UNIVERSITATEA DIN BUCURETI Facultatea de Chimie

BIOSENSORIINSTRUMENTE ANALITICE UTILIZATE N LABORATORUL MEDICAL

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific, Profesor Dr. Vasile Magearu

Doctorand,

Elena Rodica Ionescu

Bucureti, 2007

CUPRINS

INTRODUCERE................................................................................................................................ 4 3. SENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA PROTEAZELOR ...................................................... 7 3.5. Rezultate i discuii ............................................................................................................... 7 3.5.1. Caracterizarea electrochimic a electrodului modificat cu poly(pirol-alchilamonium)Gox. .......................................................................................................................................... 7 3.5.3. Performanele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei ....................... 8 4. DETECTAREA AMPEROMETRIC A CADN-ULUI DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST FOLOSIND ELECTROZI MODIFICAI CU FILMUL DE POLIPIROL .............................................................................. 9 4.1. Introducere ............................................................................................................................ 9 4.2.1. Oligonucleodele WNV ................................................................................................. 10 4.4. Prepararea sensorului ADN .............................................................................................. 10 4.5. Rezultate i discuii ............................................................................................................. 10 4.5.1. Elababorarea electrochimic i caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS). ................. 10 4.5.3. Curba de calibrare amperomtric pentru determinarea concentraiilor de cADN WNV. ................................................................................................................................................ 11 4.6. Concluzii ............................................................................................................................. 11 5. SENSOR ELECTROENZIMATIC POLIPIROL-INTERCALATOR PENTRU DETECTAREA CADN DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST ................................................................................................................. 12 5.1. Introducere .......................................................................................................................... 12 5. 4. Rezultate i discuii ........................................................................................................... 12 5.5. Concluzii ............................................................................................................................. 13 6. IMUNOSENSOR AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IGG FOLOSIND UN COPOLIMER FOTOACTIV ................................................................................................................... 14 6.1. Introducere .......................................................................................................................... 14 6.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un film polimeric ................................................. 14 6.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul de copolimeric .............................................. 14 6.4. Rezultate i discuii ............................................................................................................. 15 6.4.3. Construcia imunosensorului i detecia anticorpilor WNV ........................................ 15 6.5. Concluzii ............................................................................................................................. 16 7. IMUNOSENSORUL AMPEROMETRIC PENTRU DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IGG FOLOSIND INCAPSULAREA PHAGILOR INTR-UN FILM DE POLIPIROL(ALCHIL-AMONIUM) .................................... 16 7.1 Introducere ........................................................................................................................... 16 7.4. Prepararea imonosensorului-WNV avnd la baz phagi incapsulai ntr-un film de polipirol...................................................................................................................................... 16 7.5. Rezultate i discuii ............................................................................................................. 17 7.5.1. Elaborarea electrozilor modificai cu polimer si phagi ................................................ 17 7.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-phagi WNV....................................................... 18 7.5.3. Performanele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV ........................ 18 7.6. Concluzii ............................................................................................................................. 19 8. CONSTRUIREA IMUNOSENSORILOR AMPEROMETRICI PENTRU DETERMINAREA ANTICORPILOR ANTIHOLER BAZAI PE ELECTROGENERAREA FILMELOR PERMEABILE DE POLIPIROL-BIOTINILAT .......... 19 8.1. Introducere .......................................................................................................................... 19 8.5. Prepararea imunosensorului .............................................................................................. 20 8.7. Rezultate i discuii ............................................................................................................. 20 8.7.1. Caracterizarea electrochimic a filmului de copolimer format din poli(pirol-biotin) i poli(pirol-lactobionamid) ..................................................................................................... 20 8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT ....................................... 21

8.8 Concluzii .............................................................................................................................. 22 9. COMPARAREA A TREI CONFIGURAII DE IMUNOSENSORI ENZIMATICI PENTRU DETECTAREA ANTICORPULUI ANTI-TOXINA HOLEREI ............................................................................................. 22 9.1. Introducere .......................................................................................................................... 22 9.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici ...................................................................... 23 9.5. Tranducerea amperometric a imunoreaciei .................................................................... 23 9.6. Rezultate i discuii ............................................................................................................. 24 9.6.1. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP ............. 24 9.6.2. Performanele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, i PPO-B ......................... 24 9.6.3. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B i PPO-B ca markeri enzimatici n construcia de imunosensori ............................................................................. 25 9.7. Concluzii ............................................................................................................................. 25 10. MBUNATATIRI ADUSE N REINEREA ENZIMELOR DE FILMUL DE POLI(PIROL-ALGINAT) N ELABORAREA BIOSENSORILOR ......................................................................................................... 26 10.1. Introducere ........................................................................................................................ 26 10.4. Rezultate i discuii ........................................................................................................... 26 10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat i polipirol-alginat pentru testele electrochimice 26 10.4.2. Studii de permeabilitate ............................................................................................. 27 10.4.4. Biosensori amperometrici bazai pe filmele de alginat i polipirol-alginat ............... 28 10.5. Concluzii ........................................................................................................................... 28 11. BIOSENSORI AMPEROMETRICI BAZAI PE GELURI DE ALGINAT I POLIPIROL-ALGINAT CONINND CELULE ALGALE DE CHLORELLA VULGARIS..................................................................................... 28 11.1. Introducere ........................................................................................................................ 28 11.5. Prepararea biosensorului algal ........................................................................................ 29 11.7. Rezultate i discuii ........................................................................................................... 29 11.7.1. Compararea electrochimic a stabilitii gelurilor de alginat i poli-pirol alginat ce conin celule algale................................................................................................................. 29 11.7.3. Performanele analitice ale biosensorilor celule algale-alginat i celule algalepilipirol-alginat....................................................................................................................... 30 11.7. Concluzii ........................................................................................................................... 31 BIBLIOGRAFIE SELECTIVA...................................................................................................... 33
* Numerotarea tabelelor, figurilor si cea a indicatiilor bibliografice este cea din teza de doctorat

atinge nivelul necesar dozajului imunologic. Alte technici relativ rapide (cteva ore) INTRODUCERE folosite n laboratorul medical pentru identificarea microorganismelor, sunt technicile bazate Bacteriile, virusurile i alte microorganisme sunt larg rspandite n natur i mediul nconjurtor. Bacteriile patogene se gsesc n pmnt, n ape, n tractul intestinal al animalelor sau n apele contaminate cu deeuri fecale. O persoan poart n medie mai mult de 150 de tipuri de bacterii care pot exista att n interiorul ct i la exteriorul corpului uman. Majoritatea microorganismelor desfoar activiti eseniale n natur, fiind n numr mare benefice dezvoltrii plantelor i animalelor. Depistarea rapid i specific a microorganismelor (bacterii, virusuri) este astfel esenial n diagnosticarea, tratarea i prevenirea eficient a unei infecii umane. n acest direcie, metodele de laborator convenionale dei sunt eficiente necesit cteva ore pn la obinerea rezultatelor i un personal calificat n pinate pe utilizarea probelor de acizi nucleici (ADN sau ARN), care recunosc specific probele complemantare de acizi nucleici, precum i technica de amplificare n lan a acizilor nucleici PCR- bazat pe o amplificare rapid a ADNului sau ARN-ului microbial pentru identificare. Dei PCR-ul este foarte specific, metoda prezint mai multe dezavantaje: prezena unui person calificat, un mediu de lucru foarte curat, necesitatea izolrii si caracterizrii genelor unice ale microoganismului analizat, iar uneori etape suplimentare de lucru pentru eliminarea substanelor inhibitorii. Marea parte a inconvenienelor ntmn realizarea metodelor clasice de

identificare a microorganimelor sunt eliminate prin introducerea biosensorilor. Astfel, n ultimii ani, se observ un interes deosebit acordat

microbiologie. n mod curent pentru identificarea

dezvoltarii technologiei biosensorilor ce este bazat pe cerina din ce in ce mai ridicat n detectarea rapid i specific ntr-un timp scurt a unui numr sporit de analii, vitali sntii omului. Prin introducerea patogenilor biosensorilor microbieni i n a diagnosticarea

microoganismelor sunt folosite testele imunologice ca imunofluorescena, aglutinarea pe plac i testele enzimatice ELISA ce au la baza monitorizarea reaciiei anticorp-antigen [65]. Aceste teste prezint o sensibilitate i o specificitate moderat, necesitnd cteva ore de prepare i cel puin 106 microorganisme pentru identificare. Dac acest numr de microoganisme nu este prezent n proba de analizat, trebuie mai nti ca microoganismele s fie cultivate ntr-un mediu de agar sau ntru-un mediu bogat n nutrieni pentru cel puin 2 sau 3 zile pentru a

toxinelor biologice se mbuntete considerabil sensibilitatea i selectivitatea testelor biochimice. Ca urmare, biosensorii intervin n diagnosticarea clinic (de exemplu determinarea glucozei din snge), n controlul alimentaiei publice, n bioprocesele de control, i n testarea calitii mediului. Lucrarea de doctorat prezint construirea reuit a mai multor tipuri de biosensori bazai pe

-4-

utilizarea de filme variate de polipirol ce faciliteaz capturarea biomoleculelor i permit dozarea specific i reproducil a enzimelor, viruilor i bacteriilor cu ajutorul metodelor electrochimice (amperometrie, voltametrie). Ca i construcie, lucrarea este structurat n dou pri principale care se refer la date din literatur -PARTEA TEORETIC- primele dou capitole i contribuii originale PARTEA EXPERIMENTAL prezentate pe parcursul a 9 capitole. n primul capitol sunt tratate aspecte generale legate de structura virusurilor, bacteriilor i bacteriophagilor cu descrierea n particular a virusului Nile West i a bacteriei Vibrio cholera ce sunt studiai (identificai electrochimic) n teza de doctorat metodele identificare fizico-chimice a acestora i precum i de n enzimatice folosite

gelatin. Biosensorul are la baz digestia unui strat uscat de gelatin depozitat la suprafaa unui electrod de platin. n capitolul 4 este prezentat elaborarea unui biosensor amperometric folosit n determinarea fragmetelor scurte prezintetizate de ADN din virusul Nile West. Biosensorul este bazat pe cuplarea covalent a unei probe-ADNaminate de un film de polipirol electrogenerat la suprafaa unui electrod de platin. Prin cuplarea ulterioar cu ADN-ul target se realizeaz procesul de hibridizare monitorizat prin

intermediul unei probe-ADN biotinilate via interaciei cu avidin. Capitol 5 descrie un concept original de sensor-ADN, bazat pe identificarea unui ADN derivat din virusul Nile West prin intermediul unui compus intercalant grefat covalent de un film de polipirol ce permite ulterior integrarea sa specific n duplexul ADN dup cum arat experienele amperometrie. n capitolul 6 se descrie construirea unui imunosensor amperometric pentru determinarea anticorpilor IgG specifici pentru virusul Nile de voltametrie ciclic i

curent

laboratoarele de analize medicale. n capitolulul 2 se prezint aspectele generale privind construirea biosensorilor (imuno-sensori i sensori ADN) bazai pe utilizarea de electrozi modificai cu diferite filme polimerice bazate pe derivai ai pirolului. De asemenea se trateaz succint biochimia general a anticorpilor, acizilor nucleici i a markerilor enzimatici ce ajut la ntelegerea principiului de funcionare al biosensorilor fabricai n lucrarea de doctorat. n capitolul 3 se descrie construirea unui biosensor amperometric folosit n determinarea de concentraii sczute de proteaze (tripsin). La nceput este prezentat principiul de construcie al sensorului enzimatic, urmat de discutarea evoluiei amperometrice n timp, ca urmare a aciunii tripsinei asupra unui strat uscat de

