Ingineria tisular este o abordare recent i interesant de a furniza artificiale esuturi sau organe pentru pacienii care sufer

de pierderea sau eecul acestor structuri *1+ n aceast abordare., esuturi sau organe pot fi proiectate folosind o combinatie de celule i schele polimer . esut specifice celule pot fi izolate de la un tesut mic biopsie prelevate de la pacient i de cultur in vitro. Celulele sunt apoi ncorporate ntr-un polimer care imita schela extracelulare matrice (ECM), care ajut la livrarea a celulelor de a site-ului dorit, ofer spaiu pentru formarea de tesut nou, i controleaz structura i funcia a tesuturilor inginerie. *2,3+ hidrogeluri sunt un candidat potenial pentru utilizare ca un preparat injectabil n aplicaii de inginerie tisulara.Utilizarea hidrogelurilor permite celulelor s fie injectat n organism ntr-un mod minim invaziva. Acest lucru poate reduce durerea pentru pacient, precum i costurile i timpul de recuperare. Un numr de polimeri sintetici i naturale au fost folosite pentru a forma hidrogeluri pentru aplicaii de inginerie tisulara. Alginat este un polimer natural, care este frecvent utilizat n aplicaii biomedicale. Acesta este deosebit de comun n multe aplicaii de inginerie tisulara, din cauza sale biocompat-flexibilitate, toxicitate redus, costuri relativ sczute i comportamentul gelifierea uoar cu cationi bivaleni. *4-13] comercial disponibile alginate sunt extrase din alge brune, cum ar fi Laminaria hiperborean, Ascophyllum nodosum i macro- cystis pyrifera *14+ alginat. este un copolimer bloc cu o structur liniar compus din blocuri homopolymeric de BDmannuronate (M) i un-L-guluronate (G) reziduuri. Acesta este, de asemenea, construit cu alternativ G-i M-blocuri (MG) [15,16]. Numrul relativ de M-i G-blocuri depinde de originea alginat. G-blocuri de lanuri de alginat pot fi reticulat cu cationi bivaleni, cum ar fi ionii de calciu, prin interaciuni ionice cu grupurile carboxilice din alginat de care induce gelifiere (figura 1 (a)) [17,18]. Gelation poate bereversibly induse de schimbari in mediile externe, cum ar fi pH-ul *19,20+ i temperatur. *21,22+ Hidrogeluri forfecare-reversibil reticulat, care poate recupera de structuri de gel de forfecare induse de defalcare, sunt atractive pentru livrarea de terapie, inclusiv celulele, astfel cum gel poate curge ca un lichid atunci cnd este injectat, dar re-gel odat introdus n organism. Alginat pot forma, de asemenea, prin intermediul hidrogeluri de celule reticulare-, n loc de reticulare ionic. Am raportat anterior o metoda roman pentru a forma geluri care utilizeaz numai celulele i celule interactive polimeri (Figura 1 (b)) *23+. Cell-interactive polimeri au fost sintetizate prin cuplarea cu o peptida de acid arginin-glicin-aspartic (RGD) secvena a lanurilor de alginat utiliznd solubil n ap carbodiimid Chem-terul *24+. amestec de soluie alginat RGD-modificat i celule formeaz geluri, fr utilizarea de molecule de reticulare suplimentare. Amestecul prezinta forfecare-reversibil comportament gelifiere. Acest sistem poate avea multe avantaje in aplicatii de inginerie tisulara: gel poate forma fr a utiliza un chimice de reticulare, iar celulele pot fi livrate la corpul ntr-un mod minim invaziva. Celulele nu sunt

