Referat: Demineralizarea și decelularizarea țesuturilor

dintelui, tehnici, metode.

Onofraș Daniela, M1919

Medicina regenerativă
 Medicina regenerativă și ingineria țesuturilor sunt domenii multidisciplinare înrudite și suprapuse,
care urmăresc să restabilească sănătatea pacienților prin promovarea unui proces de remodelare și reparare. Deși
termenii sunt adesea folosiți în mod sinonim și adesea combinați sub umbrela ingineriei tisulare și a medicinei
regenerative, există o distincție între aceste două discipline. Medicina regenerativă este un domeniu din știința
medicală care utilizează celule, schele, factori de creștere și alte molecule de semnalizare și/sau manipularea
genelor pentru a restabili sau a stabili funcția normală prin vindecare endogenă pentru a repara, regenera sau
înlocui celulele, țesuturile sau organele prin vivo și ex vivotehnici. Ingineria tisulară se află în suprapunerea
dintre medicina regenerativă și ingineria biomedicală și utilizează tehnici care combină schele, celule și materiale
biologice pentru a produce și dezvolta noi țesuturi in vitro și in vivo care repară sau înlocuiesc țesuturi sau organe
bolnave, deteriorate sau lipsă. . Împreună, aceste domenii caută să ofere remedii bolilor complexe și adesea
cronice, mai degrabă decât tratamente care gestionează boala .

Schelele joacă un rol cheie în ingineria țesuturilor, unde biomaterialul folosit pentru construirea
schelelor este central. Aceste biomateriale, fie naturale, fie sintetice, trebuie să fie biocompatibile și
biodegradabile și să posede caracteristici adecvate sau favorabile pentru regenerarea tipului de țesut, servind ca
suport temporar în locul matricei extracelulare native (ECM), deși ulterior sunt înlocuite cu noi -ţesut
regenerat. O anumită formă de ECM poate fi găsită în toate țesuturile organismelor multicelulare vii. Plantele
folosesc celuloza, cel mai abundent biopolimer de pe planetă, pentru a-și construi pereții celulari; ciupercile
folosesc chitina pentru pereții lor celulari (la fel ca și artropodele din exoscheletul lor); și toate animalele folosesc
o combinație de proteoglicani, polizaharide, glicoproteine și proteine pentru a-și forma ECM. De-a lungul istoriei
omenirii, ECM a găsit o utilizare extinsă sub formă de piele, tendoane, catgut etc. în fabricarea uneltelor,
instrumentelor și îmbrăcămintei. Mai recent, oamenii de știință au început să recunoască importanța ECM în
formarea și dezvoltarea țesuturilor și, prin urmare, un potențial de utilizare în ingineria țesuturilor și medicina
regenerativă. Cu compușii din ECM, ECM decelularizată (dECM) are capacitatea de a stimula un răspuns de
remodelare și reparare in vivo prin inducerea unui răspuns macrofag M2, mai degrabă decât a unui răspuns
macrofag M1 cu inflamație și fibroză. Cercetătorii au descoperit, de asemenea, că dECM poate promova un
fenotip celular mai stabil . În ultimul deceniu, s-au făcut progrese considerabile în dezvoltarea dECM pentru
ingineria și regenerarea țesuturilor. Aici, trecem în revistă acest progres cu accent pe structura și proprietățile
ECM, metode de pregătire a dECM, metode de modificare și procesare a dECM în constructe funcționale,
aplicațiile in vitro, in vivo și clinice ale constructelor dECM, urmate de o discutarea direcţiilor de cercetare
recomandate.
 ECM de vertebrate poate fi derivată din diferite țesuturi prin diferite metode. Un pas comun, care este
frecvent utilizat printre aceste metode, este înghețarea țesuturilor pentru a provoca ruptura celulară și separarea
straturilor de țesut. Decelularizarea implică metode mecanice și chimice pentru a îndepărta celulele din țesuturi și
pentru a păstra structurile ECM intacte. Metodele timpurii de decelularizare presupun folosirea băilor
chimice. Aceste metode funcționează bine pentru țesuturile simple, subțiri, cum ar fi vezica urinară și organele
digestive, dar nu și pentru organele solide intacte. Protocoalele eficiente de decelularizare pentru organele solide
implică tăierea organului în felii subțiri sau bucăți mici și decelularizarea lor într-o baie chimică, dar acest lucru
perturbă arhitectura organelor și împiedică utilizarea dECM rezultată ca structură intactă. cu fluide
decelularizante pentru a perturba și îndepărta celulele uniform pe țesuturi. Perfuzia arborelui vascular
funcționează și pentru alte țesuturi simple și complexe unde este de dorit să aibă o structură intactă .

