Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
INDRUMTOR DE LABORATOR
BIOCHIMIE
Referenti stiintifici:
Conf. univ. Dr. Vica Simona
Conf. univ. Dr. Alina Caraban
CUPRINS
LABORATOR 1. Msuri de protecia muncii n laboratoarele de biochimie .......................... 4
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse alimentare ........................... 6
Soluii de reactivi ...................................................................................................................... 7
LABORATOR 2. METODE DE ANALIZ FOLOSITE N BIOCHIMIE ........................... 12
LABORATOR 3 - 4.GLUCIDE............................................................................................... 22
Extragerea glucidelor din produsele alimentare ...................................................................... 23
3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul ............................................ 24
3.2.Determinri cantitative ale glucidelor ............................................................................... 27
3.2.1.Determinarea glucidelor reductoare cu ajutorul reaciei Fehling .............................. 27
3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool............................................................. 29
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianur de potasiu .............................. 32
LABORATOR 5-6. LIPIDE .................................................................................................... 35
5.1.Determinarea principalilor indici la grsimi ..................................................................... 35
5.1.1. Determinarea punctului de topire ............................................................................... 35
5.1.2. Determinarea indicelui de iod..................................................................................... 37
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare ....................................................................... 38
5.1.4. Determinarea indicelui de aciditate ............................................................................ 39
5.1.5. Indice de peroxid ........................................................................................................ 39
5.1.6. Reacia Kreis............................................................................................................... 41
6.1. Determinarea grsimii metoda Soxhlet principiul metodei.......................................... 42
6.2. Determinarea grsimii din produsele lactate metoda Gerber principiul metodei....... 43
LABORATOR 7-8-9. DETERMINAREA PROTEINELOR DIN PRODUSELE
ALIMENTARE ........................................................................................................................ 45
7.1. Obinerea extractelor proteice .......................................................................................... 46
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire ........................................ 46
8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen .......................... 49
8.2. Determinarea coninutului de cazein din lapte ............................................................... 51
9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului ................................................................... 52
9.2.Determinarea proteinelor metoda Kjeldhal principiul metodei.................................... 54
LABORATOR 10. ENZIME ................................................................................................... 55
10.1. Evidenierea unor enzime ............................................................................................... 56
10.1.1.Evidenierea peroxidazei din hrean ........................................................................... 56
1
Prefa
Soluii de reactivi
Concentraia este o caracteristic esenial a unei soluii i reprezint raportul dintre
cantitatea de substan dizolvat i cantitatea dizolvantului utilizat.
Exist mai multe moduri de exprimare a concentraiei unei soluii.
a. Concentraia procentual: reprezint cantitatea de substan dizolvat n 100g soluie,n
acest caz exprimarea fiind "g/g".
Dac soluia se prepar prin cntrirea solvatului i aducerea acestuia la
volum constant cu solventul, este exprimare "g/V".
Dac soluia se prepar volumetric, ambele componente ale soluiei fiind
lichide, avem exprimare "V/V".
b. Concentraia molal se refer la numrul de moli de substan dizolvat n 1000ml
solvent.
c. Concentraia molar reprezint numrul de moli de substan dizolvat n 1000ml
soluie.
d. Concentraia normal se refer la numrul de echivaleni (vali) n 1000ml soluie.
Normalitatea unei soluii se noteaz fie cu "n", fie cu "N". Soluia
care conine un val substan n 1000ml soluie, se numeste soluie 1N.
Echivalentul gram (val) reprezint cantitatea dintr-o substan n grame, egal cu
echivalentul su chimic. Echivalentul se calculeaz diferit pentru acizi, baze i sruri,
conform urmtoarelor relaii:
Pentru acizi
Se calculeaz mprind masa molecular a acidului la numrul atomilor de hidrogen ai
acidului.
Exemplu:
Pentru baze
Se calculeaz mprind masa molecular a bazei la numrul de grupri hidroxilice
Exemplu
Pentru sare
Exemplu
EMgCO3=84,3/2=42,15g
Utilizarea soluiilor normale n volumetrie prezint avantajul c soluiile de aceeai
normalitate reacioneaz ntre ele n volume egale, deoarece conin dizolvate substane n
cantiti echivalente.
Titrul (T) unei soluii reprezint cantitatea de substan exprimat n grame, care se
gsete dizolvat ntr-un ml de soluie. Soluia al crei titru se cunoate se numete soluie
titrat.
De exemplu, dac n 1000ml soluie se gsesc 40,0005g NaOH, ntr-un ml de soluie se
afl T g NaOH, adic :
T=40,0005/1000=0,040005g NaOH
Pentru obinerea unei soluii cu un anumit titru se procedeaz dup urmtoarele metode:
a). fie prin cntrirea unei anumite cantiti de substan etalon sau titrimetric.
