Biocel Curs + LP

Mircea Leabu i Marina T.
Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate
2.1. Consideraii generale asupra membranelor

biologice (biomembranelor)
2.1.1. Definiia noiunii de membran celular
Pentru ca o celul s supravieuiasc i s-i desfoare eficient activitatea
trebuie s îi asigure o independen relativ fa de mediul înconjurtor. Asta
înseamn c trebuie atât s-i protejeze structurile i echilibrele moleculare interne,
cât s i fie capabil s recepteze informaii despre ce se întâmpl în jurul su, s le
interpreteze i s îi adapteze corespunztor comportamentul. Pentru rezolvarea
acestor nevoi ale celulei trebuie s existe o component în organizarea celulei care s
delimiteze i s protejeze celula de variaiile necontrolabile din mediu. Aceast
component, acceptat intuitiv de mult vreme, a fost la început denumit
membran plasmatic. Noiunea îi are originea în lucrrile lui Wilhelm
Friedrich Benedikt Hofmeister (1824 – 1877) care, în 1867, a postulat c fiecare
mas plasmatic este mrginit la suprafaa exterioar de un strat subire mai
translucid, cu indice de refracie a luminii mai mare i cu densitate i tenacitate
crescute. Hofmeister a numit aceast structur de mrginire ca ”strat de piele” al
protoplasmei (Hautschicht). Noiunea de membran plasmatic i caracterul su
semipermeabil au început s fie menionate în manuale numai dup studiile de
osmolaritate ale botanistului, chimistului i farmacistului german Wilhelm
Friedrich Phillip Pfeffer (1845 – 1920), respectiv de permeabilitate ale
botanistului i geneticianului olandez Hugo Marie de Vries (1848 – 1935). O alt
denumire sinonim, sub care poate fi întâlnit ceea ce acum se denumete
membran celular este aceea de plasmalem.
Am putea defini lapidar membrana celular ca acea ultrastructur,
format în principal din lipide polare i proteine, care separ, dar i unete
celula cu mediul. Se va vedea c pe msur ce vom înainta în prezentarea
organizrii moleculare i a funcionrii membranei celulare definiia se va încrca de
semnificaii. Este aici momentul s menionm o convenie: vom numi ultrastructur
în cursul acestui manual orice component supramolecular din structurile vii, în
acest context din celule, care nu poate fi observat la microscopul optic (a crui
putere de rezoluie este de 0,2Pm), ci doar la microscopul electronic. Aadar,
convenional, în contextul biologiei celulare, numim ultrastructur orice element de
organizare a celulelor, esuturilor sau organelor care nu se poate observa decât la
microscopul electronic, iar structur ceea ce se poate observa la microscopul optic.
Membrana celular i, în general, biomembranele, unde includem i
endomembranele, au o grosime de 7-10nm (0,007-0,01Pm), adic sunt de ~20 de ori
mai subiri decât o structur observabil la microscopul optic.
O scurt incursiune în istoria evoluiei cunotinelor despre organizarea
molecular a membranei celulare poate fi util formrii gândirii tiinifice a tinerilor
interesai s se îndrepte ctre cercetarea biomedical.
2.1.2. Repere istorice în cunoaterea organizrii membranei

celulare
Prezena unei ultrastructuri care s înveleasc celula, pentru a o separa de
mediu i a menine homeostazia intern, a fost intuit, aa cum am amintit mai sus,
dinainte de a se cunoate din ce este format la nivel biochimic i cum este
organizat pentru a îndeplini funciile de baz: separarea mediului intracelular de cel
extracelular i permiterea interaciunilor celulei cu mediul, fr de care nu ar fi
posibil supravieuirea. Aceast intuire a reprezentat totodat o provocare pentru
oamenii de tiin din domeniu. Dup studiile de pionierat menionate mai sus,
primul care a contribuit la obinerea unor informaii utile în dezvoltarea
13
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate
cunotinelor despre natura (bio)chimic a membranei celulare a fost Charles

Ernest Overton, care în 1899 [1] a raportat o serie de rezultate ce au artat c
permeabilitatea prin membran a unor compui chimici este cu atât mai ridicat cu
cât solubilitatea lor în lipide este mai ridicat. Aceste rezultate au dus la ideea c
lipidele sunt componente majore ale membranelor celulare. Experimentele au fost
efectuate atât pe celule vegetale, cât i pe eritrocite, dovedindu-se c lipidele
structureaz membranele celulare indiferent de regnul crora acestea aparin.
Acestei informaii i s-au adugat rezultatele studierii tipurilor de molecule din
diverse organisme, care au dovedit c lipidele sunt de departe cele mai abundente
molecule hidrofobe din sistemele celulare. Investigaiile asupra proprietilor fizice
ale membranelor celulare au artat c rezistena lor electric sau capacitana sunt în
domeniile celor obinute în sisteme create prin folosirea lipidelor izolate.
Evidenierea de ctre Irving Langmuir1 a faptului c lipidele amfifile întinse
într-un film pe o suprafa apoas se orienteaz cu capul polar ctre ap i cu prile
hidrofobe ctre aer, a reprezentat premiza unor experimente care au dus la
aprofundarea cunoaterii modului de organizare a membranelor celulare. Aceasta
pentru c, în 1925, medicul olandez Evert Görter (1881 – 1954) i asistentul su
Frank Grendel, folosind tehnica lui Langmuir au descoperit c lipidele extrase din
membrana eritrocitar acoper o suprafa dubl de monofilm, fa de suprafaa
populaiei eritrocitare din care lipidele au fost extrase [2]. Ei au propus c lipidele
sunt organizate în membranele celulare sub forma unui bistrat i pot fi considerai
prinii actualului model de organizare a membranei celulare, pe care îl vom dezvolta
i analiza detaliat ceva mai jos.
Urmtorul moment în înelegerea organizrii moleculare a membranei
celulare a fost în 1935, când James Frederic Danielli (1911 – 1984) i Hugh
Davson (1909 – 1996), ambii de la University College din Londra au stipulat c la
nivelul membranelor trebuie s existe i proteine întrucât tensiunile superficiale de la
suprafaa unui bistrat lipidic sunt mult mai ridicate decât cele de la suprafaa
membranelor celulare. Adugarea de proteine în mediul de formare a unui bistrat
lipidic duce la scderea tensiunilor superficiale. Pe baza acestor rezultate
experimentale Danielli i Davson au propus modelul „sandwich” de organizare a
membranei celulare conform cruia aceasta este format dintr-un bistrat lipidic
plasat între dou straturi de proteine globulare.
Modelul Danielli-Davson a prut s fie confirmat de aspectul trilaminat
evideniat electrono-microscopic pentru membranele celulare (Fig. 2.1). Examinarea
electrono-microscopic a membranelor într-o diversitate de celule i observaia c
toate arat la fel, l-a determinat pe J. David Robertson (1923 – 1995) s lanseze,
în 1957, modelul „unit membrane”. Toate membranele se evideniau ca dou
straturi (lamine) electrono-opace ce delimitau unul electrono-transparent. Modelul
meninea ideea c membranele sunt alctuite dintr-un bistrat lipidic plasat între
dou straturi proteice, iar observarea atent sugera c proteinele din exterior sunt
diferite de cele din interior [3].
Anii ’60 – ’70 ai secolului XX au reprezentat perioada unor dezvoltri care au
dus în 1972 la elaborarea de ctre Seymour Jonathan Singer (n. 1924) i Garth
L. Nicolson (n. 1943) a modelului în mozaic fluid de organizare a membranei
celulare [4], model valabil i pentru endomembrane, adic pentru toate tipurile de
biomembrane. Articolul care a introdus denumirea modelului a fost anticipat de o
lucrare a celor doi, din noiembrie 1971, în care au definit principiile organizrii
moleculare a membranei celulare [5]. În conformitate cu acest model, formaiunea
1 Irving Langmuir, chimist i fizician (1881 – 1957), a primit în 1932 Premiul Nobel în chimie pentru lucrrile sale
în chimia suprafeelor, aa cum a motivat juriul ("for his discoveries and investigations in surface chemistry").
14
de baz a unei membrane este un bistrat lipidic cu proprieti fluide manifestate

bidimensional, mozaicat cu proteine care fie sunt ataate de o parte sau de cealalt a
bistratului, fie sunt cufundate în acesta strbtându-l complet sau parial.
Fig. 2.1. Biomembranele (membranele celulare i endomembranele) se evideniaz în imaginile

de microscopie electronic de transmisie ca ultrastructuri cu aspect trilaminat. Punctele negre
de pe suprafaa celulei reprezint markeri electronodeni (aur coloidal cu diametrul de 5nm) pregtii
pentru evidenierea componentei glucidice a membranei. © Mircea Leabu, 2014.
Fig. 2.2. Imagine de microscopie electronic de transmisie pentru un preparat obinut prin
tehnica de îngheare-fracturare. În jumtatea dreapt a imaginii, unde fractura a trecut printre foiele
bistratului lipidic al unei membrane celulare, se observ abundena de particule proteice care
reprezint proteine ce strbat complet structura lipidic de baz. (Imagine pus cu amabilitate la
dispoziie de Dr. Florea Lupu, University of Oklahoma Health Sciences Center.) © Florea Lupu, 2014.
15
Fig. 2.3. O reprezentare la nivel molecular a organizrii biomembranelor sub forma mozaicului
fluid. Desenul sugereaz diversitatea de componente (diferite lipide, variate proteine – în verde,
multiple structuri glucidice – hexagoane albastre) care argumenteaz eterogenitatea organizrii, ca i
distribuia asimetric a biomoleculelor la nivelul ultrastructurii. © Mircea Leabu, 2014.
Membranele, organizate în mozaic fluid (Fig. 2.3), se caracterizeaz prin

eterogenitate compoziional (bazat pe o mare diversitate de tipuri de molecule ce
intr în alctuirea lor) i prin aranjare asimetric (ce este conferit chiar de
elementul de baz, bistratul lipidic, la nivelul cruia foia extern conine
preponderent anumite tipuri de lipide, iar foia intern altele). Asimetria este sporit
de proteinele ce completeaz organizarea membranelor, cele adsorbite pe faa
extern fiind diferite de cele prezente pe faa intern, în timp ce proteinele cufundate
în structura lipidic de baz expun poriuni diferite ale lanului polipeptidic de o
parte sau de cealalt a bistratului. Pe de alt parte, componenta glucidic a
membranelor se gsete numai la suprafaa acestora, crescând caracterul asimetric al
organizrii lor. În sfârit, diversitatea de molecule care organizeaz membranele
prezint o permanent dinamicitate, ceea ce le confer un comportament fluid. Mai
mult, micarea componentelor lipidice sau proteice se realizeaz aproape în
exclusivitate în planul membranei, fr rsturnri spontane ale moleculelor care s
permit trecerea lipidelor dintr-o foi a bistratului în cealalt, sau s permit
proteinelor s treac poriunile expuse la exterior ctre interior, sau invers. Aceast
mobilitate restricionat la micrile în plan determin caracterul fluid manifestat
bidimensional al membranelor. Toate aceste caracteristici, datorate
comportamentului componentelor moleculare ale membranelor, se rsfrâng, într-un
mod fericit, asupra funcionalitii lor, aa cum se va vedea în detaliile de mai jos
asupra organizrii ultrastructurii care separ, dar i unete celula cu mediul
înconjurtor.
16
În ceea ce urmeaz ne propunem s abordm organizarea molecular i

funcionarea membranei celulare parcurgând drumul de la molecule la o structur
funcional.
2.1.3. Compoziia chimic global a membranei celulare

