Capitolul 6

M surarea activit ii enzimatice

6.1. Determinarea activit ii enzimatice a unor enzime din diverse surse 6.1.1. Determinarea activit ii catalitice a peroxidazei din hrean Peroxidaza din hrean este o enzim (o glicoprotein ) cu masa molecular de 44 KDa i care posed protohemin IX drept grupare prostetic . Pentru o activitate catalitic corespunz toare hemul este indispensabil. Mecanismul de reac ie al peroxidazelor este descris n Schema 6.1. Enzima reac ioneaz cu un echivalent de ap oxigenat , reac ie n urma c reia rezult un cation-radical, n care atomul de fier i schimb starea de oxidare (de la III la IV). Aceast reac ie de oxido-reducere implic cedarea a doi electroni. Un echivalent rezult de la ionul FeIII, dnd na tere la intermediarul oxiferil (FeIV=O). Acest intermediar, I, oxideaz un substrat organic (AH2) la radicalul corespunz tor (AH). Compusul rezultat sufer din nou o reac ie de oxidare (cel de-al doilea electron este cedat) conducnd la intermediarul II, n care centrul oxiferil este coordinat de ligandul porfirinic normal (dianionic). n final, compusul II, este redus la starea nativ (feric ) concomitent cu oxidarea substratului. Func ia peroxidazei este de a converti apa oxigenat , compus care poate produce unele reac ii metabolice nedorite, n ap i oxigen:

144

Int roduc ere n l abor a torul d e bioc hi mi e

Oxigenul poate adesea reac iona cu al i compu i din celul pentru a produce compu i secundari.

Schema 6.1. Mecanismul de ac iune al peroxidazelor n forma simplificat

Reac ia catalizat de peroxidaz poate fi m surat prin urm rirea form rii oxigenului rezultat prin dou variante: a. acumularea gazului ntr-un sistem nchis i m surarea acestuia cu ajutorul unui nanometru;

Figura 6.2. Determinarea enzimatic a peroxidazei prin intermediul oxid rii guiacolului la un dimer colorat

Ac t iv it a te a e nz i ma ti c

145

b. prin apari ia unei forme active a oxigenului. O serie de compu i reac ioneaz cu oxigenul i sunt transforma i n compu i colora i. Drept donor de hidrogen se pot utiliza 5amino-1,4-ftalazin-diona (luminol), 3-amino-9-etilcarbazolul (AEC), acid 5-amino-salicilic (5AS), 4-cloro-1-naftolul (4C1N), 3,3-diamino-benzidina (DAB), o-dianisidina, guiacolul, o-fenilendiamina (OFD), acid ascorbic, rezorcina, pirogalol. Peroxidaza este o enzim ideal pentru experimente, deoarece este u or de izolat din diferite surse (bacterii, vegetale, ciuperci sau animale). Aplica ii Peroxidaza a fost folosit cu succes n imunologie prin legarea acestei enzime de anticorpi n scopul localiz rii antigenilor. Reactivi i materiale 1) Solu ie stoc de ap oxigenat 10 mM (n tampon fosfat 100 mM pH 7); 2) Solu ie tampon 100 mM (fosfat pH 6); 3) Solu ie o-dianisidin 30 mM (10 mg ntr-un ml metanol); 4) Solu ie tampon de reac ie: 9,6 ml solu ie tampon + 0,1 ml o-dianisidin 30 mM. Modul de lucru ntr-o cuv din plastic se pipeteaz 0,97 ml solu ie tampon de reac ie i 20 l enzim . Se omogenizeaz con inutul dup care se adaug 10 l de ap oxigenat . Se nregistreaz absorban a la 436 nm i 25 C. Se m soar viteza de reac ie utiliznd un coeficient de extinc ie -1 -1 436 = 8300 M cm . Se determin viteza de reac ie men innd constant concentra ia enzimei i temperatura de reac ie variind concentra ia apei oxigenate. Se va m sura viteza de reac ie la 15, 25, 37 C folosind condi iile ini iale de reac ie. Toate m sur torile vor fi repetate de cel pu in 3 ori. Se vor determina urm torii parametri: Vmax, Km i Ea.

