C09

DETERMINAREA PROTEINELOR - determinarea azotului
Rolul proteinelor:
- surs de energie
- surs de aminoacizi eseniali - meninerea sntii
- component major al alimentelor
- utliziat ca i ingredient - confer alimentelor proprieti speciale.
2. Identificarea proteinelor
- analize de expertiz
- depistarea falsurilor
1. Determinarea cantitativ a proteinelor
- informaii nutriionale
- aspect legal
Metode
- chimice
- fizice
- fizico-chimice

METODE CHIMICE

- se bazeaz de determinarea coninutului de azot.

- mai multe tipuri de azot n alimente

N
t
= N
a
+ N
o
= N
a
+ N
nep
+ N
p

- anorganic : NO
3
-
, NH
4
+

- organic : proteic i neproteic.

(De regul speciile anorganice sunt solubile n ap putnd fi uor de ndeprtat
din aliment prin simpla dizolvare n ap)
DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR

1. METODA KJELDAHL - elaborat n 1883 de ctre Johann Kjeldahl (berar)

Principiu
Alimentul este mineralizat n mediu acid puternic, azotul proteic fiind
transformat n ion amoniu determinat ulterior prin titrare cu un acid tare.
Metoda nu msoar direct coninutul de protein - factor de conversie.
Factorul de conversie F=6,25 (Proporia de azot, in majoritatea proteinelor, este
de aproximativ 16%).
F variaz n funcie de secvena de aminoacizi specific fiecrei proteine :
- cereale (proteine cu coninut ridicat n glutamin) F=5,7.
- carne F=6,25
- lapte F= 6,38
- ou F=6,68.
- Aceasta presupune c proporia de azot neproteic este nesemnificativ astfel
nct determinarea azotului s reprezinte doar coninutul total de proteine.
- De regul se determin azotul total

Analiza decurge n 3 etape:
- mineralizarea/digestia
- neutralizarea/distilarea
- titrarea

Mineralizarea/digestia

- are loc la cald cu acid sulfuric cnd are loc reacia :
aliment + H
2
SO
4
CO
2
+ H
2
O + (NH
4
)
2
SO
4
(1)
- reacia este nsoit de o degajare de SO
2
i SO
3
, conform reaciilor:
H
2
SO
4
H
2
O + SO
3

2SO
3
2SO
2
+ O
2

Amoniacul format n mediu acid nu este eliberat ca i NH
3
gazos,
deoarece este captat n soluie sub form de (NH
4
)
2
SO
4
.

Mineralizarea probei se face n majoritatea cazurilor cu H
2
SO
4
i diferite
adaosuri menite s faciliteze aciunea oxidant a acestuia (ap oxigenat).
Alegerea H
2
SO
4
nu este fcut ntmpltor, deoarece el beneficiaz de
avantajul unui punct de fierbere superior, care permite nclzirea prelungit
la temperaturi relativ nalte, fr pierderi importante de soluie.

Pentru accelerarea procesului de mineralizare se adaug de obicei sruri ale
metalelor grele cu aciune catalizant, cum ar fi Ag
+
, Cu
2+
, Se
3+
, Hg
2+
.
Adaosul srurilor mercurice, creeaz ns inconvenientul formrii
combinaiilor amidomercurice, ceea ce determin pierderi de NH
3
, ce trebuie
ulterior surmontate prin adugarea Na
2
S
2
O
3
(acesta determin distrugerea
combinaiilor amidomercurice, n timpul distilrii amoniacului).

Se mai adaug sruri ale metalelor alcaline, cum ar fi K
2
SO
4
sau Na
2
SO
4
, n
vederea creterii temperaturii de fierbere, respectiv creterea eficienei
procesului de mineralizare.

Mineraizarea se realizeaz n baloane speciale, Kjeldahl, cu gt lung,
nclzite n pozitie nclinat fa de direcia flcrii i prevzute cu o mic
plnie, care funcioneaz ca un refrigerent de aer, permind refluxarea
permanent a acidului sulfuric, eventual evaporat.

1 - 5 g aliment, prob care conine cca. 0,03 - 0,04 g N se cntresc ntr-un
balon Kjeldahl, se adaug 20 mL acid sulfuric concentrat.

nclzirea se realizeaz lent, pn la carbonizarea complet i innegrirea
puternic a soluiei. Oxigenul rezultat oxideaz treptat substanele
organice, fapt observat prin modificrile de culoare care apar n soluie.
Culoarea neagr iniial se atenueaz i se modific treptat, ajungnd pn
la decolorarea complet, sau la o slab nuan galben (dac exist n
prob cantiti mari de fier), ceea ce indic terminarea procesului.

Dac proba conine mult zahr, spumeaz puternic la nceput, provocnd
astfel debordarea amestecului i eventuale pierderi. Pentru evitarea acestui
fenomen se utilizeaz fie adaosul a ctorva picturi de alcool octilic, fie
introducerea ctorva bile de sticl, cu ajutorul crora spuma se sparge
mecanic. Uneori spumarea este evitat dac se las proba cu acid peste
noapte, nainte de nclzire.

Cnd exist cantiti mari de elemente ale grupei metalelor alcalino-
pmntoase, sulfaii acestora precipit provocnd pierderi prin
coprecipitare.

Operaia dureaz de obicei mult, n funcie de cantitatea i de natura
substanei oxidate (mai ales n cazul probelor bogate n grsimi).

n cazul n care se urmrete determinarea azotului total trebuie remarcat
faptul c n procesul de mineralizare nu se relizeaz trecerea n sruri de
amoniu a combinaiilor azotate oxigenate cum ar fi, nitraii, nitriii sau a
unor combinaii organice nitro, notrozo, nitril. Astfel se adaug la proba de
analizat acid sulfuric conc rcit la ghea, acid salicilic i se agit bine
balonul timp de 10 min. Se adaug apoi Na
2
SO
4
anh, Na
2
S
2
O
3
sau granule
de Zn, compui cu caracter reductor. Se mineralizeaz apoi proba n
mod obinuit.