Substanele etalon sunt acele substane din care prin simpl cntrire i dizolvare n balon
cotat, la volum cunoscut, se pot obine soluii cu concentraia cunoscut.
b). fie prin titrare cu ajutorul unei substane etalon. Se cntrete o anumit cantitate din
substana etalon (0,15-0,20g), se dizolv n ap i se titreaz cu soluia al crei titru dorim s
l determinm.
Pentru stabilirea titrului sunt necesare cel puin dou titrri n scopul verificrii
concordanei dintre rezultate.
Factorul soluiei (F) este un factor de corecie al concentraiei unei soluii, este numrul
care arat corespondena dintre un ml soluie aproximativ normal i o soluie exact normal.
De exemplu, pentru o soluie exact 0,1N de NaOH titrul teoretic este de 0.004. Pentru o
soluie aproximativ 0,1 N s presupunem c titrul real este 0.004328. Factorul acestei soluii
va fi:
F=
Aceasta nseamn c la 1ml din soluia noastr corespund 1.082ml din soluia exact 0.1N.
In general, dac se titreaz o soluie a substanei A cu greutate molecular M A, cu
reactivul B avnd normalitatea n i factorul F, folosind V ml din reactivul B, cantitatea de
substan A din proba analizat va fi:
TEST
11
- Poteniometrice
- Conductometrice
2.3.1. Metode optice
a. Metodele colorimetrice reprezint metodele de analiz care se bazeaz pe compararea
vizual a intensitii coloraiei soluiilor de concentraii diferite cu cea a unei soluii standard.
Aceste analize prezint avantajul c necesit cantiti mici de substan i un timp relativ
redus n comparaie cu analizele chimice.
b. Metoda fotocolorimetric se bazeaz pe fenomenul efectului fotoelectric (fotoefect),
adic fenomenul de desprindere a electronilor din atomii substanei sub influena fluxului
luminos.
Celulele fotoelectrice transform energia luminoas n energie electric. Fotocurentul care
ia natere este proporional cu intensitatea I a radiaiei i se msoar cu un galvanometru de
sensibilitate mare.
Inlocuirea ochiului observatorului cu celule fotoelectrice elimin erorile subiective.
c.Metoda spectrofotometric se bazeaz pe determinarea coeficientului de extinie a
soluiei la diferite lungimi de und.
Fig. Spectrofotometru
Pe baza raportului dintre lungimea de und i capacitatea de percepere a ochiului omenesc
radiaiile luminoase se mpart n trei categorii:
13
Culoarea
Violet
400-450 nm
Albastru
450-500 nm
Verde
500-570 nm
Galben
570-590 nm
Portocaliu
590-620 nm
Rou
620-760 nm
Polarimetre
Pentru o anumit lungime de und, unghiul de rotaie specific a unei substane aflate sub
form de soluie, este proporional cu grosimea stratului traversat i cu concentraia ei.
Constanta de proporionalitate specific fiecrei substane se numete unghi de rotaie
specific i se noteaz cu ()D20, unde 20 reprezint temperatura la care se face citirea, iar D,
linia sodiului (ca surs de lumin, aparatele sunt echipate cu lmpi de sodiu).
In practica, polarimetria se folosete pentru determinarea concentraiei unor glucide cu
ajutorul aparatelor numite polarimetre.
Fiecare substan optic activ are un unghi specific de rotaie, n condiii determinate de
lucru. In tabelul urmtor sunt trecute valorile unghiului de rotaie specific a unor glucide de
importan biologic.
Substana
Glucoz
Fructoz
Galactoz
Maltoz
Zaharoz
()D20
+52.74
-93.78
+80.70
+136.90
+66.50
Substana
Lactoz
Manoz
Arabinoz
Xiloz
Celobioz
15
()D20
+55.30
+14.50
+105.0
+19.00
+35.00
cromatografie pe hrtie
lichid cromatografia
Rf-ul se definete ca fiind raportul dintre distana parcurs de substana separat prin
cromatografie i distana parcurs de solvent. Deci, pentru calcularea Rf-ului se msoar
pe de o parte distana de la punctul de start pn la linia de migrare a solventului (L), iar
pe de de alt parte distana de la punctul de start pn la centrul geometric al spotului
substanei respective (l).
Rf=l / L
Valoarea Rf-ului este totdeauna subunitar i n aceleai condiii de lucru fiecare
substan are un Rf cu valoare absolut specific.
Pentru evaluarea cantitativ, fiecare spot identificat se decupeaz, elueaz i se supune
determinrii fotometrice fa de un standard de referin cu concentraie cunoscut.
