vitro nu se pot realiza decat in conditii foarte dure,
improprii vietii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimica se realizeaza la 37 C
numai in mediu puternic acid si intr-un interval de timp foarte lung( 3luni); in organism in
schimb, aceasta degradare are loc foarte rapid si in mediu slab acid. Pentru a realiza in vitro tot
asa de repede aceasta hidroliza, este necesara o temperatura de 120-140 C si o mare aciditate,
deci conditii de incompatibilitate cu viataorganismelor. In mod similar, arderea glucozei in
organismele vii, cu producerea apei,bioxidului de carbon si a energiei, se realizeaza prin
intermediul enzimelor, in conditii specifice vietii celulare. In absenta enzimelor, aceste
transformari necesita temperaruri de180-200 C. Ca urmare, rolul enzimelor este fundamental in
procesele vietii.In lipsa enzimelor, majoritatea covarsitoare a reactiilor chimice din organism
nus-ar produce, si deci nu ar putea exista procese metabolice si nici fenomene de viata.Din punct
de

vedere

chimic,

enzimele

sunt

proteine

sau

proteide

cu

rol

functionalfoarte important, de natura coloidala, din care cauza ele au insusirile substantelor prote
ice, fiind astfel influentate de conditiile de mediu. Ele sunt produse numai de organismele vii si
isi pot manifesta activitatea enzimatica atat in interiorul, cat si in afaraorganismului. Substanta
asupra careia actioneaza enzima se numeste substrat.
Bogate in enzime sunt semintele in stare de germinatie, plantute, frunze, fructe etc. in
general,plantele tinere au un continut mai ridicat de enzime decat plantele batrane. Puterea
catalitica a enzimelor din organismele in crestere este mai mare decat a celor batrane.
Ca biocatalizatori, enzimele se caracterizeaza prin urmatoarele proprietati generale:
actioneaza in cantitati extrem de mici, dar manifesta o activitate extrem de intensa; nu se
consuma si nu se transforma in reactiile catalizate; orienteaza si maresc viteza reatiilor
biochimice, determinand scaderea energiei de activitate a moleculelor desubstrat asupra carora
actioneaza; determina reactii extrem de rapide; se disting printr-o specificitate de actiune;
asigura coordonarea, reglarea si controlul proceselor biochimice la care participa.

CAPITOLUL I
Caracteristici generale
Hidrolazele sunt enzime care catalizeaz reacia de scindare a moleculelor cu fixarea
componentelor apei la produsele rezultate, dupa reacia general:

R-R' + HOH R-H + R' OH

Din aceast clas fac parte enzimele care hidrolizeaz proteinele pan la aminoacizi,
polizaharidele pan la monzaharide i lipidele pan la acizi grai i glicerol. Reaciile catalizate
de hidrolaze se produc cu modificri enrgetice mici, cu degajare de energie liber mic, deci ele
nu constituie o surs energetic important pentru organism. Hidrolazele au totui un rol deosebit
in metabolismul substanelor aduse cu alimentaia deoarece ele descompun moleculele mari care
intr in compoziia alimentelor, in molecule uor de asimilat. In general reaciile de hidroliz
enzimatic sunt reversibile, iar principalele legturi chimice care pot fi scindate sunt : legatura
ester, legatura glicozidic, legatura peptidic.
Clasa hidrolaze (E.C. 3.x.x.x) conine un numr mare de diferite enzime: acetilcolinesteraze
(E.C. 3.1.1.7), amidaze (E.C. 3.5.1.x), amilaze (E.C. 3.2.x.y), carboxilesteraze (E.C. 3.1.1.1),
celulaze (E.C. 3.2.1.4), esteraze (E.C. 3.1.x.x), lipaze (E.C. 3.1.1.3), serin-proteaze (E.C. 3.4.16
+ 3.4.21) etc. Comun tuturor lipazelor i esterazelor este faptul ca ele prezint o structur /s,
adic 8 structuri paralele in s-foaie pliat sunt inconjurate de -helixuri.
1.2. TIPURI DE REACTII CATALIZATE
Hidrolazele sunt capabile s catalizeze reversibil hidroliza legturilor covalente iar lipazele
hidrolizeaz legturi ester, cum sint cele din triacilgliceroli.Lipazele scindeaza toi cei trei acizi
grai ai gliceridei, insa nu simultan, ci succesiv, fapt foarte important pentru procesul de
absorbie a lipidelor.
Lipazele mai catalizeaz i alte tipuri de reacii, cu importan industrial: intr-un mediu lipsit
de ap, esterificarea acizilor carboxilici cu un alcool (reacie de esterificare) sau cu un rest alcool
al unui ester secundar (reacie de interesterificare). Intr-o reacie de interesterificare, in absena
apei, poate avea loc i transferul unui rest acil al unui ester pe un alt ester. Intr-o reacie de
transesterificare, un rest acil este transferat fie pe un alcool (alcooliz), fie pe un acid
(acidoliz).Lipazele catalizeaz hidroliza triacilglicerolilor pan la glicerol i acizi grai.
Contrar esterazelor, lipazele sunt activate numai cand sund adsorbite la interfaa ulei-apa, i
nu hidrolizeaz substraturile dizolvate in interiorul lichidului. In urma procesului de emulsionare
lipaza separ esterii glicerinei de acizii grai cu lan lung precum trioleina si tripalmitina.

Lipazele au o activitate mic in soluiile apoase care conin substraturi solubile. In contrast,
esterazele arat o cinetic normal Michaelis-Menten in soluii apoase.
Reacia de scindare hidrolitic a esterilor nu este cantitativ, starea de echilibru se atinge in
prezena catalizatorilor din ambele direcii. Reacia de hidroliz are loc, in cea mai mare parte in
faza omogen gras. Hidroliza care se petrece la interfaa grsime-ap este redus. Viteza de
hidroliz este cu atat mai mare cu cat cantitatea de ap in faza gras este mai mare. Solubilitatea
apei este redus in grsimea neutr, in schimb este mult mai mare in acizii grai. Din acest motiv,
in cazul grsimilor neutre, viteza de hidroliza la inceput este mai mic i apoi crete rapid, pe
masur ce apar acizi grai liberi, atinge o valoare maxim de alcool i apoi scade, sczand i
concentraia grsimii nehidrolizate.
Substanele detergente care mresc solubilitatea apei in faza gras accelereaz i procesul de
hidroliz. Proporia dintre componente: ester, alcool, acid i ap la starea de echilibru este dat de
legea aciunii maselor. In prezena unei cantitti mari de ap, in cazul hidrolizei grsimilor,
glicerina, fiind uor solubil in ap, va trece in cea mai mare parte in faza apoas i echilibrul se
va deplasa spre faza apoas. In prezena unei cantiti mici de ap, echilibrul se va deplasa spre
sintez. La eucariote lipazele sunt implicate in diferite etape ale metabolismului lipidic
incluzand: digestia grsimilor, absorbia, reconstituirea i metabolismul lipoproteinelor.
Faptul c lipazele i lipidele interacioneaz la interfaa nu este inc pe deplin clar i
reprezint un subiect de investigare intens. Cercetarile privind lipazele sunt concentrate in
special pe caracterizarea structural, elucidarea mecanismului de aciune, cinetic, secvenierea
i clonarea genelor de lipaz. In comparaie cu acest efort o mic parte a cercetrilor s-a realizat
prin dezvoltarea sistemelor de producere a lipazelor de uz comercial in bioreactoare.1
1.3. Specificitatea lipazelor2

1 Reagent Chemicals ACS Specications, American Chemical Society,Washington

DC, 8th Edn, 1993,Pag 95
2 A.B.Salleh,R.N.Z.R.A.Rahman,M.Basri , New Lipases And Proteases , Nova Science
Publishers , 2006, Pag 7-13