Neutralizarea/distilarea

Dup ce digestia s-a terminat (culoare alb-galbuie a soluiei), balonul de
mineralizare este conectat la un balon colector, prin intermediul unui tub.
Soluia din balonul de mineralizare este alcalinizat prin adiie de NaOH i
supus nclzirii :

(NH
4
)
2
SO
4
+ 2 NaOH 2NH
3
+ 2H
2
O + Na
2
SO
4

Amoniacul gazos format este captat n balonul de captare, ce conine o
soluie de acid boric, de concentraie i volum riguros cunoscut. Amoniacul
este reinut n soluie sub form de sare:

NH
3
+ H
3
BO
3
NH
4
+
+ H
2
BO
3
-

Titrarea

Coninutul de azot este estimat prin titrarea boratului de amoniu format cu
o soluie titrimetrica de acid silfuric sau clorhidric, n prezena unui
indicatpr potrivit pentru evidenierea punctului final al titrrii.

NH
4
+
+ H
2
BO
3
-
+ H
+
+ Cl
-
H
3
BO
3
+ NH
4
+
+ Cl
-

Volumul soluiei de acid necesar la titrare este echivalent cu cantitatea de
amoniac eliberat n etapa anterioar. n general alturi de proba de
analizat se efectueaz i o prob blank pentru a putea fi luat n
considerare orice cantitate de azot rezidual din reactivii utilizai pentru
analiza.

Avantaje i dezavantaje

Avantaje: Metoda Kjeldahl este utilizat pe plan internaional i este nc
metoda standard de comparaie pentru alte metode de determinare a
proteinelor. Faptul c poate fi aplicat pentru orice tip de protein,
datrorit preciziei i reproductibilitii nalte ii confer poziia de lider
ntre metodele de determinare a proteinelor.

Dezavantaje: Nu d informaii despre coninutul de protein real,
deoarece azotul din alimente nu provine numai de la proteine. Diferite
proteine au factori de conversie diferii deoarece au secvene diferite de
aminoacizi. Utilizarea att acidului sulfuric la temperaturi nalte ct i a
srurilor cu rol catalitic ridic factorul de risc al analizei. Este o tehnic
care necesit mult timp, mineralizarea necesitnd cel puin 2-3 ore.

METODA DUMAS
Este o tehnic automat instrumental, capabil s msoare rapid
coninutul proteic. Se bazeaz pe metoda descris pentru prima dat de
Dumas, acum un secol. Metoda concureaz cu metoda Kjeldahl ca metod
standard pentru analiza proteinelor datorit rapiditii ei.

Principii generale
O cantitate cunoscut de prob este ars la temperaturi mari (900
o
C) n
prezen de oxigen. n urma arderii are loc eliberarea de CO
2
, H
2
O i N
2
.
CO
2
i H
2
O sunt nlturate prin trecerea gazelor prin coloane speciale care
le absorb. Coninutul de azot este apoi determinat prin cromatografie de
gaze. Coloana are ca scop separarea azotului de CO
2
i H
2
O rezidual, ca
detector se utilizeaz detectorul de conductivitate termic. Instrumentul
este calibrat prin analizarea unui material aflat n stare pur i cu un
coninut binecunoscut de azot, cum ar fi EDTA ( 9.59%N). Astfel semnalul
de la detector poate fi transformat n coninut de azot. Ca i n metoda
Kjeldahl concentraia de azot determinat este transformat n coninut
propteic utiliznd factorul de conversie specific.

Avantaje: Este mult mai rapid dect metoda Kjeldahl (sub 4
min/determinare). Nu necesit reactivi toxici, msurarea se poate face
automat, este simplu de utilizat.

Dezavantaje: Cost per analiz mare, nu d o valoare adevrat a
coninutului proteic deoarece este analizat azotul total din aliment.
Deasemenea proteine diferite necesit factori de conversie diferiti.
Metoda necesitnd cantiti mici de probe ceea ce face dificil etapa de
obinere a unei probe reprezentative.

MSURAREA ABSORBIEI RADIAIEI

UV-ViZ: concentraia proteinelor poate fi determinat prin
msurarea absorbiei radiaiei din domeniul UV-VIZ.

IR: msurarea absorbanei n domeniu IR al spectrului poate fi
utilizat pentru determinarea coninutului proteic din alimente. n mod
natural proteinele absorb radiaia IR datorit vibraiilor caracteristice a
gruprilor chimice specifice scheletului polipeptidic. Analizele prin
absorbia n IR sunt utile n special pentru analizele on-line rapide. Sunt
de asemenea avantajoase deoarece necesit o cantitate mic de prob i
sunt nedistructive. Dejavantajul major l reprezint costul ridicat al
aparaturii i calibrarea destul de laborioas.

Rezonana magnetic nuclear: RMN poate fi utilizat la
determinarea coninutului total proteic. Acesta este determinat prin
msurarea ariei de sub picul corespunztor fraciei proteice din spectrul
RMN.
METODE SPECTROFOTOMETRICE UV-VIZ

Aceste metode utilizeaz abilitatea proteinelor att n stare natural ct
i n stare chimic sau fizic modificat de a absorbi/mprtia lumina din
domeniul UV-VIZ a spectului electromagnetic.

Principiul de baz a fiecrui astfel de test este similar. n primul rnd
este elaborat o curb de calibrare absorban (turbiditate) n funcie
de concentraia de protein, pe baza unor soluii proteice de
concentraie cunoscut. Se msoar apoi absorbana (turbiditatea)
soluiei de analizat la aceeai lungime de und i se determin
concentraia pe baza curbei de calibrare.

Diferenele principale dintre metode constau n grupele chimice care
sunt responsabile de absorbie/mprtierea radiaiei, cum ar fi
legtura peptidic, gruprile aromatIce din lantul lateral, gruprile
bazice sau agregatele proteicie.
Msurarea direct la 280 nm

Triptofanul i tirozina absorb puternic lumina UV la 280 nm. Coninutul de
triptofan i tirozin din multe proteine este aproape constant, deci
absorbana soluiilor proteice la 280 nm poate fi folosit pentru
determinarea concentraiei proteice.

Avantajele acestei metode sunt: procedur simpl, nedistructiv, nu
necesit reactivi speciali.

