Determinarea conținutului de proteine din diferite produse alimentare prin

metoda Kjeldahl

1. Importanta proteinelor
Proteinele reprezinta un numar mare de compusi organici constituiti din aminoacizi uniti
prin legaturi peptidice, ce formeaza organisme vi si sunt esentiale pentru functionarea lor.
Descoperite in 1838, proteinele sunt acum recunoscute ca fiind principala componenta a celulelor
vii, insemnand mai mult de 50 la suta din greutatea “uscata” a animalelor. Cuvantul proteina vine
din grecescul proteinos care inseamna principal.
Moleculele proteice variaza de la fibre lungi si insolubile care formeaza tesutul de legatura
si parul, pana la globule solubile ce pot trece prin membranele celulare si pot cataliza reactii
metabolice. Sunt specifice fiecarei specii si fiecarui organism. Oameni au aproximativ 30.000 de
proteine diferite, din care doar 2 % au fost pe deplin analizate. Proteinele din dieta, sunt folosite
in principal pentru a construi si pentru a mentine celule, dar descompunerea lor chimica da de
asemeni energie, apropiindu-se de cele 4 calori pe gram, generate de hidrocarbonati (eng.:
carbohydrates).
Pe langa functiile lor in crestere si in mentinerea celulelor, proteinele sunt de asemeni
responsabile pentru contractia muschilor. Enzimele digestive sunt proteine, asa cum este insulina
si multi alti hormoni, anticorpii sistemului imunitar si hemoglobina, care transporta substante
vitale prin corp. Cromozomii, care transmit caracteristicile ereditare, sub forma de gene, sunt de
asemeni compusi din acizi nucleici si proteine.

Indiferent daca sunt gasite in oameni sau in bacterii unicelulare, proteinele sunt compuse
din aproximativ 20 de aminoacizi diferiti, care, pe rand sunt formate din carbon, hidrogen, oxigen,
azot si cateodata sulf.

Intr-o molecula de proteina, acesti acizi formeaza legaturi peptidice, (ce sunt legaturi intre
gruparile amino (NH2) si carboxil (COOH) ), ce creeaza lanturi lungi peptidice.
Numarul aproape infinit de combinatii pe care acesti acizi se alinieaza, si forma elicoidala sau
globulara sub care aceste lanturi se formeaza ajuta la explicarea enormei diversitati de functiuni
pe care proteinele le indeplinesc.

1
 Pentru a sintetiza proteinele esentiale vietii, fiecare specie are nevoie de anumite proportii
din cei 20 de aminoacizi. Desi plantele pot produce toate componentele de care au nevoie plecand
de la azot, dioxid de carbon si alte elemente chimice, prin fotosinteza, majoritatea celorlalte
organisme pot produce doar o parte din ele. Cele care raman, trebuie sa fie derivate din mancar.
Opt aminoacizi esentiali sunt folositi pentru a mentine starea de sanatate a unui organism: leucina
(eng.:leucine ) izoleucina, lisina (eng: lysine), metionina (eng:methionine), phenialanina (eng:
phenyalanine), teonina (eng:theonine), triptofan (eng:tryptophan) si valina. Toti acestia sunt
disponibili in proteinele produse de semintele plantelor, dar deoarece plantele nu au de obicei
concentratii prea mari de lisina si triptofan, expertii in nutritie recomanda suplimentarea dietei cu
proteine animale, din carne, oua, si lapte.
Majoritatea dietelor, mai ales in tarile dezvoltate, cum ar fi Statele Unite ale Americi, unde
proteina animala este consumata in exces, contin toate proteinele necesare.
Kwashiorkor, o boala prezenta printre copii din Africa centrala se datoreaza carentei unui
anumit aminoacid. La adulti se recomanda 0.79g de proteina pe kilogram (din greutatea corporala),
in fiecare zi. Pentru copii sau sugari cantitatea se dupleaza si respectiv se tripleaza datorita cresterii
lor rapide.