In biochimie, cromatografia pe hrtie are multiple domenii de aplicare, dar se folosete n
special pentru separarea, identificarea i determinarea aminoacizilor i a substanelor
glucidice.
b. Cromatografia n strat subire este asemntoare cromatografiei pe hrtie cu deosebirea
c n locul hrtiei se folosesc plci de sticl acoperite cu un strat adsorbant, uniform distribuit,
de grosime prestabilit, din silicagel sau alt material asemntor. Prezint avantajul unei mai
bune separri a compuilor din amestec i a unei foarte bune reproductibiliti. Metoda poate
fi utilizat i n cazul unor substane developante care ar ataca hrtia cromatografic.
http://images.1233.tw/tlc-developing-tanks/
Cromatografia pe coloane
http://www.drgpdreamdot.com/chromatography/
Sephadex-ul este o substan hidrofil de tipul dextran-ului, care are proprietatea de a se
mbiba foarte repede cu ap, formnd geluri poroase. Aceste geluri sunt formate din
macromolecule filiforme, legate ntre ele ncruciat, formnd o reea tridimensional care se
comport ca o adevrat sit molecular. Efectul acestei site este acela c modeleaz viteza
de parcurgere a ei de ctre substane n funcie de masa lor molecular.
Metoda se folosete pentru separarea diferitelor fraciuni proteice, inclusiv pentru
separarea i purificarea enzimelor, acizilor nucleici, polipeptidelor, aminoacizilor, precum i
a unor polizaharide.
c.Cromatografia n faz gazoas reprezint una din cele mai perfecionate tehnici
cromatografice cunoscute pn n prezent, cu ajutorul creia se determin substanele dintr-un
amestec, n domeniu nanogramelor. Faza mobil este alctuit dintr-un gaz purttor, iar
faza staionar este format din substane specifice care sunt lichide la temperatur nalt i
care sunt fixate de un suport inert pulverulent. Complexul de substane care alctuiesc faza
staionar sunt introduse ntr-o coloan lung i ngust, din sticl, alctuind aa-numita
umplutur de coloan. Extractul din proba de cercetat purificat printr-o tehnic special se
injecteaz n partea superioar a coloanei de unde este preluat de gazul purttor i vehiculat
de-a lungul fazei staionare. In funcie de structura lor chimic componentele amestecului
18
strbat coloana cu viteze diferite, deci, se separ unele de altele. La extremitatea opus a
coloanei exist un sistem de detecie care semnalizeaz ieirea din coloan a fiecrui element.
Intensitatea semnalelor emise este proporional cu concentraia fiecrei substane, ceea ce
permite evaluarea cantitativ. Semnalele transmise de detector sunt amplificate, apoi se
nregistreaz grafic sub forma de picuri a cror nalime sau arie e proporional cu
concentraia. Identificarea i evaluarea cantitativ se fac cu ajutorul standardelor de referin
cu concentraie cunoscut.
d. Cromatografie de lichide de nalt performan - Metoda se bazeaz pe acelai
principiu ca i celelalte metode cromatografice i anume repartizarea diferit a componentelor
unui amestec de substane ntre o faz staionar i o faz mobil. Deosebirea major ntre
aceast metod i cromatografia de gaz este aceea c faza mobil este lichid i nu gazoas.
n plus, faza mobil nu are un simplu rol de cru ci particip activ la procesul de separare
datorit unor interaciuni complexe.
2.3.3. Metode electrochimice
a.Electroforeza este tehnica analitic ce are la baz capacitatea particolelor ncrcate
electric dintr-o soluie coloidal de a migra spre polul (+) sau (-) atunci cnd prin mediul
respectiv trece un curent electric. Mai exact, dac ntr-un mediu se gsesc particole ncrcate
electric, pozitiv sau negativ, i dac n mediul respectiv se creeaz un cmp electric ntre doi
electrozi sub tensiune, atunci particolele migreaz ctre electrodul de semn contrar.
Viteza de migrare e condiionat de mai muli factori, dar n primul rnd de mrimea
ncrcturii electrice a fiecrei particole. In aceleai condiii de lucru (pH, temperatur,
intensitatea cmpului electric, natura suportului) viteza de migrare a substanelor dintr-un
amestec e diferit n funcie de natura fiecrei substane.
In practica de laborator, electroforeza se utilizeaz n special pentru separarea fraciunilor
proteice din lichidele biologice sau din extractele de esuturi, ulterior fiind posibil
identificarea i evaluarea lor cantitativ.
b.Metodele poteniometrice se bazeaz pe determinarea concentraiei ionilor din soluie
msurnd valoarea sau variaia potenialului unui electrod indicator.
Aceste metode pot fi:
directe (pH-metria)
19
hrtie de pH
pH-metru
Sistemul tampon constituit dintr-un acid slab i sarea lui cu o baz tare acid acetic,
acetat de sodiu
Sistem tampon constituit dintr-o baz slab i sarea ei cu un acid tare hidroxid de
amoniu, clorur de amoniu
Sistemele tampon ndeplinesc un rol biochimic esenial n organism pentru c ele asigur
meninerea pH-ului n limite fiziologice specifice vieii.