West prin intermediul bacteriophagilor(antigene) - ce poart un epitop specific pentru virusfotoimobilizati ntr-un film copolimeric constituit din uniti de pirol-benzofenon i pirolrutenium. Prezena phagilor grefai precum i influena unui raport optim ntre cei doi monomeri utilizai este confirmat prin studii de voltametrie ciclic. n capitolul 7 se prezint fabricarea unui immunosensor amperometric pentru

determinarea anticorpilor IgG specifici virusul Nile West prin intermediul bacteriphagilor

-5-

incapsulai ntr-un film de polipirol amfifilic. Optimizarea sistemului de dozare amperometric (cantitatea de phagi depozitat, modul de electropolimerizare) este realizat prin voltametria ciclic. n capitolul 8 se descrie modul de fabricare i de funcionare a unui imunosensor amperometric original pentru detectarea anticorpilor de holer avnd la baz utilizarea unui copolimer de polipirol-biotin i polipirollactobionamid pentru imobilizarea antigenelor holerei biotinalate prin intermediul interaciei cu unitile de avidin i n combinaie cu un marker enzimatic ca peroxidaza. Capitolul prezint de asemenea studii de estimare a permeabilitii filmului copolimeric biotinilat care este direct corelat cu posibilitatea de detecie a imunoreaciei prin amperometrie. n capitolul 9 se compar performanele analitice obinute pentru trei configuraii de imunosensori amperometrici ce utilizeaz glucooxidaza, tirozinaza i peroxidaza drept markeri enzimatici pentru detectarea amperometric a anticopilor de holera. n prima parte a studiului se prezint modul de prepare i principiul de funcionare al celor trei imunosensori iar n partea a doua se prezint n detaliu performanele fiecrui biosensor, unde sistemul ce utilizeaz peroxidaza se remrca ca fiind cel mai sensibil. n capitolul 10 este prezentat sinteza unui nou derivat de pirol, monomerul de pirolalginat care n urma procesului de

lanurilor electropolimerizate a fost clar ilustrat prin scderea permeabilitii comparativ cu gelul natural de alginat n prezena speciei permeante hidrochinona. n partea a doua a studiului au fost analizate performanele analitice ale filmelor de alginat modificat i nemodificat cu grupri pirolice coninnd molecule de gluco-oxidaza pentru determinarea glucozei. n capitolul final (11) sunt raportate fabricarea reuit i performanele analitice ale biosensorilor bazai pe incapsularea celulelor algale de Chlorella vulgaris n gelul de alginat natural i ntr-un matrix nou sintetizat de pirolalginat. Cele dou configuraii de biosensori sunt comparate n ceea ce privete curentul amperometric obinut n prezena substratului de p-nitrofenil fosfat pentru dozarea activitii fosfatazei alcaline algale. Stabilitatea superioar a gelului de polipirol-alginat este evideniat n comparaie cu cea caracteristic alginatului natural ceea ce recomand gelul de polipirol alginat ca un suport netoxic i eficient pentru construirea de biosensori. 2. Aspecte generale n construirea

biosensorilor Biosensorii sunt instrumente analitice ce integreaz o component biologic (receptorul biochimic) de o suprafa solid (transducer) ce faciliteaz intercaiile biospecifice reversibile cu analitul i convertete semnalul biologic ntr-un semnal electric msurabil. Componenta biologic este reprezentat fie de enzime, receptori, celule, esuturi, organele, peptide, anticorpi, acizi nucleici etc., asigurnd recunoaterea molecular (Figura 2.1). Biosensorii ce utilizeaz anticorpii sau fragmente de anticorpi drept material biologic sunt cunoscui sub numele de

electropolimerizarea a condus la formarea unui matrix polipirol-gel, ce prezint un grad ridicat de reinere a enzimelor, cu sporirea stabilitii la efectul distructiv al anionilor de fosfat ceea ce nu este posibil cu gelul de alginat standard. Prezena

-6-

imunosensori. Comparativ cu metodele analitice convenionale, drept structuri componeni. modern biosensorii intergrate Biosensorii posibil sunt caracterizai diveri nalta unei pentru combin obinerea

3. SENSOR AMPEROMETRIC PENTRU

DETECTAREA PROTEAZELOR

n acest capitol se prezent o metod original de cuantificare a tripsinei n domeniul picomolar, bazat pe elaborarea unui biosensor ce are la baz detecia amperometric a curentului nregistrat de un electrod de platin

specificitate analitic cu procesarea electronic fcnd sensibilitii remarcabile.

Proba

modificat incapsulate
Semnal
(curent, lumin, frecven)

cu

molecule film

de

gluco-oxidaza de poli(pirol-

intr-un

alchilamonium) (Figura 3.1.) i ulterior acoperit cu un strat de gelatin ce este supus digestiei

Analit

proteolitice.

Figura 2.1. Schema general a unui biosensor. De asemenea, biosensorii ADN bazai pe recunoaterea dezvoltare acizilor nucleici, cunosc o i rapid datorit simplicitii

Figura 3.1. Structura monomerului de pirolalchilamonium.

3.5. Rezultate i discuii 3.5.1. Caracterizarea electrochimic a electrodului modificat cu poly(pirolalchilamonium)-Gox. Deoarece Gox catalizeaz oxidarea

costurilor reduse necesare pentru testarea bolilor infecioase i genetice. Spre deosebire de enzime sau anticorpi, straturile de recunoatere a acidului nucleic pot fii sintetizate i regenerate pentru mai multe utilizri. Biosensorii sunt utilizai intensiv ca intrumente de diagnosticare clinic [48], predominant n aa numitul point-of care testing. Astzi, biosensorul cu cel mai ridicat succes comercial in vitro este biosensorul de glucoz sub form de dispozitiv portabile ce au

aerobic a glucozei cu producerea concomitent a H2O2, au fost investigate performaele analitice ale electrodului enzimatic pentru determinarea glucozei. Detecia amperometric a glucozei a fost realizat n soluie de tampon fosfat salin (0.1 M PBS, pH = 7) prin poteniostarea electrozilor modificai la 0.6 V pentru a facilita oxidarea enzimatic a H2O2 generat la suprafaa electrodului de platin. Curba de calibrare obinut a fost liniar cu variaiile concentraiei

posibilitatea de schimbare a cartrig-ului de reactivi.

REZULTATE ORIGINALE

-7-

de glucoz, iar nivelul de saturaie n glucoza platoul- se atinge la concentraia de 22 mM. Sensibilitatea biosensorului (definit ca partea liniar iniiala din curba de calibrare) i densitatea maxim a curentului la saturaie au fost de 23 mA x M-1 x cm-2, respectiv de 102 mA x cm-2. Pentru a cuantifica efectul gelatinei asupra performaelor analitice ale biosensorului, a fost investigat rspunsul amperometric al sensorului la injecia a 2 mM glucoz. Aceat concentraie de glucoz a fost aleas ca fcnd parte din reginea linear a curbei de calibrare, iar rspunsul biosensorului a fost direct proporional cu concentraia substratului [54]. Cum s-a presupus, formarea stratului de gelatin creaz mpiedicri sterice puternice ngreunnd difuzia glucozei ctre stratul de polimer-Gox i drept urmare se obin un curent diminuat de 5% din valoarea sa iniial (Figura 3.3b), cazul unui electrod nemodificat cu gelatin (Figura creterii 3.3a). Astfel, dozarea activitii datorit proteolitice a fost efectuat prin intermediul curentului amperometric degradarii stratului de gelatin n urma digestiei proteolitice.

imersarea electrodului gelatinat n soluii de tripsin: (c) 40 s; (d) 60 s; (e) 80 s; (f) 230 s; (g) 5 min; (h) 10 min; (j) 30 min. Biosensorul a fost poteniostat la 0.6 V n soluia 0.1M PBS (pH 7) supus agiiei magnetice. 3.5.3. Performanele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei Pentru ilustrarea sensibilitii crescute a biosensorilor de gelatin-Gox pentru digestia proteolitic (triptic), s-a examinat efectul diferitelor concentraii de tripsin (0,001 pn la 300 g/ml) preparate n 0.1 M PBS asupra sensibilitii biosensorului. Figura 3.4. prezint creterea dramatic a curentului amperometric n momentul injectrii a 2 mM glucoz pentru concentraii cuprinse ntre 0.1 pn la 300 g/ml. Se observ modificri de curent minore pentru concentraii cuprinse ntre 1 i 100 ng, ceea ce sugereaz c prezenta metod nu poate fii utilizat pentru determinarea de concentraii de tripsin mai sczute de 1ng/ml tripsin.

Figure 3.4. Creterea intensitii curentului amperometric pentru sensorii de gelatina-Gox n prezena glucozei (2mM) pentru diferite concentraii de tripsin dup 1 minut de digestie enzimatic. Creterea este raportat sub forma de raport a curentului obinut de biosensor i cel obinut iniial n absena gelatinei. Figura 3.3. Evoluia rspunsului biosensorului la injecia glucozei (2mM) ca urmare a degradrii stratului gelatinic de ctre tripsin (300 g/ml) pe o perioad determinat de timp. (a) nainte modificrii cu gelatin; (b) dup gelatinare; i la diferite intervale de timp de la Dozarea tripsinei a fost investigat prin incubarea electrozilor gelatinai 10 minute n soluia de tripsin. Pentru fiecare concentraie de tripsin au fost preparai trei biosensori

-8-

individuali

gelatin-Gox

iar

curentul

suprimarea rspunsului biosensorului de ctre un strat uscat de gelatin ce acoper un electrod de platin modificat cu un film de polipirol-alchil amonium coninnd molecule de gluco-oxidaza incapsulate n reeaua polimeric, iar n etapa secundar se monitorizeaz evoluia curentului amperometric catalitic aprut n prezena glucozei dup o digestie triptic progresiv a stratului de gelatin. Digestia proteolitic a stratului de gelatin este foarte rapid n prezena unei concentraii de 300 g/ml tripsina, conducnd la o cretere continuu a curentului anodic timp de un minut de tratament cu tripsin. Dup acest timp, se observ un efect

amperometric medie a fost nregistrat. S-a observat o cretere liniar a curentului cu logaritmul concentraiilor de tripsin n domeniul de 1 pn la 250 ng/ml (Figura 3.6).