Pentru o abordare logic i angajarea în drumul pe care ni l-am propus, putem
pleca de la ceea ce conine sub aspect chimic membrana celular. În compoziia
membranelor se afl ap într-un procent de 20-30, restul de 70-80% fiind reziduu
uscat. Cât privete compoziia acestui reziduu uscat, substanele minerale sunt slab
reprezentate (pân la 1%), restul de 99% fiind substane organice, adic lipide 40-
50%, proteine 50-60% i o component glucidic de pân la 10%2.
Compoziia chimic global mai sus menionat poate prea contradictorie
cunotinelor noastre despre cantitatea de ap din sistemele biologice. Este corect, în
sistemele biologice apa reprezint aproximativ 70-80%, iar substana uscat numai
20-30%. Care este logica acestei situaii rsturnate? O putem înelege plecând de la
însi definiia membranei celulare: ultrastructura care separ, dar i unete celula
cu mediul.
S dezvoltm raionamentul. Ce caracter fizico-chimic are interiorul celular?
Unul hidrofil. Apa este solventul biologic fr de care reaciile biochimice care stau la
baza proceselor celulare nu s-ar putea desfura. Dar ce proprieti fizico-chimice are
mediul extracelular? Tot hidrofile. Aadar, membrana celular trebuie s separe
dou medii hidrofile. Este de ateptat, în conformitate cu legile fizicii, ca o barier
eficient între dou medii hidrofile s aib caracter hidrofob. Aa stând lucrurile,
aceast ultrastructur cu caracter hidrofob trebuie s exclud masiv apa, de unde
procentul redus de ap aflat la nivelul structurii membranelor. Aadar, soluia
optim s-a dovedit a fi o ultrastructur bazat pe lipide. Care sunt modalitile de
aranjare i rolurile lipidelor, proteinelor i componentei glucidice din organizarea
molecular a membranelor vom dezvolta în cele ce urmeaz, abordând pe rând
aceste componente i având în minte, în permanen, modelul mozaicului fluid de
organizare a ultrastructurii denumit membran celular.
Ceea ce mai putem meniona aici este faptul c aa cum se sugera din definiia
noiunii de membran celular aceasta trebuie s se comporte ca o barier între
mediile extracelular, respectiv intracelular, îns aceast barier nu trebuie s fie una
absolut ci selectiv, adic s permit interaciunea celulei cu mediul. De aceea,
putem afirma c membrana celular trebuie s îndeplineasc dou mari categorii de
funcii: (i) funcie de barier (adic s nu permit trecerea întâmpltoare prin ea)
i (ii) funcie metabolic (adic s asigure celulei schimburi de informaie i de
substan cu mediul, în ambele sensuri: dinspre exterior spre interior i dinspre
interior spre exterior).
Bibliografie selectiv
1. Overton E. (1899) Über die allgemeinen osmotischen Eigenschaften der Zelle, ihre vermutlichen
Ursachen und ihre Bedeutung für die Physiologie. Vierteljahrsschr. Naturforsch. Ges Zürich 44: 88–
114.
2. Gortel E, Grendel F. (1925) On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood. J Exp
Med. 41, 439–443.
3. Robertson JD. (1957) New observations on the ultrastructure of the membranes of frog peripheral
nerve fibers. J Biophys Biochem Cytol. 3: 1043-8.
4. Singer SJ, Nicolson GL. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science.
175: 720-31.
2 Repartizarea procentelor între substanele organice se raporteaz la totalul acestora; adic totalul lipide +
proteine + glucide = 100%. Atragem atenia cititorilor c în toate situaiile în care se opereaz cu procente,
acestea trebuie corect raportate la baza de referin.
17
5. Singer SJ, Nicolson GL. (1971) The structure and chemistry of mammalian cell membranes. Am J
Pathol. 65: 427-37.
6. Steck TL, Weinstein RS, Straus JH, Wallach DF. (1970) Inside-out red cell membrane vesicles:
preparation and purification. Science. 168: 255-7.
7. Steck TL. (1972) Selective solubilization of red blood cell membrane proteins with guanidine
hydrochloride. Biochim Biophys Acta. 255: 553-6.
8. Steck TL. (1974) The organization of proteins in the human red blood cell membrane. A review. J Cell
Biol. 62: 1-19.
9. Marchesi SL, Steers E, Marchesi VT, Tillack TW. (1970) Physical and chemical properties of a
protein isolated from red cell membranes. Biochemistry. 9: 50-7.
10. Tillack TW, Marchesi SL, Marchesi VT, Steers E Jr. (1970) A comparative study of spectrin: a
protein isolated from red blood cell membranes. Biochim Biophys Acta. 200: 125-31.
11. Tillack TW, Marchesi VT. (1970) Demonstration of the outer surface of freeze-etched red blood cell
membranes. J Cell Biol. 45: 649-53.
12. Segrest JP, Jackson RL, Andrews EP, Marchesi VT. (1971) Human erythrocyte membrane
glycoprotein: a re-evaluation of the molecular weight as determined by SDS polyacrylamide gel
electrophoresis. Biochem Biophys Res Commun. 44: 390-5.
13. Nicolson GL, Marchesi VT, Singer SJ. (1971) The localization of spectrin on the inner surface of
human red blood cell membranes by ferritin-conjugated antibodies. J Cell Biol. 51: 265-72.
14. Marchesi VT, Tillack TW, Jackson RL, Segrest JP, Scott RE. (1972) Chemical characterization
and surface orientation of the major glycoprotein of the human erythrocyte membrane. Proc Natl Acad
Sci U S A. 69: 1445-9.
15. Tillack TW, Scott RE, Marchesi VT. (1972) The structure of erythrocyte membranes studied by
freeze-etching. II. Localization of receptors for phytohemagglutinin and influenza virus to the
intramembranous particles. J Exp Med. 135: 1209-27.
16. Segrest JP, Kahane I, Jackson RL, Marchesi VT. (1973) Major glycoprotein of the human
erythrocyte membrane: evidence for an amphipathic molecular structure. Arch Biochem Biophys. 155:
167-83.
18
2.2. Lipidele membranare

2.2.1. Aspecte generale
Lipidele reprezint 40-50% din materialul organic al membranelor. Sub
aspect molecular ele constituie componenta biochimic de baz a membranelor
celulare (raportul molecular lipide/proteine fiind de ~50/1).
Aa cum stipuleaz modelul în mozaic fluid al organizrii
membranelor, lipidele sunt organizate în membrane sub form de bistrat, cu
capetele hidrofile la exterior i cozile hidrofobe în interior, bistrat care prezint
proprieti fluide, manifestate bidimensional. În bistrat lipidele au o distribuie
(dispunere) asimetric i sunt de o mare eterogenitate. Aadar, membranele celulare
au la baza organizrii lor un bistrat lipidic cu comportament fluid manifestat
bidimensional, caracterizat prin asimetrie i eterogenitate.
În cele ce urmeaz vom cuta s argumentm aceste afirmaii de ordin
general, detaliind aspectele legate de eterogenitatea lipidelor ce intr în componena
membranelor, dispunerea lor asimetric în cadrul bistratului i comportamentul lor
fluid, manifestat bidimensional, cu scopul de a înelege cum acestea asigur
funcionarea membranelor. Informaiile se vor nuana i ne vor ajuta s înelegem
mai bine cum opereaz membranele celulare, prin abordarea ulterioar a aspectelor
legate de proteinele membranare ca i prin discutarea componentei glucidice a
membranelor. De punctat c tot ce vom prezenta aici, în principiu, pentru
organizarea i funcionalitatea membranei celulare se aplic i membranelor din
interiorul celulelor, aa-numitele endomembrane, cele care structureaz organitele
delimitate de membrane.
2.2.2. Definiia lipidelor membranare

În problema definirii lipidelor membranare, nu ne propunem un enun cu
valabilitate absolut. Intenia este de a formula o definiie operaional, pentru
interesul nostru, astfel încât s avem aceeai percepie a noiunii. Vom structura
aceast definiie dup modelul logic al definirii prin gen proxim i diferen(e)
specific(e)3.
3 Logica, tiina care ne înva cum s gândim corect pe baza unor structurri raionale ale cunotinelor,
stabilete patru modaliti de construcie a definiiilor pentru noiuni (fiine, obiecte, fenomene). Aceste patru
modaliti conduc la patru tipuri de definiii care sunt: (i) definiiile genetice (constructive) prin care se
indic modul în care a luat fiin noiunea; (ii) definiiile ostensive (demonstrative sau prin indicare) prin
care se enumer câiva dintre membrii (preferabil reprezentativi) clasei din care face parte noiunea de definit;
(iii) definiiile enumerative prin care se enumer toi membrii clasei; (iv) definiiile prin gen proxim i
diferen(e) specific(e) prin care, mai întâi se stabilete o categorie mai larg de noiuni creia îi aparine i
cea pe care dorim s o definim (genul proxim), dup care se identific i se enumer atâtea caracteristici, specifice
noiunii pe care urmrim s o definim, câte sunt necesare pentru o extragere fr ambiguiti din genul proxim i
pentru definirea clar.
Pentru extinderea demersului intelectual al acestei note de subsol, s exemplificm cu definiii pentru fiecare tip
din cele patru.
În privina definiiilor genetice am putea propune una pentru ce este România i vom spune: România este o ar
european format printr-un proces îndelungat de unire a unor ri medievale mici, mai întâi a Moldovei cu ara
Româneasc, în a doua jumtate a secolului al XIX-lea, proces finalizat prin adugarea Ardealului i Basarabiei la
sfâritul primului rzboi mondial.
Ca exemplu de definiie ostensiv s încercm aplicarea la Oceania, spunând: Oceania este o regiune de insule din
Oceanul Pacific între care se afl Papua Noua Guinee, Insulele Marshall, Samoa, Noua Zeeland.
Definiia enumerativ o putem exemplifica pentru rile scandinave i vom putea spune: rile scandinave sunt
Norvegia, Suedia, Finlanda i Danemarca.
Nu vom da exemplu de definiie prin gen proxim i diferen(e) specific(e), deoarece folosim metoda în text la
definirea lipidelor membranare, dar vom remarca faptul c toate celelalte tipuri de definiii se adreseaz, de
regul, unor iniiai (în istorie sau geografie pentru exemplele folosite), pe când tipul de definiie ce face subiectul
acestei fraze este unul instructiv, care poate ajuta înelegerea i unora mai puin sau deloc iniiai. Definiia cu gen
proxim i diferene specifice este cel mai des utilizat în tiine, dac nu în exclusivitate. Prin acest tip de definiie
se pot defini chiar i obinuinele, despre care tot tiina logicii ne spune c sunt greu de definit. Condiia este ca
cel care definete s cunoasc foarte bine ceea ce trebuie s defineasc. Pentru cei care sunt instruii, acest tip de
19
Lipidele membranare reprezint o categorie larg de substane organice

relativ insolubile în ap, solubile în cei mai muli solveni organici, cu caracter
amfifil, multe dintre ele fiind esteri ai unor alcooli polihidroxilici cu acizi grai (acizi
carboxilici cu lan alifatic liniar, adic o caten liniar coninând mai muli atomi de
carbon).
Se observ c, din punct de vedere al structurii chimice, definiia este foarte
cuprinztoare sub aspectul speciilor moleculare pe care le poate include. S nu
uitm, îns, c interesul nostru este de natur biologic, aa c, privind din aceast
perspectiv, mai multe întrebri pot frmânta dorina de a ptrunde logic domeniul.
Care ar fi acestea?
1. De ce lipide (în elementul de baz al organizrii biomembranelor care este
bistratul lipidic)?
2. Care dintre lipide (particip la organizarea membranelor)?
3. De ce (dispunere în) bistrat?
S lum pe rând aceste întrebri i s punctm aspecte care s ne ajute în a
gsi rspunsuri, cu rsfrângere asupra înelegerii funcionalitii membranelor.
2.2.3. Descrierea lipidelor membranare i caracterizarea