20
TEST
21
Laborator 3 - 4.Glucide
22
23
Indicele de refracie
Indicele de refracie este o constant specific fiecrei substane. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mrimea i structura fizic a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraia unei soluii i astfel se poate stabili procentul de substan
uscat sau de ap.
Determinrile se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abb.
Indicele de refracie este puternic influentat de temperatur, deci este necesar ca determinrile
s se fac la temperatur bine reglat, constant. In acest scop, refractometrele sunt cuplate de
obicei cu baie ultratermostatat.
24
Tipuri de refractometre:
Indicele de refracie
Indicele de refracie este o constant specific fiecrei substane. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mrimea i structura fizic a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraia unei soluii i astfel se poate stabili procentul de substan
uscat sau de ap.
Determinrile se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abb.
Indicele de refracie este puternic influentat de temperatur, deci este necesar ca
determinrile s se fac la temperatur bine reglat, constant. In acest scop, refractometrele
sunt cuplate de obicei cu baie ultratermostatat.
Modul de lucru pentru refractometrul Abbe-Zeiss
1.
25
2.
Cu o pipet se pun cteva picturi din lichidul de studiat pe suprafaa prismelor, dup
care se nchide blocul prismelor.
3.
4.
Privind prin luneta din dreapta se pune la punct imaginea firelor reticulare prin nvrtirea
ocularului. Apoi se caut domeniul de separaie dintre cmpul luminos i ntunecat
nvrtind butonul din stnga. Dac n cmpul lunetei se observ o figur neregulat,
nseamn c lichidul nu a acoperit ntreaga suprafa a prismei. n acest caz se mai pun
cteva picturi de lichid, pn cnd domeniul luminos i cel ntunecat sunt separate
printr-o linie dreapt.
5.
6.
Date experimentale:
Nr
Repetitii/medie
probei.
1
R1
IR
R2
R3
M
2
R1
R2
R3
M
R1
R2
R3
M
26
Conc SU
solubila in apa
Calcule si observatii
27
28
Cupru mg
Glucoz mg
6,4
12,7
19,1
25,4
31,8
38,2
44,5
50,9
57,3
63,6
70,0
76,3
82,7
89,1
95,4
101,8
108,1
114,4
120,8
127,2
133,5
139,8
146,2
152,6
159,0
3,2
6,3
9,4
12,6
15,9
19,2
22,4
25,6
28,9
32,3
35,7
39,0
42,4
45,8
49,3
52,8
56,3
59,8
63,3
66,9
70,7
74,5
78,5
82,6
86,6
Zahr Invertit
mg
3,2
6,4
9,7
13,0
16,4
19,8
23,2
26,5
29,9
33,4
36,8
40,3
43,8
47,3
50,8
54,3
58,0
61,8
65,5
69,4
73,3
77,2
81,2
85,2
89,2
30
31
32
Determinarea: Intr-un balon cotat de 100ml se introduc 10ml lapte peste care se adaug cca.
40ml ap i se omogenizeaz. Adugm 1 ml soluie saturat de CuSO4, (0,5 ml solutie
saturata de fericianura de potasiu). Amestecul se agit de 3-4 ori i se completeaz cu apa
pna la semn, dupa care se las 5 minute n repaus. Dup un repaos de 5 minute se filtreaz
prin filtru cutat i se obine un lichid clar de culoare slab albstruie. Pentru a ndeprta
excesul de sulfat de cupru adugm 0,5-1,0g pulbere de zinc, se omogenizeaz i se filtreaz
din nou. Astfel se obine un lichid incolor i perfect limpede.
Filtratul se introduce n biuret i se procedeaz n continuare ca la stabilirea titrului
soluiei de fericianur.
Calculul rezultatelor
a. Calcul Titru
33
Interpretarea rezultatului
Continutul n lactoza al laptelui de vaca este n medie 4,55%.
Cantitatea de lactoza din lapte scade n cazul falsificrii laptelui cu apa precum si n cazul
modificarilor inflamatorii ale glandei mamare. Laptele cu aciditate de peste 21T nu se
preteaz pentru determinarea lactozei. n acest caz se vor obtine valori mai mici dect
cele pentru laptele proaspt deoarece procesele fermentative se desfoar n primul rnd
pe seama lactozei.
Test
34
tuburi capilare din sticl, uniform calibrate, bine degresate i uscate, cu diametrul interior
de 1mm i lungimea de 15 mm.
glicerin
nclzete uor pn la topire complet. In acest moment, cu ajutorul unei pense, se introduc
n creuzet dou tuburi capilare care se vor umple complet cu grsime topit.Se las apoi
creuzetul n repaos pentru rcire i nchegarea grsimii. Se scot cele dou tuburi capilare i se
cur de grsimea aderent la suprafaa lor extern. Coloana de grsime din interiorul
capilarelor trebuie s fie compact i s ocupe tot lumenul acestora. Cu ajutorul unui inel
subire de cauciuc se fixeaz cele dou capilare de o parte i alta a rezervorului cu mercur al
termometrului i termometrul astfel pregtit se introduce la congelatorul frigiderului unde se
ine 24 de ore
Paharul Berzelius umplut cu glicerin se trece pe plita electric sau pe sita de azbest i n
el se suspend termometrul cu cele dou tuburi capilare. Termometrul se fixeaz cu ajutorul
unei cleme n poziie perfect vertical, n aa fel nct s se ocupe centrul geometric al masei
de glicerin din pahar, iar tuburile capilare la rndul lor s fie n poziie perfect vertical.