Figura 3.6. Curba de calibrare a tripsinei ilustreaz creterea curentului biosensorilor de gelatina-Gox n momentul injectrii a 2 mM glucoza pentru diferite concentraii de tripsin i dup un timp de degradare a gelatinei de 10 minute. Condiiile experimentale au fost identice cu cele din Figura 3.4. Limita de detecie de 1 ng/ml sau 42 pM este remarcabil, fiind mult mai superioar comparativ cu ali biosensori 25 nM i 40 ng/ml [117,118]. n plus, aceti biosensori prezint un timp de rspuns de 20 i 60 minute, n timp ce electrozii de gelatin-Gox rspund rapid, dup 1 minut pentru 300 g/ml tripsin sau n 10 minute pentru 1 ng/ml tripsin.

toxic al tripsinei asupra moleculelor de glucooxidaza ce induce o scderea progresiv a curentului. Acest efect de toxicitate este datorat tripsinei ce atac situsurilor de arginin i lizin prezente n Gox. Ca urmare, timpul de dozaj foarte rapid al tripsinei (1 min), precum i simplicitatea cons-truirii biosensorului enzimatic face ca acest tip de dozare enzimatic s vin n ajutorul monitorizrii strii de sntate a pacienilor suspeci de dereglri n nivelul tripsinei. 4. DETECTAREA AMPEROMETRIC A CADNULUI DERIVAT DIN VIRUSUL

NILE WEST

FOLOSIND ELECTROZI MODIFICAI CU FILMUL DE POLIPIROL

3. 6. Concluzii n acest capitol se prezint o metod amperometric original i cu potenial de aplicabilitate n domeniul medical ca urmare a posibilitii de dozare rapide (10 minute) a unor concentraii foarte sczute de tripsin de pn la 1ng/ml. Acest metod folosete n prima etap 4.1. Introducere n acest capitol prezent o noua strategie de fabricare a sensorilor-ADN bazat pe grefarea chimic a oligonucleotidelor pornind de la simpla elaborare a filmului de poli(pirol) Nsubstituit de ctre grupele de hidroxi-sucinimid

-9-

(NHS). Secvena cADN a fost sintetizat dintr-o secvena ARN a virusului Nile West (WNV) (de provenien din Israel) [86]. Detectarea amperometric a fragmentelor scurte de cADN WNV a fost investigat dup producerea procesului de hibridizare, prin intermediul unui marker

Figura 4.2. Fabricarea sensorului cADN WNV. 1. Filmul de poli(pirol-NHS); 2. Cuplarea probei ADN aminate; 3. Hibridizarea cADN WNV int; 4. Hibridizarea cu lanul oligonucleotic biotinilat; 5. Cuplarea gluco-oxidazei cu avidin i detectarea semnalului. 4.5. Rezultate i discuii 4.5.1. Elababorarea electrochimic i

enzimatic gluco-oxidaza. 4.2.1. Oligonucleodele WNV Oligonucleotidele WNV au fost obinute de la Integrated DNA Technologies (IA). Probe-WNV-DNA (WNVP-21 mer): Amino + 12/5'-CTTTGGTGGAGAGATCGCTGA-3' (-) Target-WNV-DNA (WNVT-36 mer):
5'-GCTATTTGGCTACCGTCAGCATCTCTCCACCAAAG-3' (+)

caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS). Comportamentul electrochimic al

monomerului de pirol-NHS (2 mM) a fost investigat n CH3CN + 0.1 M LiClO4. Prin scanarea oxidativ, monomerul prezint un pic ireversibil la 1.08 V (fa Ag/10 mM Ag+ electrod de referin) ceea ce corespunde oxidrii gruprii pirol n radicali cationici (Figura 4.3A). Electropolimerizarea monomerului de pirol-NHS a fost realizat prin repetarea ciclrii potenialului pe intervalul 0 0.95V. Aparena i continuua cresere a picului reversil la 0.48V indic clar formarea filmului polimeric la suprafaa electrodului (Figura 4.3B). Electrodul

WNV-DNA-biotin (WNVB15 mer):

5'-CGGTAGCCAAATAGC/Biotin/-3'(-)

Non-complementary target WNV-DNA (NCT37 mer):

5'-AGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTG-3' (+)

4.4. Prepararea sensorului ADN Etapele urmate n elababorarea

modificat a fost transferat n soluia de CH3CN + 0.1 M LiClO4 fr monomer de pirol-NHS. Dup cum s-a presupus, voltamograma ciclic a acestui electrod prezint un pic de potenial de oxidare la E1/2 = 0.58 V reflectnd bine cunoscuta electroactivitate a scheletului

sensorului cADN WNV sunt ilustrate n Figura 4.2:

polipirolic (Figura 4.3C).

- 10 -

Figura 4.3. Voltamograme ciclice ale filmului de pirol-NHS (2 mM) la suprafaa electrodului de platin (diametru 5 mm) (A) nainte i (B) n timpul electropolimerizrii prin repetarea potentalului de scanare n CH3CN + 0.1 M LiClO4, (C) dup tranferul n CH3CN + 0.1 M LiClO4.; viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.

4.5.3. Curba de calibrare amperomtric pentru determinarea concentraiilor de cADN WNV. n prezena oxigenului, Gox catalizeaz oxidarea glucozei cu producerea concomitent a H2O2 , care poate fii detectat i cuantificat prin intermediul oxidrii sale electrochimice. Figura 4.5. prezint rspuns de curent amperometric al sensorului ADN pentru dou concentraii de glucoz (20 mM i 140 mM) n funcie de concentraia de WNVT, indicnd o limit de detecie extrem de sensibil i anume de 1 fg ml.-1 Ambele curbe de calibrare cresc cu creterea concentraiei de WNVT obinndu-se un pseusoplatou peste 500 ng ml.
-1

Figura 4.5. Rspunsul de curent amperometric al sensorului cADN la injectarea glucozei (a) 140 mM, (b) 20 mM n funcie de concentraia de WNVT. Potenialul aplicat: 0.6 V n soluia agitat de 0.1 M PBS (pH = 7). 4.6. Concluzii n combinaie acest cu capitol procesul este de prezentat supraoxidare

electrogenerare filmului de polipirol-NHS n electrochimic n vederea obinerii unui polimer permeabil pentru grefarea de oligonucleotide reagentless. Acest legatur chimic a probei cADN WNV de filmul polimeric conduce la fabricarea unui sensor cADN eficient prin utilizarea unui marker enzimatic ce identific duplexul ADN format la suprafaa electrodului

- 11 -

de platin. Se obine o limit de detecie extrem de sensibil (1 fg ml ) de cADN WNV ce este

-1

provenind din partea proteic a WNV regiunea codat 1145-1180 a fost realizat prin capturarea (fishing) duplexului ADN. Ulterior, caracteristicele analitice ale sensorului WNV cDNA au fost investigate ce prin msuratori unui marker

asociat cu o stabilitatea ridicat a rspunsului amperometric. 5. SENSOR ELECTROENZIMATIC POLIPIROLINTERCALATOR PENTRU DETECTAREA CADN DERIVAT DIN VIRUSUL NILE WEST 5.1. Introducere Lund n considerare procesul de

amperometrice enzimatic [87].

folosesc

5. 4. Rezultate i discuii Scopul electrozilor modificai a fost acela de a detecta duplexul-ADN dup marcarea cu molecule de Gox, prin oxidare electrochimic la suprafaa electrodului de platin cu producerea de H2O2 de ctre Gox. Oricum, caracterul hidrofobic detectarea a filmului poli1 ngreuneaz creterea transformarea H2O2 n ap, influennd astfel amperometric. Pentru permebilitii, filmul polimeric [150] a fost superoxidat prin ciclarea potenialului ntre 0.0V i 1.3V (Figura 5.2B). Immobilizarea covalent a RAD a fost efectuat la temperatura camerei, prin depositarea unei soluii apoase de RAD pe electrodul polipirolic modificat (20 l, 140 g/ml) i lsat la incubaie peste noapte n condiii de mediu umid. Voltamograma ciclic a electrodului RAD-modificat efectuat n tamponul fosfat deaerat prezint n regiunea negativ un pic reversibil la 0.35 V, regiune n care filmul poli1 nu este electroactiv (Figura 5.2C). Acest semnal redox este n bun acordan cu valoarea potenialului (- 0.25 V) obtinut pentru reducerea a RAD-ului n soluie. n plus, intensitate de curent a picului reversibil variaz liniar cu viteza de scanare, confirmnd astfel grefarea chimic a RAD.

intercalare, n acest capitol se propune un concept original de identificare a secvenei ADN derivate din soluie virusul de Nile West ssDNA i bazat pe urmat de adugarea oligonucleotidie complementare ntr-o apoas identificare (fishing) electrochimic a duplexului format la suprafaa sensorului. Electrodul este n prealabil modificat cu un intercalator planar sintetic, un derivat redox acridinic (RAD) [145] grefat chimic la suprafaa electrodului via unui film electrogenerat de polipirol N-substituit de gruparea N-hidroxidsuccinimida (Figura 5.1). RAD-ul grefat va fii ulterior folosit n procesul de intercalare n dsADN la suprafaa

electrodului.

Figura 5.1. Structura chimic a derivatului redox de acridona (RAD) (a) i a celui de pirol N-substituit de grupul N-hydroxysuccinimida 1 (b). Elaborarea unui sensor genomic WNV a fost astfel selectat ca model pentru investigarea conceptului de WNV-sensor. Pentru aceasta, determinarea procesului de hibridizare dintre dou oligonucleotide derivate dintr-un fragment

- 12 -

Acoperirea aparent
-9

a electrodului cu

RAD ( = 2.25 x 10 mol x cm-2) a fost estimat prin integrarea sarcinii caracteristic picului. Lund n considerare c din punct de vedere teoretic, acoperirea maxim a suprafeei

electrodului cu un strat compact de RAD corespunde la 2.37 x 10-10 mol x cm-2, se confirm clar c moleculele de intercalator au fost grefate att la interfaa polimer-solute ct i n interiorul structurii polipirolice. Figura 5.3. Rspunsul curentului amprometric pentru sensorii de poli 1 RAD dsADN n funcie de concentraia de ADN analizat (target). Insertul reprezint curentul otinut de sensorul ADN la injecia glucozei (20mM) pentru 1 ng/mL de ADN-target. E = 0.6 V/Ag/AgCl.

Figura 5.2. Voltamogramele ciclice pentru electrodul modificat cu poly(pirol) (diametrul de 5mm): (A) electroactivitatea polipirolului (B) supraoxidarea polipirolulu (a) primul scan, (b) patru scanari n CH3CN + 0.1M LiClO4 ; viteza de scanare 0.1 Vs-1 ; (C) dup imobilizarea chimic a RAD n tampon PBS deaerat, viteza de scanare 20 (a), 50 (b), and 100 (c) mVs-1. (D) Voltamograme ciclice ale electrodului poly-1RAD (a) nainte i (b) dup incubarea cu WNV dsDNA (10 ng/mL) n soluie tampon PBS; viteza de scanare 0.1 Vs-1. Rspunsul curentului obinut de

5.5. Concluzii n acest capitol s-a prezentat realizarea unui nou tip de sensor genomic amperometric foarte sensibil pentru detectarea unui singur lan oligonucleotidic (ssADN) derivat dintr-o secven din virusul virusul virusul Nile West (WNV). Sensorul este bazat pe folosirea unui intercalator-ADN (un derivat redox acridinic) grefat chimic la suprafaa unui electrod de platin modificat cu un film electropolimerizat de polipirol N-substituit de ctre gruprile Nhidroxisuccinimida (pyrrole-NHS). Intercalatorul grefat de electrod se inser n duplexul-ADN format ntre ssADN WNV (analitul) i oligonucleotida complementar (ssADN) ce este marcat cu uniti biotinice ceea ce, ulterior permite ancorarea unui marker enzimatic ca gluco-oxidaza prin intermediul intercaiei de

electrozii modificai (poli1-RAD-dsDNA) la injecia glucozei (20 mM) a fost investigat n tamponul PBS (Figura 5.3). Curentul maxim a fost obinut ntr-un timp foarte scurt (30-40 secunde). Intensitatea curentului obinut a fost proporional cu concentraia ADNului-int, iar limita de detecie a fost de 1 mg/ml (90 fM).