Lipazele manifest diferite specificiti fa de grsimi/uleiuri. Specificitatea lipazelor poate fi

clasificat in 5 tipuri (conform Rogalska, citat de Pfeffer, 2008):
1) Specificitate de substrat
Triacilgliceridele nu reprezint unicul substrat pentru lipaze: diacilgliceridele,
monoacilgliceridele i fosfolipidele pot fi, de asemenea, hidrolizate. Unele lipaze manifest
preferin pentru anumii acilgliceroli. Lipaza din Penicilium camembertii, de exemplu,
manifest o activitate catalitic mai mare fa de mono- i diacilgliceroli, dar nu i fa de
triacilgliceroli.
2) Lipaze nespecifice
Unele lipaze nu prezint nici specificitate de substrat nici stereospecificitate. Aceste enzime
hidrolizeaz orice legtur esteric. Astfel de lipaze sunt produse de Candida rugosa i
Pseudomonas cepacia.
2) Lipaze acil-specifice
Unele lipaze prezint specificitate pentru anumii acizi grai, aa cum este cazul lipazei din
Geotrichum candidum, care prezint o specificitate strict pentru acizii grai nesaturai cu dubla
legtur in 9 (de ex. acidul oleic). Alte lipaze ce aparin acestui grup prezint specificitate inalt
fa de acizii grai cu lan scurt, aa cum este cazul lipazelor din Penicillium roquefortii.
4) Lipaze stereospecifice
Aceste lipaze pot face distincia intre poziiile 1 i 3 ale trigliceridelor, exemple fiind lipaza
lingual uman i unele lipaze produse de Pseudomonas fluorescens i Humicola languinosa
(Pfeffer, 2008).

5) Regiospecificitate (specificitate regionala)

Lipazele au capacitatea de a face distincie intre poziiile 1, 2 sau 3 ale gliceridelor, astfel:
lipazele cu specificitate 1,3 (cunoscute ca lipaze specifice sn1,3), cum sunt cele secretate de
Rhizopus oryzae i Rhizomucor miehei, hidrolizeaz preferenial legturile esterice din poziiile 1
i 3, in timp ce lipazele cu specificitate pentru poziia 2 (lipaze specifice sn2), produse de
Candida antarctica, Candida parapsilosis sunt puin numeroase i manifest preferin pentru
poziia 2.3

1.4. Grsimile i uleiurile ca substraturi ale lipazelor

Grsimile i uleiurile se deosebesc, in primul rand, prin starea de agregare: solide, semisolide sau
lichide, mai mult sau mai puin vascoase. Ele au origine vegetal sau animal, fiind constituite in
special din triacilgliceroli ai acizilor grai cu numr par de atomi de carbon. Prin grsimi se
ineleg produsele solide sau semisolide la 20oC, in timp ce uleiurile sunt lichide. Toate sunt
nemiscibile cu apa i au o densitate mai mic decat aceasta. Proprietile fizice ale grsimilor i
uleiurilor sunt determinate de lungimea lanului acizilor grai constitueni i de numrul dublelor
legturi din acetia. Acizii grai saturai cu lan lung prezint un punct de topire mai ridicat decat
acizii grai nesaturai, cu lan scurt. Lipidele vegetale sunt, de regul, bogate in acizi grai
nesaturai, exclusiv cu numr par de atomi de carbon, in care dublele legturi au configuraia cis.
Cei mai comuni acizi grai prezeni in gliceride sunt acidul dodecanoic (lauric), acidul
tetradecanoic (miristic), acidul octadecanoic (stearic), acidul hexadecanoic (palmitic) i acidul
oleic .
In ultimii 60 de ani, producia de grsimi i uleiuri s-a dublat (2006 mai mult de 100 milioane
tone) (Tabelul 1). A crescut, in special, producia de ulei de rapi (Brassica napus oleifera), ulei
de soia (Glycine max), grsime de palmier i ulei de floarea-soarelui (Helianthus annuus), in
timp ce cantitatea de ulei de pete a sczut.

