Sunteți pe pagina 1din 77

PURCREA CORNELIA

INDRUMTOR DE LABORATOR

BIOCHIMIE

pentru studenii de la specializrile:


CONTROLUL SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE
TEHNOLOGIA PRELUCRARII PRODUSELOR AGRICOLE

EDITURA UNIVERSITII ORADEA


2015

Referenti stiintifici:
Conf. univ. Dr. Vica Simona
Conf. univ. Dr. Alina Caraban

Tehnoredactare: Cornelia Purcrea

EDITURA UNIVERSITATII ORADEA


ISBN:978-606-10-1467-5 CD

CUPRINS
LABORATOR 1. Msuri de protecia muncii n laboratoarele de biochimie .......................... 4
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse alimentare ........................... 6
Soluii de reactivi ...................................................................................................................... 7
LABORATOR 2. METODE DE ANALIZ FOLOSITE N BIOCHIMIE ........................... 12
LABORATOR 3 - 4.GLUCIDE............................................................................................... 22
Extragerea glucidelor din produsele alimentare ...................................................................... 23
3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul ............................................ 24
3.2.Determinri cantitative ale glucidelor ............................................................................... 27
3.2.1.Determinarea glucidelor reductoare cu ajutorul reaciei Fehling .............................. 27
3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool............................................................. 29
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianur de potasiu .............................. 32
LABORATOR 5-6. LIPIDE .................................................................................................... 35
5.1.Determinarea principalilor indici la grsimi ..................................................................... 35
5.1.1. Determinarea punctului de topire ............................................................................... 35
5.1.2. Determinarea indicelui de iod..................................................................................... 37
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare ....................................................................... 38
5.1.4. Determinarea indicelui de aciditate ............................................................................ 39
5.1.5. Indice de peroxid ........................................................................................................ 39
5.1.6. Reacia Kreis............................................................................................................... 41
6.1. Determinarea grsimii metoda Soxhlet principiul metodei.......................................... 42
6.2. Determinarea grsimii din produsele lactate metoda Gerber principiul metodei....... 43
LABORATOR 7-8-9. DETERMINAREA PROTEINELOR DIN PRODUSELE
ALIMENTARE ........................................................................................................................ 45
7.1. Obinerea extractelor proteice .......................................................................................... 46
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire ........................................ 46
8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen .......................... 49
8.2. Determinarea coninutului de cazein din lapte ............................................................... 51
9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului ................................................................... 52
9.2.Determinarea proteinelor metoda Kjeldhal principiul metodei.................................... 54
LABORATOR 10. ENZIME ................................................................................................... 55
10.1. Evidenierea unor enzime ............................................................................................... 56
10.1.1.Evidenierea peroxidazei din hrean ........................................................................... 56
1

10.1.2. Evidenierea activitii peroxidazei din lapte ........................................................... 56


10.2. Influena factorilor fizico-chimici asupra activitii enzimelor...................................... 57
10.2.1.Influena temperaturii asupra activitii enzimelor................................................... 57
10.2.2. Influena pH-ului asupra activitii enzimatice. ....................................................... 58
LABORATOR 11-12. VITAMINE ......................................................................................... 60
11.1. Metode de identificare ale vitaminelor........................................................................... 60
11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale ........................................................................... 64
11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans ......................................................... 66
LABORATOR 13.PIGMENI ................................................................................................ 69
13.1.Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subire ............................... 69
13.2. Determinarea spectrofotometric a coninutului de clorofil ......................................... 71
LABORATOR 14. EVALUARE LABORATOR. .................................................................. 73
BIBLIOGRAFIE ...................................................................................................................... 74

Prefa

Alimentele sunt produse naturale, cu o compoziie complex, de origine vegetal sau


animal. Ele constituie suportul material al vieii, al sntii omului, asigurnd energia i
substanele de baz necesare desfurrii proceselor metabolice.
Substanele componente ale alimentelor se numesc nutrieni. Nutrienii sunt compui
organici sau anorganici, care pot avea rol structural, energetic i funcional ca de exemplu :
glucide, lipide, protide, enzime, vitamine, elemente minerale i produi secundari de
metabolism.
Prezenta lucrare este astfel realizat, nct s poat fi utilizat cu succes de studenii
de la seciile Tehnologia Prelucrrii Produselor Alimentare, Controlul i Expertiza Produselor
Alimentare dar i de cei de la Facultile de Agricultur, Zootehnie i Biotehnologii, care
studiaz biochimia.
Indrumtorul ncepe cu protecia muncii, continu cu o prezentare general a
laboratorului de biochimie, a soluiilor de reactivi folosii i a metodelor de analiz utilizate n
mod curent n biochimia analitic calitativ i cantitativ.
Urmtoarele lucrri cuprind numeroase experiene privind identificarea i dozarea
constituenilor principali ai materiei vii (glucide, lipide, protide), a substanelor cu rol
funcional (enzime, vitamine), a produselor de origine secundar (pigmeni).
La sfritul fiecrui capitol, am ntocmit cte un test de verificare, care vine n
sprijinul studenilor, pentru a adnci cunotinele dobndite la orele de laborator i pe cele
predate la orele de curs.

LABORATOR 1. Msuri de protecia muncii n laboratoarele de biochimie

Laboratoarele de biochimie alimenter sunt destinate activitilor didactice, tiinifice


respectiv aplicative (agricole, alimentare. etc). In astfel de laboratoare se poate executa o
mare diversitate de lucrri necesitnd substane, sticlrie, ustensile, aparatur i instalaii
adaptate scopurilor propuse.
Accidentele de orice natur pot fi evitate dac se respect cu strictee condiiile de
lucru prescrise la executarea diferitelor lucrri. In acest scop exista prescripii generale, cu
caracter normativ, referitoare la protecia i securitatea muncii (P.S.M.) care trebuie s fie
bine cunoscute de ctre pesoanele care desfoar activiti n laboratoare de profil. Intregul
personal i studenii care lucreaz n laborator trebuie s cunoasc i s respecte regulile de
protecia muncii i asigurarea securitii pentru prevenirea accidentelor de munc.
Intregul personal i studenii care lucreaz n laborator trebuie s cunoasc i s respecte
regulile de protecia muncii i asigurarea securitii pentru prevenirea accidentelor de munc.
1. Personalul din laborator este obligat s poarte halat.
2. Pentru a evita inhalarea diferitelor substane din praful care se ridic odat cu mturarea
poelelor, acestea nu se mtur, ci se spal cu ap sodat, detergeni sau soluii antiseptice.
3. Aparatele electrice trebuie s aibe prizele mpmntate i izolarea electric s fie perfect.
4. Fiecare laborator trebuie s fie dotat cu extinctor.
5. Incperea unde se prepar acizii minerali, apa de brom, unde se lucreaz cu solveni
organici trebuie s fie prevazut cu ni, exhaustor i ventilaie electric.
6. Solvenii i acizii se depoziteaz n subsolul cldirii, unde trebuie s existe ci de acces ct
mai largi.
7. In chiuvete nu se vor arunca precipitate sau reactivi tari care atac conducta, dac totui se
ntmpl, se las s curg o cantitate mare de ap pentru a evita deteriorarea chiuvetei.
8. La destuparea sticlelor trebuie s se acorde o atenie deosebit manipulrii dopurilor.
Acestea se aaz cu partea plat pe mas i partea cilindric n sus.
4

9. Pentru a evita impurificarea reactivilor surplusul de reactivi ce rmne n vase nu se toarn


din nou n sticl.
10. Evaporarea solvenilor inflamabili se va face numai pe bi de nisip sau bi de ap
electrice, sub nie cu tiraj convenabil.
11. Sticlele cu reactivi se eticheteaz clar i durabil, iar turnarea reactivilor din sticle nu se
face n dreptul etichetelor, pentru a evita distrugerea lor.
12. Dup terminarea lucrrilor se verific dac aparatura electric a fost scoas din prize i
dac robinetele au fost nchise.
13. In laborator se pstreaz curenie perfect. Pe masa de lucru se vor afla numai vasele i
reactivii cu care se lucreaz.
14. Este interzis gustarea soluiilor i substanelor de laborator.
15. Mirosirea substanelor gazoase se face cu pruden printr-o micare de vnturare deasupra
vasului spre nas.
16. Eprubetele n care se fac experienele nu trebuie ndreptate nici spre cel care face
experimentul, nici spre vecin.
17. Substanele volatile, foarte inflamabile se vor feri de cldura mare i de lumina solar. Cu
ele se lucreaz numai n camere bine aerisite i la o deprtare de 5 metri de orice surs de
flacr.
18. Subsantele sensibile la lumin sunt pstrate n sticle colorate.
19. Msurarea soluiilor toxice nu se face prin pipetare, ci numai cu ajutorul biuretelor sau
pipetelor automate.
20. Substanele periculoase ca: fosforul, metalele alcaline, benzina, sulfura de carbon,
carbidul, acetona, iodul, etc. nu se arunc n chiuvet, ci se adun n borcane sau se
transform n substane inofensive. Fosforul alb se pstreaz sub ap, iar metalele alcaline sub
petrol.
21. La diluarea acizilor se va turna acidul n ap i nu invers, lsnd s se preling foarte ncet
acidul pe pereii vasului.
22. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon i azot lichid se depoziteaz n afara laboratoarelor.
23. Cromatografia i electroforeza se efectueaz n ncperi izolate de restul laboratorului i
prevzute cu ventilaie.
24. Substanele toxice se in sub cheie.
25. Fiecare laborator trebuie s fie dotat cu trus de prim ajutor.

Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse


alimentare
Analiza biochimic trebuie efectuat imediat ce mostrele recoltate sunt aduse la laborator
pentru c acestea se depreciaz foarte repede fie datorit activitii microorganismelor ce se
gsesc n sau pe produse, fie activitii enzimelor tisulare, ambii factori fiind favorizai de
temperatura camerei, de prezena oxigenului din aer i de lumin.
Laboratorul trebuie astfel dimensionat nct s se poat efectua cu promptitudine analizele
solicitate pentru a putea stabili operativ starea produsului.
Orice laborator de control biochimic al alimentelor trebuie s se compun din urmtoarele
ncperi:
1. Sala de primire a probelor;
2. Sala de pregatire a materialului.
3. Laboratorul de lucru propriu-zis prevzut cu mese faianate sau acoperite cu
materiale termorezistente i rezistente la acizi i baze, chiuvete, etajere metalice
pentru reactivi uzuali, becuri de gaz i prize;

4. Camera frigiderelor pentru pstrarea probelor si contraprobelor


5. Camera de balane si aparatura performanta- amplasat n acea parte a cldirii n
care trepidaiile sunt minime.Balana trebuie s fie instalat pe o consol fixat n
perete sau mese fixe;
6. Depozit de reactivi, cu minimul de reactivi pe timp de un an. Aici e interzis instalarea
de prize, surse de ap si gaz. Reactivii toxici vor fi amplasai ntr-un dulap metalic cu
cheie, iar cheile vor fi psrate de ctre eful de laborator;
7.Sala pentru splarea sticlriei.

Soluii de reactivi
Concentraia este o caracteristic esenial a unei soluii i reprezint raportul dintre
cantitatea de substan dizolvat i cantitatea dizolvantului utilizat.
Exist mai multe moduri de exprimare a concentraiei unei soluii.
a. Concentraia procentual: reprezint cantitatea de substan dizolvat n 100g soluie,n
acest caz exprimarea fiind "g/g".
Dac soluia se prepar prin cntrirea solvatului i aducerea acestuia la
volum constant cu solventul, este exprimare "g/V".
Dac soluia se prepar volumetric, ambele componente ale soluiei fiind
lichide, avem exprimare "V/V".
b. Concentraia molal se refer la numrul de moli de substan dizolvat n 1000ml
solvent.
c. Concentraia molar reprezint numrul de moli de substan dizolvat n 1000ml
soluie.
d. Concentraia normal se refer la numrul de echivaleni (vali) n 1000ml soluie.
Normalitatea unei soluii se noteaz fie cu "n", fie cu "N". Soluia
care conine un val substan n 1000ml soluie, se numeste soluie 1N.
Echivalentul gram (val) reprezint cantitatea dintr-o substan n grame, egal cu
echivalentul su chimic. Echivalentul se calculeaz diferit pentru acizi, baze i sruri,
conform urmtoarelor relaii:

Pentru acizi
Se calculeaz mprind masa molecular a acidului la numrul atomilor de hidrogen ai

acidului.

Exemplu:

Pentru baze
Se calculeaz mprind masa molecular a bazei la numrul de grupri hidroxilice

Exemplu

Pentru sare

Se calculeaz mprind masa molecular a srii la numrul atomilor de metal nlocuii de


hidrogen :

Exemplu
EMgCO3=84,3/2=42,15g
Utilizarea soluiilor normale n volumetrie prezint avantajul c soluiile de aceeai
normalitate reacioneaz ntre ele n volume egale, deoarece conin dizolvate substane n
cantiti echivalente.
Titrul (T) unei soluii reprezint cantitatea de substan exprimat n grame, care se
gsete dizolvat ntr-un ml de soluie. Soluia al crei titru se cunoate se numete soluie
titrat.
De exemplu, dac n 1000ml soluie se gsesc 40,0005g NaOH, ntr-un ml de soluie se
afl T g NaOH, adic :
T=40,0005/1000=0,040005g NaOH
Pentru obinerea unei soluii cu un anumit titru se procedeaz dup urmtoarele metode:
a). fie prin cntrirea unei anumite cantiti de substan etalon sau titrimetric.
Substanele etalon sunt acele substane din care prin simpl cntrire i dizolvare n balon
cotat, la volum cunoscut, se pot obine soluii cu concentraia cunoscut.
b). fie prin titrare cu ajutorul unei substane etalon. Se cntrete o anumit cantitate din
substana etalon (0,15-0,20g), se dizolv n ap i se titreaz cu soluia al crei titru dorim s
l determinm.
Pentru stabilirea titrului sunt necesare cel puin dou titrri n scopul verificrii
concordanei dintre rezultate.
Factorul soluiei (F) este un factor de corecie al concentraiei unei soluii, este numrul
care arat corespondena dintre un ml soluie aproximativ normal i o soluie exact normal.