- 13 -

afinitate dintre avidin i biotin. Dozajul amperometric simplu a permis obinerea unei limite de detecie foarte sensibil n domeniul de 1pg/ml ssADN-WNV. 6. IMUNOSENSOR AMPEROMETRIC PENTRU
DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IgG FOLOSIND UN COPOLIMER FOTOACTIV

Imobilizarea phagilor de WNV-diplayed epitope de filmele copolimerice fotoactivabile se realizeaz multiple prin ntre iradierea grupele copolimerului de ce favorizeaz formarea de legturi covalente benzofenon polimerizate i phagi. Electrozii modificai cu phagi au fost testai amperometric pentru imunodozarea de anticorpi-WNV. 6.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un

6.1. Introducere Cu scopul de fabricare a unui

film polimeric Electropolimerizarea monomerilor sau a amestecului de monomeri (2mM) a fost efectuat ntr-o soluie organic de CH3CN + 0.1 M TBAP prin controlarea potenialui de electroliz la + 0.85 V f de electrodulde referin de Ag/Ag+. Procesul de electropolimerizare a fost oprit cnd densitatea de sarcin anodic a fost de 2.5 mC cm-2. Electrozii modificai au fost apoi transferai ntr-o soluie de CH3CN + 0.1 M TBAP fr monomer iar apoi tranferai ntr-o soluie de CH3CN coninnd 0.1M LiClO4. 6.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul de copolimeric O soluie apoas de 20 l a fost depozitat pe electrodul modificat cu filme copolimerice i last s se evapore. Electrozii rezultai au fost iradiai la = 355 nm pentru 5 minute. Iradierea electrozilor modificai cu phagi adsorbii a fost realizat cu o fibr optic folosind o lamp de mercur (presiunea medie de 500 W) n conexiune cu lampa de o putere de 68910 Arc (ambele provenite de la Oriel Instruments). Filtrele au fost folosite pentru selectarea lungimii de und de 335 nm i s

imunosensor portabil i necostisitor pentru dozarea anticorpilor WNV acest capitol prezint elaborarea unui transducer amperometric bazat pe imunoreacia cu phagii-WNV displayedepitope imobilizai la suprafaa electrodului de platin (bacteriophagii sunt virusuri ce infecteaz bacteriile). In acest capitol se raporteaz elaborarea reauit a unui film copolimeric n scopul utilizrii sale n construcia de imunosensori, copolimerul avnd la baz doi monomeri pirolici: un monomer fotoactivabil pirol-benzofenona (monomerul 1) i un monomer cationic

tris(bipiridin-pirol)rutenium complex (monomer 2) (Figura 6.1).

Figura 6. 1. Structura monomerilor 1 i 2.

blocheze

razele

IR,

prevenind

astfel

- 14 -

supranclzirea fiberei optice i a suprafeei electrodului. 6.4. Rezultate i discuii 6.4.3. Construcia imunosensorului i detecia anticorpilor WNV Dup adsopia phagilor de filmele de poli(1-2) a urmat legarea lor covalent de suport prin intermediul activrii luminii la = 355 nm ceea ce iniiaz polimerizarea grupelor de benzofenon. Pentru a investiga efectul produs de aceast reacie au fost fotochimic, incubai cu electrozii diferite modificai Figura 6.5. Principiul funcionrii imunonosensorului-WNV amperometric. Se observ obinerea unui semnal

amperometric stabil ntr-un timp foarte scurt de 30 secunde ilustrnd astfel buna permeabilitate a filmului copolimeric. Valorile curentului maxim obinute pentru diferite diluii a anticorpii-WNV au fost folosite pentru realizarea curbei de calibrare (Figura 6.6).

concentraii de anticorpi-WNV (de la 10 la 106). Apoi, electrozii au fost incubai cu cel de-al doilea anticorp marcat cu peroxidaza din hrean. Recunoaterea anticorpilor-WNV legai de phagi este realizat prin intermediul unui marcr enzimatic ca peroxidaza. Ulterior, toi imunosensorii-WNV au fost imersai n soluia de tampon fosfat salin 0.1 M (20 ml, pH 7.2) coninnd 2 mM hidrochinon i poteniostai la 0V. Dup injectarea peroxidului de hidrogen (2 mM), semnalul amperometric corespunznd

reducerii chinonei produse enzimatic a fost nregistrat n fucie de diluia de anticorpii-WNV (Figura 6.5).

Figura 6.6. Curba de calibrare pentru anticorpii-WNV obtinut de filmele de poli(1-2) n raport de 1:1 prin intermediul imunodozarii electroenzimatice. Potenialul aplicat a fost de 0V in PBS 0.1M (20 ml pH = 7.2) Fiecare punct din curba de calibrare reprezint media de rspuns n curent nregistrat de trei imunosensori diferii. Se observ o scdere a semnalului amperometric pentru titrul anticorpilor sensibil. din intervalul 1:10 la 1:106 constituind astfel o limit de detecie foarte

- 15 -

6.5. Concluzii n acest capitol este prezent

fost determinate. Moleculele de phagi au fost modificate cu o secvena de 15 aminoacizi provenii din anvelopa proteic avirusul virusul Nile West virusului (WNV) ce au fost folosii drept antigeni n loc de virusul propriu-zis (phagi identici cu cei din capitolul 6). Avantajul major al phagilor const n faptul c sunt inofensivi pentru oameni iar preparea lor nu necesit etape complicate de execuie. 7.4. Prepararea imonosensorului-WNV avnd la baz phagi incapsulai ntr-un film de polipirol Dup imobilizarea phagilor de electrod, a fost realizat saturarea eventualelor siturilor non-specifice de adsopie a proteinelor cu albumina seric bovin (BSA) sporind astfel sensibilitatea testului de dozare. Soluia blocant a fost preparat zilnic din soluie de tampon fosfat salin (0.1 M PBS, pH = 7.2) coninnd 5 % (w/v) BSA. Din aceast soluie s-au depozitat 20 l pe electrodul modificat cu filmul polimeric de poli(pirol-alchilamonium) coninnd particule phagi i incubat pentru 1 ora la temperatura camerei. Apoi, imunosensorii au fost cltii cu PBS (pH = 7.2) pentru 5 minute i incubai cu 20 l soluie de anti-IgG WNV de concentraii diferite (de la 10 la 107). Anticorpii-WNV au fost diluai cu o soluie de 1 % (w/v) BSA/PBST (PBS coninnd 0.05 % (v/v) Tween-20, PBST) i pstrai la 4C. Electrozii rezultai au fost clatii pentru 20 de minute cu soluia de PBST. Ulterior electrozii au fost incubai cu 20 l de solute de anticorpii-IgG marcai cu HRP (102) pentru 20 de minute urmnd cltirea lor pentru 20 de minute cu PBST nainte de efectuarea msurtorilor amperometrice (Figura 7.1).

electrogenerarea filmelor de polipirol compuse din grupri de benzofenon i grupri de tris(bpiridin-pirol) rutenium (II) pentru o imobilizare fotochimic inovatoare a entitailor biologice, n particular a phagilor virusului Nile West ce-i prezerv proprietile de recunoatere molecular n prezena anticorpilor specifici. Pentru dozarea reaciilor imunologice s-a utilizat dozajul amperometric ceea ce permite obinerea unei limite de detecie n intervalul de 1:10 ce
6

reprezint titrul anticorpilor IgG-WNV. Acesta reflect eficiena legrii covalente fotochimice dintre phagii i filmul polipirolic, fr a afecta ulterior imunoreaciille, precum i o permeabilitate bun a filmului copolimeric datorat complexului de rutenium ce permite transducerea amperometric a imunoreaciei. 7. IMUNOSENSORUL AMPEROMETRIC PENTRU
DETECTAREA ANTI-NILE WEST VIRUS IgG FOLOSIND INCAPSULAREA PHAGILOR INTR-UN FILM DE POLIPIROL(ALCHIL-AMONIUM)

7.1 Introducere n acest capitol este raportat construcia imunosensorilor amperometrici pentru identificarea rapid a anticorpilor IgG-WNV folosind filme de poli(pirol-alchilamonium) pentru reinerea phagilor-WNV la suprafaa electrodului de crbune. Ca urmare au fost investigate proprietile electrochimice ale electrozilor modificai cu polimer-phagi WNV, iar performanele analitice amperometrice ale imunosensorului cu configuraie optimizat au

- 16 -

Figura 7.1. Reprezentarea schematic a principiului de funcionare a imunosensorului amperometric pentru detecia anticorpilor-WNV prin intermediul anticorpului-secundar marcat cu HRP ce catalizeaz formarea speciilor electroactive de chinon (Q) n prezena substratelor: hidrochinon (HQ) si a H2O2. 7.5. Rezultate i discuii 7.5.1. Elaborarea electrozilor modificai cu polimer si phagi Comportamentul electrochimic al filmelor adsorbite de pirol-alchil amonium cu i fr phagi a fost investigat prin voltametria ciclic la suprafaa electrodului de crbune n mediul apos coninnd 0.1M LiClO4 drept electrolit suport. Prin scanri repetitive ale electrodului n intervalul de potenial 0 0.9 V se observ apariia quasi-reversibil a sistemului de picuri n jurul a 0.5 V (Figura 7.2). Aceast evoluie indic formarea filmului de polipirol la suprafaa electrodului de crbune. Figura 7.2. Voltamogramele ciclice ale filmelor adsorbite de monomer de pirol-alchil amonium (120 nmol) n timpul procesului de polimerizare i a polimerului obinut. (A) monomerul singur; (B) monomerul amestecat cu 10 l monomerul amestecat cu 20 l phagi; (D) monomerul amestecat cu 30 l phagi. Electropolimerizarea a fost efectuat timp de 10 minute prin ciclarea potenialului ntre 0 i 0.9V /Ag/AgCl ntr-o soluie apoas coinnd 0.1M LiClO4, cu o vitez de scanare de 0.1V s-1. Prezena phagilor imobilizai, densitatea lor i acesibilitatea pentru imunoreacia cu anticorpii-WNV este direct reflectat de intensitatea curentului obinut la reducerea chinonei. Valorile de curent maxim (Imax) corespunznd a trei cantitai diferite de phagi (10, 20 si 30 l) imobilizate prin CPE sau RPS sunt schematizate in Tabelul 7.2.

- 17 -

Tabelul 7. 2. Influena diferitelor cantitti de phagi T7-Ep 15x2 incapsulai n filme polimerice de poli(pirol_alchilamonium) generate fie prin CPE, fie prin RPS asupra rspunsului de curent amperometric cnd s-a folosit anticorpi-WNV n stare de saturare (1/10 dilutie)a

phagi T7-Ep15x2 (l) Imax (CPE) (nA) Imax (RPS) (nA)

10 240 40

20 140 15

30 70 10

a) dup marcarea cu anticorpul secundar-HRP n prezena H2O2 (0.1mM) i a 2 mM hidrochinon , iar electrozii sunt poteniostai la 0 V. 7.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirolphagi WNV Figura 7.3. ilustreaz voltamograma RDE obinut pentru filmul polimer-phagi. Permeabilitatatea (Pm) este estimat folosind ecuaiile descrise anterior de Gough i Leypoldt [136-138] (Figura 7.3). Valorile de Figura 7.3. (A) 10 l phagi T7 -Ep 15x2 in prezena a 2 mM soluie de hidrochinon dizolvat in 0.1 M PBS (pH = 7.2). Voltamogramele electrodului turnant de carbon (diametru de 5 mm) modificat cu filmul de poli(pirol-amonium): (a) 3000, (b) 2500, (c) 2000, (d) 1500, (e) 1000, si (f) 500 rpm/min. Viteza de scanare a fost de 0.020 V s-1. (B) Graficul Koutecky-Levich pentru (a) un electrod nemodificat, (b) pentru un electrod modificat cu un film polimeric i (c) pentru un electrod modificat cu un film polimeric coninnd 10l phagi T7lEp15x2 phage. Soluia test a fost 2 mM hidrochinon n soluia de 0.1 M PBS (pH = 7.2). 7.5.3. Performanele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV Pentru a investiga capabilitile analitice ale electrozilor modificai cu polipirol-phagi pentru dozarea amperometric a anticorpilorWNV, electrozii cu phagi au fost incubai cu diferite diluii de anticorpi-WNV n intervalul de

permeabilitate ale filmului de poli(pirol-alchil amonium) i cele ale polimerului coninnd phagi T7-Ep 15x2 (10 l) sunt similare, 4.2
-2 -1

respectiv 2.5 x 10 cm s . In plus, aceste valori de permeabilitate sunt similare cu cele raportate pentru acelai tip de polimer (polipirol-alchil amonium) cu i fr incapsularea glucozoxidazei (3 si respectiv 5 x 10-2) [167]. Aceste rezultate ilustreaz cum fenomenul de

incapsulare a phagilor ntr-un film de polipirol pentru o cantitate mic de phagi (10 l) nu afecteaz permeabilitatea filmului i prin urmare structura sa.