36
presiunea de jos n sus a glicerinei din pahar. Aproape instantaneu pictura de grsime se
desprinde de captul tubului capilar i se ridic la suprafaa stratului de glicerin.
5.1.2. Determinarea indicelui de iod
Dublele legturi ale acizilor grai nesaturai din compoziia grsimilor confer acestora
caracter de instabilitate chimic, ce se traduce i prin capacitatea lor de a adiiona uor
halogeni la nivelul acestor duble legturi.
Indicele de iod este cantitatea de iod, n grame, adiionat de 100g grsime.Valorea
acestui indice este condiionat de natura i propria acizilor gra6si nesaturai (adic de
numrul dublelor legturi) din compoziia grsimilor. Grsimile care au un coninut mic de
acizi grai neasturai vor avea indicele de iod cu valoare mai mic (grsimile animale n
general), iar cele care au un coninut mare de acizi grai nesaturai, vor avea un indice de iod
cu valoare mare (uleiurile)
De exemplu, untul de vac are un indice de iod cuprins ntre 21 36 ; untura de porc
ntre 43 70 ; uleiul de floarea soarelui intre 119 135.
Indicele de iod constituie un criteriu pentru aprecierea puritii grsimii.
In condiii specifice de lucru, se trateaz o cantitate dat de grsime cu o soluie de iod de
concentraie cunoscut, apoi se titreaz excesul de iod cu o soluie echivalent de tiosulfat de
sodiu. Cantitatea de iod adiionat se calculeaz din diferen.
Reactivi necesari : - cloroform sau tetraclorur de carbon
- reactiv Hanus (monobromur de iod)
- iodur de potasiu, soluie 15% proaspt preparat
- tiosulfat de sodiu, soluie 0,1N
- amidon, soluie 1%, proaspt preparat
Mod de lucru: Cantitatea de grsime care se ia n lucru, se va corela cu indicele de iod
probabil al acesteia dup cum urmeaz:
-
grsimea n prealabil topit. Se adaug apoi 10ml cloroform, 25ml reactiv Hanus i se las la
ntuneric 30-60 minute, funcie de valoarea indicelui de iod. Se adaug apoi 20ml iodur de
37
potasiu, i 100ml ap distilat, apoi se titreaz repede cu tiosulfat de sodiu. Spre sfritul
titrrii, cnd culoarea soluiei se deschide la galben, se adaug 3-5 picturi soluie de amidon;
soluia se coloreaz n albastru. Se continu titrarea agitnd mereu, foarte energic, pn la
dispariia culorii albastre.
In aceleai condiii se face si o prob martor, dar fr grsime.
Calculul rezultatelor :
Indicele de iod = 0,01269 (V V1) 100 / m n care:
0,01269 = cantitatea de iod, n g, corespunztoare la 1ml tiosulfat de sodiu soluie 0,1N
V = volumul soluiei de tiosulfat de sodiu, n ml, folosit la titrarea martor
V1 = volumul soluiei de tiosulfat de sodiu, n ml, folosit la titrarea probei ce se analizeaz.
m = cantitatea de grsime, n g, luat n lucru.
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare
Indicele de saponificare exprim numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar
pentru a saponifica total un gram de grsime.
Cu ct este mai mare masa molecular a gliceridei, respectiv a acizilor grai, cu att
cantitatea de hidroxid de potasiu necesar saponificrii este mai mic.Valoarea indicelui de
saponificare d indicaii asupra constituiei chimice a grsimii cercetate.
Reactivi necesari: - soluie alcoolic de hidroxid de potasiu aproximativ 0,5N- se prepar
dizolvnd 32g hidroxid de potasiu n puin ap i completnd la
1000ml cu alcool de 95C
- fenolftalein 1% n alcool 95C
- acid clorhidric 0,5N
Mod de lucru: Intr-un balon de 150-200ml se cntresc 1-2g grsime la care se adaug apoi
25ml hidroxid de potasiu alcoolic.
Balonul se astup cu un dop, prin care trece un refrigerent ascendent rcit cu ap, apoi se
nclzete pe o baie de ap fierbinte 30-40 minute. Dup acest timp soluia din flacon se
titreaz cu HCl 0,5N. Dac soluia este puternic colorat, se dilueaz cu alcool pentru ca s se
poat observa ct mai bine culoarea roie a fenolftaleinei.