Detergenții sunt cel mai frecvent tratament utilizat pentru decelularizarea țesuturilor. Acest lucru se
datorează faptului că detergenții sunt eficienți în perturbarea membranei fosfolipide a celulelor, ceea ce permite
celulei și conținutului acesteia să fie îndepărtate din țesut. Cu toate acestea, detergenții pot afecta negativ celulele
în recelularizarea dECM. Dodecilsulfatul de sodiu (SDS) este probabil cel mai comun detergent folosit pentru
decelularizare. Într-un studiu de optimizare cu SDS, Friedrich EE și colab. (2017) au raportat că cantitatea
reziduală de SDS rămasă în dECM a fost suficientă pentru a provoca un răspuns inflamator crescut și fibroză,
atât in vitro , cât și in vivo , și au raportat, de asemenea, utilizarea CaCl 2 pentru a precipita SDS din dECM
(81,4% față de 98,4). %) . Ghorbani F et al. (2021) au demonstrat că SDS rezidual, chiar și concentrațiile
reziduale scăzute de SDS găsite adesea în ECM decelularizată folosind SDS, detectate folosind un test de
albastru de metilen pentru a detecta surfactantul anionic, are ca rezultat scăderea viabilității celulare pe baza
rezistenței fenotipului celular la SDS. El M și colab. (2017) au efectuat un studiu de optimizare utilizând SDS la
diferite concentrații și durate de expunere și au descoperit că decelularizarea eficientă ar putea fi finalizată chiar
și la concentrații scăzute și durate mai scurte de expunere și că timpii de expunere mai scurti au fost asociați cu o
reținere mai bună a ECM atât structural, cât și funcțional.

Biomolecule

Într-un studiu realizat de Kawasaki T et al. (2015) comparând SDS cu un alt detergent, s-a constatat
că SDS dăunează microstructurii ECM, distruge matricea laminară ECM, elimină majoritatea
glicozaminoglicanilor sulfatați (sGAG) și afectează factorii de creștere și citokinele. Weng şi colab. (2021) au
raportat că ECM osoasă de cultură celulară decelularizată folosind SDS a fost citotoxică pentru celule în timpul
recelularizării . Mai mult, Uhl FE et al. (2020) au demonstrat că decelularizarea plămânilor folosind SDS a dus la
pierderi mari de GAG, iar GAG-urile rămase au fost disfuncționale și incapabile să lege factorii cheie de creștere
asociați matricei. Aceste descoperiri sugerează că SDS nu este un detergent ideal pentru decelularizare.
 Triton X-100 este comparabil cu SDS în ceea ce privește prevalența utilizării pentru
decelularizare. În timp ce Triton X-100 nu este la fel de eficient în îndepărtarea componentelor celulare
antigenice precum SDS, care poate duce la un răspuns inflamator in vivo , Triton X-100 dăunează în general mai
puțin structurii matricei extracelulare și are o rată de retenție mai bună a moleculelor bioactive decât SDS. Ca
rezultat, Triton X-100 este adesea folosit în combinație cu și pentru a completa alți detergenți și metode pentru a
îndepărta eficient celulele și resturile de celule din ECM. Există mulți alți detergenți, substanțe chimice, enzime
și metode care sunt folosite pentru decelularizarea țesuturilor. 