- 18 -

10 pn la 107. Aceste rspunsuri de curent au fost proporionale cu concentraia anticorpilor, iar limita de detecie a fost de10 (Figura 7.4).
7

De asemenea, a fost posibil regenerarea stratului sensibil de polimer-phagi folosind condiii acide cu scopul fabricrii de noi WNVimunosensori. 8. CONSTRUIREA IMUNOSENSORILOR
AMPEROMETRICI PENTRU DETERMINAREA ANTICORPILOR ANTI-HOLER BAZAI PE ELECTROGENERAREA FILMELOR PERMEABILE DE POLIPIROL-BIOTINILAT

Figura 7.4. Rspunsul de curent amperometric nregistrat pentru imunosensorii-WNV n prezena sistemului hidrochinona/H2O2 n funcie de diluiile de anticorpi-WNV (1:10 pn la 1:107). Potenialul aplicat este de 0V fa de SCE. Dozarea amperometric este mult mai sensibil dect alte technici ca testul colorimetric ELISA, testul chemiluminescent ELISA sau imunotestul bazat pe fibre optice [168] ce conduc la limite de detecie a titrului de anticorpi de 1:10 , 1:5x10 , i respectiv de 1:10 .
5 5 6

8.1. Introducere Lund n considerare problema

permeabilitii sczute a filmelor de polimer biotinilate, n acest capitol se prezint un nou protocol de construire de imunosensori amperometrici bazai pe electrogenerarea unui film original de copolimer biotinilat ce prezint o foarte bun permeabilitate, ceea ce permite tranducerea sa amperometric [79]. Filmul copolimeric prezint grupe de biotin -ce permite ancorarea anticorpului sau antigenului prin intermediul interaciilor de afinitate cu avidinai grupe de lactobionamid ce imbunatesc caracterul hidrofilic al filmului organic electrogenerat i astfel permeabilitatea sa. Transducerea implic recunoaterea anticorpilor capturai de ctre cel de-al doilea

De menionat este rapiditatea rspunsului de curent a diferiilor imunosensori care este stabil dup numai 5 la 20 secunde ceea ce ilustreaz o bun permeabilitate a filmului de polimer-phagi. 7.6. Concluzii n acest capitol a fost demonstrat eficiena funcionalizrii filmelor de polipirol cu phagi-WNV cu pstrarea proprietilor de recunoatere molecular a anticorpilor specifici. Configuraia imunosensorului este bazat pe grefarea fotochimic a phagilor-WNV de un film electrogenerat la un potenial de 0.850 V ce permite detectarea de anticorpi-WNV cu o sensibilitate extrem a titrului de detecie (1:107).

anticorp (anticorp secundar) marcat cu enzima peroxidaz amperometric hidrochinonei hidrogen. (Figura a n 8.1). oxidarii prezena Performanele enzimatice peroxidului a de imunosensorului sunt investigate prin detecia

- 19 -

de 0.05 pn la 500 g/ml. Timpul de incubaie a fost de 20 de minute, dup care a urmat cltirea electrodului cu soluia de PBS. n final electrozii au fost incubai pentru alte 20 minute cu 20 l soluie de anticorp secundar IgG-anti-holeramarcat cu HRP n concentraie de 0.5 mg/ml ce a fost dizolvat n soluia 1% (w/v) BSA/PBST. Toi electrozii modificai (imunosensorii) au fost splai cu soluia tampon PBS nainte de msurtorile amperometrice. 8.7. Rezultate i discuii 8.7.1. Caracterizarea electrochimic a filmului Figura 8.1. Fabricarea imunosensorului-HRP amperometric bazat pe sistemul electrochimic hidrochinona(HQ)/peroxid de hidrogen (H2O2). 8.5. Prepararea imunosensorului Etapele urmate n elaborarea de copolimer format din poli(pirol-biotin) i poli(pirol-lactobionamid) Dei electropolimerizarea monomerului de pirol-biotin furnizeaz un film compact i activ cu uniti de biotin, caracterul su oragnic impiedic umflarea polimerului n mediul apos i astfel ngreuneaz difuzia speciilor electroactive ca chinona la suprafaa electrodului [188]. Pentru a mbuntai au detectarea fost amperometric introduse a

imunosensorului la suprafaa electrodului de crbune vitros au fost: mai nti, 20 l soluie blocant a fost depozitat la suprafaa

electrodului modificat cu filmul copolimeric biotinilat pentru a preveni acrosarea nespecific a avidinei de acest film electrogenerat. Dup etapa de blocare a electrodului a urmat construirea specific a imunosensorului prin depozitarea a 20 l de avidina (1 mg/ml) dizolvat n 1 % (w/v) BSA/PBST i incubarea timp de 20 minute cu filmele biotinilate. Dup clatirea cu PBS, electrozii rezultai au fost incubai pentru alte 20 de minute cu 15 l toxina B a colerei-biotinilat [0.3 mg/ml dizolvat n 1% (w/v) BSA/PBST]. Apoi electrozii au fost cltii cu PBS i incubai cu 20 l anticorpul anti-toxina colerei subunitatea B dezvoltat n iepure la o concentraie ce variaz n intervalul

chinonei

prin

electrocopolimerizare grupe hidrofilice de pirollactobionamid n scheletul polimeric de polipirol-biotin) pentru a contrabalansarea caracterului su hidrofobic (Figura 8.2).

- 20 -

Figura 8.2. Structura monomerilor de pirollactobionamid (A) i de pirol-biotin (B). Figura 8.3. prezint voltamograme ciclice ale speciei permeante electroactive -hidrochinon- la suprafaa electrodului modificat fie cu filmul de polipirol biotinilat, fie cu filmul copolimericbiotinilat, filme formate cu aceeai sarcin de electropolimerizare, 1 mC. Prin compararea cu picul de oxidare a hidrochinonei nregistrat la suprafaa electrodului de carbon nemodificat se observ a scdere uoar a intensitii picului de curent (-14%) ce este asociat cu creterea separrii picului anodic i catodic pentru copolimer, n timp ce pentru filmul de pirol biotinilat se remarc o quasidispariie picului anodic. Acesta indic clar c homopolimerul impiedic drastic ptrunderea hidrochinonei, n timp ce copolimerul apare mult mai permeabil. Procesul de transfer de mas n filmele polimerice electrodepozitate la suprafaa

Figura 8.3. Voltamogramele ciclice n prezena 1 mM hidrochinon i 0.1 M LiClO4 n PBS (pH = 7) pentru (a) un electrod de crbune nemodificat (diametru de 5 mm), (b) un electrod modificat cu poli(pirol-biotin) i poli(pirollactobionamid) , (c) un electrod modificat cu polipirol biotin. Viteza de scanare a fost de 100 mV s-1. Figura 8.4A prezint voltamogramele de disc-rotitor caractristice filmului copolimeric n soluta apoas de hidrochinon (1 mM). Experienele de voltametrie RDE au fost reprezentate sub forma de grafic KoutechyLevich unde densitatea de curent limit este reprezentat n funcie de ptratul rdcinii vitezei de rotaie (Figura 8.4B). Din grafic, se observ un comportament liniar al copolimerului cu aceeai pant ca i electrodul nemodificat prezentnd o intersecie pozitiv ce permite extragerea raportului DmK/ ca fiind de 2.38 x 10-2 cm s-1. 8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT Pentru a determina sensibilitatea de

electrodului a fost investigat prin voltametria de electrod disc rotitor (RDE) [136-138].

dozare a anticorpului-CT, imunosensorii au fost

- 21 -

testai cu diferite concentraii de analit n domeniul de 0.01 -500 g/ml. Prin imersarea imunosensorilor-HRP n soluia de tampon coninnd 2 mM hidrochinon, curentul de baz s-a stabilizat dup 4 minute iar semnalul de curent a fost nregistrat dup injectarea

pentru speciile electroactive. Acesta a permis detectarea amperometric rapid i foarte sensibil a anticorpului de holer n combinaie cu un indicator enzimatic (peroxidaza). 9. COMPARAREA A TREI CONFIGURAII DE
IMUNOSENSORI ENZIMATICI PENTRU DETECTAREA ANTICORPULUI ANTI-TOXINA HOLEREI

peroxidului de hidrogen n celula electrochimic. Curba de calibrare pentru detectarea amperometric a anticorpului CT a fost obinut dup fiecare concentraie de anticorp-CT prin nregistrarea a rspunsului de curent caracteristic electrodului modificat (Figura 8.5).

9.1. Introducere n acest capitol au fost fabricati

imunosensori amperometrici pentru detectarea anti-toxinei holerice bazai pe imobilizarea materialului imunogenic (subunitatea B a toxinei holerei biotinilat) la suprafaa electrodului biotinilat, folosind interaciile de afinitate avidin-biotin [78]. Analitul - anticorpul antitoxina holerei- a fost detectat folosind alternativ Figura 8.5. Curba de calibrare a imunosensorului-HRP cu anticorpii-CT in intervalul de 0.05 -500 g/ml folosind sistemul hidrochinona/H2O2. trei markeri enzimatici: anticorpul IgG din iepure marcat cu peroxidaza (HRP), gluco-oxidaza biotinilata (Gox-B) sau polifenol oxidaza biotinilata (PPO-B) n combinaie cu avidina 8.8 Concluzii n acest capitol se prezint o nou strategie de imobilizare a materialului legata de anticorpii IgG din iepure care a fost pentru prima data folosit pentru tranducerea unei imunoreacii. Pentru a asigura accesibilitatea speciilor active la suprafaa electrodului i imobilizarea calitativ a probei, au fost elaborate puni de avidina-biotina cu un film copolimeric biotinilat ce a fost obinut prin electropoli-merizarea monomerului de pirolbiotina (pentru interactii de afinitate) si

imunologic de un electrod modificat cu un film copolimerict pentru dozarea anticorpilor specifici holerei. Studiul efectuat prezint pentru prima dat coelectropolimerizarea monomerilor de i pirol-lactobionamid ca o pirol-biotin

variant de film polimeric eficient pentru ancorarea biomoleculelor n stare lor biologic activ. Datorit caracterului hidrofilic ridicat, monomerul de pirol-lactobionamid sporete considerabil permeabilitatea copolimerului

monomerului de pirol-lactobionamida (pentru mbuntirea permeabili-tii). Prin metoda de electropolimerizare se asigur formarea unui film controlabil ca grosime, reproductibil, activ cu uniti de biotin, fr defecte, cu stabilitate

- 22 -

chimic i de stocare n timp [172, 175, 176, 188, 198].

secundaIgG marcat cu peroxidaza din hrean (20 l) la o concentraie de 0.5 mg/ml i dizolavat n diluantul de anticorp a fost depozitat pe suprafaa electrodului timp de 20 de minute. Apoi electrozii au fost cltii insensiv cu PBS. Trei mediatori redox diferii au fost folosii pentru testarea rspunsului amperometric a imunosensorilor-HRP: hidrochinona, ferocenul dicarboxilic, ferocianid (2mM) n prezena a 2M H2O2 (Figura 9.2). Imunosensensorii-HRP au fost poteniostai la -0.1, -0.01 i -0.1V fa de SCE pentru detectarea unui din cei trei compui enzimatici produi amperometric: fericianuda, ferocenium, i respectiv chinona.