Dezavantajul major este acela c acizii nucleici absorb deasemenea
puternic la 280 nm i pot astfel interfera n determinarea proteinelor dac
acetia sunt n concentraie suficient de mare. Chiar i n aceast situaie
au fost dezvoltate metode pentru a preveni aceste probleme, de exemplu
msurarea absorbanei la dou lungimi de und diferite.

Metoda biuretului

n condiii alcaline ionul cupric reacioneaz cu gruprile din legturile
peptidice rezultnd un compus colorat violet-purpur.
Dup amestecarea reactivului cu soluia proteic se las s se dezvolte
culoarea timp de 15-30 min dup care se citete absorbana la 540 nm.
Avantajul major al acestei tehnici este acela c nu exist interfereni
provenii din chimicale care s absoar la aceast lungime de und iar
tehnica este mai puin sensibil la tipul de protein deoarece utilizeaz
absorbia implicnd legtura peptidic comun tuturor proteinelor dect
pe gruprile laterale specifice.
Reactivul biuret care conine toate chimicalele necesare analizei poate fi
procurat din comer.

Dezavantaje: sensibilitatea este mai mic dect metodele de absorbie
direct n UV-VIZ.
Metoda Lowry

Metoda Lowry combin reactivul biuret cu un alt reactiv - Folin-
Ciocalteau (reactiv specific pentru grupele fenolice) care reacioneaz
cu tirozina i triptofanul.
n urma reaciei rezult un compus albastru a crui absorban poate fi
citit n intervalul 500 - 750 nm n funcie de sensibilitatea necesar.
Exist un mic pic n jur de 500 nm care poate fi utilizat n cazul
concentraiilor mari de protein i un pic mai mare n jur de 750 nm
care poate fi utilizat pentru determinarea concentraiilor mai mici de
protein.
Aceast metod este mai sensibil la concentraii mai mici de protein
dect metoda biuretului.
Metoda cu colorani

O cantitate cunoscut i n exces de colorant anionic (ncrcat negativ)
se adaug la soluia proteic a crui pH este ajustat astfel nct proteina
s fie ncrcat pozitiv (mai mic dect punctul izoelectric).
Proteina i colorantul formeaz un complex insolubil n ap datorit
interaciunilor electrostatice. Colorantul anionic se leag de gruprile
cationice a reziduurilor bazice ale aminoacizilor (histidin, arginin i
lisin) i la gruprile amino terminale libere.
Colorantul nelegat rmne n soluie i este determinat prin msurarea
absorbanei, dup separarea complexului insolubil prin centrifugare.
Cantitatea de protein din soluia analizat este proporional cu
cantitatea de colorant legat care se calculeaz prin diferen.

Colorant
legat
= colorant
iniial
- colorant
liber


Avantaje: Tehnicile UV-VIZ sunt rapide i simple i sunt sensibile pentru
concentraii proteice mici.

Dezavantaje: Pentru majoritatea tenicilor UV-VIZ sunt necesare utilizarea
soluiilor diluate i transparente, care nu conin substane contaminante
care s absoarb sau s imprtie radiaia la aceeai lungime de und
ca i proteina analizat. Necesitatea soluiilor transparente presupune
faptul c majoritatea alimentelor trebuie s parcurg o serie de etape de
pregtire a probei nainte de analiz, cum ar fi: omogenizare, extracie
cu solveni, centrifugare, filtrare, operaii care pot fi laborioase i
consumatoare de timp. n plus este extrem de dificil extracia
cantitativ a proteinelor din cteva tipuri de alimente, mai ales dup ce
acestea au fost procesate astfel proteinele devenind agregate sau legate
covalent de alte substane. n plus absorbana depinde de tipul proteinei
analizate proteine diferite avnd secvene diferite de aminoacizi.
DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor

Analiza alimentelor este interesat i de tipul proteinelor prezente,
deoarece fiecare protein are caracteristicile nutriionale i fizico-
chimice unice.

Tipul proteinei este de obicei determinat prin separarea i izolarea
proteinei individuale din amestecul complex de proteine, astfel nct s
poat fi identificat i caracterizat.

Proteinele sunt separate pe baza diferenelor dintre proprietile fizico-
chimice, cum ar fi mrime, sarcin, solubilitate, stabilitaze termic i
parametrii de adsorbie.

Unul dintre factorii care trebuie luai n considerare n procesul de
separare este posibilitatea alterrii structurii tridimensionale a proteinei
native.
Exist metode de separare la scal macro pentru izolarea proteinelor
care se gsesc n cantitate mare, n timp ce pentru proteinele aflate n
cantiti mici sau sunt scumpe exist metode la scal micro.

Alegerea celei mai potrivite tehnici de separare depinde de o serie de
factori, cum ar fi: cantitatea de prob disponibil, echipamentul
disponibil, tipul de protein existent, costul de analiz, inclusiv motivul
pentru care se efectueaz analiza.

Cunoaterea apriori a efectelor condiiilor de mediu asupra structurii
proteinei i a interaciunilor acesteia cu mediul este foarte util pentru
alegerea celei mai potrivite tehnici de separare. n primul rnd pentru c
ne ajut s determinm condiiile cele mai potrivite pentru izolarea unei
anumite proteine dintr-un amestec (pH, for ionic, tip solvent,
temperatur) i n al doilea rnd sunt importante condiiile care nu au
efect negativ asupra structurii proteice (protejare).
Metode bazate de diferena de solubilitate