De exemplu, pentru o soluie exact 0,1N de NaOH titrul teoretic este de 0.004. Pentru o
soluie aproximativ 0,1 N s presupunem c titrul real este 0.004328. Factorul acestei soluii
va fi:
F=

== 0,004328/ 0,004 =1,0820

Aceasta nseamn c la 1ml din soluia noastr corespund 1.082ml din soluia exact 0.1N.
In general, dac se titreaz o soluie a substanei A cu greutate molecular M A, cu
reactivul B avnd normalitatea n i factorul F, folosind V ml din reactivul B, cantitatea de
substan A din proba analizat va fi:

TEST

1. Laboratoarele de chimie trebuie s fie dotate obligatoriu cu:


a.Nis
b.Ventilatie
c.Extinctor
d.Aer conditionat
e. Trus de prim ajutor
2. Solventii organici se evapor pe:
a. flacr
b. plit electric
c. baie de ap
d. baie de nisip
3. Cu solventii organici se lucreaz la o distant de minim. de orice surs de
flacr
a. 1m
b. 3m
c. 5m
d. 10m
9

4. Balanta analitic se instaleaz in:


a. camera de primire probe
b. camera frigorific
c. laboratorul propriu-zis
d. camer special in care trepidatiile sunt minime
5. Solutiile de reactivi se prepar in:
a. cilindru gradat
b. pahar Berzelius cotat
c. balon cotat
6. Concentratia normal reprezint:
a. numr de moli de substant in 1000 ml solutie
b. cantitatea de substant dizolvat in 100 g de solutie
c. numr de echivalenti dizolvati in 1000 ml de solutie
7. Ct hidroxid de sodiu trebuie cntrit pentru a obtine 250 ml solutie 10% NaOH?
a.5 g
b. 30g
c. 25g
d. 60g
8. Pentru a prepara 500 ml solutie NaOH 0,3N avem nevoie de:
a. 120 gNaOH
b. 6 g NaOH
c. 40g NaOH
d. 12 g NaOH
9. Pentru a prepara 300 ml NaCl 2M trebuie s cntrim:
a. 58,5g NaCl
b. 117 g NaCl
c. 11,7 g NaCl
d. 35,1 g NaCl
10. Cti ml de HCl sunt necesari pentru a prepara 250 ml HCl de concentratie 1M,
folosind HCl 36% cu densitatea 1,183g/cm3?
a. 18,56 ml
b. 21,43 ml
c. 56,71 ml
d. 33,11 ml
10

11

LABORATOR 2. Metode de analiz folosite n biochimie

Dup caracteristicile lor, metodele de analiz pot fi:

calitative, atunci cnd se execut numai identificri de substan sau se evideniaz


nsuiri fizico-chimice ale acestora i

cantitative, atunci cnd se execut determinri evaluate prin msurare i exprimate n


uniti de masur.

Metodele cantitative se mpart n trei mari grupe: metode gravimetrice, volumetrice si


fizico-chimice.
2.1. Metodele gravimetrice al cror principiu se bazeaz pe cntriri analitice.
2.2. Metodele volumetrice se bazeaz pe msurri de volume, de exemplu reaciile de
titrare.
2.3. Metodele fizico-chimice la care determinrile se bazeaz pe evidenierea unor
nsusiri fizico-chimice specifice substanei care se analizeaz, care permit evaluarea
cantitativ. Aceste metode se mpart n:
2.3.1. Metode optice:
- Colorimetrice
- Fotometrice
- Spectrofotometrice
- Flamfotometrice
- Refractometrice
- Polarografice
2.3.2. Metode de separare metode cromtografice
2.3.3. Metode electrochimice
- Electroforetice
12

- Poteniometrice
- Conductometrice
2.3.1. Metode optice
a. Metodele colorimetrice reprezint metodele de analiz care se bazeaz pe compararea
vizual a intensitii coloraiei soluiilor de concentraii diferite cu cea a unei soluii standard.
Aceste analize prezint avantajul c necesit cantiti mici de substan i un timp relativ
redus n comparaie cu analizele chimice.
b. Metoda fotocolorimetric se bazeaz pe fenomenul efectului fotoelectric (fotoefect),
adic fenomenul de desprindere a electronilor din atomii substanei sub influena fluxului
luminos.
Celulele fotoelectrice transform energia luminoas n energie electric. Fotocurentul care
ia natere este proporional cu intensitatea I a radiaiei i se msoar cu un galvanometru de
sensibilitate mare.
Inlocuirea ochiului observatorului cu celule fotoelectrice elimin erorile subiective.
c.Metoda spectrofotometric se bazeaz pe determinarea coeficientului de extinie a
soluiei la diferite lungimi de und.

Fig. Spectrofotometru
Pe baza raportului dintre lungimea de und i capacitatea de percepere a ochiului omenesc
radiaiile luminoase se mpart n trei categorii:

radiaii vizibile, a cror lungime de und se situeaz n domeniul 400-760nm;

radiaii ultraviolete, cu lungimea de und mai mic de 400nm;

radiaii infraroii, cu lungimea de und mai mare de 760nm.


Lungimile de und corespunztoare spectrului vizibil sunt redate n urmtorul tabel.

13

Culoarea

Domeniul lungimilor de und

Violet

400-450 nm

Albastru

450-500 nm

Verde

500-570 nm

Galben

570-590 nm

Portocaliu

590-620 nm

Rou

620-760 nm

d.Metoda flamfotometric (fotometria cu flacr) este una din metodele de analiz


cantitativ de interes deosebit pentru laboratoarele de biochimie. Este o metod de analiz
rapid, precis i necesit o aparatur relativ simpl. Are o aplicabilitate practic limitat
ndeosebi la metalele alcaline i alcalino-pmntoase.

Fig. Flamfotometru principiu de functionare si aparat


http://www.multilab.ro/spectrometre/flamfotometru_fotometru_flacara.html
Fotometria cu flacr se bazeaz pe nregistrarea spectrelor de emisie ale diferitelor
elementelor excitate n flacr cu ajutorul unei celule fotoelectrice. Fiecare element are o
radiaie specific numit band spectral de emisie. Majoritatea atomilor posed o band de
emisie principal i mai multe benzi secundare. Benzile individuale ale diferitelor elemente se
pot suprapune cum este cazul sodiului i calciului, la aproximativ 590nm.
14

e.Refractometria se bazeaz pe fenomenele de refracie sau de reflecie total a unui fascicol


de radiaii luminoase la limita de separaie dintre dou medii cu indici de refracie diferii.
f.Polarimetria constituie o metod analitic cu ajutorul creia se masoar deviaia luminii
polarizate produse de substanele optic active i pe aceast baz se determin concentraia lor.
Lumina polarizat se obine trecnd lumina natural prin prisme speciale, numite nicoli, care
au proprieti birefringente.
Caracteristica substanelor optic active o constituie disimetria molecular datorat
carbonului asimetric. Rotaia luminii polarizate se poate face spre dreapta, caz n care unghiul
de rotaie se noteaz cu (+), sau spre stnga (-).

Polarimetre
Pentru o anumit lungime de und, unghiul de rotaie specific a unei substane aflate sub
form de soluie, este proporional cu grosimea stratului traversat i cu concentraia ei.
Constanta de proporionalitate specific fiecrei substane se numete unghi de rotaie
specific i se noteaz cu ()D20, unde 20 reprezint temperatura la care se face citirea, iar D,
linia sodiului (ca surs de lumin, aparatele sunt echipate cu lmpi de sodiu).
In practica, polarimetria se folosete pentru determinarea concentraiei unor glucide cu
ajutorul aparatelor numite polarimetre.
Fiecare substan optic activ are un unghi specific de rotaie, n condiii determinate de
lucru. In tabelul urmtor sunt trecute valorile unghiului de rotaie specific a unor glucide de
importan biologic.
Substana
Glucoz
Fructoz
Galactoz
Maltoz
Zaharoz

()D20
+52.74
-93.78
+80.70
+136.90
+66.50

Substana
Lactoz
Manoz
Arabinoz
Xiloz
Celobioz
15

()D20
+55.30
+14.50
+105.0
+19.00
+35.00

2.3.2. Metode de separare - Metode cromatografice


Permit separarea substanelor dintr-un amestec pe baza capacitii de distribuie ntre o faz
staionar i una mobil avnd ca urmare deplasarea cu vitez diferit a componentelor
purtate de faza mobil de-a lungul fazei staionare.
Metodele cromatografice se pot clasifica dup starea de agregare a fazei staionare i
mobile i dup fenomenul de absorbie sau de repartiie ntre dou faze nemiscibile n:

cromatografie pe hrtie

cromatografie n strat subire

cromatografie pe coloan de sephadex

cromatografie n faz gazoas

lichid cromatografia

a.cromatografia pe hrtie are loc o repartiie a substanelor ce se separ ntre stratul de


lichid polar (ap) aderent de hrtie i faza mobil (organic), nemiscibil cu apa. Deci, este o
cromatografie de repartiie de tip lichid-lichid.
Ca suport se utilizeaz hrtia cromatografic Whatman, Schleicher-Schll, etc.
-Pentru aplicare se pot folosi siringi, micropipete, pipete Pasteur.
-Developarea se face n aparate speciale de sticl, care s asigure o atmosfer nchis.
-Soluiile developante sunt specifice substanelor ce se cerceteaz.
Dup developare i uscare la aer a cromatogramelor, acestea se pulverizeaz uniform cu o
soluie revelatoare cu compoziie specific substanelor ce se cerceteaz. Se usuc din nou la
aer, apoi se expun la etuv, la temperatura de 90-100C pentru evidenierea spoturilor.

Fig. Cromatografia pe hartie


http://lumea-cunoasterii.blogspot.ro/
Pentru identificare se pot folosi dou procedee:

prin comparare cu standardele de referin preparate din substane cunoscute

cu ajutorul factorului de retenie numit Rf


16

Rf-ul se definete ca fiind raportul dintre distana parcurs de substana separat prin
cromatografie i distana parcurs de solvent. Deci, pentru calcularea Rf-ului se msoar
pe de o parte distana de la punctul de start pn la linia de migrare a solventului (L), iar
pe de de alt parte distana de la punctul de start pn la centrul geometric al spotului
substanei respective (l).
Rf=l / L
Valoarea Rf-ului este totdeauna subunitar i n aceleai condiii de lucru fiecare
substan are un Rf cu valoare absolut specific.
Pentru evaluarea cantitativ, fiecare spot identificat se decupeaz, elueaz i se supune
determinrii fotometrice fa de un standard de referin cu concentraie cunoscut.
In biochimie, cromatografia pe hrtie are multiple domenii de aplicare, dar se folosete n
special pentru separarea, identificarea i determinarea aminoacizilor i a substanelor
glucidice.
b. Cromatografia n strat subire este asemntoare cromatografiei pe hrtie cu deosebirea
c n locul hrtiei se folosesc plci de sticl acoperite cu un strat adsorbant, uniform distribuit,
de grosime prestabilit, din silicagel sau alt material asemntor. Prezint avantajul unei mai
bune separri a compuilor din amestec i a unei foarte bune reproductibiliti. Metoda poate
fi utilizat i n cazul unor substane developante care ar ataca hrtia cromatografic.

http://images.1233.tw/tlc-developing-tanks/

Fig. Cromatografia in strat subtire


http://www.bio-rad.com/en-za/applications-technologies/chromatography
17

c. Cromatografia pe coloan de sephadex. Principiul este asemntor cu al cromatografiei


pe hrtie sau n strat subire cu deosebirea c suportul i faza staionar sunt introduse ntr-o
coloan cilindric de sticl. Substanele din amestec sunt purtate de faza mobil de-a lungul
fazei staionare, distribuindu-se n mod specific, n funcie de capacitatea lor de migrare, n
acest fel realizndu-se separarea lor.