9.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici Electropolimerizarea copolimerului biotinilat a fost realizat prin controlarea potenialului de electroliz la 0.85V n electrolitul de acetonitril coninnd amestecul de monomer de pirol-lactobionamid (4 mM) i de monomer de pirol-biotin (4 mM). Lund n considerare natura reaciei electroenzimatice folosite pentru detectarea anticorpului anti-holer, electrozii de platin au fost utilizai pentru sistemul enzimatic bazat pe Gox-B, n timp ce electrozii de crbune au fost folosii pentru HRP i PPO-B (Figura 9.1).

Figura 9.1. Schema electrozilor modificai cu subunitatea B a toxinei holerei, biotinilate. 9.5. Tranducerea amperometric a imunoreaciei Imunosensorii au fost incubai timp de 20 de minute cu anticorpul anti-toxina holerei (antiCT, 20 l) secretat n iepure n domuniul de concentraii de 0.05 pa la 500 g/ml. Apoi, au fost investigate diferitele transducii Figura 9.2. Imunosensori amperometrici folosind copolimerul [poli(pirol-biotina, pirollacto-bionamida)] pentru modificarea electrozilor de platin sau crbune cu cei trei markeri enzimatici (Gox-B,PPO-B, HRP) pentru detectarea antitoxinei holera. (A) HRPimunosensor; (B) Gox-B imunosensor; (C) PPOB imunosensor; Medred/Medox = ferocianura/fericianuda; hidrochinona/chinona; ferocen/ferocenium; Gox - glucos-oxidaza biotinilat, PPO-polifenol oxidaza biotinilat; HRP-anticorpul IgG anti-iepure marcat cu HRP.

electroenzimatice. Pentru imunosensorul-HRP, anticorpul

- 23 -

9.6. Rezultate i discuii Pentru a imobiliza CT la suprafaa electrodului prin interacti de afinitate via punilor de avidin-biotin, s-a folosit un nou film copolimeric biotinilat [poli(pirol-biotina), poli(pirol-lactobionamida)] ca un strat iniial de ancorare. Acest film copolimeric a fost elaborat pentru mbuntirea sensibilitii transduciei reaciilor enzimatice bazate pe detectarea amperometric a produilor enzimatici prezeni la suprafaa electrodului. Catecolul a fost utilizat ca prob electrochimic pentru a ilustra diferena n permeabilitate dintre copolimerul biotinilat i filmul de poli(pirol-biotina). Figura 9.3. prezint o serie de voltamograme ciclice nregistrate la 100 mV s-1 pentru electrodul nemodificat, electrodul modificat cu poli(pirol-biotina) i electrodul modificat cu copolimer.

anti-CT folosind imunosensorul-HRP Configuraia enzimatic cea mai simpl a constat n folosirea anticorpului secundar conjugat cu o enzim, n cazul de fa HRP. Datori spectrului larg de substrate enzimatice, trei sisteme electroactive (ferocianura/H2O2, acidul dicarboxilic/H2O2 i hidrochinona/H2O2) au fost alese pentru investigaia amperometric. Timpul de rspuns pentru toi imunosensoriiHRP a fost extrem de rapid, variind ntre 5 la 30 de secunde. Acesta ilustreaz o permeabilitate bun a filmului copolimeric. Figura 9.4. prezint curbele de calibrare ale imunosensorilor-HRP pentru detectarea amperometric a anti-CT prin intermediul celor trei substrate-HRP.

Figura 9.3. Voltamogramele ciclice ale electrozilor de platin (diametru de 5 mm): (a) electrod nemodificat, (b) electrod modificat cu copolimerul poli(pirol-biotina, pirol-lactobionamida), (c) electrod modificat cu polipirolul biotinilat n prezena a 1 mM catecol n soluia apoas de 0.1 M LiClO4 (pH 7). Filmele polimerice au fost electrodepozitate prin controlarea potenialului de electroliz la 0.8 V (sarcina de electropolimerizare a fost de 1 mC). Viteza de scanare a fost de 100 mV s-1. 9.6.1. Rspunsul de curent amperometric la

Figura 9.4. Curbele de calibrare pentru anti-CT n cazul imunosensorilor-HRP folosind diferite sisteme de mediatori redox /H2O2 ;( ) hydrochinona, () ferocianid, () ferocen. 9.6.2. Performanele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, i PPO-B Sensibilitatea imunosensorului a fost determinat ca panta obinut din partea liniar a curbei de calibrare. n Tabelul 9.1. sunt prezentate valorile limitei de detecie, sensibilitii i a curentului maxim (Imax) obinute n condiii de saturare a anti-CT pentru cele trei sisteme de detecie enzimatic.

- 24 -

Sistemul hidrochinona/H2O2 conduce la obinerea celor mai bune performane analitice: cea mai sczut limit de detecie (50 ng/ml) i cea mai ridicat sensibilitate (1.5 Ag ml cm
-1 2 -

difenolilor n o-chinona. Ca urmare, detecia amperometric a anti-CT a fost efectuat n prezena a 10 mM catecol (principalul substrat al PPO) prin poteniostatarea imunosensorilor PPOB la -0.2V fa de SCE pentru a reduce o-chinona generat. Figura 6B prezint urba de calibrare pentru imunosensorii PPO-B n funtie de concentraiile de anti-CT.

). De asemenea, au fost nregistrate valori

ridicate ale Imax pentru formarea teoretic a unui monostrat de anti-CT i astfel a monostratului de HRP. Cele mai bune perfomane analitice obinute cu substratul hidrichinon pot fii atribuite dimensiunilor reduse ale cestui mediator redox comparativ cu ferocianura i ferocenul, conducnd astfel la o mai bun permeabilitate n filmul copolimeric. Valorile de detecie de 50 ng/mL anti-CT sunt similare cu cele obinute cu imunosensorii bazai pe fibre optice folosind anticorpul secundar marcat cu HRP (160 ng/ml) [180, 181, 199, 200]. 9.6.3. Rspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B i PPO-B ca markeri enzimatici n construcia de imunosensori Cu scopul mbuntirii limitei de

detecie, anticorpul secundar marcat cu HRP a fost nlocuit cu anticorpul-biotinilat. Markerii enzimatici, Gox-B i PPO-B au fost ataai de anticorpul secundar prin puntea de avidinbiotin. Figura 9.5A prezint curba de calibrare a imunosensorilor Gox-B n funcie de concentraiile de anti-CT. n ceea ce privete PPO-B, polifenol oxidaza biotinilat este folosit pentru prima dat ca marker enzimatic n fabricarea unui imunosensor. Acest enzim catalizeaz n prezena oxigenului oxidarea fenolului i o-

Figura 9.5. Curba de calibrare pentru anti-CT folosind (A) imunosensorii Gox-B n prezeta glucozei, Eapplicat= 0.6V, (B) imunosensorii PPOB n prezea catecolului; Eaplicat= -0.2V.

9.7. Concluzii n acest capitol este demonstrat

posibilitatea fabricrii de imunosensori pentru dozarea anticorpilor specifici pentru holera prin intermediul simplei imobilizri a materialului imunologic (toxina holerei) la suprafaa

electrodului modificat cu un nou film de pirol copolimeric ce poart grupri de biotin si lactobionamid. Interacia antigen-anticorp este

- 25 -

dozat amperometric. Datorit permeabilitii bune a filmului copolimeric, a fost posibil utilizarea a trei sisteme de transducere electroenzimatic (HRP, Gox-B, PPO-B) pentru detectarea anticorpului de anti-toxina holerei, ce au fost ulterior studiate i comparate n ceea ce privete performanele analitice obinute pentru fiecare marker. Astfel, imunosensorii ce folosesc HRP prezint cea mai sensibil limit de detecie (50 ng/ml). 10. MBUNATATIRI ADUSE N REINEREA
ENZIMELOR DE FILMUL DE POLI(PIROLALGINAT) N ELABORAREA BIOSENSORILOR

performanele

analitice

ale

biosensorilor

amperometrici bazai pe matrixul de glucooxidaza-polipirol-alginat i cel de gluco-oxidazaalginatul natural [228]

Figura 10.1. Reprezentarea schematic a sintezei compusului pirol-alginat.

10.1. Introducere De-a lungul timpului s-au folosit diferii polimeri naturali i sintetici pentru incapsularea biomoleculelor, celulelor i microorganismelor pentru scopuri variate. Dintre acestea, alginatul este unul dintre polimerii naturali cel mai promitor folosit la imobilizarea de celule [203, 204] i enzime [205]. Capitolul de fa ilustreaz superioritatea oferit de un matrix nou sintetizat de pirolalginat [216] comparativ cu cel bazat pe alginatul natural n elaborarea biosensorilor. De fapt, idea a fost de a demonstrata conjugatului este ndeprtat, ca de dup pirol10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat i polipirol-alginat pentru testele electrochimice Pentru funcionalizarea electrodului de crbune, s-au depozitat pe suprafaa sa 3 l soluie apoas de alginat sau pirol-alginat (2%, w/v) i lsat s reacioneze timp de 5 minute cu o picatur de 0.1 M CaCl2 [217]. Prezena acestor geluri conduce la o scdere marcant a intensitii picului reversibil comparativ cu cel obinut pentru un electrod nemodificat (Figura 10.2). Ambele geluri au fost oxidate prin controlarea potenialului de electroliz n soluia apoas coninnd 0.1 M LiClO4 timp de 10 minute la 0.93 V fa de electrodul saturat AgAgCl-KCl (Ag/AgCl). Polimerizarea presupus a pirol-alginatului a fost eficient, deoarece se observ o scdere accentuat (-70%) a intensitii picului de oxidare a derivatului de ferocen 10.4. Rezultate i discuii

electropolimerizarea alginatul natural

alginat (Figura 10.1), n condiiile n care alginatul modificat este reinut de suporturi (electrozi) datorit polimerizrii grupelor pirolice grefate. De asemenea, s-a efectuat o evaluare a cantitii de gluco-oxidaza pierdut din matrixul de polipirol-alginat ca a fost comparat cu cea din matrixul de alginat natural. Capitolul descrie

- 26 -

comparativ cu valoarea sa iniial (34 A) obinut difuzional voltamograma aliginatului naintea reflect ciclic procesului formarea caracteristic prezint o de electropolimerizare. Acest cretere n rezistena lanurilor oxidrii a polimerizate n structura de gel. Din contr, natural cretere

i 0.1M tampon fosfat (pH 7) pentru alte 10 minute.(B)(e) un electrod modificat cu 3 l alginat, (f) un electrod modificat cu 3 l alginat dup electroliza la potenial fix de 0.93 V, (g) un electrod modificat identic cu (e) dup imersarea n soluie de etanol (10 minute) i n soluie de 0.1M tampon fosfat (pH 7, 10 minute). Timpul de gelificare a fost de 5 minute n prezena agentului de gelificare 0.1 M CaCl2. Viteza de scanare a fost de 0.1V s-1. 10.4.2. Studii de permeabilitate Pentru a dovedi prezena lanurilor de polipirol n gelul de alginat, a fost determinat permeabilitatea filmelor de alginat i polipirol alginat cu ajutorul experienelor de electrod-disc rotitor (RDE) la diferite turaii i n prezena 1 mM hidrochinona dizolvat n 0.1 M Tris-HCl (pH = 7) i a ecuaiilor Gough i Leypoldt descrise n capitolul 4 (Figura 10.4). Diferena mare de permeabilitate estimat pentru filmul de alginat i polipirol alginat (3.65 x 10-1 i respectiv 2.7 x 10-2 cm s-1) reflect clar mpiedicrile sterice datorate lanurilor de polipirol generate in situ.

intensitii curentului de la 32 la 42A.