bistratului lipidic
2.2.3.1. Lipidele sunt componente ideale pentru structurarea
membranelor
Aceast seciune îi propune s rspund la prima întrebare din cele de mai
sus: de ce lipide? Caracterele fizico-chimice ale lipidelor le definesc drept molecule
ideale pentru structurarea de membrane, a cror principal menire este aceea de a
separa dou compartimente apoase (interiorul celulelor de mediul înconjurtor). De
ce le definesc drept molecule ideale? Pentru c structura chimic i caracterul lor
amfifil induce proprieti amfipate arhitecturii pe care o organizeaz, partea
hidrofob putând crea o barier, iar partea hidrofil conferind capacitatea de a
acomoda mediile apoase aflate de o parte i de cealalt, adic interiorul, respectiv
exteriorul celulei.
Lipidele sunt molecule mici cu posibiliti mari de mobilitate, astfel încât
structurile pe care le pot asambla nu sunt rigide (acest lucru reprezentând un avantaj
pentru biomembrane). Sunt molecule relativ insolubile în medii apoase, prezentând
tendin de asociere spontan, ceea ce confer structurilor pe care le formeaz
tenacitatea de a-i pstra integritatea sau de a se reface rapid, atunci când sunt
agresate mecanic. Tendina spontan de asociere implic un consum energetic
minim în pstrarea integritii bistratului, ceea ce reprezint un avantaj în economia
celular. Dei sunt molecule mici, structura lor este deosebit de complex (chiar
numai rememorând definiia, dar i, cum se va vedea în cele ce urmeaz, când vom
rspunde întrebrii “Care dintre lipide?”). Vom vedea c aceast complexitate
chimic este exploatat judicios de celul (vezi la seciunea despre rolul lipidelor
membranare). Dac ar fi s punctm, pentru început, avantajele ce rezult în privina
structurrii membranelor, notm c defectele, ce ar putea aprea în structura
chimic a lipidelor membranare sau în organizarea bistratului, sunt uor de acceptat
i, ulterior, de corectat, fr a induce efecte biologice catastrofale (caracterul amfifil
nu se pierde). Mai mult, modelarea structural a lipidelor, dup cum va reiei mai jos
(vezi la seciunea despre rolul lipidelor membranare), care se face printr-un bagaj
enzimatic adecvat, consistent i bine elaborat, folosete integrrii celulei în contextul
biologic în care se afl i funcioneaz.
definiie este elocvent din punct de vedere formator, deoarece creeaz o imagine sugestiv pentru obiectul,
noiunea sau fenomenul care se definete.
20
2.2.3.2. Clasificarea lipidelor membranare

Prin ceea ce vom include în rspunsul la întrebarea: “care dintre lipide?” vom
argumenta caracterul eterogen al organizrii moleculare a membranelor celulare.
Biochimia descrie o mare diversitate de clase de lipide, grupate în dou mari
categorii: lipide complexe, caracterizate prin prezena în structura lor a acizilor grai
(acilgliceroli, fosfogliceride, sfingolipide, ceruri) i lipide simple (steroizi,
prostaglandine i terpene). Ne putem întreba, pe bun dreptate, dac toate aceste
clase de lipide pot fi întâlnite în structura membranelor celulare. Ei bine, rspunsul
este: NU! În membranele celulare întâlnim numai trei tipuri de lipide pe care le
putem clasifica, în funcie de structura lor chimic global, în: (1) fosfolipide, (2)
colesterol i (3) glicolipide.
Enumerarea este în funcie de abundena în care apar. Fosfolipidele reprezint
70-75% dintre lipidele membrane, colesterolul 20-25%, iar glicolipidele 1-10%. O
meniune de fcut, în legtur cu glicolipidele din membranele celulelor animale,
este aceea c ele sunt din clasa sfingolipidelor (vezi despre sfingolipide mai jos, la
clasificarea în funcie de poliolul din structur). Iat, în aceast prim clasificare a
lipidelor membranare, o prim dovad a eterogenitii lipidelor membranare.
Ideea de eterogenitate a lipidelor membranare sporete, îns, dac ne-am
propune s abordm chiar i numai complexitatea tipurilor de lipide din clasa
fosfolipidelor, cele mai bine reprezentate lipide din membranele celulare, sub
aspectul abundenei. Acestea se pot clasifica, în funcie de poliolul din structur în:
(i) fosfogliceride (glicerofosfatide) – dac poliolul este glicerin (un
triol);
(ii) fosfosfingozide (sfingofosfatide, sau simplu sfingozide) – dac
poliolul este sfingozin, de fapt un aminodiol cu un lan alifatic (acesta
constituie unul din lanurile alifatice ale cozii hidrofobe, cel de al doilea
fiind un acid gras inserat printr-o legtur amidic la gruparea amino a
sfingozinei).
Dar eterogenitatea fosfolipidelor membranare nu se termin aici. Ea se
nuaneaz prin analiza detaliilor referitoare la structura lor chimic. În cele ce
urmeaz, vom discuta despre eterogenitatea structural a fosfogliceridelor, dar
menionm c unele aspecte se extind i asupra sfingozidelor.
Structura de principiu a unui fosfoglicerid este reprezentat grafic, în mod
intuitiv, în Fig. 2.4. Se observ c pe scheletul polialcoolului (glicerina) se afl grefate
pe de o parte (la hidroxilii din poziiile 1 i 2) dou lanuri alifatice provenind de la
acizii grai esterificai cu gruprile hidroxil (acestea formând coada hidrofob a
lipidului membranar), iar, pe de alt parte (la hidroxilul din poziia 3), o molecul,
notat simbolic cu X (variabil), ataat prin intermediul unei grupri fosfat,
împreun formând partea esenial a capului hidrofil al fosfolipidului.
În funcie de compusul hidrofil, variabil X, fosfogliceridele se împart în:
(i) fosfatidilcoline (prescurtare internaional PC, denumire uzual
lecitin), când X este colin (Fig. 2.5);
(ii) fosfatidiletanolamine (PE), X fiind etanolamin;
(iii) fosfatidilserine (PS), la care X este serin;
(iv) fosfatidilinozitoli (PI), în care X este inozitol;
(v) acid fosfatidic (PA), cu X-ul fiind, simplu, un atom de hidrogen.
Fosfolipidele enumerate mai sus se afl în diferite proporii în membranele
diverselor celule, dei exist date care le clasific în anumite intervale de abunden,
cum se va meniona puin mai jos. Celula controleaz aceste rapoarte între cantitatea
de diferite fosfolipide în membrane în funcie de nevoile ei, în diferitele situaii
concrete în care se poate afla.
21
Fig. 2.4. Structura schematic, de principiu, a unui fosfoglicerid. În

verde este reprezentat miezul glicerolului; în cafeniu sunt reprezentate
lanurile alifatice ale acizilor grai; cu X, în albastru, este reprezentat
partea variabil din capul hidrofil.
Echivalentul fosfatidilcolinelor pentru sfingofosfolipidele membranare sunt

sfingomielinele (SM). De amintit aici (pentru sporirea ideii de eterogenitate a
fosfolipidelor membranare) i dou tipuri de fosfolipide ”neuzuale”: 1) fosfolipidele
în care dou molecule de acid fosfatidic sunt condensate la hidroxilii laterali ai unei a
treia molecule de glicerin, formând cardiolipine (1,3-difosfatidil-gliceroli),
fosfolipide specifice membranei mitocondriale interne; 2) fosfolipidele echivalente
fosfatidilcolinelor sau fosfatidiletanolaminelor, care în poziia 1 a glicerinei au
eterificat un alcool gras nesaturat cu dubla legatur între C1 i C2, numite
plasmalogene i reprezentând ~10% dintre fosfolipide în creier, muchi, testicul,
rinichi. De remarcat c în muchiul cardiac nivelul plasmalogenelor ajunge la 50%,
speculându-se c ar putea proteja miocardul fa de efectul speciilor reactive de
oxigen de tipul oxigenului singlet.
Cât privete abundena sub care tipurile de fosfolipide apar în organizarea
bistratului, PC, SM, PE i PS sunt majoritare, reprezentând fiecare, în medie, dac ar
fi s calculm considerând toate membranele despre care
avem date, între 20 i 25%. PI i PA sunt fosfolipide mai
slab reprezentate, însemnând pân la 10-15% primul,
respectiv 1-2% cel de-al doilea; în ciuda acestui fapt (sau
poate tocmai de aceea) aceste dou fosfolipide sunt
implicate în procese celulare deosebit de importante (vezi
la rolul lipidelor membranare). Dincolo de aceste valori
medii, mai uor de reinut, abundena fiecrui tip de
fosfolipid în diversele biomembrane variaz, îns, în limite
destul de largi [1].
Fig. 2.5. Structura unei fosfatidilcoline (1-stearil-2-oleil-fosfatidil-

colin). Lecitina, denumirea uzual a acestui fosfoglicerid, vine de la
cuvântul (lekithos), care în limba greac înseamn glbenu
de ou, întrucât acesta are un coninut foarte bogat în lecitin.
22
Fig. 2.6. Lipidele membranare în foiele bistratului. Este evideniat diversitatea i distribuia
difereniat între cele dou foie ale bistratului, inducând membranelor caracterul eterogen i
asimetric.4 Aceast reprezentare simbolic a bistratului lipidic i tipurilor de lipide membranare va fi
utilizat în figurile din carte ori de câte ori este nevoie. © Mircea Leabu, 2014.
Dup prime argumente referitoare la eterogenitatea lipidelor membranare,

aduse pân în acest moment, ne aflm acum în situaia de a putea puncta aspecte
legate de dispunerea asimetric a fosfolipidelor în biomembrane (Fig. 2.6).
Experimental s-a dovedit c PC i SM sunt preponderent distribuite în foia extern a
bistratului, în timp ce PE este preponderent distribuit în foia intern, iar PS i PI
sunt, dup datele existente pân în prezent, aproape exclusiv în foia intern, în
condiii normale [2]. Mai mult, apariia PS în foia extern a bistratului reprezint o
dovad timpurie a intrrii celulei într-un proces apoptotic [3-5]. De asemenea,
activarea plachetelor sanguine este însoit de apariia PS în foia extern a
bistratului lipidic membranar [6]. Colesterolul este, în general, egal distribuit între
ambele foie ale bistratului, dei anumite situaii pot determina o redistribuire
asimetric a sa. Glicolipidele se afl numai în foia extern a bistratului lipidic. De
curând, distribuia asimetric a fosfolipidelor bistratului lipidic membranar a început
s fie investigat în contextul anumitor patologii [7, 8], afectarea ei fiind însoit de
defecte în funcionarea normal a celulelor.
Ideea eterogenitii fosfolipidelor membranare este argumentat i de
diversitatea tipurilor de acizi grai care intr în structura lor. Acetia au un numr
par de atomi de carbon cuprins între 12 i 24 (C12-C24), dei limitele valorilor
menionate sunt controversate, în sensul c ar fi prea largi pentru cea inferioar i c
ar fi mai precaut s considerm cifra 14 ca adevrat. La acizii grai cu mai puin de
12 atomi de carbon, solubilitatea în ap a lipidelor pe care acetia le formeaz crete
prea mult, ceea ce poate afecta integritatea bistratului i rolul de barier al acestuia.
Acizii grai cu mai mult de 24 de atomi de carbon în molecul sporesc prea mult
hidrofobicitatea lipidelor i îngroa bistratul reducând eficiena sub aspectul
proprietilor de permeabilitate selectiv i îi reduc fluiditatea, prin creterea
interaciunilor la nivelul cozilor hidrofobe. Aadar, din motive de eficien în
funcionarea membranelor acizii grai evideniai a structura lipidele membranare
conin între 12(14) i 24 de atomi de carbon. Ei pot fi acizi grai saturai sau
4 Exist între profesionitii domeniului o convenie ca atunci când în desene, scheme sau imagini de microscopie
electronic se prezint poriuni din membranele celulare spaiul extracelular s se aeze sus (ctre nord), iar
citosolul jos (ctre sud). Vom respecta în carte aceast convenie.
23
nesaturai, cu catena hidrocarbonat neramificat. În ceea ce privete poziionarea