doar materiale terapeutice folosite la nivelul tesuturilor inginer, dar, de asemenea, pentru a forma o crosslinkers hidrogel. Cu toate acestea, acest sistem necesit un numr mare de celule de gelifiere (de exemplu, *Celule+ 1.25 108 ml celule 1), gel rezultat este relativ slab. Acesta poate fi dificil de a izola i culturii, de exemplu o concentraie mare de celule pentru utilizri practice. Necroza ar putea duce urmare a creterii ofertei insuficiente de substante nutritive si oxigen atunci cnd acest sistem este livrat in organism. O alt preocupare de a folosi celule-reticulat hidrogeluri n aplicaii de inginerie tisulara este proprietatile lor relativ slabe fizice. Polimer constructii (de exemplu, hidrogeluri) ar trebui s menin integritatea fizic pn cnd acestea sunt sub-stituit de esuturi nou formate, sau pn cnd geluri finaliza funciilor lor *25+. Proprietile mecanice ale hidrogeluri alginat pot fi de obicei controlate prin varierea greutatea molecular a lanului de alginat *26-28+ i densitatea de reticulare *29,30+. O metod simpl de obinere proprietatile mecanice ale hidrogelurilor corespunztoare alginat este de a crete densitatea de reticulare ionic prin adugarea unor cantiti suficiente cationi ofdivalent, cum ar fi ionii de calciu. Cu toate acestea, o concentraie ridicat de ioni de calciu in tesuturile pot provoca activarea sau dezactivarea diferitelor procese celulare care influeneaz formarea de tesut *31-34] n plus, hidrogeluri alginat, n principal, reticulat cu cationii bivaleni, nu arat de forfecare-reversibil comportament gelifiere.. n acest studiu, am emis ipoteza ca o combinatie de celule reticulare i-reticulare ionic ar putea fi utile n formarea hidrogeluri alginat. Am, de asemenea, emis ipoteza c adugarea unei cantiti minime de ioni de calciu ar reduce numrul de celule necesar pentru a forma celule-reticulat hidrogeluri, fr a schimba reversibilitatea forfecare a sistemului de gel. Pentru a confirma acest lucru, am masurat proprietatile vascoelastice i gelation comportamen-vior de geluri alginat n prezena celulelor i ioni de calciu. n plus, condrocite primare au fost subcuta-tan implantat n regiunea dorsal de soareci folosind forfecarereversibil reticulate hidrogeluri pentru a testa eficacitatea acestui tip de geluri n esut cartilaginos de inginerie in vivo.

Figura 1. Descriere schematic a diferitelor formaiuni de reea reticulat de geluri alginat prin intermediul litera (a) de reticulare ionic, (b) de celule reticulare-i (c) reticulare asociere cu att ionic i celule reticulare-.

Izolarea de celule i cultur Condrocite primare au fost izolate din cartilajul articular de 4 sptmni, n vrst de Noua Zeeland alb iepuri (Samtako). Fragmentele au fost cartilaj tocat, se spal de trei ori cu tampon fosfat salin (PBS, Gibco), i digerate cu 0,05 greutate - colagenaza% de tip II (Sigma) n DMEM/F-12 (Gibco), care conine 10% FBS i 1% penicilin. -streptomicin pentru 10 ore. Celulele izolate au fost splate de dou ori cu PBS, cultivate n DMEM/F12 mass-media care conin 10% FBS i 1% penicilin-streptomicin la 37 8C sub o atmosfer de CO2 5%. NIH3T3 fibroblatii de oarece au fost achiziionate de la Coreea de celula de linie Bank (KCLB), i au fost cultivate ntr-un mediu Dulbecco Eagle modificat (de MDEM, Gibco), care conine 10% ser fetal bovin (Gibco) i 1% penicilin-streptomicin (Gibco) la 37 8C n temeiul o atmosfer de CO2 5% Pregtirea hidrogeluri Celulele au fost desprinse din vasul de cultura folosind tripsina (0,05% n etilendiaminotetraacetic de acid (EDTA) soluie), i au fost colectate ntr-o sering 1 ml de centrifugare. O sulfat de calciu (CaSO4), soluie a fost adugat la sering. Purificat i alginat liofilizat a fost dizolvat n DMEM i transferat la o alt sering. Cele dou seringi au fost legate cu un conector de sex feminin i coninutul au fost amestecate rapid. Aceasta a fost urmat de incubare la 37 8C sub o atmosfer de CO2 5% timp de 20 minute nainte de de testare.Concentraia final a soluiei a fost alginat 3 greutate -%..Concentraia de celule a variat de la 1,25 la 107 1.5 108 ml celule 1.Suma de CaSO4, de asemenea, a variat 5 - 9 10 3 celule M. pretratate cu peptida RGD solubil (10 10 3 M, 20 min), au fost pregtite i folosite pentru a confirma interaciuni specifice ntre celule i alginat RGD-modificat.