3 A.B.Salleh,R.N.Z.R.A.Rahman,M.Basri , New Lipases And Proteases , Nova Science

Publishers , 2006, Pag 7-13

Grsimile i uleiurile sunt importante componente ale produselor alimentare. Valorile nutriionale
i senzoriale precum i proprietile fizice ale trigliceridelor sunt mult influenate de factori ca:
poziia la care se leag acizii grai la molecula de glicerol, de lungimea lanului moleculei de
acid gras i gradul de nesaturare. Lipazele permit modificarea proprietilor lipidelor prin
modificarea poziiei legrii acizilor grai in molecula de glicerol i inlocuirea unuia sau mai
multor acizi grai cu alii noi. In acest fel lipidele relativ ieftine pot ajunge la valori mai ridicate
i cu proprieti imbuntite. Untul de cacao, o grsime de valoare ridicat, conine acid stearic
i acid palmitic i are un punct de topire de aproximativ 37C. Tehnologiile care se bazeaz pe
mecanismul de aciune al lipazelor incluzand hidroliza mixt i reacii de sintez sunt utilizate in
comer pentru a imbunti unele proprieti nedorite ale grsimilor cu cele ale substituienilor
din untul de cacao. O versiune a acestui proces utilizeaz lipaza imobilizat pe Rhizomucor
miehei in reacia de transesterificare unde inlocuiete acidul palmitic din untul de palmier in acid
stearic. Unele studii descriu un tip de lipaz ce catalizeaz procesele de interesterificare a
grsimii din unt i care are drept rezultat o scdere considerabil a lanului de acizi grai saturai.
Dintre gsimile vegetale, cele mai utilizate sunt uleiul de palmier, uleiul de soia, uleiul de rapi,
uleiul de floarea soarelui, untul de arahide, untul de cacao, uleiul de msline, uleiul de bumbac.
Consumul total de grsimi vegetale a fost de 118 milioane tone in 2001, la nivel mondial. In
unele ri din sud-estul Asiei, precum Malaiezia i Indonezia, exist culturi extinse de palmieri
din care se produce uleiul.

In lume, numai in anul 2001, s-a produs aproximativ 23 milioane tone de ulei de palmier, din
care Malaiezia a furnizat 12 milioane tone (52%). Glicerolul i acizii grai se obin din grsimi
prin hidroliz chimic sau catalizat de lipaze. Glicerolul este materie prim pentru obinerea
nitroglicerinei i oxidului de propilen, in timp ce acizii grai sunt transformai in metil-esteri,
care sunt utilizai drept carburani, i in amide, alcooli i diveri reactivi chimici (Yamane,
2002)..
Oamenii consum i grsimi animale, precum ulei de pete, unt, untur, seu etc. In 1998, la nivel
mondial, s-au consumat aproximativ 18 milioane tone grsime animal, ceea ce reprezint doar o
cantitate mic in comparaie cu uleiurile vegetale. Printre uleiurile comestibile, cele din pete
sunt unice prin coninutul de acizi grai polinesaturai din categoria -3, care sunt eseniali
pentru om (acizii eicosapentaenoic i docosahexaenoic).4

Metoda de determinare a activitatii enzimatice

4 S.A.Kuby, A Study Of Enzymes Vol II Mechanism Of Enzyme Action, ,CREC PRESS,1990, Pag
587

PRINCIPIUL :
Trigliceride + H2O lipaza diglicerid + acid gras
CONDIII : T = 37 C , pH = 7,2
METODA : titrimetric
REACTIVI :
A.200MM Tris HCI tampon, pH 7,2 la 37 C
B. Soluie ulei de masline (substrat)
C. 95 % etanol ( nedenaturat )
D. 0,9 % ( g / v ) TPH Indicator
E. 50 mM hidroxid de sodiu soluie standard ( NaOH )
F. Soluie lipaza ( Imediat nainte de folosire , se prepar o soluie care con ine aproximativ 500
- 1000 uniti / ml de lipaz n ap deionizat rece . )
PROCEDURA :
Pipetm ( n mililitri ) urmtorii reactivi n recipiente adecvate :

APA DEIONIZATA
TAMPON
ULEI DE MASLINE

PROBA
2.50
1.00
3.00

1.Se amestec i se echilibreaza la 37 C

2.Adaugati 1 ml enzima in proba.