acizilor grai în structura glicerofosfatidelor putem face urmtoarele afirmaii:
1. În poziia 1 a glicerinei, de regul, se afl esterificat un acid gras saturat. Cei
mai des întâlnii sunt (i) C14, acidul miristic, (ii) C16, acidul palmitic i (iii)
C18, acidul stearic. O ordine a frecvenei sub care apar ar fi: C16 > C18 > C14.
2. În poziia 2 a glicerinei, de regul, este esterificat un acid gras nesaturat. Cei
mai des întâlnii sunt (i) C18:1,5 acidul oleic, (ii) C18:2, acidul linoleic i (iii)
C18:3, acidul linolenic. Trebuie s amintim aici, pentru rolul su deosebit de
important (vezi “Rolul lipidelor membranare”), acidul arahidonic sau
acidul eicosatetraenoic (C20:4).
De menionat, în încheierea acestui comentariu, c acizii grai din sfingolipide
sunt, de regul, saturai.
Înainte de a trece la aspecte mai detaliate asupra organizrii lipidelor la
nivelul membranelor i cum aceasta se rsfrânge asupra comportamentului
bistratului lipidic i funcionalitii sale, merit de punctat, pentru o ultim
argumentare a amplei eterogeniti a lipidelor membranare, faptul c, luând în
considerare cele dou poziii de esterificare i doar cei 20 de acizi grai mai des
întâlnii, numrul diverselor entiti moleculare din fiecare tip de fosfolipid (PC, PE,
PS, PI, SM) poate atinge valoarea de 400. Bineîneles c aceste valori teoretice nu se
regsesc în realitate dintr-o multitudine de motive de constrângere specifice
sistemelor biologice.
2.2.3.3. Structura de bistrat rezolv dezideratul esenial al organizrii
membranei
Vom încerca s precizm aici câteva argumente logice pentru a rspunde
întrebrii „De ce bistrat?”. Bistratul este cea mai simpl form de organizare a
lipidelor care poate închide un volum mare de mediu hidrofil, spre a-l separa de un
altul, tot hidrofil (capetele hidrofile la exterior, putând acomoda cele dou medii
hidrofile; cozile hidrofobe în interior, în adâncimea structurii, conferind rolul de
barier). Aadar, bistratul este o form de organizare a lipidelor amfifile care poate
corespunde dezideratelor celulelor de a fi separate de mediul înconjurtor i de a-i
menine într-o manier eficient homeostazia intern.
Asamblarea în bistrat se poate face spontan, fiind deci favorizat energetic, iar
bistratul nu poate prezenta, din considerente termodinamice, capete libere. Acest
lucru confer membranelor tenacitate în pstrarea integritii structurale i
capacitate de refacere rapid chiar în cazul unor distrugeri datorate agresiunilor
mecanice.
Organizarea sub form de bistrat i dispunerea asimetric a componentelor
acestuia confer proprieti fizico-chimice diferite celor dou fee ale membranei;
mai mult, asigur comportament independent celor dou fee ale membranei, dar i
solidar, atunci când nevoile celulei o cer, aceasta având cile de a controla
comportamentul (independent sau solidar) al componentelor membranare.
2.2.3.4. Starea fizic a bistratului lipidic
Discuia asupra strii fizice a bistratului lipidic îi propune s ne dea o
imagine intuitiv privind efectele comportamentului bistratului asupra funcionrii
5 În simbolistica notrilor abreviate ale acizilor grai, prima cifr din indicele inferior reprezint numrul de
atomi de carbon din molecul, „:” reprezint simbolul pentru prezena dublelor legturi, iar cifra a doua
reprezint numrul de duble legturi din molecul. În biochimie notaiile pot fi mult mai detaliate pentru
indicarea suplimentar a poziiei dublelor legturi în lanul alifatic, îns, în economia discuiei noastre i în
înelegerea implicaiilor biologice, aceste detalii nu sunt semnificative. Totui, variabilitatea poziionrii dublelor
legturi în acizii grai nesaturai reprezint un argument suplimentar al eterogenitii lipidelor membranare (în
special pentru fosfolipide).
24
membranelor. Bistratul lipidic este fluid, adic într-o continu dinamic, aceasta
având efect asupra interrelaiilor dintre moleculele care îl compun, interrelaii care
sunt într-o permanent modificare. Fluiditatea bistratului lipidic este o rezultant a
diverselor posibiliti de micare a lipidelor ce îl alctuiesc. În ce const aceast
diversitate? Lipidele membranare pot executa urmtoarele tipuri de micri:
1. Micri intramoleculare, pe care lipidele le realizeaz în raport cu propria
lor structur (în raport cu propria lor ax, în raport cu propria lor geometrie), spaiul
ocupat de ele putând fi aproximat cu un cilindru având o baz cu suprafaa de ~60 Å2
(raz de ~4.4 Å) i o înlime de ~30 Å. Aceste micri intramoleculare pot fi:
x De rotaie, cu o frecven de 109 rotaii/s; aceste micri izvorsc din
capacitatea lanurilor acizilor grai de a se roti în jurul legturilor C-C, însoit
de vibraia atomilor de carbon angajai în legtur, iar aceste micri se
rsfrâng asupra comportamentului întregii molecule, prin cuplurile de fore pe
care le induc; rezultanta acestui „zbucium” intern molecular este micarea de
rotaie a moleculei lipidice în ansamblu.
x De flexie a cozilor hidrofobe, cu o frecven de 108 flexii/s; aceste micri
trebuie înelese tot ca rezultat al micrilor din interiorul moleculelor de lipid,
la nivelul cozilor hidrofobe ale acizilor grai nesaturai, care, din cauza
împiedicrilor datorate prezenei celuilalt acid gras din structur, nu pot
executa, de regul, decât micri asemntoare tergtorului de parbriz, dei
mobilitatea celuilalt lan, saturat, poate permite chiar rotaii complete; efectul
la nivelul întregii molecule este acela al micrii de flexie a cozii.
2. Micri intermoleculare, care implic schimbarea poziiei moleculelor de
lipid unele în raport cu altele. Acestea pot fi:
x Micri de translaie (difuzie lateral), micri ale lipidelor în planul
membranei, în aceeai foi a bistratului, unele printre altele; dinamicitatea
acestei micri este sugerat de frecvena schimbrilor de direcie, care este de
107/s, distana parcurs de un lipid în unitatea de timp neavând o semnificaie
biologic major. Trebuie menionat faptul c prezena colesterolului în
bistrat determin o diminuare a mobilitii laterale.
x Micri “flip-flop”, denumite astfel prin termenul importat din limba
englez, adic micri de trecere a lipidelor dintr-o foi a bistratului în
cealalt; aceste micri presupun o rsturnare a moleculei în planul
membranei, pentru a-i pstra capul hidrofil la exteriorul structurii, adic
trecerea capului hidrofil prin poriunea hidrofob a membranei; frecvena
acestor micri este foarte mic, practic nul (dac ar fi s riscm o cifr, am
putea spune c aceast micare ar putea avea loc o dat pe lun pentru fiecare
molecul individual), ceea ce pare logic; exist totui o endomembran la
nivelul creia micarea de “flip-flop” are loc frecvent i anume membrana
reticulului endoplasmic (aspecte ce vor fi detaliate în capitolul “Biogeneza i
traficul intracelular al membranelor” din volumul al II-lea al crii).
Valorile pentru frecvene, mai sus menionate, sunt rezultatul unor msurtori
fizice pe bistraturi artificiale. În membranele celulare i în biomembrane, în general,
micrile lipidelor nu se supun legilor micrii browniene, ci sunt mai reduse, fiind
limitate de organizarea molecular complex i de ultrastructurile proteice corticale,
aflate în spaiul citosolic de sub membrane [9].
Revenind la tema acestei seciuni, s punctm c absena practic a micrilor
“flip-flop” explic bidimensionalitatea strii fluide a bistratului lipidic, elementul de
baz din organizarea membranelor celulare. Micrile lipidelor se manifest practic
numai în cadrul aceluiai strat al bistratului. De asemenea, frecvena extrem de
redus a micrilor “flip-flop” are ca efect meninerea distribuiei asimetrice a
25
moleculelor de lipide între cele dou straturi, distribuie construit de celul cu mare
consum energetic odat cu biogeneza de novo a membranelor (vezi la “Biogeneza
membranelor” în volumul al II-lea). Manifestarea bidimensional a fluiditii
bistratului lipidic d membranei celulare caracterul de structur cu proprieti
mezomorfe, proprieti specifice cristalelor lichide. Acest comportament mezomorf
este accentuat de capacitatea lipidelor de a organiza microdomenii bogate în
sfingolipide (parte dintre ele glicolipide), colesterol i anumite proteine membranare.
Aceste microdomenii sunt denumite “plute lipidice” (în englezete ”lipid rafts”)
i au deosebit importan atât structural (organizeaz ultrastructuri specializate
ale membranei, cum ar fi caveolele), cât i metabolic inând laolalt molecule i
macromolecule destinate a funciona împreun în complexe supramoleculare [10].
Pentru a înelege mai bine organizarea microdomeniilor de membran, s
menionm c lipidele, aa cum nu sunt echilibrat repartizate între cele dou foie ale
bistratului, nu sunt omogen amestecate nici în cadrul fiecrei foie a bistratului, ci se
asociaz într-un mod neomogen pe baza unor considerente fizico-chimice. Plutele
lipidice fie planare, fie invaginate sub forma caveolelor (numite vezicule
plasmalemale în celula endotelial) se caracterizeaz printr-o fluiditate mai mic în
comparaie cu restul bistratului. Prezena plutelor lipidice i eterogenitatea lor susin
i nuaneaz ideea de organizare a membranelor ca un mozaic fluid. Plutele lipidice
pot fi asemuite unor sloiuri de forme, dimensiuni i compoziie biochimic variate, ce
plutesc în oceanul lipidic mai puin specific organizat. Caveolele reprezint o form
de plute lipidice, ce se dispun individual sau în ciorchini la nivelul membranei.
Eterogenitatea plutelor lipidice a fost evideniat prin interpretarea
rezultatelor diferitelor metode de obinere sau de studiu:
- diveri detergeni neionici utilizai (duc la fraciuni cu compoziie diferit);
- sonicarea preparatelor de membrane i analizarea fraciunii uoare (alte
rezultate);
- analize imunocitochimice (diferite încrcturi proteice la nivelul diverselor
microdomenii reprezentate de plutele lipidice).
Dei rezultatele experimentale sunt, în anumite limite, variate, sugerând
diversitatea compoziional a plutelor lipidice, se pot extrage, totui, câteva
caracteristici generale [10]:
- colesterolul este de 3-5 ori mai abundent decât în restul membranei i reprezint
33-50% din totalul lipidelor la acest nivel;
- sfingolipidele (SM i glicolipidele) sunt îmbogite i reprezint 30-35% dintre
lipidele din plute;
- glicerofosfolipidele sunt srac reprezentate (în comparaie cu restul membranei);
d30% pentru PC + PE, fa de ~50% în restul membranei;
- lipidele specifice foiei interne a bistratului (PS, PI) sunt slab reprezentate la
nivelul plutelor lipidice;
- în foia intern de la nivelul plutelor, lipidele conin preferenial acizi grai
saturai (prin aceasta, s-ar putea realiza necesarul de rigiditate corespunztor
celui al foiei externe, unde sfingolipidele, coninând acizi grai saturai, sunt
bogat reprezentate).
Anticipând, vom meniona aici c plutele lipidice se caracterizeaz i prin
capacitatea de a aglomera anumite tipuri de proteine membranare. Aadar, repetm
pentru reinerea mai atent, organizarea lipidelor membranare în microdomenii
accentueaz aspectul de mozaic fluid al membranelor (ca nite sloiuri plutind în
bistrat). Conceptul de plut lipidic este într-o continu dezvoltare [11].
În ciuda acestor organizri eterogene, capacitatea lipidelor de a se mica în
cadrul bistratului este doar nuanat pe întinsul suprafeei membranei i nu anulat.
26
Aceast capacitate de micare a lipidelor în cadrul membranei determin