Unul dintre considerentele importante pentru selectarea tehnicilor de decelularizare este controlul
calității, asigurându-se că s-a realizat o decelularizare suficientă, astfel încât să nu interfereze cu rezultatele
experimentale. Au fost stabilite metrici propuse pentru standardele minime pentru realizarea decelularizării
adecvate, iar acestea au fost în mare măsură adoptate. Analiza eficienței decelularizării poate fi apoi evaluată
folosind o combinație a trei criterii standard propuse:

 material nuclear nu este vizibil în secțiuni de țesut colorate fie cu H&E, fie cu 4′,6-diamidino-
2-fenilindol (DAPI);
 conținut de dsDNA < 50 ng/mg de ECM (greutate uscată); și
 Dimensiunea fragmentului de ADN < 200 de perechi de baze.

Aceste criterii minime au fost stabilite pentru a reduce intensitatea oricărui răspuns imun la țesuturile
străine . Mora-Navarro et al. (2022) au stabilit un protocol folosind spectroscopie de absorbanță care le-a permis
să monitorizeze progresul decelularizării în timp real, prin măsurarea absorbanței conținutului de ADN din
efluent la 260 nm. Deși acestea sunt criterii stabilite, ele s-ar putea să nu fie potrivite pentru toate țesuturile și
poate fi necesar să se ia în considerare unele dintre componentele celulare într-un standard complet pentru o
decelularizare adecvată, cum ar fi nivelurile de mitocondrii reziduale, fosfolipide, proteine MHC-1. , epitopi α-
Gal etc. În acest moment, aceste metrici servesc drept standard de aur pentru asigurarea decelularizării adecvate.

Îmbunătățirea stabilității dECM poate fi realizată prin adăugarea de materiale. Acestea pot include
alte materiale care sunt încorporate direct în dECM care oferă rezistență structurală și materiale care sunt plasate
în jurul dECM pentru a oferi suporturi structurale pentru a reduce forțele exercitate asupra acestuia. Stabilitatea
poate fi, de asemenea, îmbunătățită prin reticulare a dECM pentru a stabiliza proteinele.

Schele compozite dECM

 Există diferite moduri de a face schele hibride. Aceasta poate include modificarea dECM intact,
modificarea dECM solubilizat cu aditivi de hidrogel și adăugarea de suporturi structurale externe.

dECM solubilizat poate fi modificat prin adăugarea altor hidrogeluri. Un hidrogel comun care este
combinat cu dECM este alginatul de sodiu. Alginatul de sodiu, denumit în mod obișnuit pur și simplu alginat,
este favorabil prin faptul că este ușor și rapid reticulat folosind o soluție cu ioni de calciu, cum ar
fi CaCl2 . Combinarea alginatului cu dECM solubilizat permite schelei dorite să se stabilizeze rapid, oferind timp
ca dECM să se gelifice. Dacă se dorește, alginatul poate fi îndepărtat mai târziu prin adăugarea de citrat de sodiu
sau EDTA pentru a se lega și elimina ionii de calciu care stabilizează alginatul. Tehnici precum aceasta permit
încapsularea dECM și a celulelor în microsfere și în fire imprimate/trasate 3D pentru a crea schele (de exemplu,
trasarea într-o soluție de CaCl 2 , folosind imprimarea coaxială având un miez cu o sursă de ioni de calciu și o
coajă cu dECM amestecat cu alginat) . Alginatul sau gelatina pot fi, de asemenea, utilizate pentru a încapsula
dECM sub formă de pulbere în schele mai dense .

Chitosanul este o polizaharidă derivată din chitina care alcătuiește cojile de crustacee. Chitosanul
poate fi solubilizat într-un acid și apoi amestecat cu dECM solubilizat sau adăugat la dECM intact. Adăugarea de
chitosan la dECM solubilizat pentru a crea schele poate fi utilizată pentru a adăuga proprietăți antimicrobiene și
pentru a modifica proprietățile mecanice și dimensiunile porilor schelei .Chitosanul poate fi, de asemenea,
adăugat la dECM pentru a permite foto-linkarea la țesuturi cu agentul de reticulare potrivit.

Foile de dECM pot fi modificate cu dECM suplimentar pentru a viza mai bine țesuturile
specifice. Folosind țesuturi simple, cum ar fi amnionul, vasele de sânge și intestinul subțire, acestea pot fi
modificate pentru a fi utilizate ca substrat prin adăugarea de dECM solubilizat dintr-un alt țesut sau prin
cultivarea unor tipuri de celule specifice pe ECM pentru a forma o nouă matrice extracelulară .