2. Metoda Kjeldahl
Este o metodă analitică de determinare cantitativă a azotului din compuși organici, dar și a
azotului conținut în compuși anorganici de tipul amoniacului și a sărurilor de amoniu (NH3/NH4+).
Fără a aduce modificări metodei de bază, aceasta nu ajută la determinarea altor forme de azot
anorganic, cum ar fi de exemplu nitrații. Metoda a fost dezvoltată de către Johan Kjeldahl în anul
1883.
Metoda presupune încălzirea substanței în prezență de acid sulfuric, care are rolul de a
descompune substanțele organice prin procese de oxidare, eliberând astfel azotul redus sub formă
de sulfat de amoniu. În această etapă, se adaugă sulfat de potasiu cu scopul de a crește punctul de
fierbere al mediului de reacție (de la 337 °C la 373 °C). Se consideră că descompunerea probei
este completă în momentul dispariției colorației negre inițiale, deci când mediul de reacție pare
incolor. Urmează apoi distilarea soluției, cu o cantitate mică de hidroxid de sodiu, care are rolul
de a transforma sărurile de amoniu în amoniac. Cantitatea de amoniac prezent, și implicit cantitatea
de azot din probă, se va determina cu ajutorul unei titrări indirecte. Capătul refrigerentului folosit
este imersat într-o soluție de acid boric, iar amoniacul va reacționa cu acidul. Acidul rămas, care
nu a reacționat, este apoi titrat cu o soluție de carbonat de sodiu, folosindu-se ca indicator de pH
metiloranjul. Cunoscând volumele respective, care au fost determinate în proces, și concentrațiile
soluțiilor folosite la titrare, se fac calculele pentru determinarea procentului de azot din probă.
Reacțiile ce au loc în timpul procesului sunt:
Degradarea: Probă + H2SO4 → (NH4)2SO4(aq) + CO2(g) + SO2(g) + H2O(g)
Punerea în libertate a amoniacului:
(NH4)2SO4(aq) + 2NaOH → Na2SO4(aq) + 2H2O(l) + 2NH3(g)
Captarea amoniacului: B(OH)3 + H2O + NH3 → NH4+ + B(OH)4−
Titrarea indirectă:
B(OH)3 + H2O + Na2CO3 → NaHCO3(aq) + NaB(OH)4(aq) + CO2(g) + H2O

2
Factori de conversiune pentru unele surse proteice
Factorul de
Proteine conversiune
lapte 6,38
leguminoase 6,25
soia 6
orezul 5,95
griul 5,83
gelatina 5,55
oleaginoase 5,3

Pe parcursul mineralizarii material organica din proba de analizat este digerata in substante
minerale. Azotul este convertit in saruri de amoniu. La neutralizarea acestor saruri se elibereaza
amoniacul care este distilat si condensat intr-o solutie tampon acida. Amoniacul provoaca cresterea
ph-ului solutiei. Cantitatea de ammoniac captata poate fi masurata prin titrarea solutiei.
Mineralizarea
Mineralizarea trebuie sa transforme material organic din proba analizata in substante
minerale rapid si fara pierderi de azot. In acest scop este utilizat acidul sulfuric concentrat la
fierbere care transforma material organic in CO2 si apa, iar azotul organic este convertit in
(NH4)2SO4. Pentru a majora temperature de fierbere a acidului sulfuric pina la 370-410 °C, se
adaoga sulfat de sodium sau de potasiu. Reactia este facilitate de prezenta catalizatorilor.
Printre cei mai populari catalizatori se afla seleniul, mercurul, cuprul si titanul.
Utilizarea seleniului necesita respectarea riguroasa a conditiilor de reactive. Daca temperatura de
mineralizare nu este strict controlata sau daca cantitatea de seleniu luata pentru digestie este prea
mare , pot sa intervina pierderi esentiale de azot. Cea mai buna recuperare a azotului este procurata
de catre mercur, care este catalizatorul recomandat oficial in metodele de referinta. Mercurul poate
fi utilizat in forma de oxid (HgO).
Acest catalizator are totusi o serie de dezavantaje. Mercurul este costisitor si extrem de
toxic. Recuperarea deseurilor de mercur este destul de complicata. Nimerite in mediul ambiant in
forma anorganica, acestea pot fi transformate progresiv in metilmercur datorita actiunii unor
bacteria. In forma organica mercurul se acumuleaza spre exemplu in celulele animalelor si pestelor
in special in creier. Acumularea sa provoaca tulburari neurologice grave. Astfel toxicitatea si costul
impun de a allege alti catalizatori pentru mineralizarea probelor organice.
Cuprul procura o eficienta satisfacatoare a procesului de mineralizare. El se adauga in
forma de sulfat de cupru, care uneori se combina cu dioxid de titan (TiO2). Gradul de recuperare
al azotului depinde si de raportul K2SO4/H2SO4. In cazul sarii de potasiu acesta se ia de 15 g sare/25
ml acid concentrate.
Cantitatea de catalizator depinde de natura sa. Este evident ca schimbarea catalizatorului
necesita revederea intregii proceduri experimentale.
Una dintre principalele probleme ale metodei Kjeldahl consta in durata considerabila a
procesului de mineralizare intre 60 si 180 min. Durata de mineralizare poate fi redusa prin
utilizarea peroxidului de hydrogen , care este un oxidant puternic si accelereazaprocesul de oxidare
a materiei organice. Trebuie totusi de luat in considerare si efectul sau asupra cresterii temperaturii
de fierbere a acidului sulfuric, pentru a nu depasi limetele admise pentru procesul dat. Efectul