proprietatea numit fluiditate. Fluiditatea membranelor poate fi modulat
(modificat, reglat) de mai muli factori. Aceti factori pot fi de natur fizic, sau
chimic. Ca factori fizici amintim temperatura i presiunea. Fluiditatea membranelor
este direct proporional cu temperatura i invers proporional cu presiunea.
Efectivitatea acestor factori fizici în modularea fluiditii membranare este îns
limitat, dup cum uor ne putem da seama. Nici presiunea i nici temperatura nu
pot varia în limite largi (ba dimpotriv) în condiii fiziologice. Mult mai pregnant este
efectul factorilor chimici în modularea fluiditii membranei. Acetia, în funcie de
provenien, se pot clasifica în (i) factori chimici intrinseci sau (ii) factori
chimici extrinseci.
Factorii chimici intrinseci, pe care celula îi folosete în modularea fluiditii
membranei în funcie de necesiti, sunt cantitatea de acizi grai nesaturai din
structura fosfolipidelor sau a glicolipidelor i/sau cantitatea de colesterol din bistrat.
Fluiditatea membranei este direct proporional cu procentul de acizi grai
nesaturai din structura chimic a lipidelor bistratului (crete cantitatea de acizi grai
nesaturai, crete i fluiditatea), în timp ce creterea procentului de colesterol duce la
rigidizarea membranei (micorarea fluiditii). Aadar, fluiditatea membranei este
invers proporional cu cantitatea de colesterol din bistrat (Fig. 2.7). Cum trebuie
înelese sugestiv motivele acestor efecte ale colesterolului i acizilor grai nesaturai
asupra fluiditii membranei celulare? Descriptiv, geometria angular a cozilor
acizilor grai nesaturai are ca efect deprtarea spaial a lipidelor i micorarea
interaciunilor între acestea atât la nivelul poriunii hidrofobe, cât i al capetelor
hidrofile. În ceea ce privete efectul colesterolului, din motive structurale (datorit
geometriei spaiale), acesta sporete tria interaciunilor atât la nivelul cozilor
hidrofobe, cât i al capetelor hidrofile, anulând efectul acizilor grai nesaturai
Factorii chimici extrinseci se clasific la rândul lor în (a) fiziologici
(hormoni sau mediatori chimici liposolubili), (b) patologici (metabolii liposolubili
ai unor ageni patogeni, substane chimice toxice, liposolubile) sau (c) terapeutici
(medicamente liposolubile). Multe analgezice, ca i unele anestezice, fiind compui
liposolubili, acioneaz i prin modificarea fluiditii membranelor neuronale. Dovezi
experimentale recente dovedesc faptul c, alturi de efectele datorate modificrii
fluiditii membranare, anestezicele i/sau analgezicele acioneaz i prin
modificrile conformaionale induse la nivelul unor proteine transmembranare,
afectându-le funcia.
Fig. 2.7. Efectul rigidizant al colesterolului la nivelul bistratului. Datorit geometriei moleculare,
colesterolul are abilitatea de a se insera în spaiile dintre fosfolipide sporind interaciunile moleculare
atât la nivelul capetelor hidrofile, cât i la nivelul cozilor hidrofobe. © Mircea Leabu, 2014.
27
Dup cum vom vedea, fluiditatea membranelor este modulat i nuanat i

de ctre celelalte componente ale membranelor: proteinele i structurile glucidice.
Practic, dinamicitatea componentelor membranare, care asigur buna funcionare a
lor i, prin aceasta, a întregii ultrastructuri, difer de la un moment la altul în funcie
de starea în care (macro)moleculele se afl: independente sau în interrelaie cu alte
componente din membrana însi sau din spaiile apropiate (citosolul cortical sau
elemente din exterior).
2.2.4. Rolul lipidelor membranare

Dup cum am artat pân acum, rezult c fr bistrat lipidic nu pot exista
membrane celulare. Bistratul lipidic reprezint componenta de baz a organizrii
membranelor, funcia structural a lipidelor membranare organizate în bistrat
fiind esenial. Dincolo de funcia structural prin care ofer membranei cel mai bun
element pentru organizare i funcionare, bistratul lipidic confer membranei
celulare rolul de barier, aceast menire a lipidelor membranare fiind enunat înc
de la dovedirea prezenei lor în membrane. Dar lipidele nu se afl, nici pe departe, în
membrane numai din considerente structurale. Ele sunt implicate în importante
funcii metabolice, acele funcii care unesc celula cu mediul înconjurtor, o
integreaz pe aceasta în “ambiana biosocial”. Mai mult, echilibrul dintre diferitele
tipuri de lipide din membrane influeneaz comportamentul normal al celulei, iar
modificarea lui poate atrage deviaii patologice. De aceea, lipidele membranare pot
reprezenta inte terapeutice [12].
Glicolipidele sunt implicate în fenomene de recunoatere i semnalizare
intercelular (vezi la “Componenta glucidic a membranei”).
Detalii referitoare la rolurile metabolice ale lipidelor sunt cunoscute pentru
fosfolipide. Acestea pot fi modificate de enzime specifice numite fosfolipaze. De
regul, aceste modificri se petrec ca urmare a unor procese de semnalizare, parte
dintre metaboliii rezultai acionând ca mesageri secunzi (vezi semnificaia
sintagmei la „Semnalizarea celular”) i faciliteaz numeroase procese prin care
celulele rspund semnalelor receptate.
Exist mai multe tipuri de fosfolipaze, care au proprietatea de a elibera diverse
molecule din complexa structur biochimic a fosfolipidelor (Fig. 2.8). Acestea sunt:6
(i) fosfolipaza A1 (prescurtare internaional PLA1, cu PL de la termenul
englezesc PhosphoLipase), care elibereaz acidul gras din poziia 1 a
glicerinei;
(ii) fosfolipaza A2 (prescurtare internaional PLA2), care detaeaz acidul
gras din poziia 2 a glicerinei, cu formare de lizofosfatide;
(iii) fosfolipaza B (prescurtare internaional PLB), care poate scoate acizi grai
din ambele poziii ale glicerolului din structura fosfolipidelor, completând de
regul activitatea PLA1 sau PLA2; acioneaz în general asupra lizofosfatidelor
eliminând din bistrat fosfolipidul afectat;
(iv) fosfolipaza C, care desface legtura dintre glicerin i fosfat, cu eliberarea
diacilglicerolilor (DAG), care rmân în bistrat i a unui compus hidrofil ce
difuzeaz în citosol;
(v) fosfolipaza D, care elimin restul hidrofil X, cu formarea PA la nivelul
bistratului.
6
Recomandm o modalitate mnemotehnic de a reine legtura dintre tipurile de fosfolipaze i rolul lor. Este
uor de remarcat c, plecând de la acizii grai legai la hidroxilii din poziiile 1 i 2 ale glicerinei i mergând ctre
compusul variabil din capul hidrofil al fosfolipidelor, fosfolipazele se denumesc succesiv de la A la D în funcie de
partea din molecul pe care o taie: A1 pentru cele care scot acizii grai din poziia 1 (A de la acid i 1 poziia), A2
elibereaz acidul gras din poziia 2, apoi B contribuie la eliminarea ambilor acizi grai, C taie legtura esteric
dintre glicerin i fosfat, iar D desface numai partea variabil din capul hidrofil.
28
Pentru exemplificarea efectelor celulare, datorate aciunii fosfolipazelor,

punctm urmtoarele (vezi i subcapitolul “Semnalizarea celular”):
a) Fosfolipaza A2 poate elibera acidul arahidonic, care este precursor pentru patru
clase de substane cu roluri dintre cele mai diverse: 1. prostaglandine; 2.
tromboxani; 3. prostacicline; 4. leucotriene. Aceti compui sunt obinui
prin complexe procese de metabolizare a acidului arahidonic (cu bagaje
enzimatice adecvate), dup eliberarea sa din fosfolipidele care îl conin. Primele
trei tipuri rezult pe calea ciclo-oxigenazei, cea de-a patra clas pe calea lipo-
oxigenazei. Toate aceste tipuri de metabolii ai acidului arahidonic sunt
eliberate din celulele care îi produc i au rol de molecule mesager în diferite
procese de semnalizare celular.
b) Fosfatidilinozitolii sunt implicai în mecanisme de transmitere transmem-
branar i intracelular a semnalelor. Când unele molecule semnal (liganzi) se
leag de receptorii specifici din membranele celulare, PI intr într-o secven de
reacii denumit cascada fosfoinozitidelor (Fig. 2.9).
În aceast cascad PI sunt, pas cu pas, fosforilai iniial la fosfoinozitolfosfai
(PIP), sub aciunea fosfatidilinozitol kinazei7 (PI kinaza), cu consum de ATP, apoi la
fosfatidilinozitol-bis-fosfai8 (PIP2), sub aciunea PIP kinazei, de asemenea cu
consum de ATP. Asupra fosfatidilinozitol-4,5-bis-fosfatului format acioneaz
fosfolipaza C (izoforme E i J ale fosfolipazei C, specifice pentru fosfatidilinozitoli)
cu eliberarea de IP3 (inozitol-1,4,5-tris-fosfat9) i DAG. IP3 acioneaz ca mesager
secund inducând creterea Ca2+ în citosol i conducând la rspunsuri celulare rapide
i de scurt durat (exemplu, contracia muscular). La rândul su, DAG este
implicat în declanarea unor rspunsuri celulare mai lente i de lung durat
(exemplu, semnalizarea prin cile protein-kinazei C).
Fig. 2.8. Locurile specifice de aciune pentru diferitele tipuri

de fosfolipaze, la nivelul moleculelor de fosfolipide. A1 –
fosfolipaza A1; A2 – fosfolipaza A2; B – fosfolipaza B; C –
fosfolipaza C; D – fosfolipaza D.
7 Prin kinaze desemnm acele enzime a cror activitate se soldeaz cu grefarea de fosfat pe diferite substrate.
8 Atenie! În denumirea acestor metabolii se folosesc particulele „bis”, respectiv „tris” i nu di sau tri, deoarece
fiecare reziduu fosfat este inserat pe un alt hidroxil al inozitolului. Formele bi/di, respectiv tri se folosesc în
denumirea compuilor în care fosfatul se leag unul de altul (exemple: adenozin-difosfat, adenozin-trifosfat).
9 Vezi nota de subsol numrul 7.
29
Fig. 2.9. Cascada fosfoinozitide-

lor. Aciunea secvenial a fosfati-
dilinozitol-kinazelor duce la formarea
PIP2. Ulterior fosfolipaza C-E, cea
din exemplul figurii, cu specificitate
pentru fosfatidil-inozitoli, elibereaz
IP3 i DAG, care sunt mesageri
secunzi în anumite procese de sem-
nalizare transmembranar.
Dei rolul colesterolului în procesele metabolice de la nivelul membranei a