Colagenul și derivații săi pot fi utilizați pentru a susține dECM solubilizat. Auto-asamblarea

colagenului este unul dintre principalii inițiatori ai tranziției sol-gel a dECM solubilizat, iar adăugarea de colagen
solubilizat poate ajuta la îmbunătățirea rezistenței gelului . Gelatina, o formă hidrolizată de colagen, poate fi
amestecată cu dECM solubilizat ca purtător, dar gelatina se topește la 37 °C, în timp ce ECM gelifică la 37 °C,
așa că este necesară o planificare atentă. Gelatina metacriloil (GelMA) este un hidrogel popular utilizat în
ingineria țesuturilor, datorită biocompatibilității și proprietăților mecanice similare cu gelatina, dar avantajul este
că GelMA poate fi ușor reticulat cu adăugarea unui fotoinițiator .

Pentru schele care necesită mai multă rezistență, dECM este adesea combinat cu materiale mai
rigide. Pentru materialele biologice, osul decelularizat poate fi folosit ca suport structural, în special pentru
cartilaj și schele osoase . Materialele plastice sintetice sunt, de asemenea, utilizate pe scară largă. Ele pot fi
utilizate ca acoperire pe schele sferice de hidrogel dECM, amestecate cu dECM solubilizat pentru a îmbunătăți
proprietățile mecanice, imprimate ca suport structural în jurul dECM solubilizat, sau electrofilare pentru a susține
dECM intact. Compușii bioactivi adăugați la dECM pot influența răspunsul biologic la materialele dECM. S-a
demonstrat că dECM hepatic tratat cu prednisolon în combinație cu însămânțarea celulelor reduce prezența
celulelor imune inflamatorii la șobolani, în timp ce crește semnificativ regenerarea in vivo și răspunsul la
angiogeneză. S-a demonstrat că curcumina are efecte antimicrobiene în schelele dECM și are ca rezultat o
activitate metabolică celulară ridicată, fără impact aparent asupra viabilității celulare. Adăugarea de exozomi cu
peptide din domeniul de legare a colagenului pentru a le asigura mai eficient la dECM are potențialul de a
îmbunătăți proliferarea celulară in vitro și de a reduce fibroza in vivo. S-a demonstrat că adăugarea exozomilor
colectați din medii cultivate cu celule stem mezenchimale derivate din măduva osoasă la biocernelurile dECM
restabilește disfuncția mitocondrială a condrocitelor, îmbunătățește migrarea condrocitelor și sporește polarizarea
populațiilor de macrofage către un fenotip M2.

Când utilizați tehnici de imprimare 3D pentru a crea o schelă folosind dECM solubilizat, există
momente în care sunt necesare materiale de sacrificiu pentru a crea structuri interne. Un surfactant hidrofil,
Pluronic F-127, are proprietăți favorabile pentru utilizare ca material de sacrificiu cu dECM solubilizat: la
concentrații de aproximativ 20%, Pluronic F-127 poate forma un gel și rămâne lichid la temperaturi scăzute, dar
se solidifică la temperatura ambiantă. Aceste proprietăți sunt potrivite pentru utilizarea cu dECM solubilizat, ca
geluri dECM solubilizate la 37 °C, dar rămân lichide sub aceasta, în timp ce Pluronic F-127 este solid la 37 °C,
dar poate fi solubilizat prin scăderea temperaturii sub punctul de gel sau prin creșterea hidratarea. Acest lucru
permite Pluronic F-127 să fie utilizat ca gel de sacrificiu pentru crearea matrițelor sau ca miez pentru imprimarea
coaxială a dECM solubilizat pentru a face un tub gol (de exemplu, o schelă vasculară). Alți aditivi noi includ
nanoargila Laponite-XLG, poli(etilen glicol)-diacrilat și poli( N -izopropilacrilamidă) (PNIPAM) . Materialele
pot îmbunătăți imprimabilitatea și stabilitatea structurală a schelelor.