Figura 10. 2. Voltamogramele ciclice n prezena ferocenului dicarboxilic n tamponul 0.1M Tris-HCl (pH = 7) pentru (A) (a) un electrod nemodificat de crbune vitros (diametrul de 5 mm), (b) un electrod modificat cu pirol-alginat (3 l), (c) un electrod modificat cu polipirol-alginat (3 l) otinut prin controlarea poteialului de electroliz la 0.93V, (d) identic cu (c) dup imersarea n soluie de etanol (10 min)

Figura 3. Voltamogramele RDE ale electrodului de platin n form de disc (diametru = 5 mm) modificat cu polipirol-alginat n prezena soluie de hidrochina (1 mM) in tamponul de 0.1 M TrisHCl (pH=7): (a) 2000; (b) 1500; (c) 1000; (d) 500; (e) 100 rpm/min. Viteza de scanare: 20 mV 1.

- 27 -

M Tris-HCl (pH = 7). Aceste rezultate confirm faptul c procesul de polimerizare induce o cretere a gradului de retenie a moleculelor de Gox, contribuind la mbuntirea performanelor

biosensorului. 10.5. Concluzii Rezultatele descrise n acest capitol demonstreaz Figura 10.4. Graficul Koutecky-Levich pentru un electrod nemodificat (a), modificat cu alginat (b) i modificat cu polipirol-alginat (c). Soluia test a fost 1 mM hidrochinon n tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH = 7). 10.4.4. Biosensori amperometrici bazai pe filmele de alginat i polipirol-alginat Pentru evideierea aplicabilitii noului matrix sintetizat (pirol-alginatul) au fost elaborai biosensori glucozei. amperometrici Prin compararea pentru dozarea performanelor pentru prima dat abilitatea polimerizrii electrochimice a unui film de pirol alginat polimer pre-depozitat pe suprafaa unui electrod sub form de gel. De asemenea este demonstrat prin studii de permeabilitate i de distrugere organic a celor tipuri de polimeri (alginat i polipirol alginat) cum unitile de pirol contribuie substanial la mbuntirea proprietilor mecanice i chimice ale gelului de alginat. Astfel, matrixul de polipirol-alginat electrogenerat constituie un suport atractiv pentru imobilizarea enzimelor active i n fabricarea potenial a biosensorilor pentru diagnosticul medical.

analitice ale biosensorilor n ceea ce privete valorile de curent maxim (Imax) i de sensibilitate se obin valori superioare ale Imax = 1.11 A, i sensibilitii = 122 AM
-1

pentru filmul de 11. BIOSENSORI AMPEROMETRICI BAZAI PE

GELURI DE ALGINAT I POLIPIROL-ALGINAT CONINND CELULE ALGALE DE CHLORELLA VULGARIS

polipirol-alginat, fa de un Imax = 0.62 A, i o sensibilitate = 34 AM-1 obinute pentru filmul de alginat (Figura 10.5).

11.1. Introducere Cum a fost menionat in capitolul 10, alginatul face parte din familia de polizaharide liniare ce conine cantiti variate de reziduuri de Figura 10.5. Curbele de calibrare pentru dozarea glucozei nregistrate de electrozii de platin modificai cu alginat-Gox (3 l) (), polipirol-alginat-Gox (3 l) () i 15 l (), ce au fost poteniostai la 0.6 V n tamponul de 0.1 acid -D-manuronic i reziduuri de acid -Lguluronic. Aceste reziduuri pot varia mult ca procent formnd aranjamente compacte de-a

- 28 -

lungul lanului polizaharidic. Cationii divaleni sunt legai de prile de acid guluronic ntr-o manier cooperativ sporit, iar mrimea

11.7. Rezultate i discuii 11.7.1. Compararea electrochimic a

unitilor cooperative este mai mare de 20 de monomeri [222]. Alga verde eucariot Chlorella vulgaris este frecvent utilizat pentru studii de imobilizare i ndeprtarea nutrienilor [223, 224] Celule de C. vulagaris sunt foarte abundente n natura i sunt de importan major pentru ecosistemul acvatic, fiind considerate bioindicatori naturali ale bioactivitii reziduurilor industriale. Analiza microscopic a acestor celule, evideniaz o form sferic, de 5-10 mm n diametru. n domeniul biosensorilor, celulele de C. vulgaris au fost deja utilizate n construirea de biosensori optici i electrochimici [225, 226]. n acest capitol se descriu avantajele aduse n construirea biosensorilor amperometrici de ctre noua molecul sintetizat de pirolalginat (capitolul 10) n comparaie cu cea a alginatului natural pentru imobilizarea de celule algale de C. Vulgaris [82]]. 11.5. Prepararea biosensorului algal La temperatura camerei (25C) au fost amestecate viguros 5 ml de suspensie celule algale cu 10 ml alginat (2%, w/v) sau pirolalginat (2%, w/v). Cele dou amestecuri apoase diferite au fost depozitate pe suprafaa electrodului de platin (20 l) i acoperii cu o pictur de clorur de calciu (0.1 M) pentru 5 minute. Electrodul modificat cu pirol-alginat a fost ulterior electropolimerizat la temperatura camerei prin controlarea potenialului de oxidare la 0.94V pentru 10 minute ntr-o soluie apoas coninnd 0.1 M LiClO4.

stabilitii gelurilor de alginat i poli-pirol alginat ce conin celule algale Permeabilitatea ferocenului dicarboxilic (2 mM) dizolvat n tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM MgCl2 a fost investigat pentru cele dou tipuri de geluri, ilustrnd astfel oxidarea unui electron la suprafaa electrodului. Figura 11.1A,B prezint voltamogramele ciclice obinute pentru electrodul nemodificat i

modificat cu poli(pirol-alginat-celule algale) la temperatura de 30C. Prezena gelului de APPyA conduce la o scdere marcant n intensitatea reversibilitii picului de ferocen, unde valoarea curentului anodic scade de la 130 la 58 A. Dup incubarea acestui electrod modificat n tamponul agitat magnetic (300 rpm) la 30C pentru 50 de minute, se observ o cretere a curentului anodic pn la 68 A (Figura 11.1C). Acest cretere minor de curent demonstreaz stabilitatea bun a gelului de

Figura 11.1. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) pentru (A) un electrod de platin nemodificat la 30C; B) un electrod de Pt modificat cu un gel de poli(pirolalginat) coniind celule algale - etapa inial; C) acelai electrod (B) folosit dup 50 de minute ntr-o soluie dimamic tampon. Potenialul de scanare a fost ntre 0 i 0.7 V fa de Ag/AgCl n

- 29 -

0.1M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM MgCl2 la 30C. Viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1. APPyA la suprafaa electrodului de platin la 30C. Cum s-a presupus, depozitul de alginatcelule algale (AA) induce iniial aceleai impiedicri sterice ca APPyA n ceea ce privete accesul speciei redox, efect ilustrat prin valoare de curent anodic de 60 A (Figura 11.2A). Din contr, se observ o cretere a curentului anodic pn la 120 A dup imersarea n soluia de tampon termostat la 30C, indicnd astfel pierderea aproape total a depozitului de alginat n soluie (Figura 11.2B). Deoarece stabilitatea gelului de alginat a fost influenat de temperatura de 50C, s-au efectuat experiene similare cu gelul de AA la temperaturi sczute de 10C i 15C. Din rezultatele obinute se observ o cretere a curentului anodic de la 60 A la 100 A i respectiv 105 A (Figura 11.2C, D). Dei creterea temperaturii sporete instabilitatea gelului de AA, la temperaturi sczute de asemenea AA este instabil la suprafaa electrodului de platin.

Figura 11.2. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) n soluia tampon 0.1 M Tris-HCl (pH 9) + 1 mM MgCl2 pentru un A) electrod de platin (Pt) modificat cu gel de alginat coninnd celule algale (faza iniial); B) acelai electrod modificat dup 50 de minute de agitare ntr-o soluie tampon termostat la 30C. C) acelai AA electrod dup 50 de minute ntr-o soluie dinamic, termostat la 10C; D) acelai AA electrod dup 50 de minute ntr-o soluie termostat la 15C. Potenialul de scanare a fost cuprins ntre 0 si 0.7 V fa de Ag/AgCl; viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.

11.7.3.

Performanele

analitice

ale

biosensorilor celule algale-alginat i celule algale-pilipirol-alginat Performanele analitice ale celor dou tipuri de biosensori-algali pentru determinarea pNPP au fost comparate n condiii de pH optim de 9 i la o temperatur optim de 20C. Sensibilitatea i rspunsul biosensorului celule algale-polipirol alginat au fost de 2 mAM-1 cm2 i de 15s, iar pentru biosensorul celule algalealginat au fost de 4 mAM-1 cm2 i de 5s. Aceste rezultate evideniaz o sensibilitate i un rspunsul rapid al biosensorului celule algalealginat mult superioare n comparaie cu cele ale biosensorul celule algale-polipirol alginat ca urmare a unei poroziti mai bune a gelului nemodificat de alginat ce faciliteaz creterea proprietilor de difuzie polipirol-alginat. Cum a fost descris n experimentele de voltametrie ciclic, reeaua de polipirol afecteaz profund accesul speciilor electroactive la suprafaa electrodului. Stabilitatea operaional a celor dou fa de reeaua de

- 30 -

tipuri de biosensori algali a fost studiat prin nregistrarea continu a rspunsului de curent maxim (Imax) obinut n prezenta a 1mM pNPP dispersat n soluia agitat magnetic de 0.1 M Tris-HCl (pH 9, 20C) n funcie de timp. Rspunsul biosensorului a fost stabil pentru 20 i 120 minute pentru gelul de AA i respectiv APPyA Stabilitatea de stocare a biosensorilorAA i APPyA la 4C a fost investigat n soluie de tampon 0.1 M Tris-HCl (pH 9) coninnd 1 mM MgCl2. Pentru acesta au fost nregistrate rspunsurile biosensorilor de n curent prezena caracteristice concentraiilor

Lucrarea de doctorat a avut drept obiective construcia i caracterizarea unor biosensori medical, cu n aplicabilitate particular pentru (exemplu: n a n laboratorul

imunosensorilor enzimelor ce uman, sunt a

amperometrici proteolitice importante

dozarea tripsina)

metabolismul

imunosensorilor amperometrici pentru dozarea anticorpilor specifici pentru microorganismul Vibrio cholera, a biosensorilor amperometrici pentru identificarea virusului Nile West, si a biosensorilor ce folosesc un nou matrix sintetizat -pirol-alginatul- pentru o imobilizare eficient a enzimelor i celulelor (exemplu: celule algale de Chorella vulgaris), ntruct biosensorii sunt instrumente analitice rapide i ieftine n comparaie cu metodele convenionale utilizate n monitorizarea sntii oamenilor. Toi biosensorii fabricai n aceast tez au la baz utilizarea derivailor de pirol [pirol alchil amoniu, pirol-biotin, pirol-benzofenona, pirol-hidroxisuccinimida, tris(bipyridin) procesului de ruteniu pirol-alginat, (II)] care n pirolurma asigur

cresctoare de pNPP. Mai mult, se observ cum sensibilitatea biosensorului bazat pe gelul de APPyA scade la 65% din valoarea iniial a curentului dup 10 zile, n timp ce a fost total distrus sensibilitatea bio-sensorului-AA. 11.7. Concluzii n acest capitol este prezentat elaborarea reuit a biosensorilor amperometrici cu celule algale de Chlorella vulgaris incapsulate fie ntrun gel natural de alginat, fie ntr-un gel sintetic de alginat ce conine grupri de pirol grefate. Studiul comparativ al celor dou geluri de alginat ilustreaz prin intermediul activitii fosfatazei alcaline a celulelor algale incapsulate, rolul benefic jucat de polimerizarea electrochimic a reelei de polipirol n interiorul gelului de alginat. Acest reea sporete stabilitatea mecanic a gelului n prezena temperaturilor ridicate (30C) i a convectiei.