146

Int roduc ere n l abor a torul d e bioc hi mi e

Determinarea activit ii peroxidazei cu ajutorul fluorescen ei Sistemul peroxidaza/H2O2 a fost utilizat cu succes pentru detec ia produ ilor de reac ie rezulta i n urma reac iilor catalizate de oxigenaze (P450). n prima faz substratul este un compus aromatic, de exemplu naftalina, care poate fi convertit la compu i aromatici hidroxila i. Compu ii rezulta i (de exemplu, - sau -naftolul) pot fi converti i n urma reac iei de oxidare de la un compus incolor la un substrat fluorescent. Compu ii aromatici hidroxila i formeaz dimeri sau polimeri, care n func ie de condi ii pot fi detecta i prin colorimetrie sau fluorescen , permi nd determinarea compusului ini ial.

Schema 6.3. Detec ia monooxigenazelor prin intermediul unei reac ii enzimatice cuplate n urma c reia rezult un produs fluorescent

Pe aceea i reac ie se bazeaz i detec ia bacteriilor ce produc peroxidaza n medii lichide sau solide prin ad ugarea apei oxigenate. Mutan ii care dau reac ie pozitiv se disting prin propriet i colorimetrice sau fluorescente. Reactivi Solu ie tampon: PBS pH 7,4 (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 la 1 litru solu ie); Solu ie 1: 0,01 M -naftol n metanol; Solu ie 2 (se prepar proasp t ): solu ie diluat de peroxidaza din hrean; Ap oxigenat 30%. Modul de lucru La 975 l solu ie tampon se adaug 10 l solu ie 1. Se adaug 5 l ap oxigenat 30%, 10 l solu ie 2. Rezult produ i de reac ie care prezint fluorescen albastr . Fluorescen a relativ a produ ilor de

Ac t iv it a te a e nz i ma ti c

147

reac ie se m soar dup 1, 5 i 10 min. Se repet m sur torile utiliznd diverse concentra ii de -naftol men innd constan i ceilal i parametri. Toate m sur torile se execut n triplicat. ntreb ri 1. Ce ioni metalici se g sesc n structura peroxidazelor? 2. Care sunt sursele vegetale ce con in o cantitate mare de peroxidaz ? 3. Care este maximul de emisie al compusului fluorescent rezultat n urma conversiei naftolului asistat de peroxidaz ? 4. Poate fi folosit peroxidaza la determinarea concentra iei apei oxigenate?
Bibliografie 1. Tauber, H. i Petit, E.L. (1952) Convenient methods for preparing crystalline catalase from cow liver, JBC, 195, 703. 2. Bisswanger, H. (2004) Practical Enzymology, Wiley-VCH GmbH, Weinhein. 3. Torres, E. i Ayala, M. (2010) Biocatalysis based on heme peroxidises: Peroxidases as potential industrial biocatalysts, SpringerVerlag, Berlin. 4. Moller, K. M. i Ottolenghi, P. (1966) The oxidation of o-dianisidine by H2O2 and peroxidase at neutral pH. C.R Trav Lab Carlsberg, 35(16), 369-389. 5. Claiborne, A. i Fridovich, I. (1979) Chemical and enzymic intermediates in the peroxidation of o-dianisidine by horseradish peroxidase. 2. Evidence for a substrate radical-enzyme complex and its reaction with nucleophiles, Biochemistry, 18 (11), 2329-2335. 6. Hamilton, T.M., Dobie-Galuska, A.A. i Weintstock, S.M. (1999) The o-phenylenediamine-horseradish peroxidise system: enzyme kinetics in the general chemistry laboratory, J Chem Edu., 76(5), 642. 7. Joo H., Arisawa, A., Lin, Z. i Arnold, F.H. (1999), A highthroughput digital imaging screen for the discovery and directed evolution of oxygenases, Chem. Biol., 6, 699-706. 8. http://www.worthington-biochem.com/hpo/default.html