Cromatografia pe coloane
http://www.drgpdreamdot.com/chromatography/
Sephadex-ul este o substan hidrofil de tipul dextran-ului, care are proprietatea de a se
mbiba foarte repede cu ap, formnd geluri poroase. Aceste geluri sunt formate din
macromolecule filiforme, legate ntre ele ncruciat, formnd o reea tridimensional care se
comport ca o adevrat sit molecular. Efectul acestei site este acela c modeleaz viteza
de parcurgere a ei de ctre substane n funcie de masa lor molecular.
Metoda se folosete pentru separarea diferitelor fraciuni proteice, inclusiv pentru
separarea i purificarea enzimelor, acizilor nucleici, polipeptidelor, aminoacizilor, precum i
a unor polizaharide.
c.Cromatografia n faz gazoas reprezint una din cele mai perfecionate tehnici
cromatografice cunoscute pn n prezent, cu ajutorul creia se determin substanele dintr-un
amestec, n domeniu nanogramelor. Faza mobil este alctuit dintr-un gaz purttor, iar
faza staionar este format din substane specifice care sunt lichide la temperatur nalt i
care sunt fixate de un suport inert pulverulent. Complexul de substane care alctuiesc faza
staionar sunt introduse ntr-o coloan lung i ngust, din sticl, alctuind aa-numita
umplutur de coloan. Extractul din proba de cercetat purificat printr-o tehnic special se
injecteaz n partea superioar a coloanei de unde este preluat de gazul purttor i vehiculat
de-a lungul fazei staionare. In funcie de structura lor chimic componentele amestecului
18

strbat coloana cu viteze diferite, deci, se separ unele de altele. La extremitatea opus a
coloanei exist un sistem de detecie care semnalizeaz ieirea din coloan a fiecrui element.
Intensitatea semnalelor emise este proporional cu concentraia fiecrei substane, ceea ce
permite evaluarea cantitativ. Semnalele transmise de detector sunt amplificate, apoi se
nregistreaz grafic sub forma de picuri a cror nalime sau arie e proporional cu
concentraia. Identificarea i evaluarea cantitativ se fac cu ajutorul standardelor de referin
cu concentraie cunoscut.
d. Cromatografie de lichide de nalt performan - Metoda se bazeaz pe acelai
principiu ca i celelalte metode cromatografice i anume repartizarea diferit a componentelor
unui amestec de substane ntre o faz staionar i o faz mobil. Deosebirea major ntre
aceast metod i cromatografia de gaz este aceea c faza mobil este lichid i nu gazoas.
n plus, faza mobil nu are un simplu rol de cru ci particip activ la procesul de separare
datorit unor interaciuni complexe.
2.3.3. Metode electrochimice
a.Electroforeza este tehnica analitic ce are la baz capacitatea particolelor ncrcate
electric dintr-o soluie coloidal de a migra spre polul (+) sau (-) atunci cnd prin mediul
respectiv trece un curent electric. Mai exact, dac ntr-un mediu se gsesc particole ncrcate
electric, pozitiv sau negativ, i dac n mediul respectiv se creeaz un cmp electric ntre doi
electrozi sub tensiune, atunci particolele migreaz ctre electrodul de semn contrar.
Viteza de migrare e condiionat de mai muli factori, dar n primul rnd de mrimea
ncrcturii electrice a fiecrei particole. In aceleai condiii de lucru (pH, temperatur,
intensitatea cmpului electric, natura suportului) viteza de migrare a substanelor dintr-un
amestec e diferit n funcie de natura fiecrei substane.
In practica de laborator, electroforeza se utilizeaz n special pentru separarea fraciunilor
proteice din lichidele biologice sau din extractele de esuturi, ulterior fiind posibil
identificarea i evaluarea lor cantitativ.
b.Metodele poteniometrice se bazeaz pe determinarea concentraiei ionilor din soluie
msurnd valoarea sau variaia potenialului unui electrod indicator.
Aceste metode pot fi:

directe (pH-metria)

indirecte (titrri poteniometrice)

19

pH-ul se definete ca fiind logaritmul cu semn schimbat al concentraiei ionilor de


hidrogen dintr-o soluie. Se exprim prin valori cuprinse ntre 1-14.

Valoarea 7 corespunde mediului neutru

Valorile mai mici dect 7 corespund mediului acid

Valorile mai mari dect 7 corespund mediului bazic (alcalin)


pH-ul are o importanta deosebita in desfasurarea reactiilor biochimice din organism.

In mediul biologic, valoarea constant a pH este 7.2-7.4.


Determinarea pH-ului se poate face prin metoda cu hrtie indicator, metoda cu soluie
indicatoare, dar pentru determinarea exact a pH-ului se folosete metoda poteniometric
pH-metria.

hrtie de pH

pH-metru

Principiul metodei const n msurarea diferenei de potenial electric ntre un electrod de


referin i un electrod de msurare introdui n soluia de cercetat i exprimarea acesteia sub
form de uniti de pH.
Aparatele folosite se numesc pH-metre. Pentru etalonarea lor se folosesc soluii tampon.
Acetea sunt formate din soluii n care solvatul este alctuit din dou sau mai multe substane
chimice, care prin particularittile lor se opun la schimbarea pH-ului atunci cnd variaz
concentraia ionilor de hidrogen.
Exemple de sisteme tampon:

Sistemul tampon constituit dintr-un acid slab i sarea lui cu o baz tare acid acetic,
acetat de sodiu

Sistem tampon constituit dintr-o baz slab i sarea ei cu un acid tare hidroxid de
amoniu, clorur de amoniu
Sistemele tampon ndeplinesc un rol biochimic esenial n organism pentru c ele asigur
meninerea pH-ului n limite fiziologice specifice vieii.
20

c. Conductometria cuprinde metode de analiz bazate pe determinarea conductibilitii


soluiilor. Conductibilitatea soluiilor de electrolii se datoreaz deplasrii sarcinilor electrice
(ionilor) sub influena unui gradient de potenial realizat cu ajutorul a doi electrozi.
Exist o dependen linear ntre concentraia unui ion din soluie i contribuia acestui
ion la conductibilitatea total a soluiei.

TEST

1. Ce este cromatografia ? Dai exemple de diferite tipuri de cromatografie.


2. Precizai care este metoda cea mai des utilzat n biochimia analitic cantitativ
3. Care sunt cele 3 categorii n care se mpart radiaiile luminoase, pe baza raportului
ntre lungimea de und i capacitatea de percepere a ochiului omenesc ?
4. Ce este pH-ul ? Indicai dou metode de determinare a pH-ului.
5. Ce determinri se realizeaz cu ajutorul metodelor refractometrice ?
6. Ce sunt soluiile tampon ?

21

Laborator 3 - 4.Glucide

Glucidele sunt substane naturale universal rspndite n organismele vegetale i animale.


Au rol structural i energetic, reprezentnd combustibilul principal al tuturor organismelor.
De exemplu, pentru un adult furnizeaz 60% din energia necesar.
Glucidele sunt substane cu funciuni mixte, care conin n molecula lor grupri
carbonilice i hidroxilice, ele fiind polihidroxialdehide sau polihidroxicetone.
In funcie de complexitatea structural glucidele se clasific n dou categorii:
Oze denumite i monozaharide sunt compui la care hidroliza acid sau enzimatic nu
conduce la compui mai simpli care s pstreze totui proprietile grupului.
Ozide sunt glucide care prin hidroliza acid sau enzimatic pun n libertate una sau mai
multe molecule de monozaharide. In funcie de moleculele care rezult n urma hidrolizei,
ozidele se mpart n:
-

Holozide - care conin n structura lor monozaharide

Heterozide care sunt constituite din monozaharide i o component neglucidic


numit aglicon.

Reaciile chimice folosite pentru identificarea i dozarea glucidelor, sunt reacii de


culoare, condensare, deshidratare, oxido-reducere, hidroliz, etc.

22

Extragerea glucidelor din produsele alimentare


Extragerea monoglucidelor i a oligoglucidelor din produsele alimentare se poate realiza
prin presare sau prin extracia produsului respectiv cu anumii solveni.
Extracia prin presare
Se aplic produselor alimentare cu coninul mare de ap i glucide solubile. In urma
presrii se obine un suc care conine glucide solubile. Acest suc se utilizeaz la dozarea
glucidelor prin metode refractometrice i densitometrice. Rezultatele acestor msuratori sunt
orientative deoarece n sucul obinut pot exista i alte substane solubile n ap.
Extracia cu solveni specifici
Aceast metod este folosit frecvent n scopuri analitice i industriale. Solvenii utilizai
sunt: apa la 75-80C sau etanolul la temperatura de fierbere.
a). Extracia apoas la cald cu defecare
Extractul primar obinut prin aceast metod are un grad de puritate mai mare dect prin
presare, deoarece prin procesul de defecare se ndeprteaz substanele neglucidice cu
ajutorul unor reactivi numii defecani. (In latin, termenul de defecare nseamn desfacere,
purificare).
b). Extracia alcoolic
Metoda se folosete pentru produsele cu coninut ridicat de amidon sau n scopuri
microanalitice. Amidonul este insolubil n etanol i n felul acesta se nltur posibilitatea
antrenrii sale n extract. In cazul microanalizei glucidelor se aplic extracia alcoolic,
deoarece etanolul are un rol dublu: de extractant i de defecant. Extractul alcoolic poate fi
tratat cu schimbtor de ioni pentru a scoate eventualii anioni i cationi existeni n extract sau
poate fi tratat cu crbune activ pentru nlturarea pigmentilor solubili n etanol.

23

3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractometrul


Refractometrie este metoda pentru determinarea indicelui de refractie "n", sau a
refractiei molare Rm.Analiza refractometrica este utilizata pentru a determina concentratiei
unuei substante dintr-o solutie in functie de indicele de refractie.
Metoda refractometrica se aplica pentru determinarea concentratiilor solutiilor n
industria zaharului, conserve vegetale, produse zaharoase, glucoza, etc.; determina substanta
uscata solubila si concentratia de zahar daca n extractul solubil al unui produs alimentar
predomina zaharurile iar nezaharul este constant.
Refractometria se utilizeaza si pentru determinarea indicelui de refractie al grasimilor,
respectiv pentru determinarea continutului de grasime al unui produs alimentar.
Se numete indice de refracie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase fa de
verticala () i sinusul unghiului de refracie ().
Indicele de refracie=sin /sin

Indicele de refracie

Indicele de refracie este o constant specific fiecrei substane. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mrimea i structura fizic a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraia unei soluii i astfel se poate stabili procentul de substan
uscat sau de ap.
Determinrile se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abb.
Indicele de refracie este puternic influentat de temperatur, deci este necesar ca determinrile
s se fac la temperatur bine reglat, constant. In acest scop, refractometrele sunt cuplate de
obicei cu baie ultratermostatat.

24

Tipuri de refractometre:

Se numete indice de refracie raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase fa de


verticala () i sinusul unghiului de refracie ().
Indicele de refracie=sin /sin

Indicele de refracie

Indicele de refracie este o constant specific fiecrei substane. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mrimea i structura fizic a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentraia unei soluii i astfel se poate stabili procentul de substan
uscat sau de ap.
Determinrile se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abb.
Indicele de refracie este puternic influentat de temperatur, deci este necesar ca
determinrile s se fac la temperatur bine reglat, constant. In acest scop, refractometrele
sunt cuplate de obicei cu baie ultratermostatat.
Modul de lucru pentru refractometrul Abbe-Zeiss
1.

Se deprteaz prismele una de alta, se spal suprafaa cu alcool i se las s se usuce.

25

2.

Cu o pipet se pun cteva picturi din lichidul de studiat pe suprafaa prismelor, dup
care se nchide blocul prismelor.

3.

Cu ajutorul oglinzii se ndreapt fasciculul luminos ctre prisme.

4.

Privind prin luneta din dreapta se pune la punct imaginea firelor reticulare prin nvrtirea
ocularului. Apoi se caut domeniul de separaie dintre cmpul luminos i ntunecat
nvrtind butonul din stnga. Dac n cmpul lunetei se observ o figur neregulat,
nseamn c lichidul nu a acoperit ntreaga suprafa a prismei. n acest caz se mai pun
cteva picturi de lichid, pn cnd domeniul luminos i cel ntunecat sunt separate
printr-o linie dreapt.

5.

Cu butonul din stnga se aduce ncruciarea firelor reticulare n suparapunere cunlinia de


separaie. Cu lupa din stnga se citete pe scala gradat direct indicele de refracie IR al
lichidului

6.

Se repet msurtorile de cel puin 3 ori.