Cross-Linking

Legătura încrucișată este o opțiune populară pentru stabilizarea hidrogelurilor de tot felul. dECM
solubilizat are capacitatea de a suferi autogelificare, dar există situații în care sunt utilizați agenți de reticulare
chimici. Cele două tipuri principale de agenți de reticulare exogeni sunt agenții chimici de reticulare și
fotoinițiatorii. Agenții de reticulare, direct sau prin reacție cuplată, induc proteinele să se reticuleze. În cazul
dECM, agenții de reticulare obișnuiți includ glutaraldehida, glioxal, genipin și N -hidroxisuccinimidă (NHS),
adesea în combinație cu 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) -carbodiimidă (EDC) pentru a stabiliza reacția, printre
alți compuși chimici de reticulare, de a lega chimic proteinele între ele. Fotoinițiatorii induc, de asemenea,
reticularea proteinelor, dar mecanismul lor este acela de a genera intermediari reactivi care inițiază
reticularea. Mulți fotoinițiatori, cum ar fi Irgacure 2959, riboflavină/vitamina B2 și rose bengal necesită excitare
cu UV pentru a iniția procesul de reticulare. Deoarece UV poate fi dăunător pentru celulele încorporate într-o
schelă, alți fotoinițiatori care lucrează cu lumină vizibilă, cum ar fi eozina Y, sunt utilizate pentru a lega dECM
solubilizat. O nouă metodă de reticulare, dezvoltată de Nishiguchi și Taguchi (2021), implică legarea genipinului
la PEG cu patru brațe folosind procese determinate de pH pentru a crea un adeziv care induce o reacție rapidă de
reticulare și ca agent de gelificare. Aceste metode permit atât dECM solubilizat, cât și intact să fie reticulat.

Fabricare structurală

Foile dECM cultivate pe celule pot fi modificate pentru a crea schele. Magnan şi colab. (2020) au
cultivat fibroblaste de piele umană pentru a crea foi de dECM care au putut fi modificate pentru a crea
fire. Aceste fire au fost realizate prin tăierea foilor de dECM în benzi și apoi răsucirea benzilor pentru a forma
fire. Aceste fire ar putea fi apoi răsucite pentru a fila fire sau împletite pentru a forma fire multifilament mai
puternice. Aceste fire pot fi țesute, tricotate, înnodate sau folosite ca fire de sutură. Pentru crearea grefelor
vasculare, firele ar putea fi țesute pe un țesut circular pentru a crea o plasă cu o structură de urzeală și bătătură
pentru a produce un perete foarte dens la grefa cu capete care erau potrivite pentru sutură și permeabilitate
scăzută.

Reticulare fizică a hidrogelurilor este un alt proces utilizat pe scară largă. Pentru dECM, cele mai
comune două metode folosesc ambele vid. Pentru foile de dECM, acestea pot fi stivuite împreună și comprimate
folosind presiunea de vid pentru a laminate foile dECM împreună. Hidrogelurile de liofilizare au ca rezultat, de
obicei, un burete poros reticulat fizic. Hidrogelurile dECM liofilizate creează o structură foarte poroasă, de obicei
cu pori interconectați (deși procesul de congelare înainte de liofilizare poate afecta acest lucru) și sunt hidrofile

Bureții hidrogel liofilizați permit, de obicei, o migrație îmbunătățită a celulelor și fluxul de nutrienți
în interiorul schelei, în funcție de structura porilor. O altă metodă de a crea schele compozite, multistrat, este
fabricarea unui sistem de găuri și urechi de blocare pentru a interconecta foile de biomateriale, fără a fi nevoie să
adăugați substanțe chimice de reticulare .