MARTOR
2.50
1.00
3.00

3. Amestecati i se incubati la 37 C pentru exact 30 minute . Imediat dup nceperea incubrii

se pipeteaza 1,00 ml de reactiv F ( sol enzima) intr-un balon Erlenmeyer de 50 ml ,care este
martorul, si depozitati la 0-4 0 C.
4.Dupa 30 de min,puneti martorul si proba in 2 baloane Erlenmeyer de 50 ml .
5. Se adauga 3 ml de reactiv C in ambele baloane (proba si martor)
6. Se amestec prin agitare i apoi se adaug 4 picturi de Reactiv D ( indicator TPH).
7.Se titreaz fiecare soluie cu reactiv E ( NaOH ) pana la culoarea albastru deschis , utilizand o
biuret de 25 ml, cu gradaii de 0,1 ml .

CALCUL
Unitati/ml enzima

(NaOH)(molaritatea NaOH)(2)(df)
1

(NaOH)=volumul in ml de reactiv E folosit pentru proba minus volumul folosit pentru martor
1000=factor de conversie(de la miliechivalent la microechivalent)
2=factor de conversie a timpului( 30 min raportat la 1 ora)
df=factor dilutie

1=volumul (in ml) enzimei folosite

Se determina AE si AES. O unitate va hidroliza un microechivalent de acid gras dintr-o

triglicerida in interval de o ora la T = 37 C , pH = 7,2.
Concentratie enzimatica finala : intr-un amestec de reactie de 7,5 ml avem urmatoarele
concentatiii: 26,7 mM Tris,40 % (v/v) ulei de masline, si 500-100 unitati lipolitice.5
Utilizari ale lipazelor

5 Reagent Chemicals ACS Specications, American Chemical Society,Washington, DC, 8th

edn, 1993,pag 95

In ultimii ani lipazele au fost intens folosite ca biocatalizatori pentru o diversitate de reacii ce se
desfoar in sistem folosind solveni organici cum ar fi de exemplu sinteza esterilor i
modificarea lipidelor.Intr-un sistem apos aceti biocatalizatori sunt capabili s catalizeze
hidroliza triacilglicerolilor cu formare de acizi grai i glicerol, compui foarte importani in
industria chimic.
Hidroliza catalizat de lipaz a trioleinei a fost deasemeni folosit pentru producerea de monoi di-gliceride cu utilizare larg in calitate de emulgatori in industria alimentar i chimic.
Rolul biologic al lipazelor pentru organismele vii:
-asigur funcionarea membranelor;
-particip la metabolismul lipidic;
-particip la procesul de depozitare a grsimilor de rezerv.
Lipazele sunt enzime cu rspandire larg care s-au izolat dintr-o varietate de surse: animale,
vegetale i microbiene, fiind cunoscute i lipaze produse de archaea. Lipazele de diferite
proveniene se deosebesc intre ele sub aspectul proprietilor i caracterului aciunii.
Lipazele microbiene prezint un potenial uria in domeniul tehnologiilor alimentare, al tiinelor
medicale i in industria chimic, deoarece:
1) au specificitate larg de substrat;
2) nu necesit cofactori.
3) sunt stabile in solveni organici;
Lipazele sunt responsabile, in primul rand, de hidroliza acilglicerolilor. Au rspandire larg i
sunt indispensabili pentru degradarea triacilglicerolilor in natur. Pe lang semnificaia lor
biologic, lipazele manifest un potenial excelent pentru biotehnologii. Aceste enzime posed
proprietatea unic de a aciona la interfaa apoas i neapoas, distingandu-se de esteraze.
Activitatea catalitic a lipazelor depinde, in mare msur, de starea de agregare a substratelor.
Studiile experimentale au artat c activarea implic demascarea centrului activ i modificri
conformaionale, care necesit prezena picturilor de ulei in ap. Studii recente asupra structurii