Intr-un balon se face o titrare martor cu 25ml de hidroxid de potasiu alcoolic.
Diferena dintre numrul de ml folosii la titrarea soluiei martor N1 i a celor folosii la
titrarea soluiei cu grsime N2, d numrul de ml de hidroxid de potasiu ntrebuinai la
saponificarea grsimii luat n lucru.
38
Din acetia se calculeaz apoi numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru
saponificarea unui gram de grsime i care reprezint indicele de saponificare.
Indicele de saponificare = (N1 N2) FHCl 28 / G
n care:
n care :
40
41
Extractoare Soxhlet
42
Butirometre
Centrifug Gerber
43
Test
44
Protidele sunt substane chimice eseniale ale materie vii. Ele sunt formate n special din
aminoacizi. Sunt substane complexe care conin C, H, O, N i uneori sulf, fosfor, fier sau
cupru.
Rolul fundamental este cel plastic i funcional i mai puin energetic. Ele sunt
considerate cele mai importante substane prezente n regnul animal i vegetal.
Aminoacizii sunt acizi carboxilici n care un atom de hidrogen a fost nlocuit cu o
grupare amino, -NH2; ei rezult prin hidroliza acid, bazic sau enzimatic a proteinelor.
Din punct de vedre al comportrii fa de diferii solveni protidele se clasific n
proteine simple i proteine conjugate. Prin hidroliz proteinele simple elibereaz numai
aminoacizi, iar proteinele conjugate elibereaz pe lng aminoacizi i o component
neproteic numit grupare prostetic.
In constituia corpului omenesc se gsesc cteva mii de proteine diferite, cu structuri
speciale care corespund anumitor funcii specifice.
Analiza calitativ i cantitativ a aminoacizilor se bazeaz pe reaciile specifice date
de gruparea amino, carboxil, de radicalul moleculei fiecrui aminoacid, de legturile
peptidice, pe valoarea punctului izoelectric i pe masa molecular.
Reaciile chimice prin care pot fi identificate protidele se mpart n:
-
Reacii de precipitare
45
Rf
0.38
0.20
0.07
0.08
0.30
0.26
0.20
0.72
0.73
0.14
0.55
0.15
0.68
0.43
0.27
0.35
0.50
0.45
0.60
Culoarea ninhidrin
Violet
Violet
Brun
Brun
Violet
Violet
Violet-brun
Violet
Violet
Violet
Violet
Violet
Violet
Galben
Violet
Violet
Violet-brun
Albastr
Violet
47
http://www.reachdevices.com/TLC_aminoacids.html
http://www.youtube.com/watch?v=tDaKxskUwA0
48
Mod de lucru:
Prepararea probei martor
ntr-un vas Erlenmeyer de 100ml se introduc 25ml lapte, 1ml soluie de oxalat de potasiu i
0,5ml soluie de sulfat de cobalt, dup care se omogenizeaz. Se dezvolt imediat o culoare
roz care este stabil. Fenolftaleina s-a adugat la neutralizarea celor dou soluii.
Determinarea titrului proteic: Intr-un vas Erlenmeyer asemntor cu al probei martor se
introduc 25ml lapte, 1ml soluie de oxalat de potasiu i eventual 2-3 picturi de fenolftalein.
Se omogenizeaz bine i dup 1 minut se neutralizeaz cu hidroxid de sodiu pn la o
coloraie identic cu a probei martor. Prin aceast operaie s-au neutralizat toi acizii liberi din
prob. Pentru ca determinarea s fie precis este necesar ca la aceast neutralizare s nu se
ntrebuineze un volum de hidroxid de sodiu 0,143N, mai mare de 1,75 ml. Laptele cu
aciditate proprie mai mare nu este apt pentru determinarea proteinelor prin aceast metod.
In proba astfel neutralizat se adaug 5ml aldehid formic i se omogenizeaz. Culoarea
roz dispare brusc i laptele i reia culoarea alb specific. Dup 1 minut se titreaz din nou
cu soluia de hidroxid de sodiu pn la culoare identic cu a probei martor, notndu-se
volumul de hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare.
In condiiile n care s-a respectat ntocmai metoda de lucru descris, volumul soluiei de
hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare reprezint coninutul de proteine, n procente al
probei de lapte supus analizei.
Rezultatul se exprim ca media aritmetic a dou determinri efectuate n aceleai condiii.
Metoda are caracter orientativ.
Titrul proteic =V ,
unde V este volumul de solutie NaOH 0,143N (n ml) folosit la a doua titrare.
Rezultatul se exprima prin media a doua determinari efectuate pe aceeasi proba.
