INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE

Acidul lactic, pe lng aplicaiile din industia alimentar, farmaceutic, textil, chimic, se poate utiliza ca materie prim la fabricarea plasticului biodegradabil. Aceast aplicaie face ca acidul lactic s fie un produs valoros. Astfel, cercetrile la nivel mondial au ca obiectiv reducerea costurilor de producie, iar fermnataia lactic indus de diferite tipuri de bacterii a fost gasit ca fiind cea mai atractiv cale de a produce acid lactic. Deoarece costul mediului de fermentaie este datorat sursei de nutrieni, se dorete a se gsi noi surse ieftine de nutrieni cu potenial industrial i izolarea de noi bacterii care au capacitate mare de bioconversie a nutrienilor n acid lactic. Bacteriile probiotice fac parte, n principal, din categoria bacteriilor lactice i sunt caracterizate de efectul benefic pe care l aduc organismului uman. Produc cantitii mici de acid lactic, ns au aplicaii largi n industria alimentar. Pentru a le proteja viabilitatea pe durata expunerii condiiilor sucului gastro-intestinal, bacteriile se pot ncapsula n diferite matrici. Principalul motiv al ncapsulrii este de a mbuntii supravieuirea bacteriilor pe perioada produciei i depozitrii produselor alimentare, precum i de a le proteja fa de factorii fizici i chimici ai tractului digestiv. Scopul - evalua fermentaiile lactice pe substraturi vegetale

REZULTATE EXPERIMENTALE Acidul lactic este unul dintre cei mai importani acizi organici, produs de ctre bacteriile lactice (LAB), descoperit de ctre cercettorul suedez C.W. Scheele n anul 1780 n lapte acru. Acidul lactic are doi stereoizomeri L(+) i D() (Fig.1). Acidul lactic are o gam larg de utilizri n industia alimentar, cosmetic, textil, aromelor, etc. Dac cantitile mari de acid lactic D() sunt dauntoare pentru oameni, forma L(+) a acidului lactic este izomerul preferat al industiilor alimentare i farmaceutice fiind tolerat de ctre organismele umane deoarece omul are L-lactat dehidrogenaz, i metabolizeaz forma L(+) a acidului lactic (kerberg i colab., 1998; Hofvendahl i colab., 2000). COOH l HCOH CH3 COOH l HOCH CH3

l l

D(-) lactic acid

L(+) lactic acid

Fig.1. Structura chimic a stereoizomerilor acidului lactic D(-) i L(+) Bacteriile lactice sunt homofermentative i heterofermentative i pot produce att stereoizomerul L(+) ct i D() sau mixul racemic al acidului lactic. Avantajul semnificativ, dicolo de cel al sintezei chimice, l reprezint posibilitatea de a produce acid lactic prin metode biologice i posibilitatea utilizrii de substraturi ieftine ca: zer, melas, reziduu de amidon, sfecl, trestie de zahr, suc de lucern sau alte surese bogate n carbohidrai i nutrieni eseniali pentru dezvoltarea bacteriilor (Anuradha i colab., 1999; Ritcher i Berthold, 1998; Tsao i colab., 1999; Vishnu i colab., 1998, 2000; Vodnar i colab., 2010). Fermentaia lactic Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate sub aciunea echipamentului enzimatic al microorganismelor n acid lactic ca produs principal i produse secundare, cum ar fi: diacetil, aceton, acid acetic, alcool etilic i CO2. Calea metabolic de producere a acidului lactic este frecvent ntlnit n lumea microbian. Randamente superioare de convertire a glucidelor n acid lactic sunt ntlnite la bacterii i mucegaiuri. Bacteriile lactice, considerate ageni tipici ai fermentaiei, sunt folosite industrial n biotehnologii alimentare, la industrializarea laptelui i a crnii, n panificaie, la conservarea produselor vegetale i la obinerea acidului lactic. Mucegaiurile selecionate ale genurilor Aspergillus, Penicillium i Mucor pot fi cultivate submers cu aerare dirijat, pentru obinerea industrial a acidului lactic. n condiii naturale, acidul lactic se poate forma i n esutul muscular prin procesul de glicoliz, prin secvene