Proteinele pot fi separate prin exploatarea diferenelor de solubilitate n
soluii apoase. Solubilitatea unei molecule de protein este determinat
de :
- mrime,
- form,
- hidrofobicitate
- sarcina electric.
Proteinele pot fi selectiv precipitate sau solubilizate prin modificarea pH-
ului, forei ionice, constantei dielectrice sau temperatura soluiei. Aceste
variabile, reflectri ale faptului c proteinele sunt electrolii de mas
molecular mare, pot fi utilizate la separarea amestecurilor de proteine,
deoarece fiecare protein are compoziia sa proprie de aminoacizi, care
determin comportarea ca electrolit. Tehnicile de separare sunt simplu de
utilizat cnd sunt implicate cantiti mari de prob, deoarece ele sunt
relativ rapide, ieftine i nu sunt influenate n mod particular de ctre
ceilali componeni alimentari. Sunt des utilizate ca un prim pas n
procedurile de seaprare deoarece majoritatea componenilor
contaminani pot fi uor nlturai.
Salefierea proteinelor
Srurile neutre au efecte puternice asupra solubilitii proteinelor
globulare. n concentraii mici, srurile cresc solubilitatea proteinelor,
fenomen cunoscut ca salting-in. Srurile ionilor divaleni MgCl
2
i
(NH
4
)
2
SO
4
sunt mult mai eficiente n acest sens dect cele monovalente
KCl, NaCl, NH
4
Cl. Capacitatea srurilor neutre de a influena solubilitatea
proteinelor este n funcie de fora ionic, mrime care msoar att
concentraia ct i numrul de sarcini electrice. Pe msur ce tria ionic
continu s creasc solubilitata proteinelor ncepe s scad. La o trie
ionic suficient de mare, o protein poate fi precipitat aproape complet
din soluie, fenomen cunoscut sub numele de salting-out. Principiile
fizico-chimice care stau la baza acestui proces sunt complexe. Unul din
factorii care intervin este ndeprtarea apei de hidratare din molecula
proteinei de ctre concentraia mare de sare, ceea ce duce la scderea
solubilitii. Fiecare protein rspunde diferite la concentraia srurilor
neutre.
Precipitarea izoelectric

Solubilitatea celor mai multe proteine globulare este puternic influenat
de pH-ul sistemului, indiferent de concentraia NaCl. De ambele pri ale
pH-ului critic solubilitatea crete forte brusc. Aproape toate proteinele
globulare au un minim de solubilitate, pH-ul corespunztor diferind de la
o protein la alta. pH-ul la care o protein este cel mai puin solubil este
pH-ul su izoelectric, definit ca pH-ul la care molecula nu are ncrcare
electric i nu se deplaseaz n cmp electric. n aceste condiii nu sxist
respingere electrostatic ntre molecule proteice nvecinate, care tind s
se aglomereze i s precipite. La valori de pH deasupra sau sub pI toate
moleculele de protein au ncrcare electric net de acela semn, deci
ele se vor respinge prevenind aglomerarea, n agregate insolubile.
Deoarece proteinele au valori deferite ale pH-ului izoelectric, datorit
coninutului lor diferit de aminoacizi cu grupri R ionizabile pot fi separate
prin precipitare izoelectric.

Protein pH-izoelectric Protein pH-izoelectric
Pepsin 1
1
- globulin 6,6
Ovalbumin 4.6 Hemoglobin 6,8
Albumin seric 4,9 Mioglobin 7
-lactoglobulin 5,2 Ribonucleaz 9,6

Fracionarea cu solveni
Solubilitatea proteinelor depinde de constanta dielectric a soluiei
deoarece altereaz amplitudinea interaciunilor electrostatice dintre
grupele cu sarcin. Pe msur ce constanta dielectric scade
intensitatea interaciunilor electrostatice crete. Aceasta duce la
scderea solubilitii proteinelor n soluie deoarece ele sunt mai puin
ionizate, i astfel repulsiile electrostatice dintre ele nu sunt suficient de
mari pentru a preveni agregarea. Constanta dielectric a soluiilor
apoase poate fi sczut prin adugare de solveni organici solubili, cum
ar fi etanol i aceton. Cantitatea de solvent organic necesar
precipitrii depinde de tipul proteinei, i prin urmare aceasta poate fi
separat prin precipitare de restul proteinelor. Cantiatea optim de
solvent organic necesar precipitrii proteinei variaz ntre 5-60%.
Operaia se realizeaz de obicei sub 0
o
C pentru a preveni denaturarea
proteinelor prin creterea temperaturii la amestecarea solvetului organic
cu apa.

Separarea proteinelor prin cromatografie de adsorbtie
Cromatografia de adsorbie implic separarea compuilor prin
adsorbia/desorbia selelctiv a compuilor pe suprafaa unui
adsorbant reinut n interiorul unei coloane prin care proba i faza
mobil trec. Separarea se bazeaz pe diferenele de afinitate a
proteinelor fa de faza staionar. n funcie de tipul fazei staionare
exist dou tipuri de mecanisme de separare care se pot aplica n
cazul separrii proteinelor:
- cromatografia prin schimb ionic
- cromatografia de afinitate.
Separarea si caracterizarea se poate realiza atat pe pe coloane
deschise cat si inchise, de inalta performanta.

Cromatografia prin schimb ionic

Cromatografia prin schimb ionic se bazeaz pe fenomenele reversibile
de adsorbie/desorbie respectiv schimb ionic a ionilor din soluie i
gruprile ionice ale unei matrici solide sau reea polimeric. Aceast
tehnic este cea mai utilizat tehnic cromatografic pentru separarea
proteinelor. Un sorbent capabil sa schimbe anionii proprii cu cei ai
probei se numeste anionit. Faza mobil este format dintr-un electrolit
avnd o anumit for ionic i un anunmit pH, astfel nct s favorizeze
un numr maxim de legturi ntre faza staionar i proteina de interes.
Proteinele contaminante trebuie s se lege mai puin puternic, astfel
nct s treac mai repede prin coloan. Proteina de interes este apoi
eluat cu o alt soluie tampon care s favorizeze desorbia.
Cromatografia de afinitate

n cromatografia de afinitate, ca faz staionar se utilizeaz supori
solizi de care se leag chimic-covalent un ligand. Ligandul este o
molecul care prezint afinitate specific pentru o protein dat. Proba
de analizat este trecut prin coloan, iar proteina de interes este
reinut pe suprafaa sorbentului, n timp ce proteinele contaminante
trec nereinute. Proteina de interes este apoi eluat cu cu o soluie
tampon care favorizeaz desorbia. Aceast tehnic este cea mai
eficient metod de separare a proteinelor individuale dintr-un amestec
de proteine, dar este i cea mai scump metod, deoarece necesit
coloane cu faze staionare specifice.