Calcul si observatii:
50
51
ml solutie
standard
0
0,1
0,5
1,0
1,5
2,0
ml apa
distilat
2,0
1,9
1,5
1,0
0,5
0
Protein
mg/2ml
0
,5
2,5
5
7,5
10
Absorbanta
DO
52
Calcule i observaii
53
TEST
54
Activitatea enzimatic este frecvent exprimat n uniti (U), astfel c o unitate reprezint
cantitatea de enzim ce catalizez transformarea a 1 micromol de substrat ntr-un minut, n
condiii definite. Unitatea internaional sistematic a activitii enzimatice este katal-ul (kat)
care reprezint transformarea unui mol de substrat pe secund .
Puritatea unei enzime se exprim prin activitatea specific, care este numrul de uniti
enzimatice (U) pe mg protein sau numrul de catali pe kg protein.
57
Balon 1
5 ml
2 ml
-
H2SO4 15%
KI 10%
Molibdat de amoniu 1%
Balon 2
5 ml
2 ml
Balon 3
5 ml
2 ml
-
Balon 4
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
Se las n repaos 15 minute
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
2-3 picturi.
Agitare energic 2-3 minute
58
TEST
59
61
Identificarea vitaminei E
a. Reacia cu acidul azotic
- tocoferolul se oxideaz n prezena clorurii ferice sau a acidului azotic la tocoferilchinon, de culoare roie
Reactivi necesari : - soluie uleioas de vitamina E
- etanol
- acid azotic concentrat
Mod de lucru : Se iau ntr-o eprubet cteva picturi dintr-o soluie uleioas de vitamina E,
se trateaz cu cteva picturi de acid azotic concentrat. Coninutul se nclzete de la sine i
apare o coloraie brun roie (se lucreaz cu atenie i la nevoie se rcete).
c.Reacia cu clorura feric
Datorit gruprii hidroxil tocoferolii dau reacie pozitiv cu clorura feric. Reacia este
specific fenolilor, care sunt oxidai la compui chinonici.
Reactivi necesari : - soluie alcoolic de vitamin E 0,1mg %
- soluie clorur feric 10%
Mod de lucru : Intr-o eprubet se introduc 0,5ml solutie alcoolic de vitamin E i 2-3
picturi soluie clorur feric 10%. Dup agitare apare o coloratie galben-roiatic
Identificarea vitaminelor B
a.Vitamina B1: In mediu alcalin este oxidat de fericianura de potasiu la tiocrom de culoare
roie, care prezint o fluorescen albastr n UV.
Reactivi necesari : - soluie vitamina B1 1g
- solutie de fericianur de potasiu 2%
- metanol
- NaOH 30%
- izobutanol
- etanol 96
Mod de lucru: Intr-o plnie de separare se pipeteaz 1ml din soluia de vitamin, 4 picturi
metanol i 1-2 picturi de fericianur de potasiu 2%. Se agit i se adaug 1ml sol. NaOH
30%. Se las n repaus 2 minute i se introduc 10ml izobutanol, dup care se agit energic. Se
las n repaus cteva minute, dup care timp se separ cele dou straturi. Stratul inferior apos
se ndeprteaz i se reine stratul cu izobutanol care conine tiocromul. Se spal cu 3ml ap
distilat. Se separ apa, iar stratul de izobutanol se tranvazeaz ntr-o eprubet i se adaug
62
2ml etanol. Eprubeta se aeaz n faa unei surse de lumin UV, cnd se observ apariia unei
fluorescente albastre.
b. Vitamina B2: prezint fluorescen galben-verzuie i sub aciunea reductorilor trece n
leucoderivat, care nu mai prezint fluorescen. Reacia este reversibil i i recapt
fluorescenta n prezena oxigenului.
Reactivi necesari : - soluie vitamina B2 50mg %
- zinc metalic granule
- soluie acid clorhidric 10%
Mod de lucru: Intr-o eprubet se msoar 1ml soluie vitamin B2, care prezint o
fluorescen galben-verzuie. Se adaug 20-30 mg zinc metalic i 2ml acid clorhidric 10%. Se
agit de cteva ori i se observ dispariia fluorescenei. Se astup eprubeta cu degetul i se
agit. Se observ apariia fluorescenei, datorit oxidrii vitaminei sub aciunea oxigenului
atmosferic.
Identificarea Vitaminei C
a. Vitamina C datorit proprietii de a se oxida uor, reduce srurile de argint la argint
metalic.
Reactivi necesari : - soluie vitamin C 3g%
- soluie azotat de argint 5g%
- soluie hidroxid de amoniu 20%
Mod de lucru: Intr-o eprubet se msoar 1ml azotat de argint i se adaug hidroxid de
amoniu pictur cu pictur pn la dizolvarea precipitatului format iniial. Se adaug 2ml
soluie de vitamin C i se nclzete pe baie de ap 5-10 minute. Va aprea argintul metalic
depus pe pereii eprubetei.
b. Vitamina C se extrage din esuturi cu soluii slab acide pentru a fi evitat alterarea ei, apoi
se identific cu ajutorul fericianurii de potasiu. In prezena clorurii ferice, vitamina C, reduce
fericianura de potasiu, formnd albastrul de Berlin.