fost mai puin investigat, studii recente au dovedit c el este implicat în interaciuni
cu proteine platform/proteine adaptoare care au rol în formarea de complexe de
semnalizare [13]. În felul acesta colesterolul contribuie la recrutarea acestor proteine
platform, ca endoproteine pe faa citosolic a membranei celulare, cu facilitarea
funciei acestora de a pune în bun situaie de aciune proteine implicate în diferite
procese de semnalizare i eficientizarea fenomenelor la care trebuie s participe
partenerii asociai la nivelul platformei de semnalizare astfel formate.
Ca s rezumm cele prezentate despre lipidele membranare punctm:
1. Lipidele membranare organizeaz componenta de baz a biomembranelor,
bistratul lipidic, element cu proprieti fluide, manifestate bidimensional i
caracterizat atât prin eterogenitate compoziional, cât i prin asimetrie;
2. Structura de bistrat lipidic este ideal pentru separarea eficient, selectiv a
dou medii hidrofile (interiorul celular de mediul extern);
3. Prin componenta sa hidrofob, mrginit pe ambele pri de suprafee hidrofile
care îl compatibilizeaz cu mediile apoase separate, bistratul lipidic asigur
funcia de barier a membranelor, fr a-i conferi caracter de barier absolut,
adic fr a împiedica selectivitatea acestei structuri în interaciunea celulei cu
mediul (schimbul de substan i de informaie);
4. Departe de a avea numai un rol structural, lipidele membranare particip la
funcia metabolic a membranei celulare în procese de semnalizare, dar i prin
posibilitile de control a conformaiei proteinelor cufundate în bistrat,
putându-le modula funcia.
1. Frega NG, Pacetti D, Boselli E. (2012). Characterization of Phospholipid Molecular Species by
Means of HPLC-Tandem Mass Spectrometry. In: „Tandem Mass Spectrometry – Applications and
Principles”, editor Jeevan Prasain (ISBN: 978-953-51-0141-3). Rijeka: InTech Europe; 2012. pp. 637-
672.
2. Luckey M. Membrane structural biology with biochemical and biophysical foundations. New York:
Cambridge University Press, 2008. (Fig. 2.14, p.27).
3. Han CZ, Ravichandran KS. (2011) Metabolic connections during apoptotic cell engulfment. Cell.
147(7): 1442-1445. doi: 10.1016/j.cell.2011.12.006.
4. Armstrong A, Ravichandran KS. (2011) Phosphatidylserine receptors: what is the new RAGE?
EMBO Rep. 12(4): 287-288. doi: 10.1038/embor.2011.41.
5. Tung TT, Nagaosa K, Fujita Y, Kita A, Mori H, Okada R, Nonaka S, Nakanishi Y. (2013)
Phosphatidylserine recognition and induction of apoptotic cell clearance by Drosophila engulfment
receptor Draper. J Biochem. 153(5): 483-491. doi: 10.1093/jb/mvt014.
6. Fox JE. (1996) Platelet activation: new aspects. Haemostasis. 26: 102–131.
30
7. Zwaal RFA, Schroit AJ. (1997) Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry
in blood cells. Blood. 89: 1121–1132.
8. Kuypers FA. (1998) Phospholipid asymmetry in health and disease. Curr Opin Hematol. 5: 122–131.
9. Kusumi A, Fujiwara TK, Chadda R, Xie M, Tsunoyama TA, Kalay Z, Kasai RS, Suzuki KG.
(2012) Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction:
commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annu Rev Cell
Dev Biol. 28: 215-250. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100809-151736.
10. Pike LJ. (2004) Lipid Rafts: Heterogeneity on the high seas. Biochem. J. 378, 281-292.
11. Sonnino S, Prinetti A. (2013) Membrane domains and the "lipid raft" concept. Curr Med Chem.
20(1): 4-21.
12. Escriba PV. (2006) Membrane-lipid therapy: a new approach in molecular medicine. Trends Mol Med.
12, 34-43.
13. Sheng R, Chen Y, Yung Gee H, Stec E, Melowic HR, Blatner NR, Tun MP, Kim Y, Källberg
M, Fujiwara TK, Hye Hong J, Pyo Kim K, Lu H, Kusumi A, Goo Lee M, Cho W. (2012)
Cholesterol modulates cell signaling and protein networking by specifically interacting with PDZ
domain-containing scaffold proteins. Nat Commun. 3: 1249. doi: 10.1038/ncomms2221.
31
2.3. Proteinele membranare

2.3.1. Consideraii generale asupra prezenei proteinelor în
membrane
Modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice ne arat c,
alturi de lipidele aezate sub form de bistrat, la construcia acestor componente
celulare particip i proteinele. Raportul molecular între lipidele i proteinele ce
alctuiesc membranele celulare este în medie de aproximativ 50/1. Acest raport este
uor de îneles inând cont de faptul c, de regul, compoziia sub aspectul masei de
material organic la nivelul membranelor este de ~40% lipide i ~50% proteine, iar
lipidele sunt molecule cu greutate molecular mic, în timp ce proteinele sunt
macromolecule.
Realitatea biologic este îns divers, existând i excepii de la aceste
procente. De exemplu, la nivelul tecii de mielin, unde funcia de barier este
esenial rolului membranei celulelor Schwann care formeaz înveliul din jurul
axonului, procentul de mas pentru lipide este de ~80, iar cel al proteinelor de
numai ~20. De evideniat, pentru situaia diametral opus, compoziia de la nivelul
membranei mitocondriale interne unde lipidele reprezint ~20%, iar proteinele
~80%. Funcia metabolic a acestei membrane este deosebit de accentuat (vezi în
capitolul volumului al II-lea, destinat membranei mitocondriale interne), chiar dac
ar fi s menionm doar activitatea complexelor proteice implicate în transportul
electronilor (lanul transportor de electroni, numit i lanul respirator), respectiv
activitatea ATP-sintazei, complexul proteic care produce ATP. La nivelul membranei
mitocondriale interne îns, este la fel de important i funcia de barier. Poate de
aceea aici se afl cardiolipinele, fosfolipide deosebite, cu patru lanuri alifatice în
coada hidrofob (patru acizi grai în molecul), deci cu proprieti amfifile a cror
component hidrofob este amplificat.
Comentariile de mai sus, asupra complexitii realitii biologice în privina
raportului lipide/proteine în membrane, ne permit s enunm reguli de principiu
care sugereaz corespondena între acest raport i funcionalitatea membranei.
Aceste reguli sunt:
(i) cu cât funciile metabolice ale unei membrane (sau poriuni – ceea ce se
definesc drept microdomenii sau domenii – dintr-o membran) sunt mai
accentuate, cu atât coninutul de proteine al acelei membrane sau poriuni de
membran este mai ridicat;
(ii) cu cât rolul de barier al unei membrane trebuie s se manifeste mai pregnant,
cu atât coninutul în lipide este mai crescut.
În abordarea studiului proteinelor membranare plecm de la ceea ce tim deja
despre organizarea membranei, cu cele menionate despre caracteristicile fizico-
chimice i comportamentul membranei, aa cum am vzut c sunt induse de însi
prezena lipidelor în elementul de baz, bistratul lipidic. Completarea cu proteine a
organizrii moleculare a membranelor celulare nu anuleaz, ci amplific i/sau
nuaneaz eterogenitatea, asimetria i comportamentul de fluid bidimensional al
structurii. Vom cuta s argumentm, prin prezentarea aspectelor legate de prezena
proteinelor în membrane, afirmaia din fraza anterioar. Proteinele completeaz
bistratul lipidic pentru definitivarea organizrii biomembranelor, în toat grosimea,
ca i pentru asigurarea funcionalitii ultrastructurii.
Pentru argumentarea ideii de eterogenitate, vom utiliza aceeai strategie
folosit la prezentarea eterogenitii lipidelor membranare: discutarea diversitii de
tipuri de proteine din membrane prin clasificarea lor pe diverse criterii.
32
2.3.2. Clasificri ale proteinelor membranare

O prim clasificare a proteinelor membranare se face în funcie de poziia lor
fa de bistratul lipidic, care permite împrirea acestora în dou mari categorii:
1. Proteine periferice sau extrinseci: acele proteine care se afl ataate de o
parte sau de alta a bistratului lipidic, interacionând cu capetele hidrofile ale
lipidelor (dar nu numai, dup cum se va vedea din unele aspecte prezentate mai
jos);
2. Proteine integrale sau intrinseci: acele proteine care sunt cufundate în
bistratul lipidic strbatându-l complet sau parial.
Evidenierea, descrierea i denumirea acestor dou categorii de proteine
membranare au fost fcute în deceniul opt al secolului XX de ctre Theodore L. Steck
i colaboratorii si [1] (la numai doi ani dup introducerea modelului în mozaic fluid
privind organizarea membranelor). Diversitatea de tipuri de proteine membranare
este accentuat i de alte aspecte (Fig. 2.10).
Proteinele periferice reprezint, în general, ~25% din polipeptidele unei
membrane, se extrag cu soluii saline sau ageni chelatori, au caracter hidrofil (dup
extragere nu sunt asociate cu lipide) i îi pstreaz solubilitatea în ap. În funcie de
foia bistratului lipidic creia îi sunt asociate, proteinele extrinseci se clasific în (i)
ectoproteine (proteine periferice asociate foiei externe a bistratului, aadar expuse
la exteriorul membranei celulare sau pe faa luminal a membranelor organitelor) i
(ii) endoproteine (proteine periferice asociate foiei interne a bistratului, aadar
expuse pe faa citoplasmatic a membranelor i endomembranelor).
Au fost evideniate atari mai ferme ale proteinelor periferice la bistratul
lipidic, prin conjugri (stabilirea de legturi covalente) cu componente lipidice.
Fig. 2.10. Diversitatea de proteine membranare i exemplificarea clasificrilor acestora. 1 –

protein periferic, ectoprotein; 2 – ectoprotein ancorat prin glicofosfatidil-inozitol; 3 – protein
periferic, endoprotein; 4 – endoprotein acilat; 5 – protein integral, transmembranar unipas
(prezint i acilare); 6 – protein transmembranar multipas; 7 – protein integral, parial imersat în
bistratul lipidic; fosfolipidele din foia intern, cu sarcin negativ reprezint fosfatidilserine. © Mircea
Leabu, 2014.
33
Pe de o parte, pentru unele ectoproteine a fost evideniat o cuplare prin

carboxilul terminal la gruparea amino a etanolaminei din captul liber al structurii
glucidice a unor glicofosfatidilinozitoli (Fig. 2.10, exemplul 2). Fenomenul se
numete glipiare [2-4]. Partea lipidic rmâne în foia extern a bistratului i
poart numele de ancor glicofosfatidilinozitolic. Funciile acestor proteine
modificate prin glipiare sunt intens studiate. Exist dovezi experimentale care
confirm rolul acestor modificri într-o multitudine de procese care se petrec la
suprafaa celulei, dar i intracelular. De exemplu, unele din moleculele de adeziune
celular sunt glipiate, unele proteine glipiate sunt implicate în procese imune, exist
ectoproteine cu rol enzimatic ancorate prin glipiare, proteine glipiate rein la nivelul
lor molecule din spaiul extracelular i contribuie la endocitoza lor i a fost
evideniat direcionarea ectoproteinelor ancorate la bistrat prin glipiare ctre
domeniul apical al membranelor din celulele polarizate (celule ale epiteliilor
monostratificate).
Pe de alt parte, unele dintre endoproteine se pot asocia tranzitoriu i
reversibil bistratului lipidic prin reacii de acilare, cum ar fi miristilare, palmitilare,
farnezilare, geranil-geranilare (Fig. 2.10, exemplul 4), radicalul acil fiind cufundat în
foia intern a bistratului [2] (vezi CASETA 2.1). Aceste modificri reversibile sunt
importante pentru exprimarea funciilor acestor proteine. Mai mult, unele dintre ele,
cum ar fi proteinele G mici, numite i proteine G monomerice (vezi ce sunt acestea la
„Semnalizarea celular”) pot tranzita, pe baza acestor modificri, din starea de
protein citosolic în starea de protein periferic pentru exercitarea funciilor (vezi,
de asemenea, detalii la „Semnalizarea celular”). Au fost evideniate modificri prin
acilare i pentru proteine transmembranare (Fig. 2.10, exemplul 5).
De menionat c atât proteinele membranare acilate, cât i cele glipiate au
tendina de a se acumula în caveole sau la nivelul plutelor lipidice (microdomenii de
membran definite i discutate parial, mai sus la seciunea despre lipidele
membranare). Acolo a fost anticipat informaia c asemenea modificri ale
proteinelor le fac candidate la acumularea în microdomenii de membran de tipul
plutelor lipidice.
CASETA 2.1. Ancorarea proteinelor membranare prin intermediul conjugrilor cu
elemente lipidice (acilare)
Proteinele care îi exercit funcia biologic exclusiv pe una din cele dou fee ale bistratului lipidic
sunt adesea asociate mai ferm bistratului prin interaciuni cu lipide din foia expus fie mediului
extracelular, fie celui intracelular. O serie de proteine intracelulare (endoproteine) cu rol în
procese de semnalizare celular se atașeaz, prin modificri covalente, la stratul lipidic dinspre
faa citoplasmatic a membranei. Aceast asociere mai ferm se datoreaz legrii covalente a unor
funciuni chimice din proteine fie la catene ale acizilor grai, fie la grupri prenil (farnezil sau
geranil-geranil). Astfel, au fost evideniate urmtoarele modaliti de ataare la bistratul lipidic a
unor proteine hidrosolubile (dup biosinteza lor în citosol), pe baza unor modificri covalente,
post-traducere: (i) miristilarea, prin formarea unei legturi amidice între gruparea amino-
terminal aparinând unui rest de glicin de la captul catenei polipeptidice i gruparea carboxil a
acidului miristic; (ii) palmitilare, formarea unei legturi tip tioester între un rest de cistein din
interiorul catenei polipeptidice i gruparea carboxil a acidului palmitic; (iii) prenilare, constând
în formarea unei legturi tioeter între un rest de cistein (poziionat iniial în poziia a patra de la
captul carboxi-terminal i ulterior în poziie terminal, dup fixarea de gruparea lipidic i
clivarea celor trei aminocizi de la extremitatea catenei polipeptidice) i o grupare prenil (3-metil-2-
buten-1-il). Deseori ataarea proteinei printr-o singur ancor lipidic nu este suficient de ferm,
fiind necesar fixarea suplimentar de o ancor lipidic secundar. De exemplu, membrii familiei
de proteine Ras (proteine G mici cu funcie GTP-azic, având rol în semnalizare) sunt recrutate la
nivelul membranei plasmatice prin fixarea cu o grupare prenil combinat cu fixarea prin acidul
palmitic. Prenilarea proteinelor este mediat de trei tipuri de enzime, respectiv farneziltransferaza
i geranilgeraniltransferazele de tip I i II. În ultimii ani inhibitorii farneziltransferazei s-au
dovedit candidai terapeutici importani pentru tratamentul unor forme de cancer i al unor
infecii cu parazii aparinînd genului Plasmodium, agentul infecios al malariei, i genului
Trypanosoma (specia T. brucei), agentul infecios al „bolii somnului”.
34
Proteinele integrale (Fig. 2.10, exemplele 5-7) reprezint, de regul, ~75%