Separri bazate pe diferenele de mas
Proteinele pot fi separate pe baza masei moleculare. Aceasta variaz
ntre 10.000 i 1.000.000 daltoni. In practic, separarea depinde de raza
Stokes a proteinei, mai degrab dect masa molecular. Raza Stokes
reprezint raza medie pe care molecula proteic o are n soluie i
depinde de structura ei tridimensional.

Dializa
Dializa este folosit pentru separarea moleculelor din soluie. Se
bazeaz pe utilizarea unor membrane semipermeabile care permit
trecerea moleculelor mai mici dect o anumit mrime dat. Soluia
proteic este plasat n tubul de dializ care este nchis i plasat ntr-un
volum mare de ap sau tampon i care este agitat uor continuu.
Moleculele mici trec prin pereii tubului iar cele de protein vor fi
reinute n interiorul lui. Dializa este o metod lent, necesitnd pn la
12 ore. Este utilizat frecvent n laborator pentru nlturarea srurilor
dup separarea prin salefiere.
Ultrafiltrarea

Soluia proteic este plasat ntr-o celul ce conine o memdran
semipermeabil i apoi este aplicat o presiune sau este supus
centrifugrii. Moleculele mici i apa trec prin membran, moleculele de
protein fiind reinute. Principiul de separare este similar dializei, dar
datorit aplicrii presiunii separarea este mult mai rapid. Sunt
disponibile membrane semipermeabile cu dimensiunile critice
cuprinse ntre 500 i 300.000.
Cromatografia prin excludere molecular
Aceast tehnic cunoscut i sub numele de filtrare prin gel separ
proteinele pe baza mrimii lor. Soluia proteic este introdus ntr-o
coloan a crei umplutur este format dintr-un polimer reticulat
(dextrin, agaroz). Moleculele mai mari dect porii polimerului sunt
excluse i ies rapid din coloan. Moleculele mai mici pot intra n pori,
deci viteza lor de deplasare prin coloan este retardat. Astfel
moleculele sunt eluate din coloan n ordinea scderii dimensiunilor.
Exist faze staionare care prezint mrimi diferite ale porilor astfel
nct permit seaprarea proteinelor cu diferite mase moleculare.
Fabricantul acestor faze staionare dau informaii asupra domeniului
de greuti moleculare pentru care acestea sunt cele mai potrivite.
Masa molecular a proteinelor necunoscute poate fi determinat prin
compararea volumului de eluie cu cel al unor molecule proteice cu
masa cunoscut: reprezentare grafic a volumunlui de eluie funcie de
logaritmul masei moleculare trebuie s fie o linie dreapt. O problem
asociat acestei metode este c masa molecular nu este direct
corelat cu raza Stokes pentru diferite forme ale proteinelor.
ANALIZA AMINOACIZILOR
Analiza aminoacizilor depinde de muli factori:
- matricea probei,
- concentraia de aminoacizi,
- sensibilitatea ceruta,
- tipul analizei.

In urma analizei se determina:
- profil de aminoacizi liberi
- profil total de aminoacizi (dup hidroliz).

ETAPE
1. Pregtirea probei
Tratamentul probelor difer, depinznd de scopul analizei.
- Pentru determinarea aminoacizilor liberi este necesara obinerea unui extract,
purificare si derivatizare nainte de determinare.
- Pentru determinarea coninutului total de aminoacizi - etapa de hidroliz.

Extracia - se poate realiza in cazul matricilor insolubile (peste, carne, cereale, etc.) si de obicei
se realizeaz prin omogenizarea probei mrunite sau mcinate ntr-un solvent potrivit. Exist
aparate specializate (Polytron Stomacher) sau dispozitive mai simple care presupun agitarea cu
sau fr nclzire. Aminoacizii sunt solubili n ap, cisteina i tirozina avnd solubilitatea mai
mic. De regula se utilizeaz ap sau o soluii de acid sulfosalicilic 4%, acid tricloracetic 5%,
HCl 0,1 N. Se pot utiliza de asemenea i soluii alcoolice (etanol, metanol) care prezint
avantajul de a nu extrage proteinele (nu mai este necesar purificarea ulterioara a extractului).
Solidele solubile necesit doar dizolvare preliminar.
In cazul probelor lichide nu se mai pune n discuie extracia.

2. Purificarea probei
- izolarea aminoacizilor de ali compui extrai (proteine, carbohidrai, grsimi)
- este necesar pentru a evita probleme poteniale cum ar fi colmatarea coloanei
analitice i/sau interaciunea cu ali compui extrai cum ar fi proteinele.

Prezena grsimilor nu ridic probleme pentru extracie dar trebuie ndeprtate pentru a preveni
interferenele sau deprecierea coloanei. Grsimile sunt extrase din probe solide cu un amestec
cloroform : acetona (1:3), sau extractul poate fi splat succesiv cu acetat de etil i dietileter.
Extractul obinut este centrifugat la rece (4 C) iar supernatantul filtrat prin vat de sticl cnd se
rein materiile grase de pe suprafaa supernatantului.

Separarea de proteine i polipeptide - deproteinizare.
- chimic se realizeaz cu soluii concentrate de acizi tari, acid sulfosalicilic,
percloric, trifluoracetic, picric, fosfomolibdenic, soluii concentrate saline, solveni organici
(metanol, etanol, acetonitril). n aceste condiii proteinele precipita prin denaturare n timp ce
aminoacizii rmn n soluie.
- fizic presupune centrifugarea prin filtre membrane limitative (CUT-OFF) care
permit trecerea aminoacizilor n timp ce compuii cu masa moleculara mare sunt reinui.

Diferena dintre aceste metode consta in:
- diferena ntre masa moleculara a moleculelor excluse,
- grad de recuperare a aminoacizilor,
- compatibilitatea cu condiiile de derivatizare i cele necesare separrii analitice.