Date experimentale:
Nr
Repetitii/medie
probei.
1
R1

IR

R2
R3
M
2

R1
R2
R3
M

R1
R2
R3
M

26

Conc SU
solubila in apa

3.2.Determinri cantitative ale glucidelor


3.2.1.Determinarea glucidelor reductoare cu ajutorul reaciei Fehling
Reacia Fehling poate servi i pentru determinarea cantitativ a glucidelor
reductoare. Pentru aceasta trebuie s determinm titrul soluiei Fehling, adic
corespondena n glucoz sau alt glucid reductor al reactivului Fehling, cu care se lucreaz.
Prin titrul soluiei Fehling se nelege cantitatea de glucoz exprimat n miligrame,
care reduce amestecul format din 10ml soluie Fehling I+ 10ml soluie Fehling II.
Determinarea titrului soluiei Fehling.
Se cntarete 1g glucoz pur, uscat n prealabil la 100C i se dizolv ntr-un balon
cotat de 100ml, completndu-se la semn cu ap distilat.
Intr-un flacon Erlenmeyer se pun exact 10ml reactiv Fehling I i 10ml reactiv Fehling
II i se adaug 10-20ml ap distilat.Flaconul se nclzete pn la fierbere pe o sit de azbest
i se adaug din biuret soluie de glucoz pictur cu pictur, pn cnd soluia va deveni
incolor i se observ depunerea unui precipitat rou-crmiziu, care se depune pe fundul
vasului. Dac se depete punctul de viraj soluia va deveni galben din cauza caramelizrii
glucozei i reacia trebuie repetat.
Este bine ca reactivul Fehling s fiarb tot timpul, glucoza s se adauge numai n
picturi i titrarea s se fac ct mai repede.
Titrul soluiei Fehling =N10 mg
N= nr.ml de glucoz utilizai
In cazul determinrii glucidelor din soluii necunoscute se procedeaz la fel ca i n cazul
stabilirii titrului, cu deosebire c n biuret se pune soluia de cercetat.
Glucoz mg =Titrul solutiei Fehling1000/ N1
unde:
N1= numarul de ml utilizai din soluia de glucid necunoscut

Calcule si observatii

27

28

3.2.2.Determinarea glucidelor prin metoda Schrool


Determinarea zahrului reductor dupa aceast metod este mult mai rapid, nu
necesit aparatura special (filtru G4) ns este mai puin exact dect metoda Bertrand.
Prin aceast metod, cantitatea de oxid cupros format se determin indirect, prin
dozarea iodometric a sulfatului de cupru existent n soluia Fehling, nainte i dup reducere.
Diferena obinut reprezint cantitatea de cupru redus de ctre zahr .
Reaciile chimice care au loc sunt urmtoarele:
2 CuSO4 + 4 KI = 2 CuI + 2 K2SO4 + I2
I2 + Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6
Reactivi necesari: - soluie Fehling I
- soluie Fehling II
- tiosulfat de sodiu 0,1N
- iodur de potasiu 10%
- acid sulfuric, d=1,11
- amidon solubil 1%
Mod de lucru: Intr-un balon Erlenmeyer de 300ml se introduc 10ml soluie Fehling I, 10ml
soluie Fehling II i 20ml din soluia de analizat. Balonul se nclzete pe sit de azbest,
reglndu-se astfel flacra becului nct soluia s fiarb dup trei minute. Se fierbe dou
minute, se rcete apoi soluia n curent de ap dup care se adaug 20ml soluie de iodur de
potasiu i 15ml acid sulfuric.
Se titreaz iodul pus n libertate, prin reducerea cuprului n iodur cuproas, cu Na2S2O3
0,1N n prezena amidonului ca indicator. Titrarea se continu pn la dispariia culorii
albastre.
Se face o prob martor pentru stabilirea titrului cantitii de cupru din cei 10ml soluie
Fehling.
Proba martor se lucreaz n aceleai condiii ca i proba de analizat, cu diferena c n
locul soluiei de zahr se adaug 20ml ap distilat.
Cantitatea de cupru redus de ctre zahr se afl n funcie de cantitatea de tiosulfat de
sodiu 0,1N folosit la titrare, pe baza relaiei :
V =V1 V2 n care
V = ml Na2S2O3 0,1N corespunztor zahrului care se gsete n proba de analizat, in ml
V1 = ml tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei martor, n ml
V2 = ml de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei de analizat n ml
29

Determinarea zahrului invertit i glucozei dup Schoorl


Soluia de
Na2S2O3 0,1N ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

Cupru mg

Glucoz mg

6,4
12,7
19,1
25,4
31,8
38,2
44,5
50,9
57,3
63,6
70,0
76,3
82,7
89,1
95,4
101,8
108,1
114,4
120,8
127,2
133,5
139,8
146,2
152,6
159,0

3,2
6,3
9,4
12,6
15,9
19,2
22,4
25,6
28,9
32,3
35,7
39,0
42,4
45,8
49,3
52,8
56,3
59,8
63,3
66,9
70,7
74,5
78,5
82,6
86,6

Zahr Invertit
mg
3,2
6,4
9,7
13,0
16,4
19,8
23,2
26,5
29,9
33,4
36,8
40,3
43,8
47,3
50,8
54,3
58,0
61,8
65,5
69,4
73,3
77,2
81,2
85,2
89,2

Cantitatea de zahr analizat, corespunztoare volumului V de tiosulfat de sodiu se afl cu


ajutorul unui tabel, exprimarea fiind n zahr invertit sau glucoz.
Calcul i observaii

30

31

4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianur de potasiu


Lactoza din lapte este unul din componentele extractului uscat total reprezentnd
aproximativ 35%. Lactoza este un compus instabil suferind fermentaii sub infuena
microorganismelor prezente n lapte.
Pentru determinarea lactozei din lapte se folosesc mai multe metode chimice
(metoda Bertrand, varianta Elser, metoda cu fericianur de potasiu), sau se folosesc metode
instrumentale (metoda polarimetric).
Lactoza, reduce n mediu alcalin i la cald, fericianura de potasiu K3[Fe(CN)6] n
ferocianur de potasiu, K4[Fe(CN)6], ceea ce va duce la decolorarea soluiei galbene de
fericianur.
Reactivi necesari : - sulfat de cupru, soluie saturat
- soluie alcalin de fericianur de potasiu: se dizolv 23g fericianur de
potasiu n cca.400ml ap, iar n alt pahar 23g hidroxid de potasiu tot n cca. 400ml ap.
Cele dou soluii se trec n balon cotat de 1000ml, se completeaz cu ap la semn i se
omogenizeaz.
- soluie standard de lactoz: 5g lactoz se aduc cu ap n balon cotat de
1000ml, se completeaz la semn i se omogenizeaz.1ml din aceast soluie conine
5mg lactoz.
Mod de lucru
Stabilirea titrului soluiei de fericianur de potasiu : Intr-un vas Erlenmeyer se introduc
10ml soluie alcalin de fericianur de potasiu, peste care se adaug 30ml ap distilat i se
aeaz pe sita de azbest, iar deasupra lui se potrivete biureta cu soluie standard de lactoz.
Se pornete flacra i cnd ncepe fierberea se picur soluie de lactoz din biuret agitnd
flaconul dup fiecare pictur, pn n momentul n care culoarea galben dispare brusc.
Ritmul de picurare trebuie s fie rar,iar soluia din vas n continu fierbere moderat.
Titrul soluiei de fericianur de potasiu exprimat n numrul de mg lactoz necesar pentru a
reduce 1ml soluie de fericianur, se stabilete cu ajutorul formulei :
T = V x5 / 10
n care :

V = volumul soluiei de lactoz folosit, n ml


5 = coninutul de lactoz, n mg , corespunztor la 1ml soluie
10 = volumul soluiei de fericianur folosit,n ml

32

Determinarea: Intr-un balon cotat de 100ml se introduc 10ml lapte peste care se adaug cca.
40ml ap i se omogenizeaz. Adugm 1 ml soluie saturat de CuSO4, (0,5 ml solutie
saturata de fericianura de potasiu). Amestecul se agit de 3-4 ori i se completeaz cu apa
pna la semn, dupa care se las 5 minute n repaus. Dup un repaos de 5 minute se filtreaz
prin filtru cutat i se obine un lichid clar de culoare slab albstruie. Pentru a ndeprta
excesul de sulfat de cupru adugm 0,5-1,0g pulbere de zinc, se omogenizeaz i se filtreaz
din nou. Astfel se obine un lichid incolor i perfect limpede.
Filtratul se introduce n biuret i se procedeaz n continuare ca la stabilirea titrului
soluiei de fericianur.
Calculul rezultatelor
a. Calcul Titru

b. Calcul continut lactoza


Coninutul de lactoz din lapte, exprimat n g la 100ml, se calculeaz astfel :
Lactoz, g la 100ml = (Tx10x10 /V x1000)x 100
n care :
T = titrul soluiei de fericianur de potasiu
10 = volumul soluiei de fericianur de potasiu luat n lucru,n ml
10 = raportul ntre volumul balonului cotat (50 ml) i laptele luat n lucru (5 ml)
V = volumul de filtrat folosit, n ml
1000 = factor de transformare mg n g
100 = factor de exprimare pentru 100ml lapte

33

Interpretarea rezultatului
Continutul n lactoza al laptelui de vaca este n medie 4,55%.
Cantitatea de lactoza din lapte scade n cazul falsificrii laptelui cu apa precum si n cazul
modificarilor inflamatorii ale glandei mamare. Laptele cu aciditate de peste 21T nu se
preteaz pentru determinarea lactozei. n acest caz se vor obtine valori mai mici dect
cele pentru laptele proaspt deoarece procesele fermentative se desfoar n primul rnd
pe seama lactozei.

Test

1. Care este rolul glucidelor n organism ?


2. Cum se pot extrage glucidele din produsele alimentare ?
3. Dai exemplu de reacie de reducere, care permite identificarea i determinarea
cantitativ a glucidelor reductoare.
4. Ce monoglucide rezult n urma hidrolizei lactozei ?
5. Care este substana de baza din reactivul Fehling?

34

Laborator 5-6. Lipide

5.1.Determinarea principalilor indici la grsimi


5.1.1. Determinarea punctului de topire
Valoarea punctului de topire al grsimilor este n strns corelaie cu natura i proporia
acizilor grai din structura lor chimic. Astfel, grsimile care conin i acizi grai saturai
inferiori de tipul acizilor butiric, caproic, caprilic, care la temperatura camerei sunt lichizi sau
semilichizi, vor avea consistenta mai moale dect alte grsimi, cum este cazul grsimii
laptelui. Invers, grsimile n structura crora predomin acizii grai saturai superiori de tipul
acidului stearic vor avea consistena mult mai ferm, cum este cazul seului de rumegtoare.
Toi acizii grai nesaturai sunt lichizi la temperatura de 20C. Exemplul cel mai evident
l constituie uleiurile vegetale, la care proporia de acizi grai nesaturai este de 60%.
Pentru c grsimea fiecrei specii are o structur chimic specific i valoarea punctului
de topire va fi relativ specific.
Punctul de topire poate fi socotit ca indicator util pentru stabilirea speciei de la care
provine grsimea supus analizei.
Valoarea punctului de topire este dat de temperatura corespunztoare momentului n
care grsimea introdus ntr-un tub capilar i nclzit lent, se clarific brusc.
Materiale necesare:
-

tuburi capilare din sticl, uniform calibrate, bine degresate i uscate, cu diametrul interior
de 1mm i lungimea de 15 mm.

termometru cu mercur de 0100C, gradat din 0,1 n 0,1C

pahar Berzelius de 100ml

stativ cu clem pentru suspendarea termometrului


35

glicerin

plit electric sau bec de gaz


Mod de lucru : Intr-un creuzet mic de porelan se introduc cteva grame de grsime i se

nclzete uor pn la topire complet. In acest moment, cu ajutorul unei pense, se introduc
n creuzet dou tuburi capilare care se vor umple complet cu grsime topit.Se las apoi
creuzetul n repaos pentru rcire i nchegarea grsimii. Se scot cele dou tuburi capilare i se
cur de grsimea aderent la suprafaa lor extern. Coloana de grsime din interiorul
capilarelor trebuie s fie compact i s ocupe tot lumenul acestora. Cu ajutorul unui inel
subire de cauciuc se fixeaz cele dou capilare de o parte i alta a rezervorului cu mercur al
termometrului i termometrul astfel pregtit se introduce la congelatorul frigiderului unde se
ine 24 de ore
Paharul Berzelius umplut cu glicerin se trece pe plita electric sau pe sita de azbest i n
el se suspend termometrul cu cele dou tuburi capilare. Termometrul se fixeaz cu ajutorul
unei cleme n poziie perfect vertical, n aa fel nct s se ocupe centrul geometric al masei
de glicerin din pahar, iar tuburile capilare la rndul lor s fie n poziie perfect vertical.

Fig. Instalaie pentru determinarea punctului de topire a grsimii


Se acioneaz cldura i se urmrete temperatura pe scala gradat a termometrului i
aspectul grsimii din cele dou tuburi capilare. Inclzirea trebuie s fie lent, nct viteza de
cretere a temperaturii s nregistreze un ritm de 2-3C/ minut.
In preajma punctului de topire coloana de grsime din capilare ncepe s se clarifice de
la exterior spre interior. In momentul n care s-a realizat clarificarea complet se citete
valoarea temperaturii. In acest moment o bul de grsime se va profila brusc la captul
superior al tubului capilar, ca urmare a alunecrii coloanei de grsime topit mpins de

36

presiunea de jos n sus a glicerinei din pahar. Aproape instantaneu pictura de grsime se
desprinde de captul tubului capilar i se ridic la suprafaa stratului de glicerin.
5.1.2. Determinarea indicelui de iod
Dublele legturi ale acizilor grai nesaturai din compoziia grsimilor confer acestora
caracter de instabilitate chimic, ce se traduce i prin capacitatea lor de a adiiona uor
halogeni la nivelul acestor duble legturi.
Indicele de iod este cantitatea de iod, n grame, adiionat de 100g grsime.Valorea
acestui indice este condiionat de natura i propria acizilor gra6si nesaturai (adic de
numrul dublelor legturi) din compoziia grsimilor. Grsimile care au un coninut mic de
acizi grai neasturai vor avea indicele de iod cu valoare mai mic (grsimile animale n
general), iar cele care au un coninut mare de acizi grai nesaturai, vor avea un indice de iod
cu valoare mare (uleiurile)
De exemplu, untul de vac are un indice de iod cuprins ntre 21 36 ; untura de porc
ntre 43 70 ; uleiul de floarea soarelui intre 119 135.
Indicele de iod constituie un criteriu pentru aprecierea puritii grsimii.
In condiii specifice de lucru, se trateaz o cantitate dat de grsime cu o soluie de iod de
concentraie cunoscut, apoi se titreaz excesul de iod cu o soluie echivalent de tiosulfat de
sodiu. Cantitatea de iod adiionat se calculeaz din diferen.
Reactivi necesari : - cloroform sau tetraclorur de carbon
- reactiv Hanus (monobromur de iod)
- iodur de potasiu, soluie 15% proaspt preparat
- tiosulfat de sodiu, soluie 0,1N
- amidon, soluie 1%, proaspt preparat
Mod de lucru: Cantitatea de grsime care se ia n lucru, se va corela cu indicele de iod
probabil al acesteia dup cum urmeaz:
-