Msurtorile reologice Modulul de stocare (G0) i un modul n pierdere (G00) de amestec de celule i RGDmodificate soluii alginat au fost masurate cu ajutorul unui reometru de rotaie (Gemeni 150, Malvern), echipat cu un dispozitiv con-si-plac (20 cu diametrul de plac mm, 48 con unghi). Comportamentul gelifiere a fost monitorizat cu un modul de frecven unic la 0,1 Hz timp de 20 min. Proprietile vascoelastice ale geluri au fost, de asemenea, investigat folosind un mod de matura frecven n intervalul de la 0,01 la 1 Hz. Deschiderea diferena de la vrful conului i placa a fost stabilit

la 150 mm, iar temperatura de operare a fost meninut constant la 37 0.1 8C. Comportamentul forfecare gelifierea reversibil a fost confirmat prin ruperea n mod intenionat structura de gel. Acest lucru a fost realizat prin applyinga shearstress (100 Pa) for10 e i therecovery de monitorizare de gelifiere. n Implantarea vivo i analiza histologica Toate procedurile au fost n conformitate cu Universitatea Hanyang Linii directoare pentru ngrijirea i utilizarea animalelor de laborator. SPF / VAF soareci immunodeficent (6 sptmni vechi, Orientbio) au fost anesteziati cu injecie intramuscular de clorhidrat de ketamina (8 mg / kg greutate corporal, Yuhan Corporation). Condrocite (*Celule+ 7.0 107 celule ml 1) au fost amestecate fie cu RGD -modSoluia alginat de ified n prezena ionilor de calciu sau DMEM/F12 mass-media numai, i subcutanat injectat n dorsala a soareci. Pentru fiecare injectare, 0,2 ml de celule / polimer de construct a fost injectat (n = 4). ase sptmni dup implantare, toate soareci au fost sacrificat i seciuni de esuturi au fost preluate. Probele au fost stabilite n 10 wt -.% Formalin tamponat, deshidratat cu o serie de gradat alcool, i ncorporate n parafin pentru analiza histologic. esut seciuni cu 4 mm grosime, fie au fost colorate cu hematoxilin i eozina (H & E), pentru analiza morfologic sau cu Safraninul-O pentru sulfatat glicozaminoglican (GAG) analiza. Rezultate i discuii Pregtirea hidrogeluri O peptida care conine secvena de arginin-glicinacid aspartic (RGD), un ligand bine-cunoscut, care adeziv se poate lega n mod specific de receptorii de celule, a fost punct de vedere chimic conjugat cu coloana vertebral alginat. HGR-modificat alginat a fost mai nti testate pentru a stabili dac acesta poate forma hidrogeluri n prezena a fibroblastelor, fr utilizarea de ionii de calciu suplimentare. Atunci cand celulele au fost adugate pentru a-RGD Soluie alginat modificat (*celule+ 1.5 108 ml celule 1, cercuri din figura 2), depozitarea modul de forfecare (G0) a fost mai mare dect pierderea de forfecare modulul (G00). Acest lucru indic faptul c amestecul format o structur gel (Figura 2). Cu toate acestea, un numr mare de celule (*celul+ 1.5 108 ml celule 1) au fost necesare pentru a forma geluri. Acest lucru poate pune n practic dificulti n aplicaiile transplant cu celule. n plus, atunci cnd un numr mare de celule sunt transplantate in vivo, Necroza poate s apar ca urmare a ofertei limitate de substante nutritive i oxigen. Cnd exist un numr mic de celule au fost amestecate cu RGD-peptida modificat soluie de alginat (*Celule+ 1.25 107 celule ml 1, ptrate n figura 2), un gel structur nu a fost format (Figura 2). Acest lucru se datoreaz probabil