Exemple:
- Acidul fosfomolibdenic este foarte eficient dar produce pierderi de aminoacizi cu caracter
acid si/sau bazic n special lizin. Acizii tari scad foarte mult valoarea pH-ului n contextul n care
derivatizarea se realizeaz n medii bazice pentru analizele prin derivatizare precoloan.
ndeprtarea acidului se realizeaz prin evaporare i/sau ajustarea pH-ului. n cazul n care analiza se
realizeaz prin cromatografie de schimb ionic i derivatizare postcoloan nu mai apar probleme. Chiar
dac acidul sulfosalicilic este cel mai utilizat agent de deproteinizare s-au constatat unele interferene
i grade sczute de recuperare.
- Utilizarea solvenilor organici prin amestecarea a 2-3 volume solvent organic cu un volum
extract are rezultate foarte bune, gradul de recuperare fiind aproape de 100%. Prezint avantajul c
este uor de ndeprtat prin evaporare.
- Soluiile saline concentrate nu sunt utilizate la deproteinizare deoarece interfer n
procesul de derivatizare i hidroliz.

Purificarea probelor utiliznd rini schimbtoare de cationi (cationii) rein aminoacizii din
medii acide n timp ce ali interfereni cum ar fi carbohidraii trec prin coloana nefiind reinui.
Ulterior aminoacizii sunt desorbii cu o baz volatil care apoi este nlturat prin evaporare.
n cazul extraciei pe faz solid cu C18 compuii cum ar fi grsimile, proteinele i peptidele
sunt reinute, n timp ce compuii polari i aminoacizii trec nereinui. Metoda nu este foarte
bun deoarece aminoacizii hidrofobi se pot reine (grade mici de recuperare) iar compuii
hidrofili nu se rein, impurificnd extractul.

Hidroliza
1. Hidroliza acid - proba este tratat cu HCl 6N la 110C timp de 20-96 h sau 145C timp de 4 h.
n aceste condiii dure poate avea loc degradarea unor aminoacizi. Digestia se realizeaz n
recipiente nchise n atmosfer inert de azot, pentru a minimiza degradrile. Hidroliza poate fi
realizat att cu metode n faz lichid ct i gazoas. n metodele n faz lichid HCl este n
contact direct cu proba, fiind potrivit pentru probe complexe (cereale etc.). Hidrolizatul
contine multi interferenti, de aceea analiza necesita metode cromatografice prin schimb ionic
i derivatizare postcoloan. Digestia n faz gazoas reduce zgomotul de fond. n cazul
cantitilor limitate de probe se utilizeaz hidroliza n faz de vapori. n aceast metod n tubul
de hidroliz este plasat proba i apoi totul ntr-un vas mare ce conine HCl. Atmosfera
oxidant (oxigen) este nlocuit cu azot inert. n urma nclzirii numai vaporii de HCl vin n
contact cu proba, fiind astfel exclus contaminarea cu compui nevolatili. Aceast metod este
mai potrivit pentru determinrile cu derivatizare precoloan.
Hidroliza poate fi mbuntit prin optimizarea temperaturii i a timpului de hidroliza, sau prin
adugarea de compui protectori ai aminoacizi labili (tirosin, serin, treonin, metionin,
triptofan-foarte sensibil n probele cu coninut ridicat de carbohidrai) cum ar fi: fenol, Na2SO3,
triptamin, mercaptoetanol, acid mercaptoetenoic, acid tio- i ditiodipropionic. De asemenea
HCl poate fi nlocuit cu acid metansulfonic 4 N. Se utilizeaz agenii de alchilare pentru a
stabiliza aminoacidul (cisteina) rezultat n urma hidrolizei: acid brompropionic, acid iodoacetic
bromopropilamina, vinilpiridina. Glutamina i asparagina sunt dezaminate n timpul hidrolizei
i sunt codeterminate cu acidul glutamic i aspartic. O alt problema de care trebuie inut cont
este rmnerea intact a unor peptide chiar dup 24 de ore de hidroliz. Aceste polipeptide
sunt formate n principal de ctre aminoacizii hidrofobi cum ar fi valina, leucina, isoleucina, i
fenilalanina. Aceste peptide sunt mult mai rezistente fa de hidroliz i necesit o perioad
mai lung. Dar aceste condiii ar duce la degradarea altor aminoacizi.
Aa cum se observ nu exist nici un set de condiii experimentale care s ndeplineasc toate
condiiile metodele utilizate reprezint un compromis pentru obinerea unui numr ct mai mare
de aminoacizi. Se realizeaz o hidroliza la 110 C 22-24 h, de preferat n stare de vapori, n
prezen de ageni protectivi (fenol). Pentru analiza triptofanului i cisteinei sunt necesare
proceduri speciale.

2. Hidroliza alcalin se realizeaza cu soluii 4,2 M de NaOH, KOH, LiOH sau Ba(OH)2 cu sau fr
adiie de 1% (m/v) tioglicol timp de 18 h la 110 0C.

3. Hidroliza enzimatic - se realizeaz cu enzime proteolitice cum ar fi tripsina, chimotripsina,
carboxipeptidaz, papain, thermolizin. Trebuie sa se tina cont de activitatea specific a
enzimei utilizate.

DETERMINAREA CANTITATII TOTALE DE AMINOACIZI

Cea mai simpla sarcina este determinarea continutului total de aminoacizi, fara a face
discriminare unii de altii. Sunt metode spectrofotometrice, care se bazeaza pe reactia gruparilor
-aminice cu reactivi:
- o-ftaldialdehida,
- ninhidrina
- acid trinitro-benzen-sulfonic.

Exista o corelatie liniara intre intensitatea absorbtiei/emisiei si concentratia gruparilor aminice.

Se aplica pentru:
- obtinerea indexului protelitic,
- controlul gradului de hidroliza a proteinelor alimentare,
- controlul procesului de eliminare a proteinelor din vin,
- controlul proceselor de fabricatie (branza),
- dezvoltarea aromei pe baza aminoacizilor care in urma transformarilor genereaza
compusi ce comfera aroma, etc.

METODE DE DETERMINARE CARE IMPLICA TEHNICI DE SEPARARE

Analiza aminoacizilor individuali necesit o separare prealabil mai puin cazul in care se
utilizeaz metode selective de determinare. Separarea aminoacizilor din amestec necesita
tehnici de separare foarte eficiente cum ar fi cromatografia (HPLC, CG) sau electroforeza
capilara. Alegerea tehnicii de analiza depinde in principal de echipamentul disponibil i de
preferinele personalului, deoarece fiecare metoda prezint avantaje si dezavantaje.