Reactivi necesari : - soluie de HCl 2%
- fericianur de potasiu 1%
- clorur feric soluie 1%
Mod de lucru: Se cntresc 4-5g din materialul vegetal i se introduc ntr-un mojar unde se
mojareaz cu nisip i HCl 2%. Se aduce apoi volumul la 100ml cu acid clorhidric i se
filtreaz. Din acest lichid se introduc 5ml ntr-o eprubet i se trateaz cu o pictur de sol.
fericianur de potasiu i o pictur de sol. de clorur feric. Rezult o coloraie albastr.
63
Calcul si observatii
65
67
TEST
1. Ce este acidul ascorbic, ce rol are n organism ? Dati exemple de surse naturale de acid
ascorbic.
2. Mentionai pentru fiecare vitamin din grupul B, numele i rolul n organism
3. Ce rol are vitamina A n organism, i care sunt produsele alimentare bogate n vitamina
A? Ce sunt provitaminele A?
4. Indicai o metod de identificare a vitaminei A care poate fi utilizat si pentru
determinarea cantitativ a vitaminei A.
5. Care sunt factorii care influeneaz stabilitatea vitaminelor ? Dai exemplu pentru
vitamina A, B1 i C.
68
Laborator 13.Pigmeni
Culoarea diferitelor organe ale plantelor se datoreaz unor substane colorate, numite
pigmeni.
Pigmenii naturali au rol biochimic i fiziologic foarte important. Iau parte la
numeroase procese metabolice, formeaz sisteme de oxidoreducere, dau gustul, aroma i
coloritul unor produse alimentare. Pigmenii clorofilieni au rol esenial n procesul de
fotosintez
Sub aspect chimic, pigmenii naturali sunt substane foarte heterogene. Ei se gsesc
n celule i esuturi n stare liber sau sub form de cromoproteide, glicozide etc.In general se
gsesc n cantiti mici i se determin prin metode cromatografice, colorimetrice i
spectrofotometrice.
13.1.Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subire
Amestecul de pigmeni este extras cu un solvent potrivit si se separ prin
cromatografie in strat subtire pe placi acoperitecu silicagel-material adsorbant, fiecare
pigment situndu-se ntr-o anumit zon, de-a lungul plcii.
Reactivi necesari :
- aceton
- hexan
- sulfat de sodiu anhidru
- mojar cu pistil
- nisip sau sticl pisat
- tuburi capilare
- hrtie de filtru
Obinerea extractului: pentru prepararea extractului de pigmeni se mojareaz 2g frunze de
spanac cu puin nisip i 3 ml aceton.Se decanteaz soluia si se trece pe o plnie cu vat, se
stoarce vata pentru a recupera extractul. Poriunile de extract se reunesc ntr-un tub cu capac.
Reziduul din mojar se reia cu 3 ml de aceton, se repet operaia anterioar. La final se
adaug 3ml de aceton i 5ml de hexan n mojar i se mojareaz pn reziduul se decoloreaz.
Soluia obinut se trece intr-o eprubeta cu dop.
Se adaug 3 ml de saramur se agita si se las s se separe. Startul de sus va fi verde inchis
iar cel de jos verde deschis.
Extractul splat se usuc adugnd sulfat de sodiu anhidru pn la limpezirea soluiei.
69
caroten
diceto-carotenoide
cetohidroxi-carotenoide
hidroxi-carotenoide
Spoturile obinute se pot determina i cantitativ folosind metode colorimetrice.
http://www.uniregensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC-e.htm
Calcule i observaii laborator 13.1.
70
71
TEST
72
73
BIBLIOGRAFIE
1. Dumitru IF., - Biochimie - Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti 1980.
2. Dumitru IF., D.Iordchescu Introducere n enzimologie- Ed. Medical, Bucureti ,
1981.
3. Iordchescu D., I.F.Dumitru-Biochimie practic Tipografia Universiti, Bucureti,
1980.
4. Neamu G.,- Biochimie alimentar- Ed.Ceres, Bucureti, 1997
5. Neamu G.,- Lucrri Practice de biochimie alimentar- Tipo Agronomia, Cluj-Napoca,
1997
6. Popescu N., Meica S., - Noiuni i elemente practice de chimie analitic sanitar
veterinar, Ed.Diacon Coresi, Bucureti, 1993.
7. Purcrea C.,- Biochimie alimentar practic, Ed.Univ.Oradea,2003.
8. Purcrea C., Biochimie agroalimentar. Edit.Univ. Oradea, 2005.
9. Socaciu C.,- Chimie alimentelor- Ed.Academic.Press, Cluj-Napoca, 2003.
10. Socaciu C., O.Bobi - Caiet de lucrri practice, Chimia alimentelor, Ed. Academic
Press, Cluj-Napoca, 2003.
74
75