din proteinele unei membrane, se pot extrage din structura bistratului lipidic prin
folosirea de detergeni (adic dup distrugerea integritii bistratului lipidic), dup
extragere rmân asociate cu lipide, sunt insolubile în ap (dializarea detergentului
duce la precipitarea lor prin floculare) i au caracter amfifil (poriunea hidrofob
fiind reprezentat de zona imersat în bistratul lipidic, poriunea/poriunile
hidrofil/hidrofile reprezentând domeniile lanului polipeptidic expuse în afara
bistratului lipidic). Proteinele integrale care traverseaz complet bistratul lipidic sunt
denumite proteine transmembranare (Fig. 1.10, exemplele 5 i 6) i reprezint cea
mai mare parte a proteinelor intrinseci. Cele care sunt parial cufundate în bistratul
lipidic (Fig. 2.10, exemplul 7) nu au primit o denumire specific. Mai mult, acestea
din urm au fost considerate pân prin ultimul deceniu al secolului XX a fi practic
inexistente. Se specula în favoarea acestei idei pe considerente structurale i
termodinamice. Explicaia era c nu putea fi adoptat de ctre aceste proteine o
conformaie care s asigure hidrofobicitate în poriunea de pliere a lanului
polipeptidic în interiorul bistratului lipidic. În momentul de fa sunt cel puin dou
proteine integrale candidate la imersare parial în bistratul lipidic al membranelor
crora le aparin: citocromul b5 din membrana reticulului endoplasmic i
caveolina, la nivelul membranelor celulelor ce pot structura caveole ca formaiuni
specializate de membran (de exemplu, celule musculare netede, celule endoteliale,
enterocite etc.). Schimbarea atitudinii comunitii stiinifice în privina acestei
situaii, dup raportarea dovezilor experimentale legate de aranjamentul celor dou
proteine în membrane, este un exemplu al dinamicii cunoaterii în biologia celular
i al modului rapid în care conceptele pot evolua în acest domeniu.
Revenind la proteinele transmembranare, acestora li se definesc trei domenii
structurale: (i) un ectodomeniu, numit si domeniu extern (poriunea expus pe
faa extern a membranei), (ii) un endodomeniu, numit i domeniu citosolic
(poriunea expus pe faa intern a membranei) i (iii) un domeniu
transmembranar (poriunea ce strbate bistratul lipidic). În ceea ce privete
modul de organizare structural a ecto- i endo-domeniilor, lanurile proteice se pot
împacheta combinat în aceste zone atât ca -helixuri, cât i ca -pliuri, aa cum se
întâmpl cu toate proteinele. Situaia este oarecum diferit pentru domeniul
transmembranar. Pentru acesta, pân prin deceniul 9 al secolului XX, a existat
accepiunea c nu poate fi structurat decât sub form de -helix, astfel încât s poat
fi mascate ctre axul acestuia poriunile hidrofile ale lanului polipeptidic, iar la
exteriorul su s fie expuse prile hidrofobe, acomodabile cu hidrofobicitatea din
profunzimea bistratului lipidic. Se justifica i în acest caz prin considerente de ordin
structural i termodinamic. Între timp îns, au fost identificate proteine
transmembranare care, la nivelul domeniului transmembranar, prezint -pliuri
orientate în contrasens care se organizeaz asemenea doagelor unui butoia. În acest
fel fiecare doag (poriune organizat în -pliuri) expune ctre zonele hidrofobe ale
bistratului suprafaa hidrofob i ascunde ctre interiorul butoiaului componentele
hidrofile din structura lanului polipeptidic. Asemenea proteine se întâlnesc, de
exemplu, în membrana mitocondrial extern formând porine. Descifrarea structurii
porinelor a reprezentat un alt exemplu de schimbare de atitudine pe care evoluia
cunoaterii realitii biologice a impus-o comunitii tiinifice.
Proteinele transmembranare se pot clasifica i pe baza altor criterii. Astfel, în
funcie de numrul de treceri ale lanului polipeptidic prin planul membranei ele se
împart în (i) unipas (o singur trecere; exemplul 5 în Fig. 2.10) i (ii) multipas
(mai multe treceri; exemplul 6 în Fig. 2.10). Este lesne de îneles c proteinele
structurate ca -pliuri la nivelul domeniului transmembranar (porinele) nu pot fi
unipas.
35
În funcie de poziia fa de bistrat a captului amino al lanului polipeptidic,

proteinele transmembranare se clasific în (i) proteine transmembranare de tipul I
(când captul amino se afl în ectodomeniu) i (ii) proteine transmembranare de
tipul II (când captul amino se afl în endodomeniu).
Toate aceste clasificri ne sugereaz marea diversitate de proteine
membranare, astfel încât este clar c prezena proteinelor în structura membranelor
respect caracterul eterogen al organizrii acestora, nuanându-l. În acelai timp,
existena ecto- i endoproteinelor (firesc entiti moleculare diferite, rezultat al unor
fenomene diferite de biosintez i asamblare; vezi la seciunea „Biogeneza
membranelor” din volumul al II-lea) sporete asimetria organizrii moleculare a
membranelor. Mai mult, asimetria membranelor este accentuat i de prezena
proteinelor transmembranare cu ectodomeniul diferit de endodomeniu, ca i prin
caracterul asimetric al organizrii lanului polipeptidic cruia îi putem asocia
caracteristici vectoriale (origine, direcie, sens), chiar dac similitudinea nu trebuie
îneleas în sensul strict algebric. Originea unei proteine poate fi convenional
atribuit captului amino-terminal (cu acesta începe biosinteza proteinelor la nivelul
ribozomilor), direcia nu este deloc una rectilinie, iar sensul este dinspre captul
amino-terminal spre captul carboxi-terminal.
Vom comenta ceva mai jos efectul i importana proprietilor eterogenitate i
asimetrie (care sunt amplificate de prezena proteinelor), asupra funcionalitii
membranelor. De fapt, insistena noastr în prezentarea acestor caracteristici de
organizare a biomembranelor (eterogenitate, asimetrie i comportament dinamic de
fluid bidimensional) nu s-ar justifica dac nu ar fi deosebit de important
semnificaia biologic a lor.
2.3.3. Exemple de proteine membranare

Primele i cele mai detaliate informaii asupra proteinelor membranare au
fost obinute din studiul membranelor eritrocitare [5]. Motivaia este simpl i se
bazeaz pe urmtoarele aspecte:
(i) materialul biologic este uor de obinut în cantitate suficient (eritrocitele
reprezint populaia celular majoritar din sânge);
(ii) omogenitatea populaiei celulare este uor de asigurat (celelalte tipuri celulare
reprezint o mas mic, sunt mai uoare, sedimentând deasupra eritrocitelor
la centrifugare, sau doar în câmp gravitaional, iar eliminarea lor se poate face
chiar cu pierderi de eritrocite, pentru siguran în eliminarea impurificrii
preparatului final);
(iii) membranele se obin fr dificultate printr-un simplu oc hipoton urmat de
centrifugare; membranele obinute (numite i fantome eritrocitare) nu sunt
impurificate cu endomembrane (membrane ale organitelor celulare),
inexistente în hematii.
Proteinele membranelor astfel purificate au fost rezolvate prin electroforez în
gel de poliacrilamid în prezen de dodecilsulfat de sodiu (SDS-PAGE). Avantajele
acestui tip de electroforez constau în faptul c detergentul (dodecilsulfatul de sodiu,
numit i laurilsulfat de sodiu) pe de o parte elibereaz toate proteinele (atât pe cele
periferice, cât i pe cele integrale) din arhitectura membranei, solubilizându-le dup
dezorganizarea bistratului lipidic [6], iar pe de alt parte se adsoarbe unitar pe
lanurile polipeptidice, conferindu-le o densitate de sarcin negativ unitar. În
aceste condiii migrarea proteinelor în câmp electric, prin mediul vâscos de
poliacrilamid, se face numai în funcie de greutatea lor molecular.
Rezultatele unei asemenea abordri pentru descrierea proteinelor membranei
eritrocitare se înfieaz sub forma unui spectru de benzi proteice distribuite între
20 i 250 kDa, care iniial au primit denumiri sub form de cifre (banda 1, banda 2,
36
etc.), nuanându-se cu, spre exemplu, banda 4.1, banda 4.2, acolo unde benzile
apreau ca dublete. Ulterior, unele dintre proteine au primit denumiri specifice. În
momentul de fa organizarea i funcionarea membranei eritrocitare poate fi
discutat pe baza informaiilor disponibile referitoare la proteinele ei. Comentariile
asupra proteinelor membranei eritrocitare ne vor ajuta s înelegem mai aprofundat
organizarea acestor macromolecule în arhitectura biomembranelor, care este în
strâns legtur cu funcionalitatea lor.
Vom începe cu o protein, de fapt o glicoprotein (60% din masa molecular a
glicoconjugatului este reprezentat de încrctura glucidic), numit glicoforin
(etimologic însemnând purttoare de glucide), prezent din abunden în membrana
eritrocitului, care migreaz atipic (se dispune electroforetic undeva pe la 90kDa, dei
masa ei molecular este de numai ~30kDa). Exist mai multe izoforme de glicoforin
[7] identificate pân în prezent: A, B, C, D i E. Izoforma glicoforin A a fost prima
protein a membranei eritrocitare cunoscut detaliat [8], sub aspectul structurii
biochimice. Are 131 aminoacizi, cunoscându-i-se integral secvena; este protein
transmembranar unipas, tip I (captul amino în ectodomeniu); domeniul expus la
suprafaa membranei este mare (70 de aminoacizi) i poart 16 lanuri glucidice (15
O-glicozidice i unul N-glicozidic), acestea dublând practic gabaritul acestei molecule
(aceast organizare biochimic a glicoproteinei reprezint o explicaie pentru
migrarea electroforetic atipic; practic densitatea de sarcin negativ pe unitatea de
mas este mai mic decât în mod normal, detergentul SDS adsorbindu-se unitar
numai pe lanul polipeptidic, nu i pe structurile glucidice); endodomeniul este mic
(39 de aminoacizi), purtând captul carboxil al lanului polipeptidic; domeniul
transmembranar este structurat în -helix i conine 22 de aminoacizi, care sunt
identificai.
Paradoxul este c, dei structural glicoforina i-a dezvluit repede secretele,
funcia nu i se cunoate înc exact. Totui, pentru izoforma glicoforin C a fost
dovedit o funcie structural [9] (vezi mai jos la citoscheletul asociat membranei),
iar pentru izoforma glicoforin A un rol de restabilire a funciei unei forme mutante a
proteinei banda 3, prin interaciunea dintre cele dou [10]. Ciudenia este cu atât
mai mare cu cât exist eritrocite (Ena-) din a cror membran glicoforina lipsete,
fr ca funcionalitatea s le fie afectat. Populaiile cu asemenea defecte de
exprimare a glicoforinei sunt în zonele cu malarie endemic, iar exprimarea
deficitar în glicoforin A reprezint un mecanism de adaptare, parazitul
Plasmodium falciparum invadând eritrocitele gazd prin legarea la o structur
glucidic purtat de aceast protein transmembranar [11].
O situaie diametral opus o reprezint proteina banda 3, cunoscut i ca
AE1 (de la numele în englez, „Anion Exchanger 1”) [10], despre care informaia
asupra detaliilor structurale a evoluat mai anevoios, dar a crei funcie a fost repede
i clar stabilit: este proteina care structureaz canalul anionic de schimb între
bicarbonat (HCO3-) i clorur (Cl-). Banda 3 este protein transmembranar, are 911
aminoacizi în lanul polipeptidic i o mas molecular de ~100kDa. Partea N-
terminal a proteinei (aminoacizii 1-359) intr în structurarea endodomeniului,
asigurând interaciuni cu alte proteine membranare. Domeniul transmembranar, la
nivelul cruia se formeaz canalul de schimb anionic, are 12-14 treceri în -helix prin
bistratul lipidic (~50kDa din masa molecular). La endodomeniul mare format în
principal din captul N-terminal se adaug captul C-terminal scurt (format din 33
aminoacizi) aflat tot spre citosol. Aadar, endodomeniul conine ~400 din
aminoacizii care formeaz proteina, adic ~40kDa i poart atât captul N-terminal
(protein transmembranar de tip II), cât i captul C-terminal. Ectodomeniul este
mic, încrctura glucidic este redus (se pare c doar un lan, cu o structur extrem
de eterogen [12]) i este reprezentat de bucle dintre poriunile transmembranare. În
poriunea C-terminal banda 3 leag anhidraza carbonic II, important pentru
37
funcia transportorului prin furnizarea anionului bicarbonat [13]. Au fost identificate