unor lipaze au evideniat unele aspecte privind activitatea hidrolitic, activarea la interfa i
stereoselectivitatea lipazelor. Enzime precum proteazele i carbohidrazele sunt folosite pe scar
larga, la nivel industrial. Dei, actualmente, lipazele reprezint 5% din piaa enzimelor,
potenialul lor va crete spectaculos datorit aplicaiilor din ce in ce mai numeroase. Aciunea
lipazelor are o mare importana pentru pstrarea alimentelor, mai ales a celor ce conin cantitti
mari de lipide. Prin aciunea acestor enzime, in timpul depozitrii produselor alimentare se
produce o rapid descompunere a gliceridelor in acizi grai i glicerol, ceea ce conduce la o
cretere a aciditii produselor i la deprecierea lor calitativ.6

CONCLUZII

6 G.Alvaro,A.Illanes Enzyme Biocatalysis: Principles And Applications,Springer

Science,2008,Pag 304

 Lipazele sunt hidrolaze capabile sa scindeze legturi ester, cum sint cele din
triacilgliceroli.Mai catalizeaz i alte tipuri de reacii, intr-un mediu lipsit de ap,
esterificarea acizilor carboxilici cu un alcool (reacie de esterificare) sau cu un rest alcool
al unui ester secundar (reacie de interesterificare).
Sunt activate numai cand sund adsorbite la interfaa ulei-apa, i nu hidrolizeaz
substraturile dizolvate in interiorul lichidului. In urma procesului de emulsionare lipaza
separ esterii glicerinei de acizii grai cu lan lung precum trioleina si tripalmitina.
Lipazele au o activitate mic in soluiile apoase care conin substraturi solubile.
Lipazele manifest diferite specificiti fa de grsimi/uleiuri. Specificitatea lipazelor
poate

fi

clasificat

in

tipuri:

specificitate

de

substrat,specificitate

regionala,nespecifice,acil-specifice si stereospecifice.
Folosesc drept substrat uleiuri si grasimi asupra carora actioneaza, permitand modificarea
proprietilor lipidelor prin schimbarea poziiei legrii acizilor grai in molecula de
glicerol i inlocuirea unuia sau mai multor acizi grai cu alii noi. In acest fel lipidele
relativ ieftine pot ajunge la valori mai ridicate i cu proprieti imbuntite.
Lipazele sunt implicate in diferite etape ale metabolismului lipidic incluzand: digestia
grsimilor, absorbia, reconstituirea i metabolismul lipoproteinelor.
In ultimii ani lipazele au fost intens folosite ca biocatalizatori (pentru o diversitate de
reacii) , ca emulgatori in industria alimentar i chimic, sunt indispensabile pentru
degradarea triacilglicerolilor in natur si

manifest un potenial excelent pentru

biotehnologii,reprezentand in momentul actual 5% din piata enzimelor.

BIBLIOGRAFIE

1.Reagent Chemicals ACS Specications, American Chemical Society,Washington DC, 8th Edn,
1993,Pag 95
2.A.B.Salleh,R.N.Z.R.A.Rahman,M.Basri , New Lipases And Proteases , Nova Science
Publishers , 2006, Pag 7-13
3.S.A.Kuby, A Study Of Enzymes Vol II Mechanism Of Enzyme Action, ,CREC PRESS,1990,
Pag 587
4.G.Alvaro,A.Illanes
Science,2008,Pag 304

Enzyme

Biocatalysis:

Principles

And

Applications,Springer