3
combinat al peroxidului de hydrogen si a sarurilor permite in mod riguros controlat de a diminua
considerabil durata procesului de mineralizare.
Distilarea
Dupa mineralizare , digestatul , care este format din acidul sulfuric si sarurile sale, este
neutralizat si alcalinizat prin adaugarea bazei alcaline concentrate (NaOH sau KOH). Azotul care-
i prezent in forma de sulfat de amoniu, poate fi distilat. In timpul neutralizarii se produce reactia:
(NH2)4SO4+2NaOH →2NH3↑+Na2SO4+2H2O
In caz daca la mineralizare sa folosit un catalizator de mercur , in Solutia de baza folosita
pentru alcalinizare se adauga tiosulfatul de sodiu pentru a impiedica complexarea mercurului cu
amoniacul.
Amoniacul degajat este captat de catre o solutie acida, de regula, o solutie tampon de acid
boric (H3BO3). In general se iau 40-50 ml solutie de 4%, dar acesti parametri pot varia.
Titrarea
Amoniacul prezinta o substanta cu caracter basic. La dizolvarea sa intr-o solutie acida,
acesta capteaza protoni si provoaca cresterea ph-ului:
NH3+H3BO3→NH4+H2BO3
Pentru titrarea solutiei obtinute se ia un acid tare de concentratie mica, spre exemplu, HCl
0,02 N. Solutia se titreaza pina la atingerea valorii initiale a pH-ului din Solutia de acid boric:
H2BO3+H → H3BO3
Detectarea punctului de echivalenta se efectueaza visual, cu ajutorul indicatorilor de pH,
sau electrometric, cu ajutorul pH-metrului. Cantitatea de acid necesara titrarii este proportionala
cantitatii de ammoniac, iar aceasta este proportionala continutului de azot din proba analizata.

3. Determinarea conținutului de proteine din bere

Proba: 25 ml de bere (de la care s-a eliminat dioxidul de carbon) se introduce intr-o epruvetă și
se concentrează in mineralizator la temperatura de 100°C până are consistența unui sirop.
Antispumant pentru digestie: Pentru fiecare probă se adaugă:
2 pastile antispumare VS;
10 ml acid sulfuric concentrat (96-98%);
10 ml peroxid de hidrogen (H2O2) 35% (130 vol.)
2 pastile catalizatoare VST.

4. Determinarea conținutului de proteine din pastele făinoase

Modul de lucru:
Proba: se mărunțesc pastele în bucăți mici, manual sau cu un dispozitiv corespunzător și amestecă-
le bine. Cu ajutorul unui aparat corespunzător se realizează măcinarea finală. A se cântări 1 g de
probă cu o acuratețe de ± 0,1 mg.

4
Reactivi pentru asimilare: pentru fiecare probă se adaugă în eprubetă:
2 tablete de catalizator VCM;
12 ml acid sulfuric concentrat (96-98%). Agitați ușor eprubeta cu proba.
Mineralizare: se încălzește la 420°C timp de 60 minute.
Răcire: eprubetele se lasă la răcit la 50-60°C.
Distilare - titrare: se poziționează eprubeta în poziție în unitatea UDK 129.
factor: 6.25
Reactanți adăugați: apă distilată= 50 ml; H3BO3= 30 ml; NaOH= 50 ml; Titrant: HCL 0,1 N; Timp
de distilare= 5 min.

Fig. 1 Mineralizare Fig. 2 Distilator

5. Determinarea conșinutului de proteine din paine si produsele de panificație

Modul de lucru:
Proba: se mărunțește proba, manual sau cu un dispozitiv corespunzător și amestecă-le bine. Cu
ajutorul unui aparat corespunzător se realizează măcinarea finală. Se cântărește 2 g de probă uscată
cu o acuratețe de ± 0,1 mg.
Reactivi pentru asimilare: pentru fiecare probă se adaugă în eprubetă:
2 tablete de catalizator VTCT;
12 ml acid sulfuric concentrat (96-98%). Agitați ușor eprubeta cu proba.
Mineralizare: se încălzește la 420°C timp de 60 minute.
Răcire: eprubetele se lasă la răcit la 50-60°C.
Distilare - titrare: se poziționează eprubeta în poziție în unitatea UDK 129.
factor: 5.7
Reactanți adăugați: apă distilată= 50 ml;
H3BO3= 30 ml; Se introduce in paharul Erlenmeyer de colectare a distilatului.

5
NaOH= 50 ml;
Titrant: HCL 0,2 N; În prezenta indicatorului Tashiro.
Timp de distilare= 5 min.