1,0g , pentru indicele de iod cuprins ntre 10-50

0,6g, pentru indicele de iod cuprins ntre 50-70

0,25g, pentru indicele de iod cuprins ntre 70-120

0,15g, pentru indicele de iod mai mare de 120


Intr-un flacon Erlenmeyer de 300ml cu dop rodat, se cntrete la balana analitic

grsimea n prealabil topit. Se adaug apoi 10ml cloroform, 25ml reactiv Hanus i se las la
ntuneric 30-60 minute, funcie de valoarea indicelui de iod. Se adaug apoi 20ml iodur de
37

potasiu, i 100ml ap distilat, apoi se titreaz repede cu tiosulfat de sodiu. Spre sfritul
titrrii, cnd culoarea soluiei se deschide la galben, se adaug 3-5 picturi soluie de amidon;
soluia se coloreaz n albastru. Se continu titrarea agitnd mereu, foarte energic, pn la
dispariia culorii albastre.
In aceleai condiii se face si o prob martor, dar fr grsime.
Calculul rezultatelor :
Indicele de iod = 0,01269 (V V1) 100 / m n care:
0,01269 = cantitatea de iod, n g, corespunztoare la 1ml tiosulfat de sodiu soluie 0,1N
V = volumul soluiei de tiosulfat de sodiu, n ml, folosit la titrarea martor
V1 = volumul soluiei de tiosulfat de sodiu, n ml, folosit la titrarea probei ce se analizeaz.
m = cantitatea de grsime, n g, luat n lucru.
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare
Indicele de saponificare exprim numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar
pentru a saponifica total un gram de grsime.
Cu ct este mai mare masa molecular a gliceridei, respectiv a acizilor grai, cu att
cantitatea de hidroxid de potasiu necesar saponificrii este mai mic.Valoarea indicelui de
saponificare d indicaii asupra constituiei chimice a grsimii cercetate.
Reactivi necesari: - soluie alcoolic de hidroxid de potasiu aproximativ 0,5N- se prepar
dizolvnd 32g hidroxid de potasiu n puin ap i completnd la
1000ml cu alcool de 95C
- fenolftalein 1% n alcool 95C
- acid clorhidric 0,5N
Mod de lucru: Intr-un balon de 150-200ml se cntresc 1-2g grsime la care se adaug apoi
25ml hidroxid de potasiu alcoolic.
Balonul se astup cu un dop, prin care trece un refrigerent ascendent rcit cu ap, apoi se
nclzete pe o baie de ap fierbinte 30-40 minute. Dup acest timp soluia din flacon se
titreaz cu HCl 0,5N. Dac soluia este puternic colorat, se dilueaz cu alcool pentru ca s se
poat observa ct mai bine culoarea roie a fenolftaleinei.
Intr-un balon se face o titrare martor cu 25ml de hidroxid de potasiu alcoolic.
Diferena dintre numrul de ml folosii la titrarea soluiei martor N1 i a celor folosii la
titrarea soluiei cu grsime N2, d numrul de ml de hidroxid de potasiu ntrebuinai la
saponificarea grsimii luat n lucru.
38

Din acetia se calculeaz apoi numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru
saponificarea unui gram de grsime i care reprezint indicele de saponificare.
Indicele de saponificare = (N1 N2) FHCl 28 / G

n care:

N1 = volumul de acid clorhidric, n ml, folosit la titrarea probei martor


N2 = volumul de acid clorhidric, n ml, folosit la titrarea probei de grsime
28 = cantitatea de hidroxid de potasiu, n mg, corespunztoare la 1ml hidroxid de potasiu,
G = masa de grsime
5.1.4. Determinarea indicelui de aciditate
Indicele de aciditate reprezint numrul de miligrame de hidroxid de sodiu necesar pentru
neutralizarea acizilor grai liberi dintr-un gram de grsime.
Reactivi necesari : - hidroxid de sodiu 0,1N
- fenolftalein, soluie alcoolic 2%
- amestec alcool-eter 1:1 (un volum alcool etilic 95C se amestec cu un
volum eter etilic) nainte de folosire se neutralizeaz cu NaOH 0,1N n
prezen de fenolftalein .
Mod de lucru : Intr-un pahar Berzelius se cntresc 5g de grsime i se nclzete pn la
topire. Se adaug 20ml amestec alcool-eter neutralizat fa de fenolftalein i se titreaz cu
NaOH 0,1N sub agitare continu, pn la apariia culorii roz care trebuie s persiste 30 de
secunde.
Calcul :
Aciditate, n acid oleic % = 0,0282 V 100 / m

n care :

0,0282 = cantitatea de acid oleic, n g, corespunztoare la 1ml hidroxid de sodiu 0,1N


V = volumul soluiei de hidroxid de sodiu 0,1N, n ml, folosit la titrare
m = masa probei luat pentru determinare.
5.1.5. Indice de peroxid
Indicele de peroxid reprezint cantitatea de peroxid i alte substane oxidante dintr-o
cantitate dat de grsime, care oxideaz iodura de potasiu. Iodul eliberat se titreaz cu o
soluie de tiosulfat de sodiu iar exprimarea rezultatelor se face n miliechivaleni de peroxid la
1 kg produs.
Reactivi necesari : - cloroform + acid acetic glacial
- iodur de potasiu, soluie apoas saturat, proaspt preparat
39

- tiosulfat de sodiu, soluie 0,1N i 0,01N


- amidon, soluie 1%, proaspt preparat
Mod de lucru: Probele de grsime pentru aceast determinare se recolteaz n borcane brune
de sticl cu dop rodat. Recipientul se umple complet cu grsime fr a se forma goluri de aer,
se nchide etan i se pstreaz la rece i ntuneric pe tot parcursul, pn n momentul
analizei.
Proba se nclzete moderat pe baia de ap cu 5-10C peste punctul de topire al
grsimii, apoi se omogenizeaz uor fr a se ngloba aer. Dac grsimea topit are un
coninut mare de ap (este pronuna tulbure) se adaug cca. 20% sulfat de sodiu anhidru, se
omogenizeaz i se las n repaus pentru decantare.
Din stratul clar de la suprafa se cntrete foarte exact ntr-un flacon cu dop rodat o
cantitate corelat cu indicele probabil de peroxid i anume.
Indicele de peroxid probabil (miliechivaleni/kg)
Pn la 19
ntre 1931
ntre 3150
ntre 5088

Cantitatea de grsime (g)


5 0,05
2,0 -1,2
1,5 -0,8
0,8 -0,5

In flaconul cu grsime se introduc 10ml cloroform si se omogenizeaz pn la


dizolvare. Se adaug 15ml acid acetic, 1ml soluie de iodur de potasiu, se nchide cu dopul,
se agit 1 minut si se las n repaus la ntuneric exact 5 minute.
Se adaug 75ml ap distilat i se titrez repede cu soluie de tiosulfat de sodiu, 0,01N
dac indicele de peroxid este pn la 19, sau 0,1N dac indicele de peroxid este mai mare.
Ctre sfritul titrrii se folosete soluia de amidon (pn la dispariia culorii albastre).
In paralel se efectueaz o determinare martor n aceleai condiii dar fr grsime.
Calculul rezultatelor:
Indice de peroxid, miliechivaleni/kg = (V V1) n 1000 / m
n care :
V = volumul soluiei de tiosulfat de sodiu, n ml, folosit la titrarea probei
V1= volumul soluiei de tiosulfat de sodiu, n ml, folosit la titrarea martorului
n = normalitatea soluiei de tiosulfat de sodiu folosit la titrare
m= masa probei de grsime, n g, luat n lucru

40

5.1.6. Reacia Kreis


Aldehida epihidrinic se formeaz n mod constant n procesul de oxidare avansat a
grsimilor. Ea reacioneaz cu fluoroglucina n mediu acid, formnd un compus colorat.
Intensitatea culorii este proporional cu cantitatea de aldehid epihidrinic, deci i cu
procesul de oxidare.
Reactivi necesari: - fluoroglucin, soluie eteric 0,1%. Se pstreaz max 1 spt. n sticle
brune
- acid clorhidric concentrat(d=1,19)
Mod de lucru: Intr-o eprubet curat se introduce o anume cantitate din proba de grsime,
dup topirea prealabil la temperatur moderat (cca.50C). Se adaug acelai volum de acid
clorhidric concentrat i se omogenizeaz bine. Se adaug n continuare acelai volum de
soluie de fluoroglucin i se omogenizeaz din nou.
Dac untura este proaspt soluia din eprubet rmne incolor sau capt o tent glbuie.
Dac sunt instalate procese de oxidare, apare o culoare roie de diferite intensiti, funcie
de gradul rncezirii. Culoarea se dezvolt imediat i este stabil o or.
Calcule si observatii

41

6.1. Determinarea grsimii metoda Soxhlet principiul metodei


n produsele naturale, substanele grase sunt nglobate de obicei n celule grsoase, a
cror membran este de natur proteic. Extragerea cantitativ din proba care se analizeaz,
presupune eliberarea grsimii din corsetul proteic.
Distrugerea membranei sau peliculei proteice se poate realiza pe dou ci: pe cale
fizic (cu ajutorul cldurii), sau pe cale chimic (prin hidroliza acid sau alcalin). Separarea
grsimii de celelalte componente organice i minerale se poate realiza prin extracie selectiv
cu ajutorul solvenilor organici, sau prin centrifugare.
Determinarea grsimii din produsele alimentare de origine animal se poate realiza
prin mai multe metode: prin extracie cu solveni organici, cum ar fi metoda Soxhlet,
Goldfish, Mojonnier sau folosind hidroliza acid sau alcalin - metoda Gerber, Babcock.
Metoda de referin utilizat n laboratoarele de stat este metoda Soxhlet.
Principiul metodei
Grsimea din proba de cercetat este extras pn la epuizare cu solveni organici i
dup ndeprtarea solventului de extracie se cntrete i se exprim procentual. Pentru
asigurarea extraciei complete, proba este supus n prealabil unui tratament termic la
temperatur moderat prin care se realizeaz deshidratarea i distrugerea membranei sau
peliculei proteice a microstructurii n care este nglobat.

Extractoare Soxhlet

42

6.2. Determinarea grsimii din produsele lactate metoda Gerber


principiul metodei
Componentele majore din esurile i umorile animale au greutate specific 1,00 (apa) sau mai
mare de 1,00 (protidele, glucidele i substanele minerale). Lipidele au greutate specific mai
mic dect unu. Exist deci posibilitatea separrii i determinrii lipidelor prin centrifugare.
Pentru aceasta este necesar ca toate componentele s se gseasc sub form de soluie,
emulsie sau suspensie coloidal, situaie ce se poate realiza n condiii optime prin hidroliz
acid.
Metoda se folosete n special pentru determinarea grsimii din lapte i din produsele
lactate. Prin adaptri corespunztoare ns, se poate utiliza pentru determinarea grsimii din
orice produs de origine animal.
Produsul de cercetat este introdus ntr-un recipient de sticl special numit butirometru
unde este supus unei hidrolize rapide cu ajutorul acidului sulfuric. Grsimea eliberat din
structura n care este ncorporat, se separ prin centrifugare. Pentru uurarea separrii se
folosete alcoolul amilic. Cantitatea de grsime, exprimat procentual, se citete direct pe tija
gradat a butirometrului.

Butirometre

Centrifug Gerber
43

Test

1. Care este rolul lipidelor n organism ?


2. Ce fel de acizi grai conin uleiurile? Precizai care este reacia folosit pentru
determinarea gradului de nesaturare a grsimilor.
3. Enumerai constantele caracteristice lipidelor.
4. Care este metoda folosit pentru a pune n eviden degradarea oxidativ avansat a
grsimilor ?
5. Care este principiul metodei de determinare a grsimilor din lapte i alte produse
lactate ?
6. Indicai solventul folosit pentru extragerea grsimilor prin metoda Soxhlet.