lipire insuficient ntre celule i celule-interactive polimeri. Aceast constatare a fost in concordanta cu precedente nostru studii. Am fost capabil de a crea celule-reticulat geluri alginat utiliznd ambele preosteoblastelor *23+ i fibroblaste.

Figura 2. Modificri n stocare (G0, simboluri pline) i pierderea de modul de forfecare (G00, simboluri deschise) a soluiilor alginat RGD-modificat n prezena unor concentraii de celule diferite (*celule+ 1.5 108 celule ml 1, cercuri; 1.25 107 celule ml 1, patrate). n acest experiment, fr ionii de calciu suplimentare au fost adugate. Am testat urmtor, dac utilizarea unui numr mic de ioni de calciu ar putea contribui la reticulare suplimentare i formarea unei structuri hidrogel n prezena unui numr mic de celule.Raportul dintre G0 G00 a fost folosit ca un indicator al gelifierea sistemului. n general, un numr suficient de ioni de calciu este esentiala pentru formarea de hidrogeluri ionice alginat reticulat. Atunci cnd o soluie RGD-alginat a fost amestecat cu o cantitate mica de ioni de calciu (de exemplu, 7 10 3 M), geluri nu s-au format (Figura 3, deschis cercuri). Surprinzator, atunci cand celulele (1.25 107 celule ml 1) au fost adugate la amestec, G0/G00 valorile au crescut n mod dramatic (Figura 3, ptrate umplute).Numrul de ioni de calciu folosite a fost de aproximativ o cincime dintre care de obicei necesar pentru a forma hidrogeluri ionice reticulat alginat. HGR-a modificat alginat amestecat cu celule (doar *+ celule 1.25 107 ml celule 1, fr ioni de calciu), precum precum i non-modificat alginat amestecat cu att celulelor (*+ celule 1.25 107 ml celule 1) i de calciu ioni (7 10 3 M) nu formeaz geluri (Figura 3).

Figura 3. Comportamentul gelifierea RGD-modificat alginat cu ambele celule si ioni de calciu (ptrate umplute), HGR modificat cu alginat cu celule deschise doar (ptrate), nemodificat alginat cu ambele celule si ioni de calciu (cercuri pline), i RGD-modificat alginat cu ioni de calciu (numai cercuri deschise) (*celule+ 1.25 107 celule ml 1, *CaSO4+ 7 10 3 M).Punctul cross-over n cazul n care G0 G00 pro-ari o msur a pragului de gelifiere (linia punctat). Amestecul de soluie de alginat nemodificat i celulele nu formeaza o structura de gel din cauza lipsei de capacitate de legare a receptorilor celulari integrina la polimeri ligandmodificat, chiar dac o cantitate mica de ioni de calciu a fost adaugat. Aceste rezultate indic n mod clar faptul c structura de gel face sinergic, ca urmare a specifice de celule-polimer interaciunile i interaciuni ionice (Figura 1 (c)). n plus, timpul de gelifiere combinat celulesi calciu-reticulat gel a fost redus n mod semnificativ (250) n comparaie cu geluri formate din celule i celuleinteractive polimeri numai (600 e). [23] Pentru a investiga dac formarea unei structuri gel a fost indus n principal de interaciuni specifice ntre peptide adezive i de celule, celulele au fost pre-tratai cu peptide RGD solubile i amestecat cu o soluie de alginat de RGD-modificat. n cazul n care celulele au fost pre-tratai cu peptide solubile RGD nainte de amestecarea cu polimeri, receptorii integrina ale celulelor au fost blocate. Acest lucru a dus la capacitatea de legare redus a celulelor de a lanului de alginat de ligand-modificat. Cele G0 valorile pentru un amestec de RGD-modificat alginat i RGD-pre-tratate cu celulele au fost mai mici dect cele G00 valori (Figura 4, patrate). Aceasta a fost, spre deosebire de un amestec care conine celulele normale (Figura 4, cercuri). Aceast constatare n mod clar indic faptul c interaciunile specifice dintre liganzi de pe coloana vertebral alginat i a celulelor receptori onthe sunt contribuitori primare la formarea unei structuri gel.