A) Cromatografia de lichide
1. Metode prin schimb cationic - se bazeaz pe faptul ca aminoacizii au sarcin electric. Ca
faz staionar se utilizeaz polistirenul sulfonat cu soluii apoase tampon de citrat de sodiu
ca faze mobile. Elutia se realizeaz cu gradient, creterea att a pH-ului ct si a concentraiei.
In aceste condiii aminoacizii cu caracterul cel mai acid vor iei primii iar cei cu doua sau mai
multe grupri amino primare vor fi eluati mai trziu. Dup separare aminoacizii sunt
derivatizai pentru detecie fie in VIZ fie in fluorescen. Se pot utiliza de asemenea si detectori
electrochimici. Avantajul metodei este ca da rezultate foarte precise pentru toate tipurile de
probe cunoscute. Este considerat metoda de referint. Fiecare metod noua trebuie sa se
raporteze la aceast metod. Dezavantajul major const in costul ridicat al aparaturii, a fazelor
mobile complexe i a timpului lung de analiz.
2. Crompatografie de lichide cu faz invers (RP-HPLC) - este foarte utilizata deoarece poate fi
folosita i pentru alte aplicaii.

n acest caz aminoacizii trebuie derivatizai nainte de separare pentru ai transforma n
molecule hidrofobe, astfel nct s poat participa la procese de repartiie ntre faza stationar
i cea mobil. Totodat derivatizarea va permite o detectie mai bun.
- Faza mobil trebuie s dizolve proba pentru a fi transparent pentru sistemul de
detectie. Faza mobil este o combinaie de tampon apos cu un solvent organic ca
metanol, acetonitril, tetrahidrofuran. Tamponul este format din soluii cel mult
100mM de acetat sau fosfat. De regul eluia se realizeaz cu gradient.
- Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel chimic modificate cu
grupri alchil, n principal C18. Selectivitatea obinut cu coloane provenite de la
productori diferiti este diferit datorit metodelor diferite de atasare a lantului
alchil de suprafata suportului de silicagel, de densitatea acoperirii care comfera
un grad mai mare sau mai mic de hidrofobicitate.

Deasemenea gruprile silanol nereactionate pot interaciona cu moleculele aminoacidului
ducnd la aparitia picurilor cu cozi. Pentru a preveni acest inconvenient se poaze aduga
trietilamin.
Analiza aminoacizilor

Derivatizarea - are ca scop mbuntirea :
- separarii,
- deteciei.
Eficiena agentului de derivatizare este evaluat pe baza urmtoarelor aspecte:
- s reacioneze att cu aminoacizii primari ct i cu cei secundari,
- s dea un singur derivat cu fiecare aninoacid,
- s reacioneze cantitativ i reproductibil,
- produsul rezultat s fie stabil,
- s nu existe interferene ale produilor secundari sau a excesului de agent de
derivatizare,
- s necesite condiii simple i blnde de reacie,
- s prezinte posibilitate de automatizare.
DERIVATIZARE N VEDEREA MBUNTIRII DETECIEI - sensibilitatea i selectivitatea deteciei
sunt influentate de proprietile spectrale i electrochimice a derivailor obinui. Alegerea
agentului de derivatizare este fosrte important.

Detecie spectroscopic - se bazeaza pe ataarea de molecula aminoacidului grupri care confer
moleculei derivate proprieti absorbante (UV/Viz) sau fluorescente. Derivatizarea se poate realiza
naintea separrii - derivatizare precoloan sau dup separare - derivatizare postcoloan.
Derivatizarea precoloan att on-line ct i off-line iar cea postcoloan se realizeaz on-line.

1. Derivatizarea precoloan: pe lng mbuntirea selectivitii i sensibilitii n urma
derivatizrii moleculele de aminoacid devin mai hidrofobe, fcndu-le potrivite i pentru
separarea prin cromatografie de lichide pe faz invers RP18. Ca reactivi de derivatizare se
utilizeaz:

a. Fenil-iso-tiocianat reacioneaz att cu aminoacizii primari ct i cu cei secundari, formnd
derivatul feniltiocarbamil, detectabil n UV la 245 nm. Derivatul rezist la temperatura camerei 1 zi
i o durat mai lung de timp n frigider, mai ales n absenta apei. Prepararea probei este
laborioasa, necesit mediu bazic (trietilamina, pH 10,5) i include cteva etape de uscare, ultima
etap fiind cea de nlturare a excesului de reactiv, care poate distruge coloana. Derivatul apare
n cel mult 10 min, deci un timp de reacie de 20 de min este suficient pentru reacia total.
Compoziia reactivului de derivatizare este esenial pentru determinarea acidului glutamic i
aspartic. Prezena cationilor mono i bivaleni (provenit din sticlrie n timpul hidrolizei) i a
srurilor (NaCl) pot cauza insolubilizarea derivailor acidului aspartic i glutamic. Pentru ceilali
aminoacizi concentraia NaCl nu prezint importan