44

Laborator 7-8-9. Determinarea proteinelor din produsele alimentare

Protidele sunt substane chimice eseniale ale materie vii. Ele sunt formate n special din
aminoacizi. Sunt substane complexe care conin C, H, O, N i uneori sulf, fosfor, fier sau
cupru.
Rolul fundamental este cel plastic i funcional i mai puin energetic. Ele sunt
considerate cele mai importante substane prezente n regnul animal i vegetal.
Aminoacizii sunt acizi carboxilici n care un atom de hidrogen a fost nlocuit cu o
grupare amino, -NH2; ei rezult prin hidroliza acid, bazic sau enzimatic a proteinelor.
Din punct de vedre al comportrii fa de diferii solveni protidele se clasific n
proteine simple i proteine conjugate. Prin hidroliz proteinele simple elibereaz numai
aminoacizi, iar proteinele conjugate elibereaz pe lng aminoacizi i o component
neproteic numit grupare prostetic.
In constituia corpului omenesc se gsesc cteva mii de proteine diferite, cu structuri
speciale care corespund anumitor funcii specifice.
Analiza calitativ i cantitativ a aminoacizilor se bazeaz pe reaciile specifice date
de gruparea amino, carboxil, de radicalul moleculei fiecrui aminoacid, de legturile
peptidice, pe valoarea punctului izoelectric i pe masa molecular.
Reaciile chimice prin care pot fi identificate protidele se mpart n:
-

Reacii de culoare specifice sau generale

Reacii de precipitare

45

7.1. Obinerea extractelor proteice


a.Albumina vegetal: 25g fin de gru se amestec cu 100ml ap distilat i se las s
stea 30 minute, agitnd din cnd n cnd. Se filtrez pe filtru cutat. Dac primele poriuni sunt
tulburi se filtreaz din nou.
b.Albumin de origine animal : La 50ml lapte se adaug un volum egal de ap distilat
i apoi, n picturi amestecnd, 0,2-0,3ml acid acetic concentrat, pn la obinerea unui
precipitat floconos.
Dup 5-10 minute amestecul se filtreaz printr-o pnz umezit n prealabil. Primele
cantiti se refiltreaz. Soluia limpede, puin glbuie conine albumin i o parte din
globulina din lapte. Reziduul de pe filtru este constituit din cazein i grsime.
c.Obinerea proteinelor din albuul de ou
O soluie concentrat de proteine se formeaz dintr-un albu de ou la care se adug 5-6g
NaCl. Se agit puin, se pune ntr-un vas de 500ml . Cnd trebuie preparat o soluie diluat,
se ia un anumit volum din soluia concentrat i se dilueaz de dou sau de trei ori cu ap
distilat.

7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire


Proteinele sunt alctuite dintr-un amestec de aminoacizi n diferite proporii i din aceast
cauz este important s cunoatem aminoacizii constitueni.
Separarea i identificarea aminoacizilor constitueni este posibil prin cromatografie pe
hrtie sau n strat subire.
In cromatografia pe hrtie se folosete hrtie de filtru mbibat i strbtut de diferite
amestecuri de solveni, de exemplu fenol-ap sau butanolap. Aceleai amestecuri de
solveni sunt folosii i n cromatografia n strat subire cu deosebirea c n acest caz faza fix
este dispus pe o plac de sticl, i este constituit dintr-un material poros solidsilicagel sau
oxid de aluminiu.
Aminoacizii se deplaseaz cu viteze diferite de-a lungul hrtiei sau a plcii cromatografice.
Deoarece aminoacizii sunt incolori, trebuie s se realizeze o reacie de culoare cu ninhidrin.
Aminoacizii se prezint sub form de pete de dimensiuni diferite, cu intensiti diferite de
culoare.
Pentru a identifica n parte se face o cromatogram de comparaie, folosind cte un
aminoacid cunoscut, astfel se poate cunoate poziia fiecrui aminoacid n cromatogram.
Aparatur necesara : - amestec de 2-3 aminoacizi (1mg/ml ap, 0,1%)
46

- soluii de control de aminoacizi (1mg/ml)


- amestec de developare butanol-acid acetic- ap 4:1:5
- ninhidrin 0,1-0,2% n butanol
- Hrtie cromatografic Whatman nr.1 sau plci cromatografice
Mod de lucru: Pe o plac cromatografic se trag linii paralele la distane de 1cm. La 2cm de
marginea inferioar se aeaz cu micropipeta cte o pictur din soluia de cercetat i din
soluiile de control. Diametrul fiecrei picturi trebuie s fie cca. 2-3mm, iar cantitatea
maxim de aminoacizi ntr-o pat n jur de 0,03mg/. Placa cromatografic se introduce n
tancul de cromatografiere care conine amestecul de developare, astfel nct captul pe care
au fost pui aminoacizii s ajung n soluie. Petele de aminoacizi nu trebuie s intre n
amestecul de developare. Se las un timp, pn cnd frontul solventului ajunge la 2cm de la
marginea superioar a plcii. Se scoate placa, se usuc n etuv la 100C i se pulverizeaz
cu ninhidrin. Se introduce 10 minute n etuv la 90C, apoi se observ poziia i intensitatea
culorii petelor aprute i se calculeaz Rf-ul.
Distana de la linia de start la pat
Rf =
Distana de la linia de start pn la frontul solventului
Acidul aminat
Alanin
Arginin
Cistein
Cistin
Acid glutamic
Glicin
Histidin
Izoleucin
Leucin
Lizin
Metionin
Ornitin
Fenilalanin
Prolin
Serin
Treonin
Triptofan
Tirozin
Valin

Rf
0.38
0.20
0.07
0.08
0.30
0.26
0.20
0.72
0.73
0.14
0.55
0.15
0.68
0.43
0.27
0.35
0.50
0.45
0.60

Culoarea ninhidrin
Violet
Violet
Brun
Brun
Violet
Violet
Violet-brun
Violet
Violet
Violet
Violet
Violet
Violet
Galben
Violet
Violet
Violet-brun
Albastr
Violet

47

http://www.reachdevices.com/TLC_aminoacids.html
http://www.youtube.com/watch?v=tDaKxskUwA0

48

8.1Titrul proteic. Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen

Laptele de vac contine n medie 3,4% proteine reprezentate de:


cazeina (2,7%);
lactalbumina (0,4%-0,5%);
lactoglobulina (0,1-0,2%).
In structura proteinelor aminoacizii sunt legai ntre ei prin legturi peptidice ntre
gruparea amino a unui aminoacid i gruparea carboxilic a altui aminoacid. In lanurile
polipeptidelor exist i grupri amino i carboxilice libere. Pentru determinarea cantitativ
este necesar punerea n libertate a aminoacizilor din macromolecula protidic. In acest scop
soluia este supus hidrolizei alcaline.
Principiul metodei
Grupele aminice libere ale proteinelor (-NH2 ) reactioneaza cu formaldehida formnd grupri
(N=CH2) caracteristice bazelor Schiff. n acest fel aciditatea datorata gruparilor carboxilice
(-COOH) se poate msura prin titrare cu soluie de hidroxid de sodiu si se poate corela cu
continutul de proteine prin nmultirea cu un factor empiric. Reactiile chimice sunt
urmtoarele:

Reactivi: - NaOH 0,143N. 1ml din aceast soluie corespunde la 1% proteina


- aldehid formic soluie 40%, neutralizat fa de fenolftaleina inainte de folosire
- oxalat de potasiu soluie 28%, neutralizat fa de fenolftaleina inainte de folosire
- sulfat de cobalt heptahidrat, soluie 5%
- fenolftalein soluie alcoolic 2%
49

Mod de lucru:
Prepararea probei martor
ntr-un vas Erlenmeyer de 100ml se introduc 25ml lapte, 1ml soluie de oxalat de potasiu i
0,5ml soluie de sulfat de cobalt, dup care se omogenizeaz. Se dezvolt imediat o culoare
roz care este stabil. Fenolftaleina s-a adugat la neutralizarea celor dou soluii.
Determinarea titrului proteic: Intr-un vas Erlenmeyer asemntor cu al probei martor se
introduc 25ml lapte, 1ml soluie de oxalat de potasiu i eventual 2-3 picturi de fenolftalein.
Se omogenizeaz bine i dup 1 minut se neutralizeaz cu hidroxid de sodiu pn la o
coloraie identic cu a probei martor. Prin aceast operaie s-au neutralizat toi acizii liberi din
prob. Pentru ca determinarea s fie precis este necesar ca la aceast neutralizare s nu se
ntrebuineze un volum de hidroxid de sodiu 0,143N, mai mare de 1,75 ml. Laptele cu
aciditate proprie mai mare nu este apt pentru determinarea proteinelor prin aceast metod.
In proba astfel neutralizat se adaug 5ml aldehid formic i se omogenizeaz. Culoarea
roz dispare brusc i laptele i reia culoarea alb specific. Dup 1 minut se titreaz din nou
cu soluia de hidroxid de sodiu pn la culoare identic cu a probei martor, notndu-se
volumul de hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare.
In condiiile n care s-a respectat ntocmai metoda de lucru descris, volumul soluiei de
hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare reprezint coninutul de proteine, n procente al
probei de lapte supus analizei.
Rezultatul se exprim ca media aritmetic a dou determinri efectuate n aceleai condiii.
Metoda are caracter orientativ.
Titrul proteic =V ,
unde V este volumul de solutie NaOH 0,143N (n ml) folosit la a doua titrare.
Rezultatul se exprima prin media a doua determinari efectuate pe aceeasi proba.
Calcul si observatii:

50

8.2. Determinarea coninutului de cazein din lapte


Principiul metodei
Metoda are la baz determinarea titrului proteic prin metoda Sorensen.Formaldehida adugat
n lapte blocheaz gruprile amino, din proteine si determin creterea aciditii libere.
Msurarea nivelului aciditii libere dup blocarea gruprilor aminice st la baza determinrii
proteinelor din lapte.
Mod de lucru
Intr-un balon Erlenmeyer de 100 ml se adaug 10 ml lapte; 0,5 ml soluie alcoolic de
fenolftalein i se titreaz cu NaOH 0,1 M pn la culoarea roz. Adugm 2 ml formaldehid
20% i se titreaz din nou cu NaOH 0,1M pn la apariia coloraiei roz care persist 30
secunde.
Coninutul de casein se calculeaz cu ajutorul formulei urmtoare
Casein g% = V x 1,47
Unde, V = volumul NaOH folosit la a doua titrare
1,47 factor de conversie pentru csei
Coninut mediu de cazein n diferite tipuri de lapte:
vac - 2,60%,
capr - 2,90%,
oaie - 4,50%,

51

9.1.Determinarea proteinelor - metoda biuretului


Principiul metodei
Sulfatul de cupru n mediu bazic reacioneaz cu substanele care conin 2 sau mai
multe legturi peptidice formnd un complex colorat n albastru- violet. Intensitatea culorii
este direct proporional cu numrul legturilor peptidice din protein. Numele metodei
provine de la compusul biuret H2N-CO-NH-CO-NH2 care d reacie pozitiv tipic. Metoda
este folosit pentru determinarea unor cantiti relativ mari de protein (1-20 mg).
Reactivi
- Soluie standard de albumin seric bovin 5mg/ml preparat extemporaneu
- Reactiv biuret (3g CuSO4 x 5 H2) si 9 g tartrat de sodiu si potasiu in 500 ml solutie NaOH
0,2M, se adaug 5g KI i se aduce la 1 l cu NaOH 0,2 M.
- extract proteic total obinut prin centrifugarea unui omogenat (1g tesut hepatic /10 ml ap
distilat)
Mod de lucru
In 6 eprubete se pipeteaz:
Nr.
crt
1
2
3
4
5
6

ml solutie
standard
0
0,1
0,5
1,0
1,5
2,0

ml apa
distilat
2,0
1,9
1,5
1,0
0,5
0

Protein
mg/2ml
0
,5
2,5
5
7,5
10

Absorbanta
DO

In fiecare eprubeta adugm 3 ml de reactiv biuret. Probele se agit energic, se


incubeaz timp de 10 minute la 37 C si dup rcire se colorimetreaz la 540 nm fa de ap.
Se construiete o curb de etalonare trasnd pe abscis mg/2ml protein- iar pe ordonat DO
la 540nm. Se determin concentraia proteic n extractul proteic total, incubnd 2ml preparat
cu 3ml reactiv biuret la 37C timp de 10 minute. Dup rcire, proba se colorimetreaz la 540
nm fa de ap iar DO msurat este transformat in concentratie proteic mg/2ml cu
ajutorul curbei de etalonare.

Dac intensitatea culorii este prea puternic se dilueaz

preparatul proteic pn cnd DO se ncadreaz n curba de etalonare. Valorile obinute trebuie


multiplicate prin factorul de diluie.

52

Calcule i observaii

53

9.2.Determinarea proteinelor metoda Kjeldhal principiul metodei


Componenta de baz, cu valoare nutritiv, din majoritatea produselor alimentare de
origine animaldar si vegetal este proteina. Calitatea acestor produse se apreciaz, n primul
rnd, dup coninutul lor n proteine.
Proteinele dintr-un anumit tipde aliment au un coninut de azot cu valoare relativ
constant, la 100g proteine. Cunoscnd coninutul de azot se poate calcula cantitatea de
proteine cu ajutorul unui factor de convertire
Exemplu pentru carne -Continutul de azot este 16 g la 100 g protein. Factorul de
convertire este 6,25 (rezultat din raportul 100/16).
Principiul metodei
Proba de analizat se mineralizeaz prin nclzire cu acid sulfuric concentrat n
prezena unui catalizator. n urma degradrii proteinelor i a celorlali compui cu azot, se pun
n libertate ionii de amoniu care se combin cu acidul sulfuric formnd bisulfatul de amoniu.
Amoniacul pus n libertate prin alcalinizare puternic este distilat i titrat.

TEST

1. Care sunt metodele de obinere a extractelor proteice ?


2. Care este rolul proteinelor n organism ?
3. De cte feluri pot fi reaciile de precipitare ?
4. Ce este punctul izoelectric ?
5. Care sunt cele trei etape ale metodei Kjeldahl ?