biochimice catalizate de enzime similare cu cele ale celulei microbiene. Caracterele morfo-fiziologice generale ale bacteriilor lactice. Bacteriile lactice sunt foarte rspndite n natur n diferite biotopuri; aparatul foliar al plantelor, microbiota intestinal (in primii ani de via sau cnd n alimentaie predomin aptele), cavitatea bucal, suprafaa pielii. Dintre sursele alimentare permanent asociate cu bacteriile lactice amintim laptele, n care bacteriile lactice prezente pe canalele galactofore sunt antrenate la mulgere, i legumele (varz, castravei .a.). Caracterele morfologice. Bacteriile lactice prezint heterogenitate morfologic; principalele forme sunt derivate de la forma coccus: streptococi (genul Lactococcus i Streptococcus), diplococi (genul Leuconostoc), tetrade (genul Pediococcus). Numeroase alte bacterii lactice se prezint sub form cilindric, de bastonae cu dimensiuni variabile, izolate sau formnd lanuri lungi (genul Lactobacillus). Caracterele fiziologice. Bacteriile lactice sunt pretenioase din punct de vedere nutritiv i nmulirea lor are loc n medii cu compoziie chimic complex. Ca surse de carbon i energie, bacteriile lactice pot s produc asimilarea sau fermentarea pentozelor (riboz, xiloz, arabinoz), a hexozelor (glucoz, galactoz), a diglucidelor (lactoz, maltoz, zaharoz). Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat n acid lactic, iar acidul citric n aceton i diacetil. Acidul lactic nu poate fi folosit de ctre bacteriile productoare i acumularea sa prin fermentare conduce la inhibarea nmulirii i la ncetinirea vitezei de fermentaie. Ca surse de azot, bacteriile lactice prefer aminoacizi, peptide i amide, fr s poat folosi srurile amoniacale. Bacteriile lactice au enzyme proteolitice intracelulare, care pot avea un rol pozitiv la maturarea brnzeturilor, dup eliberarea lor din celulele autolizate. Specia Lactobacillus casei poate produce o hidroliz enzimatic a cazeinei.

Bacteriile lactice, n general, i cete termofile, n special, necesit prezena n mediu a unor factori de cretere (vitaminele: B2 i B6, biotina, acidul para-amino-benzoic, acidul folic acidul pantotenic). Bacteriile lactice sunt acidotolerante, valorile minime de pH la care are loc creterea fiind de 4,3 - 4,8, pentru lactococi, i 3,8 - 4,4, pentru lactobacili, cu valori optime n domeniul de pH = 4 - 6. n report cu oxigenul din aer, bacteriile lactice sunt anaerobe sau facultativ anaerobe. Prin cretere n medii lichide (bere, vin, sucuri) dau o tulbureal persistent i acrire, iar prin dezvoltarea n lapte produc coagularea acid a cazeinei cnd pH-ul se reduce la 4,6, ca urmarea formrii de acid lactic. Bacteriile lactice sunt adaptate s creasc ntr-un domeniu larg de temperaturi (0...55 0C), cu valori optime n domeniul mezofil (20...25 0C streptobacterii, 30...35 0C - lactococi) sau termofil (35...45 0C lactobacterii). Sunt bacterii nesporulate i pot fi inactivate pe cale termic la temperaturi mai mari de 65 0C (n 30 de minute) sau la 72...740C, n 15-20 de secunde (regim de pasteurizare a laptelui).

Caracterele taxonomice i clasificarea bacteriilor lactice.

Dup punerea n eviden a bacteriilor lactice de ctre Louis Pasteur, n 1875, ca ageni de acrire ai berii, muli cercettori au studiat aceste bacterii att de rspndite n natur. O clasificare de referin aparine lui Orla Jensen (1919), care mparte bacteriile lactice n dou mari grupe: - bacterii lactice, Gram-pozitive, facultativ anaerobe, care produc numai acid lactic cu un randament de 90-100% din zahrul consumat. Genunile mai importante sunt Thermobacterium i Streptobacterium, n care erau inclui lactobacilii, streptococii lactic (genul Streptococcus), precum i reprezentanii genurilor Betacoccus (actual Leuconostoc) i Tetracoccus (actual Pediococcus); - pseudofermeni lactici (bacterii lactice atipice), care produc prin fermentaie cantiti mici