C6H5-N=C=S + H2N-HCR-COOH C6H5-NH-CS-NH-HCR-COOH
b. Clorura de 4-dimetil-aminobenzen-4-sulfonil (Dabsyl-Cl sau DBS) - detecie n domeniul vizibil
la 448-468 nm. Lungimea de unda mare de absorbie face ca linia de baz a cromatogramei s fie
stabil pentru multe sisteme de solveni. Limita de detecie n domeniul picomolilor. Derivaii
sunt foarte stabili (1 sptmn) i pot fi formai att de aminioacizii primari ct i cei secundari.
Timpul de reacie este de aprox. 15 min la 70 C, are loc n mediu bazic cu exces de reactiv.
Eficiena reaciei depinde foarte mult de matrice i variaz funcie de tipul aminoacidului i
prezena clorurilor n concentraie mare.
H
2
N N N S
O
O
Cl + CH
COOH
R
H
2
N
-HCl
CH
COOH
R
HN H
2
N N N S
O
O
c. Clorura de 1-dimetilamino-naftalen-5-sulfonil (Dansyl-Cl) - este mult folosit pentru
determinarea azotului terminal din proteine i peptide. Reacioneaz cu aminoacizii primari i
secundari dnd un derivat puternic fluorescent (detecie prin excitare la 350 nm i msurarea
emisiei la 510 nm sau detecie la 250 nm). Derivatul este stabil 1 zi sau 7 zile la ntuneric i la -
40 C. Derivatizarea este simpl, necesit mediu bazic pH-9,5 timp de reacie 1 h la temperatura
camerei la ntuneric / 15 min la 60C sau 2 min la 100C. Poate forma derivai multiplii cu
histidina, lisina i tirosina, deci condiiile de reacie trebuie optimizate i atent controlate.
+ H
2
N CH
COOH
R
SO
2
Cl
N(CH
3
)
2
-HCl
N(CH
3
)
2
SO
2
CH
COOH
R
NH
d. 5-5'-ditio-bis(nitrobenzoic acid) (DTNB) - utilizat pentru aminoacizii cu sulf
S
S
HOOC
HOOC
O
2
N
O
2
N
+
HS R
S
HOOC
O
2
N S R
+
S
HOOC
O
2
N H
e. 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) - da derivai stabili att cu aminoacizii
primari ct i cu cei secundari, lungimea de excitare la 470 nm i cea de emisie 530 nm.
Timp de reacie 1 min la 60 0C

f. 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) - se utilizeaz la determinarea
cantitativ a tiolilor i aminelor reacioneaz cu cisteina in mediu acid dnd un produs
verde cu maximul de absorbie la 410 nm.
h. Aldehida o-ftalica (o-phthaldialdehyde OPA) reactioneaza cu aminoacizii primari in
prezenta mercaptanului pentru a da un compus cu fluorescenta ridicata. Fluorescenta este
msurata la 455nm sau 470 nm dup excitare la 230 respectiv 330 nm. Reactivul in sine nu este
fluorescent. Derivaii pot fi detectai si in absorbie la 338 nm. Tipul mercaptanului utilizat
influenteaza stabilitatea selectivitatea cromatografica si intensitatea fluorescentei. Dintre cei
mai utilizati: 2-mercaptoetanol, etantiol, si acidul 3-mercaptopropionic. Derivatizarea este
rapida (1-3 min) la temperatura camerei si in mediu alcalin (tampon pH=9,5). Dezavantajul
major este ca aceti derivai nu sunt stabili, problema fiind parial rezolvata prin controlarea
stricta a timpului dintre etapa de derivatizare si cea de injectie. Nu reactioneaza cu aminele
secundare. Acest dezavantaj poate fi surmontat prin transformarea aminelor secundare in
amine primare prin oxidare cu hipoclorit sau cloramina nainte de derivatizare.
g. 9-fluorenilmetil-cloroformate (F-MOC) - d derivai fluorescenti atat cu aminele primare cat si
cu cele secundare, lungimea de und de excitare 265nm, emisie 315 nm. Dezavantajul cel mai
mare este ca reactivul de derivatizare este fluorescent i poate interfera in determinare. Este
extras nainte de analiz. Reactioneaza cu amine puternic hidrofobe rezultnd compui cu timp
de retenie mare. Timp de reacie 45-90s fara incalzire.
O C
O
Cl
+
H
2
N CH
COOH
R
- HCl
O C
O
NH CH
COOH
R
2. Derivatizarea postcoloan - implic separarea aminoacizilor liberi prin cromatografie de
lichide, introducerea n efluent a agentului de derivatizare potrivit, amestecarea i trimiterea lor
cu ajutorul unei pompe n camera de reacie i n final pomparea derivatului obinut n detector.
Principalul dezavantaj al acestui tip de derivatizare este c necesit echipament adiional: o
pomp pentru introducerea i amestecarea agentului de derivatizare i eventual un dispozitiv
de nclzire. Un alt dezavantaj este lrgirea picului la baz produs de ctre volumul mort
introdus dup coloan.

Ca i reactivi de derivatizare se utilizeaz: ninhidrina, fluorescamina i aldehida o-ftalic.

a. fluorescamina nu este fluorescenta, derivatul se masoara la 475 excitare la 390nm. Un
dezavantaj major este acela c reacia are loc n mediu bazic, n contextul n care separarea
prin schimb ionic are loc n mediu acid. Aceasta face necesar adaugarea unei pompe
suplimentare pentru a introduce un tampon bazic nainte de a reactia cu fluorescaina. Se
folosete numai n cazul derivatizrilor speciale.
HC
COOH
R
NH
2
+
O
O
O O
O
OH
OH
N O
C
R
HOOC
H
b. ninhidrina - reacioneaz cu toi cei 20 de aminoacizi dnd compui colorai fr a produce
compui secundari sau mai muli compui de derivatizare. Derivaii provenii de la amine
primare dau un produs albastru cu maximul de absorbie la 570 nm, iar cei provenii de la
amine secundare dau un compus brun cu maximul de absorbie n jur de 440 nm.
O
O
OH
OH
+
R
CH
COOH
H
2
N
O
O
N CH
COOH
R
O
O
NH
2
O
O
OH
OH
O
O
N
+ R C
O
H
+
CO
2
O
O
NH
2
+
O
O
2H
2
O
-
DERIVATIZARI IN VEDEREA OBTINERII UNEI SEPRARI MAI BUNE

Scopul acestor derivatizari este de a obtine compusi volatili si termostabili in vederea
analizei GC.

Derivatizarea se realizeaza in doua etape:
- esterificare cu alcooli acidulati cu HCl 3M, de exemplu: metanol, i-propanol, i-
butanol, n-propanol, n-butanol si alcool i-amilic (gruparea COOH).
- N-acilare cu o anhidrida acida in mediu anhidru : anhidrida trifluoracetica,
anhidrida pentafluoropropionica, N-tert(butildimetilsilil)trifluoracetamida
(gruparea NH2).

C09

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

C09

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

DETERMINAREA PROTEINELOR - determinarea azotului

S-ar putea să vă placă și