54

Laborator 10. Enzime


Enzimele sunt substane de natur proteic, fiind constituite fie numai din resturi de
aminoacizi, legai prin legturi peptidice, fie din catene polipeptidice i alte componente
organice sau anorganice. Acestea prezint structuri spaiale complicate.
Enzimele, numite i biocatalizatori, accelereaz viteza reaciilor biochimice de 10 8
1011 ori prezentnd o capacitate catalitic superioar catalizatorilor chimici.Reaciile care n
laboratoarele de chimie decurg n condiii speciale de temperatur, presiune, pH, n prezena
enzimelor decurg n condiii moderate.
Activitatea catalizatorilor, indiferent de natura lor chimic, se caracterizeaz prin
faptul c poate fi decelat cnd acetia se gsesc n cantiti foarte mici. La sfritul reaciei
att catalizatorul chimic ct i enzima se regsesc, ntr-o stare neschimbat, putnd participa
la un nou atac catalitic.
Enzimele au un grad deosebit de complexitate, motiv pentru care sunt uor
denaturabile prin modificarea temperaturii, pH-ului, prin aciunea razelor UV, a
ultrasunetelor, prin congelri i decongelri repetate etc.
Deosebirea esenial dintre enzime i catalizatorii chimici const n nalta specificitate
de aciune a enzimelor, avnd capacitatea de a cataliza un singur tip de reacie biochimic,
uneori a unei singure substane chimice (specificitate absolut de substrat).
Determinarea activitii enzimatice
Prezena unei enzime ntr-un amestec de reacie poate fi pus n eviden i urmrit
fie prin dispariia substratului, fie prin apariia unui produs de reacie. Enzima este incubat
cu substratul, n condiii de concentraii, pH i temperatur strict controlate i din amestecul
de reacie se scot la anumite intervale de timp probe, care sunt analizate.
Fiecare prob este nsoit de un martor, n scopul depistrii reaciilor chimice
nespecifice i spontane care au loc independent de enzim.
Dac urmrim variaia n timp a vitezei enzimatice vom constata c la nceput acest
parametru crete linear, dup care scade. Abaterea de la linearitate a vitezei de reacie n
funcie de timp poate fi datorat fie inversrii sensului reaciei (echilibrul este atins i reacia
invers devine mai important), fie scderii n timp a concentraiei substratului cnd enzima
nu mai este saturat n acesta, fie inhibiiei printr-un produs al reaciei. Pentru a minimaliza
aceste efecte, n cercetrile enzimologice se determin viteza iniial de reacie v o cand v
crete linear n timp.
55

Activitatea enzimatic este frecvent exprimat n uniti (U), astfel c o unitate reprezint
cantitatea de enzim ce catalizez transformarea a 1 micromol de substrat ntr-un minut, n
condiii definite. Unitatea internaional sistematic a activitii enzimatice este katal-ul (kat)
care reprezint transformarea unui mol de substrat pe secund .
Puritatea unei enzime se exprim prin activitatea specific, care este numrul de uniti
enzimatice (U) pe mg protein sau numrul de catali pe kg protein.

10.1. Evidenierea unor enzime


10.1.1.Evidenierea peroxidazei din hrean
Peroxidaza catalizeaz oxidrile cu oxigen peroxidic, deci activeaz i urmtoarea reacie
n care donorul de electroni este pirogalolul.
Trecerea culorii n portocaliu-brun indic apariia configuraiei chinonice n purpurogalin.
Reactivi necesari : - peroxidaz (extract apos de hrean)
- pirogalol 2%
- ap oxigenat 0,5%
Mod de lucru : Intr-o eprubet se iau 1ml extract apos de hrean, la care se adaug 0,5ml
pirogalol i dou picturi de ap oxigenat. Imediat apare o culoare portocalie brun.
10.1.2. Evidenierea activitii peroxidazei din lapte
Peroxidaza existent n laptele care nu a fost supus unui tratament termic descompune apa
oxigenat cu eliberare de oxigen. Evidenierea acestui fenomen se poate face prin reacii de
culoare specifice ale oxigenului cu unele substane uor oxidabile, cum ar fi ; parafenilen
diamina, tinctura de guaiac sau benzidina.
Evidenierea activitii peroxidazei este util pentru identificarea laptelui nepasteurizat.
Reactivi necesari : - ap oxigenat 3%
- parafenilendiamin
Mod de lucru : Intr-o eprubet se introduc 5ml lapte, 5 picturi ap oxigenat i cca. 1g
amestec de parafenilendiamin cu nisip, dup care se omogenizeaz, se las n repaos 2
minute, apoi se citete reacia.
In cazul prezenei peroxidazei (lapte nepasteurizat) lichidul din eprubet capt culoare
albastr cenuie
In cazul absenei peroxidazei (lapte corect pasteurizat) lichidul nu-i modific culoarea sau
capt o tent cenuie slab perceptibil.
56

10.2. Influena factorilor fizico-chimici asupra activitii enzimelor


10.2.1.Influena temperaturii asupra activitii enzimelor
Aciunea temperaturii asupra reaciilor enzimatice este dubl:
- modific viteza reaciei enzimatice
- denatureaz enzima, respectiv apoenzima care este de natur proteic
Majoritatea enzimelor au o temperatur optim, ntre 20-40C. La temperaturi sub 0C,
activitatea enzimelor scade foarte mult, fr s fie distruse. Sub form uscat, enzimele i
pstreaz activitatea i unele pot rezista scurt timp la o temperatur de 100C. Se prefer ca
temperatur de lucru +37C, deoarece distrugerea enzimei este practic nul, iar viteza reaciei
este suficient de mare.
Reactivi necesari : - saliv diluat
- soluie de amidon 1% n clorur de sodiu 0,3%
- reactiv Fehling
Mod de lucru: In dou eprubete se msoar cte 4ml soluie amidon 1% n clorur de sodiu
0,3%. Intr-o eprubet se adaug 1ml saliv proaspt, nefiart, iar n a doua 1ml saliv fiart.
Se agit i se introduc n termostat la + 37C timp de 15 minute. Se adaug n fiecare
eprubet 1ml reactiv Fehling i se fierbe pe baie de ap 5 minute. In eprubeta cu saliv
nefiart, reactivul Fehling este redus la suboxid de cupru de culoare roie crmizie. In
eprubeta cu saliv fiart, unde amilaza este distrus prin fierbere, amidonul; nefiind
hidrolizat, reactivul Fehling nu este redus, deci culoarea nu se schimb.

57

10.2.2. Influena pH-ului asupra activitii enzimatice.


Fiecare enzim dezvolt o activitate maxim la o anumit valoare a pH-ului= pH optim.
Extractul enzimatic s-a obinut din cartofi 10 g cartofi se mojareaz cu 5 g carbonat de
calciu. Amestecul se trece cantitativ in cilindru de 100 ml si dup o or se filtreaz prin vat.
Modul de lucru
Reactiv
Extract enzimatic
HCl 1 N (pH=2)
NaOH 1 N (pH=14)
Ap distilat (pH=7)
Se agit
H2O2 1%

Balon 1
5 ml
2 ml
-

H2SO4 15%
KI 10%
Molibdat de amoniu 1%

Balon 2
5 ml
2 ml

Balon 3
5 ml
2 ml
-

Balon 4
5 ml

5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
Se las n repaos 15 minute
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
2-3 picturi.
Agitare energic 2-3 minute

Probele se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1N n prezena amidonului ca indicator pn


la decolorare.
Calcul
Datele experimentale exprimate n ml tiosulfat de sodiu se scad din ml tiosulfat folosit
la titrarea probei martor. VM VP
Folosind aceste date si pH-ul la care a acionat enzima se traseaz curba care indic
influena pH-ului asupra activitii enzimei.
Calcule i observaii laborator 10.

58

TEST

1. Ce sunt enzimele i ce rol au n organism ?


2. Care este diferena ntre cataliza enzimatic i cea chimic ?
3. Care sunt factorii care influeneaz activitatea enzimatic ?
4. Care este enzima care catalizeaz hidroliza amidonului ?
5. Ce importan prezint determinarea activitii peroxidazei n industria alimentar
6. Care este enzima determinat din mierea de albine, ce constituie un criteriu de
autenticitate al mierii de albine ? Descriei principiul metodei de lucru folosite.

59

Laborator 11-12. Vitamine


Celulele conin pe lng componentele lor de baz, anumite substane organice, active la
concentraii foarte mici, numite vitamine, care sunt vitale pentru organism. Unele organisme
nu pot sintetiza vitamine i trebuie s le obin din surse exogene.
Lipsa vitaminelor din organism (avitaminoz), insuficiena (hipovitaminoz) sau
concentraia crescut (hipervitaminoz) dau natere la tulburri metabolice mai mult sau mai
puin grave.
Vitaminele au structur chimic heterogen i din aceast cauz clasificarea lor este foarte
dificil.Cel mai des folosit criteriu este n funcie de solubilitate i dup acest criteriu exist
vitamine liposolubile (A, D, E, K) i vitamine hidrosolubile (vitaminele B, C, PP).
Fiecare vitamin prezint reacii caracteristice majoritatea lor fiind reacii de culoare.

11.1. Metode de identificare ale vitaminelor


Identificarea vitaminei A
a. Vitamina A d cu acidul tricloracetic o coloraie galben care vireaz n albastru.
Reactivi necesari: - soluie uleioas de vitamina A 0,1mg%
- soluie cloroformic de acid tricloracetic 30%
Mod de lucru: Intr-o eprubet se msoar 0,5ml soluie uleioas de vitamina A i 1ml soluie
acid tricloracetic 30%. Apare o coloraie galben care vireaz n albastru.
b. Vitamina A tratat cu fenol n prezena guaiacolului dau o coloraie roie purpurie.
Reactivi necesari : - soluie uleioas de vitamin A 0,1mg%
- guaiacol cristale
- fenol p.a.
- acid clorhidric concentrat
- cloroform
Mod de lucru : Intr-o eprubet se msoar 0,5ml soluie vitamin A la care se adaug un
cristal de guaiacol, 2 picturi fenol, 1ml acid clorhidric concentrat i 5ml cloroform. Dup
agitare apare o coloratie roie-purpurie.
c. Reacia dintre vitamina A i clorura de stibiu n soluie cloroformic, cu formarea unei
coloraii albastre, poart denumirea de reacia Carr-Price. Reacia poate fi folosit i pentru
dozarea vitaminei A.
60

Reactivi necesari : - concentrate de vitamina A


- cloroform purificat
- soluie cloroformic de clorur de stibiu
Mod de lucru : la 4-5 picturi de soluie de vitamina A se adaug 1ml cloroform i 1-2 ml
soluie cloroformic de clorur de stibiu. Se agit coninutul eprubetei. Apare o coloraie
albastr proporional cu coninutul de vitamina A.
In cazul determinrilor cantitative se compar culoarea obinut cu o scar etalon sau
colorimetric.
Identificarea vitaminei D
a. Reacia cu aldehide: Vitaminele D reacioneaz cu aldehidele aromatice (vanilin,
furfural), n prezena acidului percloric, cu formarea de produi colorai.
Reactivi necesari : - soluie benzenic de vitamina D
- soluie 0,1% de aldehid aromatic n benzen
- acid acetic glacial
- amestec de acid percloric ; 2ml aldehid acetic se trateaz
2,5ml acid acetic glacial i se nclzete la 95-100C, timp
de 30 minute .
Mod de lucru : Intr-o eprubet se iau 1ml soluie benzenic de vitamina D i 1ml de aldehid
aromatic n benzen i se nclzesc la fierbere. Se adaug apoi dou picturi de reactiv
percloric i se fierb nc un minut, apoi se las s se rceasc la temperatura camerei. Soluia
devine tulbure, colorat n verde. Se adaug 1,5ml acid acetic i se urmrete culoarea
format.
a. Reacia cu clorura de stibiu : soluia benzenic de vitamina D se trateaz cu cloroform
n raport de 1:10 i apoi cu o soluie cloroformic de clorur de stibiu.i se obine o coloraie
galben-portocalie.
b. Reactia cu anilin
Reactivi necesari: - untur de pete
- amestec anilin : HCl, n raport 15:1
Mod de lucru: Intr-o eprubet se introduc 3ml untur de pete sau soluie uleioas de
vitamina D, i 1ml amestec de anilin :HCl. Se agit uor si se nclzete la fierbere. Emulsia
galben devine la nceput verde ters apoi trece n rou. Dup 2-3 minute emulsia se separ n
dou straturi dintre care cel inferior are o culoare roie intens.