de acid lactic, i, n cantiti superioare, gaze: CO2, H2, acid acetic a. Sunt bacteria Gramnegative, aerobe. n aceast grup erau incluse bacteriile coliforme cu genul Escherichia i Aerogenes (actual Enterobacter). O alt clasificare, cea a lui Bergey, separ bacteriile lactice adevrate n familia Lactobacteriaceae, n timp ce bacteriile coliforme se regsesc n familia Enterobacteriaceae. Cea mai recent clasificare aparine tui Kandler i Weiss (1986), care, n afar de proprietile fiziologice i tinctoriale ale bacteriilor lactice, are la baz cunoaterea procentual a coninutului de guanin i citozin din structura acizilor nucleici, criteriu taxonomic stabil, pe baza cruia s-au putut constata similitudini sau diferenieri ntre speciile cunoscute. Conform acestei clasificri, bacteriile lactice sunt incluse n familia LACTOBACTERIACEAE cu mai multe genuri: 1. Genul Streptococcus cuprinde: - grupul streptococilor lactici inclui n genul Lactococcus cu speciile: Lactococcus lactis; Lactococcus lactis biovar diacetilactis; Lactococcus lactis biovar acetoinicus i Lactococcus cremoris (sin. Str. cremoris - streptococul smntnii); - grupul viridans, bacterii ce aparin genului Streptococcus, avnd ca specii importante pe: Streptococcus salivarius subsp. thermophillus (SST) (sin. Streptococcus thermophillus) cultur folosit la fabricarea iaurtului i Streptococcus bovis; - grupul streptococilor fecali, denumii i enterococi, cu specia reprezentativ Streptococcus fecalis; - grupul streptococilor patogeni, cu speciile Streptococcus pyogenes (agentul scarlatinei) i Streptococcus agalactiae (agentul mastitei, transmisibil prin laptele colectat de la vaci bolnave). 2. Genul Lactobacillus (sin. Lactobacterium) include aproximativ 50 de specii clasificate n funcie de temperatura optim de activitate i de modul de fermentare a glucidelor n homofermentativi lactobacili care produc numai acid lactic i cantiti minore

de substane de arom - i heterofermentativi lactobacili productori de acid lactic, acid acetic, diacetil, CO2. Lactobacilii homofermentativi se pot clasifica astfel: - termofili (TO = 40.. .50 0C): - Lactobacillus delbrueckii subspecia delbrueckii; - Lactobacillus delbrueckii subspecia lactis; - Lactobacillus delbrueckii subspecia bulgaricum (LDB); - mezofili (TO = 30...35 0C): - Lactobacillus acidophillus; - Lactobacillus helveticus. Lactobacilii facultativ heterofermentativi mezofili sunt: - Lactobacillus casei; - Lactobacillus sake. Lactobacili heterofermentativi mezofili sunt: - Lactobacillus brevis; - Lactobacillus, Lb. fermenti; - Lb. inulinus (sin. Sporolactobacillus inulinus); - Lb. bifidum (sin. g. Bifidobacterium bifidus). 3. Genul Leuconostoc include bacterii sub form de coci, diplococi, heterofermentative mezofile - produc prin fermentaie acid lactic, alcool etilic, CO2, iar prin biosintez, poliglucidele de tip dextran. Dintre speciile cu importan practic se amintesc: Leuconostoc cremoris, Leuconostoc citrovorum i Leuconostoc paracitovorum, bacterii care pot folosi ca surse de carbon citraii; i subspeciile lui Leuconostoc mesenteroides i Leuconostoc dextranicum, productoare de dextran prin conversia zaharozei i polimerizarea dextrozei. 4. Genul Pediococcus include bacterii lactice homofermentative, mezofile, cu temperatura optim la 30 0C, cu speciile: Pediococcus acidilactici, Pediococcus cerevisiae. Ci de formare a produilor principali i secundari n fermentaia lactic. Biochimismul formrii produilor de fermentaie difer n funcie de echipamentul