Figura 4. Modificri n stocare (G0, simboluri pline) i pierderea de modul de forfecare (G00, simboluri deschise) de soluii de alginat RGD-modificate, n prezena de celule pre-tratate cu peptide solubile RGD (ptrate) (*celule+ 1.25 107 de celule ml 1, *RGD+ 10 10 3 M, [CaSO4] 7 10 3 M). Cercuri reprezint un amestec de RGD-modificat Celulele normale i alginat (*celule+ 1.25 107 ml de celule 1, *CaSO4+ 7 10 3 M). Fora de forfecare induse reversibil gelation Noi urmtoare a confirmat c gelurile reticulat folosind combinaii de reticulare de celule reticulare i ionice ar putea arta un comportament de forfecare-reversibil gelifiere. Forfecare-reversibil comportament gelifiere este una dintre proprietile de hidrogeluri care le face atractive pentru utilizarea n aplicaii biomedicale multe ca un material injectabil. Acest lucru se datoreaz faptului c gel poate curge ca un lichid n timpul injectrii, ci formeaz o structur de gel odat ce acestea sunt plasate n corp. Cell-reticulat geluri arat forfecare-reversibil comportament gelifiere, ca liganzi adeziune cuplate la coloana vertebral alginat se poate lega de receptorii integrina de celule slab i lipirea lor este reversibila. *23+ n acest studiu, o structur de gel a fost format n prezena de celule i ionii de calciu dup aproximativ 250 s de amestecare. n acest moment, structura de gel a fost n mod intenionat defalcate prin aplicarea forei de forfecare (100 Pa, 10 s). Interesant, structura de gel de recuperat-a lungul timpului. Forfecare-reversibile gelationwas realizate la leasttwice, indiferent de prezena ionilor de calciu in geluri (Figura 5). Cu toate acestea, soluia nemodificat alginat nu a demonstrat un comportament de forfecare gelifierea reversibil, chiar i n prezena celulelor.

Comportamentul controlat gelation Am investigat dac rata de gelifiere i proprietile mecanice ale gelurilor ar putea fi reglementate prin diferite, fie concentraia de celule sau de concentraia de calciu. ca concentraia de celule a crescut de la 2.0 la 106 2.1 107 celule ml 1, G0 valorile au crescut de la 1,7 la 33.7 Pa, iar timpul gelifiere a sczut 720 - 200 s (figura 6 (a)). Ca mai multe celule sunt adugate la sistem, site-uri mai exista obligatorii n cadrul sistemului. Acest lucru mbuntete formare de gel si rezultatele in geluri cu rezisten mecanic mbuntit. Modificri n concentraia de calciu influenat, de asemenea, comportamentul gelation de geluri preparate folosind metoda reticulare asociere. n cazul n care cantitatea de calciu a crescut 5 - 9 10 3 M, n G0 valori crescute de la 3,1 thegelationtime Paand to189 a sczut 770 - 110 s (figura 6 (b)). Aceste modificri au fost observate indiferent de numrul de celule din sistemul (*celule+ 1.25 107 celule ml 1). Concentraiile de cal-difuze ioni utilizate n acest experiment au fost prea mici pentru a permite formarea de geluri alginat ionice reticulat n absena celulelor. Controlul proprietatile mecanice ale geluri ar putea fi

important in regenerarea tesuturilor, ca de obicei nevoie de schele polimer rezisten mecanic optim a regenera n mod corespunztor esut sau organ, n funcie de tipul de esut sau organ. *35+