61

Identificarea vitaminei E
a. Reacia cu acidul azotic
- tocoferolul se oxideaz n prezena clorurii ferice sau a acidului azotic la tocoferilchinon, de culoare roie
Reactivi necesari : - soluie uleioas de vitamina E
- etanol
- acid azotic concentrat
Mod de lucru : Se iau ntr-o eprubet cteva picturi dintr-o soluie uleioas de vitamina E,
se trateaz cu cteva picturi de acid azotic concentrat. Coninutul se nclzete de la sine i
apare o coloraie brun roie (se lucreaz cu atenie i la nevoie se rcete).
c.Reacia cu clorura feric
Datorit gruprii hidroxil tocoferolii dau reacie pozitiv cu clorura feric. Reacia este
specific fenolilor, care sunt oxidai la compui chinonici.
Reactivi necesari : - soluie alcoolic de vitamin E 0,1mg %
- soluie clorur feric 10%
Mod de lucru : Intr-o eprubet se introduc 0,5ml solutie alcoolic de vitamin E i 2-3
picturi soluie clorur feric 10%. Dup agitare apare o coloratie galben-roiatic
Identificarea vitaminelor B
a.Vitamina B1: In mediu alcalin este oxidat de fericianura de potasiu la tiocrom de culoare
roie, care prezint o fluorescen albastr n UV.
Reactivi necesari : - soluie vitamina B1 1g
- solutie de fericianur de potasiu 2%
- metanol
- NaOH 30%
- izobutanol
- etanol 96
Mod de lucru: Intr-o plnie de separare se pipeteaz 1ml din soluia de vitamin, 4 picturi
metanol i 1-2 picturi de fericianur de potasiu 2%. Se agit i se adaug 1ml sol. NaOH
30%. Se las n repaus 2 minute i se introduc 10ml izobutanol, dup care se agit energic. Se
las n repaus cteva minute, dup care timp se separ cele dou straturi. Stratul inferior apos
se ndeprteaz i se reine stratul cu izobutanol care conine tiocromul. Se spal cu 3ml ap
distilat. Se separ apa, iar stratul de izobutanol se tranvazeaz ntr-o eprubet i se adaug

62

2ml etanol. Eprubeta se aeaz n faa unei surse de lumin UV, cnd se observ apariia unei
fluorescente albastre.
b. Vitamina B2: prezint fluorescen galben-verzuie i sub aciunea reductorilor trece n
leucoderivat, care nu mai prezint fluorescen. Reacia este reversibil i i recapt
fluorescenta n prezena oxigenului.
Reactivi necesari : - soluie vitamina B2 50mg %
- zinc metalic granule
- soluie acid clorhidric 10%
Mod de lucru: Intr-o eprubet se msoar 1ml soluie vitamin B2, care prezint o
fluorescen galben-verzuie. Se adaug 20-30 mg zinc metalic i 2ml acid clorhidric 10%. Se
agit de cteva ori i se observ dispariia fluorescenei. Se astup eprubeta cu degetul i se
agit. Se observ apariia fluorescenei, datorit oxidrii vitaminei sub aciunea oxigenului
atmosferic.
Identificarea Vitaminei C
a. Vitamina C datorit proprietii de a se oxida uor, reduce srurile de argint la argint
metalic.
Reactivi necesari : - soluie vitamin C 3g%
- soluie azotat de argint 5g%
- soluie hidroxid de amoniu 20%
Mod de lucru: Intr-o eprubet se msoar 1ml azotat de argint i se adaug hidroxid de
amoniu pictur cu pictur pn la dizolvarea precipitatului format iniial. Se adaug 2ml
soluie de vitamin C i se nclzete pe baie de ap 5-10 minute. Va aprea argintul metalic
depus pe pereii eprubetei.
b. Vitamina C se extrage din esuturi cu soluii slab acide pentru a fi evitat alterarea ei, apoi
se identific cu ajutorul fericianurii de potasiu. In prezena clorurii ferice, vitamina C, reduce
fericianura de potasiu, formnd albastrul de Berlin.
Reactivi necesari : - soluie de HCl 2%
- fericianur de potasiu 1%
- clorur feric soluie 1%
Mod de lucru: Se cntresc 4-5g din materialul vegetal i se introduc ntr-un mojar unde se
mojareaz cu nisip i HCl 2%. Se aduce apoi volumul la 100ml cu acid clorhidric i se
filtreaz. Din acest lichid se introduc 5ml ntr-o eprubet i se trateaz cu o pictur de sol.
fericianur de potasiu i o pictur de sol. de clorur feric. Rezult o coloraie albastr.
63

11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale


Se bazeaz pe proprietatea reductoare a acidului ascorbic. Acidul ascorbic prin
oxidare se transform n acid dehidroascorbic. Dozrile se fac prin volumetrie iar solutia de
titrare este - iodat de potasiu,
Extracia din produse vegetale
15 g produs vegetal se mojareaz timp de 10 minute cu 2,5 g de nisip si 10 ml de acid
metafosforic. Se complecteaz la 50 ml cu acid metafosforic, se filtreaz sau se
centrifugheaz. Din filtrat se iau 10 ml si se dozeaz vitamina C la fel ca din suc.
Dozarea vitamine C
Reactivi: - soluie standard vitamina C 1 mg/ml
- amidon 1%
- HCl 1M
- Iodat de K 0,004N (1,2g KI + 0,478g I2, se aduce la 1000 ml cu ap distilat).
- acid metafosforic 5%
10 ml de soluie standard de vitamina C se amestec cu 20 ml ap distilat, 2 picturi
de HCl 1 M i 15 picturi de amidon 1%, se titreaz cu iodat de K pn la culoarea albastr
care persist 15 secunde. Se noteaz cu V volumul de iodat folosit la titrare.
Se repet aceleai operaii pentru suc sau pentru supernatant, n loc de 10 ml soluie
standard se vor folosi 10 ml suc sau filtrat.
Se noteaz cu V1 volumul de iodat folosit la titrare.
Calcul
Pentru suc
10 x V1
vitamina C mg /10 ml suc = ------------V
Pentru vegetale
10 x V1 x 5
vitamina C mg /100 g produs = ----------------- x 100
Vxm
V = vol. de iodat folosit la titrarea soluiei standard
V1 = vol. de iodat folosit la titrarea probei
5 = dilutia
10 = ml solutie standard luata in lucru
m = masa probei (15g)
100 = raportarea la 100 g produs
64

Calcul si observatii

65

11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans


In mediu acid vitamina C este oxidat la acid dehidroascorbic de ctre reactivul Tillmans
(2,6-diclorfenolindofenol) de culoare roie, care se reduce consecutiv transformndu-se n
leucoderivatul corespunztor incolor.

Reactivi necesari : - soluie Tillmans-10mg 2,6-diclorfenolindofenol n 100ml ap distilat


se pstreaz cteva zile la frigider.
- soluie de acid metafosforic 5%n ap distilat
- acid acetic glacial
- carbonat de calciu pulbere
- soluie de acetat de plumb 5%
- material de analizat
Mod de lucru :
Stabilirea titrului n acid ascorbic al soluiei de reactiv Tillmans
Se pipeteaz ntr-un balon Erlenmeyer 10 ml soluie de vitamina C i se titreaz din biureta
cu soluie Tillmans cu pictura, pn n momentul n care culoarea vireaz n roz i persist
30 secunde.
T= 0,088 10 / V
n care:
0,088 = cantitatea de acid ascorbic, n mg existent n 1ml
10 = volumul soluie de acid ascorbic luat n lucru
V= volumul soluiei de indicator folosit la titrare
Intr-un flacon Erlenmeyer se pun 20ml lapte, peste care se adaug sub agitare, 8ml soluie
de acid metafosforic . Se omogenizeaz i apoi se filtreaz. Inr-un alt flacon Erlenmeyer se
pipeteaz 14ml filtrat (echivalentul a 10ml de lapte) i se titreaz cu reactiv Tillmans, pn la
apariia culorii roz persistente 30 de secunde.
66

Calcul : Coninutul n vitamin C, exprimat n mg la 100ml lapte, se calculeaz cu ajutorul


formulei:
Vitamin C, mg la 100ml = VT100 / V1
n care:
V = volumul soluiei de indicator, n ml, folosit la titrare
T = titrul soluiei de indicator
V1= volumul de lapte corespunztor celor 14ml filtrat luat n lucru (10ml)
Coninutul vitaminei C din lapte este cuprins ntre 10 i 80 mg/l cu variaii n funcie de
specie , tipul de alimentaie i sezon, fiind mai ridicat vara cnd animalele se hrnesc cu iarb
i cu diferite nutreuri verzi.
Calcule i observaii laborator 12

67

TEST

1. Ce este acidul ascorbic, ce rol are n organism ? Dati exemple de surse naturale de acid
ascorbic.
2. Mentionai pentru fiecare vitamin din grupul B, numele i rolul n organism
3. Ce rol are vitamina A n organism, i care sunt produsele alimentare bogate n vitamina
A? Ce sunt provitaminele A?
4. Indicai o metod de identificare a vitaminei A care poate fi utilizat si pentru
determinarea cantitativ a vitaminei A.
5. Care sunt factorii care influeneaz stabilitatea vitaminelor ? Dai exemplu pentru
vitamina A, B1 i C.

68

Laborator 13.Pigmeni
Culoarea diferitelor organe ale plantelor se datoreaz unor substane colorate, numite
pigmeni.
Pigmenii naturali au rol biochimic i fiziologic foarte important. Iau parte la
numeroase procese metabolice, formeaz sisteme de oxidoreducere, dau gustul, aroma i
coloritul unor produse alimentare. Pigmenii clorofilieni au rol esenial n procesul de
fotosintez
Sub aspect chimic, pigmenii naturali sunt substane foarte heterogene. Ei se gsesc
n celule i esuturi n stare liber sau sub form de cromoproteide, glicozide etc.In general se
gsesc n cantiti mici i se determin prin metode cromatografice, colorimetrice i
spectrofotometrice.
13.1.Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subire
Amestecul de pigmeni este extras cu un solvent potrivit si se separ prin
cromatografie in strat subtire pe placi acoperitecu silicagel-material adsorbant, fiecare
pigment situndu-se ntr-o anumit zon, de-a lungul plcii.
Reactivi necesari :
- aceton
- hexan
- sulfat de sodiu anhidru
- mojar cu pistil
- nisip sau sticl pisat
- tuburi capilare
- hrtie de filtru
Obinerea extractului: pentru prepararea extractului de pigmeni se mojareaz 2g frunze de
spanac cu puin nisip i 3 ml aceton.Se decanteaz soluia si se trece pe o plnie cu vat, se
stoarce vata pentru a recupera extractul. Poriunile de extract se reunesc ntr-un tub cu capac.
Reziduul din mojar se reia cu 3 ml de aceton, se repet operaia anterioar. La final se
adaug 3ml de aceton i 5ml de hexan n mojar i se mojareaz pn reziduul se decoloreaz.
Soluia obinut se trece intr-o eprubeta cu dop.
Se adaug 3 ml de saramur se agita si se las s se separe. Startul de sus va fi verde inchis
iar cel de jos verde deschis.
Extractul splat se usuc adugnd sulfat de sodiu anhidru pn la limpezirea soluiei.
69

Cromatografie -Mod de lucru:


Soluia cu amestecul se aplic n picturi la baza plcii, cu ajutorul unei micropipete. Se usuc
picturile prin suflare i se introduce placa n amestecul de eluare cu captul cu picturi n jos
astfel ca picturile s nu ajung n eluent.
Linia de start trebuie s fie la 1,5-2 cm.
Developarea dureaz aproximativ 30 de minute.Identificarea componentelor se face prin
compararea poziiei lor cu cea a componentelor din soluii etalon sau prin stabilirea valorilor
Rf.
La terminarea separrii, pe plac ordinea pigmenilor de sus n jos va fi :
-

caroten

diceto-carotenoide

cetohidroxi-carotenoide

hidroxi-carotenoide
Spoturile obinute se pot determina i cantitativ folosind metode colorimetrice.

http://www.uniregensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC-e.htm
Calcule i observaii laborator 13.1.

70

13.2. Determinarea spectrofotometric a coninutului de clorofil


Mod de lucru
-

Se cntresc 100 mg frunz /prob.

Se mojareaz cu 10 ml aceton 80% cu ajutorul nisipului sau a sticlei pisate

Se filtreaz si filtratul se colecteaz intr- eprubet.

Determinarea concentratiei de clorofil.


Blanckul folosit este acetona. Se umple cuva spectrofotometrului cu extractul obtinut
si se citesc absorbantele la urmtoarele lungimi de und: 663 nm; 645 nm; 470 nm.
Calcule:
Folosind ecuaia Arnon se calculeaz continutul de clorofila
Chl a (mg/g) = [(12.7 A663) - (2.6 A645)] ml acetona / mg frunze
Chl b (mg/g) = [(22.9 A645) - (4.68 A663)] ml acetona / mg frunze
Total Chl = Chl a + Chl b.
C x+c = 1000 A470 1.90Chla 63.14 Chlb/214, (x = xantofila si caroten)

71

TEST

1. Care este rolul pigmenilor naturali?


2. Care este rolul clorofilei n organismele vegetale ?
3. Indicai metodele cel mai des utilizate pentru identificarea si dozarea pigmenilor.

72

Laborator 14. Evaluare laborator.


Determinarea unor parametrii, efectuarea unor calcule

73

BIBLIOGRAFIE
1. Dumitru IF., - Biochimie - Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti 1980.
2. Dumitru IF., D.Iordchescu Introducere n enzimologie- Ed. Medical, Bucureti ,
1981.
3. Iordchescu D., I.F.Dumitru-Biochimie practic Tipografia Universiti, Bucureti,
1980.
4. Neamu G.,- Biochimie alimentar- Ed.Ceres, Bucureti, 1997
5. Neamu G.,- Lucrri Practice de biochimie alimentar- Tipo Agronomia, Cluj-Napoca,
1997
6. Popescu N., Meica S., - Noiuni i elemente practice de chimie analitic sanitar
veterinar, Ed.Diacon Coresi, Bucureti, 1993.
7. Purcrea C.,- Biochimie alimentar practic, Ed.Univ.Oradea,2003.
8. Purcrea C., Biochimie agroalimentar. Edit.Univ. Oradea, 2005.
9. Socaciu C.,- Chimie alimentelor- Ed.Academic.Press, Cluj-Napoca, 2003.
10. Socaciu C., O.Bobi - Caiet de lucrri practice, Chimia alimentelor, Ed. Academic
Press, Cluj-Napoca, 2003.

74

75