enzimatic al bacteriilor lactice i de sursele de carbon fermentescibile. Bacteriile lactice homofermentative produc fermentarea anaerob a hexozelor pe calea Embden - Mayerhof - Parnas (EMP) pn la formarea acidului piruvic, apoi, fiind lipsite de enzima piruvat decarboxilaz, reduc acidul piruvic, obinndu-se acidul lactic sub aciunea a dou lactatdehidrogenaze care necesit NAD/ NADP n calitate de coenzime: L-Lactatdehidrogenaz L(+)lactat + NAD+ <------------------------------> Piruvat + NADH+H+ L-Lactatdehidrogenaz D(-)lactat + NAD+ <------------------------------> Piruvat + NADH+H+. n fermentaia homolactic forma predominant a acidului lactic este dependent de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei [lactococii formeaz L (+)-lactat i lactobacilii D (-) lactat], dar i de prezena lactat racemazei, care, atunci cnd este activ n celula microbian rezult prin fermentaie, amestecul racemic (D, L-lactat), conform reaciei: L(+)lactat <------------------------------> D(-)lactate Ecuaia global a fermentaiei homolactice este urmtoarea: C5H12O6 + 2 ADP + 2Pi 2 CH3-CHOH-COOH + 2 ATP + 75 kj Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza i lactoza pot fi transportate ca atare n celul, printr-un sistem activ de permeaze prezent la Streptococcus salivarius subspecia thermophillus i lactobacilii termofili, sau prin transport activ catalizat de sistemul

fosfotransferaz - fosfoenolpiruvat (PT-PEP) prezent la bacterii ale genului Lactococcus i Lactobacillus sp., cu formarea esterilor fosforici. Lactoza sau lactozo-P n celula bacterian sub aciunea galactozidazei (lactazei) este transformat n glucidele componente: -Galactozidaz Lactoza------------------------->Glucoz + galactoz n timp ce glucoza este metabolizat direct pe calea EMP, galactoza este transformat pe urmtoarele ci metabolice: a) calea D-tagatozei 6P (genul Leuconostoc); b) calea Leloir (SST, LDB, Leuconostoc); c) calea glicolitic (Embden Mayerhof Parnas) de fermentaie a glucozei. n fermentaia homolactic se pot forma, n cantiti mici, substane de arom, diacetil i aceton, fie prin metabolizarea glucidelor, fie a citrailor care asigur o surs suplimentar de acid piruvic. Bacteriile lactice heterofermentative produc fermentaia anaerob a glucidelor (pentoze, hexoze) pe calea pentozo-fosfatului (6P-gluconatului). n funcie de specie difer i natura produselor de fermentaie: - Lactobacillus brevis produce acid lactic, acid acetic i CO2; - Leuconostoc mesenteroides produce acid lactic, etanol i CO2; - Lactobacillus bifidus produce fermentare heterolitic pe calea fructozo 6P, fr formare de CO2. Bifidobacteriile, care reprezint 95% din microflora intestinal a sugarilor, pot fi folosite pentru obinerea unor produse lactate cu efect terapeutic (produse probiotice). Aplicaii practice ale fermentaiei lactice. Acidul lactic are multiple ntrebuinri:

- n industria alimentar pentru acidifierea sucurilor i esenelor de fructe, limonadelor, bomboanelor; - n medicin, sub form de lactai de Ca i Fe, substane uor asimilabile de ctre organismul uman; - n industria chimic mordant la colorarea i imprimarea mtsii i a diferitelor textile; - n industria pielriei; - n industria panificaiei, paralel cu fermentaia alcoolic produs de drojdia de panificaie n aluat are loc activitatea fermentativ a bacteriilor lactice din microbiota finii sau a culturilor selecionate, contribuind la formarea aromei i la creterea n volum a pinii; - n industria extractiv, la fabricarea amidonului, n timpul operaiei de nmuiere a porumbului, prin adugarea de SO2 este inhibat dezvoltarea bacteriilor butirice i este favorizat dezvoltarea unei fermentaii lactice; lichidul obinut de la nmuierea porumbului se folosete n form concentrat ca adaos la obinerea mediilor de cultur a microorganismelor n industriile fermentative; - n industria laptelui bacteriile lactice, n special cele homofermentative, sub form de culturi pure selecionate, sunt folosite la obinerea produselor lactate acide: lapte acru, sana, chefir, lapte acidofil, iaurt, smntn fermentat, a untului i la fabricarea brnzeturilor; - prin fermentaia lactic spontan determinat de bacteriile lactice din microflora epifit a plantelor, se pot conserva prin murare varza, castraveii, tomatele, mslinele i poate avea loc nsilozarea furajelor verzi; - n vinificaie bacteriile lactice pot avea un efect pozitiv, reducnd aciditatea vinurilor prin transformarea acidului malic n acid lactic; - fermentaia lactic spontan nedirijat poate avea i un efect negativ, ducnd la alterarea unor produse (acrirea berii, borirea vinului) sau pierderi de zaharoz la difuziune, n industria zahrului.