electropolimerizare

formarea reelelor polimerice ce permit ulterior imobilizarea speciilor biologice (enzime,

anticorpi, antigeni, oligonucleotide) n starea lor biologic activ. Ca urmare, dozarea tripsinei s-a realizat rapid i simplu cu ajutorul unui biosensor amperometric avnd la baz digestia graduat a unui strat uscat de gelatin (strat format la suprafaa unui electrod de platin modificat cu filme de polipirol alchil-ammoniu ce conine molecule enzimatice de gluco-oxidaza) n funcie de concentraia utilizat de tripsin. O limit de detecie foarte sensibil a fost obinut pentru dozarea tripsinei cu o concentraie de 1 pg/ml

CONCLUZII FINALE

- 31 -

unde timpul de rspuns al biosensorului a fost de 10 minute. n continuare au fost construii

a fost foarte rapid: ntre 5-20 secunde pentru (ii) i mai puin de 40 de secunde pentru (iv). n ultima parte a lucrrii de doctorat se prezint fabricarea biosensorilor bazai pe

biosensori ce sunt capabili de a detecta specific anticorpii caracteristici holerei (anti-CT) cu ajutorul sistemelor electrochimice ce folosesc markeri enzimatici ca gluco-oxidaza biotinilat (Gox-B), polifenol oxidaza biotinilat (PPO-B) i peroxidaza (HRP). Limitele de detecie obinute pentru biosensorii Gox-B, PPO-B, i HRP sunt foarte sensibile de 1 g/ml, 0.1 g/ml i respectiv 50 ng/ml anti CT, iar timpul de rspuns al celor trei imunosensorii a fost foarte rapid mai puin de 30 de secunde. n ceea ce privete detecia virusului Nile West, teza de doctorat descrie 4 tipuri de (imuno)biosensori: (i) imunosensori pentru detecia anticorpilor IgG specifici virusului Nile West, sensori bazai pe i fotoimobilizarea tris(bipiridin-

utilizarea unui nou derivat de pirol (pirol-alginat) ce-i poate gsi aplicaii n laborartorul medical datorit caracterului su netoxic. Ca exemplu pentru confirmarea capabilitilor acestui nou polimer au fost construii biosensori enzimatici i biosensori pentru dozarea activitii fosfatazei alcaline caracteristic celulelor algale de

Chlorella vulgaris importante n monitorizarea polurii mediului, ce sunt un bun indiciu de estimare a declanrii eventualelor maladii umane. Pentru viitor se sper elaborarea de (imuno)biosensori utili n depistarea timpurie a altor virusuri i bacterii extrem de periculoase pentru om, n testarea coagulrii sngelui, n moni-torizarea unui tratament medicamentos a citokinelor i markerilor cardici n unitile de reanimare, precum i n testarea fertilitii i n monotorizri endocrinologice. n acest sens progresele nregistrate [231-233] n vor domeniul favoriza

phagilor-WNV ntr-un film copolimeric format din pirol-benzofenona pirol)ruteniu; (ii) imunosensori pentru detecia anticorpilor IgG specifici virusului Nile West, unde phagilor-WNV sunt incapsulai ntr-un film de polipirol-alchil ammoniu; (ii) sensori cADN derivai din WNV unde oligonucleotida aminat este grefat de un film electrogenerat de polipirolsubstituit cu grupul de Nhidroxisuccinimida; (iv) sensori cADN derivai din WNV bazai pe utilizarea unui intercalator redox acridic pentru detecia specific a duplexului-ADN WNV. Limite de detecie remarcabile au fost obinute pentru biosensorii cu configuraia (ii) de 10-7 anticorpi-WNV i pentru biosensorii cu configuraia (iv) de 1 pg/ml oligonucleotid specific pentru WNV. De asemenea timpul de rspuns al acestor biosensori

nanotechnolgiei

dezvoltarea nano-imunosensorilor, n particular n proteomics (studiul proteinelor) i cellomics (studiul celulelor). Unanim acceptat, scopul final al

(imuno)biosensorilor este miniaturizarea ce va permite integrarea tuturor etapelor efectuate n laboratorul medical ntr-un singur dispozitiv sensor lab-on-chip- care n mare parte poate fii de unic folosin. Ca un avantaj major, cantitatea de prob lichid (snge, urin, etc) necesar pentru testarea biochimic se va diminua considerabil, mai puin de < 1 l [234]

- 32 -

unde cel mai probabil elementele de baz pentru construirea unui sensor-integrat miniaturizat vor fii pompele, valvulele, i un circuit pentru control electronic [235]. De asemenea se sper ca imunosensori implatabili s poat fii comercializai la un pre sczut, ceea ce va facilita introducerea lor n rutina medical ca o alternativ precis pentru depistarea unei eventuale maladii. BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 21. Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Gregoire Herzog, Sebastien Karine Gorky, Boaz S. Leshem, Marks, for the

Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks, Comparison between the performances of amperometric immuno-sensors for holera antitoxin based on three enzyme markers, Talanta, 66 (1), 15-20 (2005). 79. Rodica E. Ionescu, Chantal Gondran, Serge Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks, Construction of amperometric immunosensors based on the electro-generation of a permeable biotinylated polypyrrole,

Anal.Chem, 76( 1), 6808-6813, (2004) 82. Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah, Serge Cosnier, Claude Durrieu, Jean-Marc Chovelon, Robert S. Marks, Amperometric algal Chlorella vulgaris cell biosensors based on alginate and polypyrrole-alginate gels, Electroanalysis 18 (11), 1041-1046, 2006. 86. Rodica E. Ionescu, Sebastien Herrmann, Serge Cosnier, Robert S. Marks, for A the

Herrmann,

Robert

Amperometric photoactive Microbial (2007).

immunosensor

detection of anti-Nile West virus IgG using a copolymer, Technology, Enzyme 40(3), and

403-408,

22. Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Sebastien Herrmann, Robert S. Marks, Amperometric immunosensor for the detection of anti-Nile West virus IgG, Anal. Chem., acceptat spre publicare. 48. Rodica Aplicatiile E. Ionescu, biosensorilor Anton in Ciucu,

polypyrrole

cDNA

electrode

amperometric detection of Nile West virus, Electrochem. Comm., 8 (11), 1741-1748 (2006). 87. Serge Cosnier, Rodica E. Ionescu, Sebastien Herrmann, Demeunynck, Electroenzymatic Laurent Bouffier, S. Martine Marks,

laboratorul

medical, Jurnalul laboratorului clinic, 2, 4-5, (1998). 54. Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Protease amperometric sensor, Anal. Chem., 78(18), 6327-6331, 2006. 65. Razvan Stoia, Adriana Dumitrescu, Ioana Mooiu, Rodica E. Ionescu, Dan Coli, Major parameters of chronic lymphocytic leukemia, Documenta Haematologica, 3(1), 41- 45, (1999). 78. Rodica E. Ionescu, Chantal Gondran, Serge

Robert

polypyrrole-intercalator

sensor for the detection of Nile West virus cDNA, Anal. Chem., 78(19), 7054-7057 (2006). 117. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth, C.R. Lowe, Anal. Chem., 67 (1995) 4229. 118. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth, C.R. Lowe, Sens. Actuators, B: Chem., 33 (1996) 55.

- 33 -

136. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, J. Electrochem. Soc., 127 (1980) 1278. 137. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, Anal. Chem., 51 (1979) 439. 138. J.M. Saveant, J. Electroanal. Chem., 302 (1991) 91. 145. L. Bouffier, M. Demeunynck, A. Millet, P.J. Dumy, J. Org. Chem., 69 (2004) 8144. 150. F. Palmisano, C. Malitesta, D. Centonze, P.G. Zambinin,. Anal. Chem., 67 (1995) 2207. 172. S. Cosnier, B. Galland, C. Gondran, A. Le Pellec, Electroanalysis 10 (1998) 808. 175. S. Cosnier, M. Stoytcheva, A. Senillou, H. Perrot, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, Anal.Chem., 71 (1999) 3692. 176. O. Ouerghi, A. Touhami, N. JaffrezicRenault, C. Martelet, H. Ben Ouada, S. Cosnier, Bioelectrochemistry 56 (2002) 131. 180. R.S. Marks, E. Bassis, A. Bychenko, M.M. Levine, Opt. Eng., 36 (1997) 3258. 181. T. Konry, A. Novoa, S. Cosnier, R.S. Marks, Anal. Chem., 75 (2003) 2633. 188. C. Mousty, J.L. Bergamasco, R. Wessel, H. Perrot, S. Cosnier, Anal.Chem., 73 (2001) 2890. 198. S. Cosnier, A. Le Pellec, R.S. Marks, K. Perie, J.P. Lellouche, Electrochem. Commun., 5 (2003) 973. 199. S. Cosnier, A. Leppelec, B. Guidetti, I. Rico-Lattes, J. Electroanal. Chem., 449 (1998) 165. 200. R.S. Marks, A. Novoa, D. Thomassay, S. Cosnier, Anal. Bioanal. Chem., 374 (2002) 1056.

203. G. Orive, R.M. Hermandez, A.R. Gascon, R. Calafiore, T.M. Chang, P. De Vos, G. Hortelano, D. Hunkeler, I. Lacik, A.M. Shapiro, J.L. Pedraz, Nature Medicine 9 (2003) 1104. 204. P.S.J. Cheetham, K.W. Blunt, C. Bucke, Biotechnol. Bioeng., 21 (1979) 2155. 205. N. Munjal, S.K. Sawhney, Enzyme

Microb. Technol., 30 (2002) 613. 216. Khalil Abu-Rabeah, Boris Polyak, Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Synthesis and characterization of a pyrrole-alginate conjugate and its application in a biosensor construction, Biomacromolecules, 6(6), 3313-3318, (2005). 217. E. Taqieddin, M. Amiji, Biomaterials 25 (2004) 1937. 222. O. Smidsrod, G. Skjak-Braek, TIBTECH 8 (1990) 71. 225. P. Pandard, D. M. Rawson, Environ. Toxicol. Water. Qual., 8 (1993) 323. 226. C. Chouteau, S. Dzyadevych, C. Durrieu, J.-M. Chovelon, Biosens. Bioelectron., 21 (2005) 273 228. Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah, Serge Cosnier, Robert S. Marks, Improved enzyme retention from an electropolymerized polypyrrole-alginate matrix in the development of biosensors, Electrochem. Commun., 7 (12), 12771282, (2005). 231. B.M. Cullum, T. Vo-Dinh, Trends Biotechnol., 18 (2000) 388. 232. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi

- 34 -

A.Gheber, Nanolithography using protease etching of protein surfaces, NanoLetters 3(12), 1639-1642 (2003). 233. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi A. Gheber, Manufacturing of nanochannels with controlled dimensions using protease nanolithography NanoLetters 5(5), 821-827 (2005). 234. M.I. Song, K. Iwata, M. Yamada, K. Yokoyama, T. Takeuchi, E. Tamiya, I. Karube, Anal. Chem., 66 (1994) 778. 235. R.A. Felder, G.J. Kost, MLO Med. Lab. Obs., 30 (1998) 22.

- 35 -