Strategiile de succes de medicină regenerativă ale matricei extracelulare xenogene au nevoie de un

echilibru sinergic între inflamație, fibroză și procesul de remodelare. Au fost identificate subseturi de macrofage
adaptive pentru a modula inflamația și a orchestra repararea țesuturilor parenchimatoase învecinate. Acest studiu a fabricat
 CD206 + M2 (M2γ) amorsat cu PPARγ și, în primul rând, a verificat rolurile lor antiinflamatorii și de
fenotipul CD68 +

regenerare a țesuturilor în regenerarea organelor bioinginerești xenogene. Rezultatele noastre au arătat că

răspunsul celulelor T CD3 + CD8 + de tip Th1 la complexul radicular bazat pe matrice de dentină xenogeneică
(xenocomplex) a fost inhibat semnificativ de macrofagul M2γ in vitro.. Activarea PPARγ a recrutat în timp util și
polarizarea macrofagelor tisulare CD68 + CD206 + la xenocomplex in vivo . Aceste subseturi au atenuat
citokinele proinflamatorii (TNF-α, IFN-γ) la locul inflamației și au scăzut CD3 + CD8 +Limfocitele T din
sistemul periferic. Când au fost traduse într-un model de primate non-umane ortotopic, macrofagele M2 amorsate
cu PPARγ au imunosuprimat IL-1β, IL-6, TNF-α, MMP-urile pentru a permite xenocomplexului să scape în mod
eficient de respingerea mediată imun și să inițieze integritatea sinergică grefă-gazdă. Aceste activități colective
au promovat diferențierea celulelor asemănătoare odontoblastelor și a celulelor parodontale pentru a ghida
regenerarea pulpă-dentină și cement-PDL-oase și au salvat odontogeneza parțial lezată, cum ar fi expresia DSPP
și periostinei. În cele din urmă, rădăcina regenerată a prezentat echivalență structurală-biomecanică și funcțională
cu dintele nativ. Conversia în timp util a macrofagului M1-la-M2 a orchestrat în principal odontogeneza,
fibrogeneza și osteogeneza, care reprezintă un potențial modulator pentru regenerarea țesutului parenchimatos-
stromal intact al organelor vizate.

Celulele stem/progenitoare ale foliculului dentar (DFPC) sunt un grup de celule stem mezenchime
dentare care se află în foliculul dentar și joacă un rol critic în dezvoltarea și menținerea funcției
dentare. Originare din creasta neurală, DFPC-urile au o capacitate de diferențiere multipotențială. Mai important,
au superiorități, inclusiv accesibilitatea ușoară și sursele abundente, capacitatea de auto-reînnoire activă și surse
necontroversabile în comparație cu alte celule stem, făcându-le un candidat atractiv în domeniul ingineriei
tisulare. Progresele recente evidențiază proprietățile excelente ale DFPC în regenerarea țesuturilor orofaciale,
inclusiv repararea osului alveolar, regenerarea parodonțiului și formarea complexului bio-rădăcină. În plus, ele
joacă un rol unic în menținerea unui micromediu favorabil pentru celulele stem, imunomodularea și regenerarea
țesuturilor legate de nervi. 
 Bibliografie

1. de Sousa Iwamoto LA, Duailibi MT, Iwamoto GY, Juliano Y, Duailibi MS, Ossamu Tanaka
FA, Duailibi SE. Tooth tissue engineering: tooth decellularization for natural scaffold. Future Sci OA. 2016 Mar
31;2(2):FSO121. doi: 10.4155/fsoa-2016-0016. PMID: 28031968; PMCID: PMC5137886.
2. McInnes AD, Moser MAJ, Chen X. Preparation and Use of Decellularized Extracellular
Matrix for Tissue Engineering. J Funct Biomater. 2022 Nov 14;13(4):240. doi: 10.3390/jfb13040240. PMID:
36412881; PMCID: PMC9680265.
3. Li H, Sun J, Yang H, Han X, Luo X, Liao L, Yang B, Zhu T, Huo F, Guo W, Tian W.
Recruited CD68+CD206+ macrophages orchestrate graft immune tolerance to prompt xenogeneic-dentin matrix-
based tooth root regeneration. Bioact Mater. 2020 Oct 14;6(4):1051-1072. doi: 10.1016/j.bioactmat.2020.09.029.
PMID: 33102946; PMCID: PMC7567936.
4. Bi R, Lyu P, Song Y, Li P, Song D, Cui C, Fan Y. Function of Dental Follicle
Progenitor/Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine: From Mechanisms to Applications.
Biomolecules. 2021 Jul 7;11(7):997. doi: 10.3390/biom11070997. PMID: 34356621; PMCID: PMC8301812.