Figura 5. Forfecare-reversibil comportamentul gelifierea RGD-modificat alginat (cercuri pline) i non-modificat alginat (cercuri deschise), n prezena de 1,25 107 celule ml 1 i 7 10 3 M CaSO4.Punctul cross-over n cazul n care G0 G00 ofer o msur a pragului de gelifiere (linie orizontal punctat).Linia vertical punctat indic aplicarea de for de forfecare a sistemului (100 Pa, 10 s).

Figura 6. Modificri n depozitare modul de forfecare (G0, cercuri pline) i timpul de gelifiere (ptrate deschise) de hidrogeluri n funcie de concentraia de celule (a) (*CaSO4+ 7 10 3 M) i (b) CaSO4 concentrri (*celule+ 1.25 107 ml de celule 1).

concluzie Noi am fost capabil de a manipula proprietile viscoe-Lastic de hidrogeluri alginat prin introducerea att de celule reticulare i-reticulare ionic la soluii alginat. Msurtorile reologice a confirmat comportamentul gelifierea acestor geluri.Numrul de celule necesar pentru a forma celule-reticulat geluri a fost semnificativ redus prin utilizarea unei cantiti mici de ioni de calciu. n plus, proprietile mecanice i comportamente gelifierea gelurile au fost controlate de ctre variind concentraia de ioni de calciu i a celulelor n sistem. Forfecare-reversibil comportament gelifiere a fost, de asemenea, meninut atunci cand celulele au fost reticulate, cu att celule i ionice reticulare metode, care este critic atunci cnd aceste geluri sunt utilizate ca un sistem de livrare injectabil pentru terapie minim invaziva. Mai mult dect att, geluri combinationally reticulat a fost eficace la regenerarea tesuturilor cartilaginoase-moderai noi in vivo. Aceste geluri au aplicaii poteniale ar fi sistemele noi de livrare injectabile, deoarece acestea nu conin reactivi chimici toxici, spre deosebire de alte geluri utilizate n mod obinuit. Cartilaj Regenerarea In Vivo Gelurile au fost pregtite de reticulare asociere i subcutanat implantat n regiunea dorsal de soareci. Seciunile esutului din jurul implantelor au fost recuperate dup ase sptmni. Volumul total al preluate de celule / polimer constructii a crescut cu aproximativ 20%, comparativ cu volumul de injecie iniial. Volumul de celule livrate cu mass-media a rmas doar aproximativ 60% din volumul de injecie iniial, indicnd faptul c hidrogeluri utilizate n acest studiu meninut structura lor mult mai bine la animale. Seciuni de esuturi colorate cu H & E nu au prezentat semnificativ inflamarii-maiilor n esuturi regenerat (Figura 7 (a) i 7 (b)). Condrocite n lacune au fost clar observata cand tesuturile cartilaginoase s-au format n prezena de celule / polimer constructii (Figura 7 (a)). Pe de alt parte, atunci cand celulele au fost transplantate in animalele n absena geluri, celulele au fost de natur s necroza si fibroza (figura 7 (b)). Hidrogeluri combinaie reticulat au fost, de asemenea,

eficiente pentru a forma matrici extracelulare, dup cum reiese din imaginile de seciuni de esut colorate cu Safraninul-O, indicnd cantitatea mare de glicozaminoglicani (GAG sulfatate) n esuturile nou formate (Figura 7 (c)). In acest studiu, a fost demonstrat c metoda de reticulare combinaia a fost util pentru a oferi condrocite primare i pentru a regenera tesutul formarea cartilajului in vivo.