forme mutante pentru proteina banda 3 care induc o serie de patologii specifice
eritrocitelor [10], iar glicoforina A pare a fi de ajutor acestor forme mutante în
restabilirea funciei de transport.
Cea de-a treia protein pe care o amintim este spectrina, care, împreun cu
celelalte dou amintite mai sus, reprezint peste 60% (procente de mas) din
proteinele membranei eritrocitare. Spectrina este o protein periferic situat pe faa
intern a membranei (aadar o endoprotein) i reprezint componenta de baz a
ceea ce numim citoschelet asociat membranei sau simplu citoschelet
membranar ori citoscheletul membranei.10
Citoscheletul membranei este o reea de endoproteine cu ochiuri i
noduri, solidar membranei prin ataarea la endodomeniul unor proteine
transmembranare. Grosimea acestei ultrastructuri membranare este de 5-10nm.
Citoscheletul membranei este solidar i cu organitul denumit citoschelet.
Citoscheletul ca organit este reprezentat de filamente sau microtubuli distribuite în
întreg volumul citosolic i este responsabil, între altele, de meninerea i/sau
modificarea formei celulelor, ca i de geometria membranei. La unele tipuri celulare
citoscheletul este implicat în organizarea specializrilor de membran cum ar fi
microvilii, stereocilii, cilii, flagelii. De menionat c la eritrocit forma biconcav i
maleabilitatea acesteia se datoreaz în exclusivitate citoscheletului membranar.
Spuneam c spectrina este componenta de baz a citoscheletului asociat
membranei. Ea este un heterodimer (Fig. 2.11, A) format dintr-o subunitate (-
spectrin, 280kDa) i o subunitate (-spectrin, 246kDa). Ambele subuniti
sunt formate predominant din multiple uniti repetitive de 106 aminoacizi: 22
pentru D-spectrin i 17 pentru E-spectrin [14]. Cele dou subuniti cu geometrie
fibrilar se rsucesc uor una în jurul alteia într-o structur elicoidal, formând
bastonae flexibile cu lungimea de ~100nm. Rsucirea este în contrasens
(antiparalel), fiecare bastona având la capete gruparea amino-terminal a unei
subuniti i gruparea carboxi-terminal a celeilalte. Captul coninând gruparea
amino-terminal a subunitii i gruparea carboxi-terminal a subunitii este
numit capul bastonaului, iar cellalt capt este coada acestuia. Bastonaele au
capacitatea de a interaciona câte dou, cap la cap, formând tetrameri lungi de
~200nm (Fig. 2.11, B). Aceti tetrameri formeaz laturile reelei citoscheletului
membranar. Capetele tetramerilor, ce reprezint cozile bastonaelor de spectrin, au
capacitatea de a se asocia, de regul câte 5 sau 6, prin interaciuni cu oligomeri de
actin, formând nodurile reelei, la nivelul crora se gsesc i alte proteine care
controleaz dinamica interaciunilor i, prin aceasta, dinamica citoscheletului
membranar.
Aadar actina este o alt protein ce particip la organizarea citoscheletului
membranei, asigurând solidarizarea componentelor acestuia la nivelul nodurilor. În
forma sa monomeric actina este o protein globular cu masa de ~43kDa i un
diametru de ~5nm. La nivelul citoscheletului membranar formeaz fragmente mici,
de 8-12 monomeri cu rolul de a asigura asocierea cozilor tetramerilor de spectrin în
nodurilor reelei.
Tot în noduri se localizeaz o alt protein periferic, banda 4.1, cu masa de
~80kDa i conformaie globular (diametrul ~6nm). Banda 4.1 interacioneaz
dinamic, pe de o parte cu spectrina i actina în nodurile reelei citoscheletale i, pe de
alt parte, cu endodomeniul glicoforinei C, contribuind la ataarea citoscheletului pe
10 Atragem atenia c noiunea de citoschelet se utilizeaz i pentru organitul nedelimitat de endomembrane

format din filamente de actin, filamente intermediare i microtubuli. Aadar, facem apel la cititori s disjung
între sintagma citoschelet asociat membranei sau citochelet membranar i organitul numit citoschelet.
38
faa citosolic a membranei [10]. Rezult de aici un rol structural pentru o izoform a
paradoxalei glicoforine.
Ataarea citoscheletului asociat la membran este îns datorat în principal
unei alte proteine globulare, ankirina (masa molecular ~210kDa, diametrul
~9nm). Ankirina se leag atât la subunitatea a spectrinei, la cea de-a 15-a unitate
repetitiv [13] (în treimea dinspre cap a heterodimerului), cât i la endodomeniul
benzii 3, asigurând ancorarea reelei citoscheletului membranar, prin intermediul
laturilor ochiurilor acestuia.
Pe scurt, citoscheletul membranei (Fig. 2.12) este format din tetrameri de
spectrin ce organizeaz laturile ochiurilor reelei, unde prin intermediul ankirinei se
leag de banda 3 (protein transmembranar) i din mici filamente de actin care
leag cozile tetramerilor de spectrin la nivelul nodurilor reelei, unde, prin
intermedierea benzii 4.1, reeaua se ataeaz suplimentar la endodomeniul benzii 3,
sau al glicoforinei. Interaciunile de afinitate dintre elementele citoscheletului asociat
membranei sunt într-o dinamic permanent, astfel încât aceast ultrastructur nu
este rigid, ci într-o continu modelare care s satisfac nevoile celulei. În acest fel
eritrocitul îi modeleaz forma pentru a putea s treac prin cele mai subiri capilare
(diametrul acestor capilare este de 5Pm, în timp ce diametrul unui eritrocit este de 7-
8Pm). În timpul strbaterii acestor capilare eritrocitul capt o form concav-
convex (ca o meduz) i astfel se strecoar, cu membrana foarte aproape de cea a
celulei endoteliale din peretele vasului de sânge, favorizându-se schimbul de gaze.
Citoscheletul asociat membranei nu este doar o caracteristic a membranei
eritrocitare. El se gsete în toate celulele i este structurat asemntor, chiar dac
unele dintre componente au fost denumite diferit (spre exemplu echivalenta
spectrinei în celulele nervoase este numit fodrin). Repetm, dac la eritrocit
aceast ultrastructur este singura responsabil de forma celulei, ca i de
maleabilitatea acesteia, deoarece este un element dinamic în permanent
reconstrucie, la celelalte celule pentru asigurarea formei, citoscheletul asociat
membranei este în interrelaie cu organitul denumit citoschelet.
Fig. 2.11. Structurarea i organizarea spectrinei. (A) Ambele subuniti D i E sunt formate din
domenii repetitive de câte 106 aminoacizi i se rsucesc, antiparalel una în jurul alteia, formând un
bastona de 100nm. (B) Heterodimerii DE se leag cap-cap formând tetrameri lungi de 200nm. ©
Mircea Leabu, 2014.
39
Fig. 2. 12. Organizarea citoscheletului membranar, ca o reea dinamic de endoproteine cu

ochiuri i noduri. Tetramerii spectrinei formeaz laturile ochiurilor, la nivelul crora ultrastructura se
ataeaz prin ankirin la banda 3 (canalul de schimb anionic), protein transmembranar multipas,
prin aceste interaciuni reeaua solidarizându-se membranei. Nodurile se formeaz prin ataarea
multipl a tetramerilor de spectrin la nivelul cozilor heterodimerilor DE, iar interaciunile acestora sunt
întrite prin participarea oligomerilor de actin i a proteinei benzii 4.1. Banda 4.1 ataeaz
suplimentar citoscheletul membranar la ultrastructur, interacionând cu domeniul citosolic al
glicoforinei (încrctura glucidic bogat a glicoforinei este reprezentat prin norul albastru de
deasupra ectodomeniului proteinei). Traseele contorsionate ale tetramerilor de spectrin sugereaz
maleabilitatea ultrastructurii i se datoreaz punilor flexibile pe care monomerii D, respectiv E le
organizeaz între unitile repetitive de tip spectrinic. © Mircea Leabu, 2014.
Revenind la metodologia electroforetic de studiere a proteinelor

membranare, aceasta a fost dezvoltat, prin combinare cu extragerea i ataarea
proteinelor – rezolvate prin SDS-PAGE – pe membrane adsorbante (din
nitroceluloz sau poli-difluorur de viniliden). Extragerea proteinelor din gelul de
electroforez se realizeaz tot sub aciunea câmpului electric aplicat unui sandvi
format de gelul obinut dup migrarea i rezolvarea proteinelor pe baza greutilor
lor moleculare i membrana adsorbant, iar procesul este numit transfer
electroforetic. Tehnica se finalizeaz cu o etap de imunodetecie a diferitelor specii
proteice prin folosirea de anticorpi, printr-o metod indirect (anticorpi primari,
direcionai specific împotriva unei anumite proteine, urmai de anticorpi secundari,
anti-specia surs a anticorpilor primari, cuplai, de regul, cu peroxidaz de hrean,
pentru reacia de vizualizare prin chemiluminiscen amplificat). Prin aceast
dezvoltare pot fi investigate proteine membranare fr a mai fi nevoie de izolarea
iniial a unor fraciuni pure de membran. Singurul aspect ce trebuie cunoscut
anterior este localizarea membranar a proteinei investigate. Pentru exemplificarea
tehnicii (denumit în literatura de specialitate, fr o semnificaie semantic,
„western blot”) artm variaia exprimrii unor integrine în culturi celulare
obinute din celule musculare netede din peretele de tromp uterin (Fig. 2.13).
Tehnica este deosebit de util în studiul efectelor anumitor condiii experimentale
asupra exprimrii proteinelor studiate, ca i în studii de activare a unor proteine în
diferite procese celulare, dac exist anticorpi specifici pentru domeniile proteinei
care sufer modificri ca urmare a activrii.
40
Fig. 2.13. Investigare prin „western blot” a

variaiei exprimrii unor diverse subuniti de
integrine în celule musculare netede din tromp
uterin, la diferite pasaje obinute dup iniierea
unei culturi primare. 1 – pasajul 2; 2 – pasajul 4; 3
– pasajul 6; 4 – pasajul 8. Cifrele din partea stâng
a imaginii reprezint masele moleculare ale
standardelor. Evidenierea E-actinei ne ajut s
dovedim încrcarea proteic identic a probelor
supuse electroforezei. © Mircea Leabu, 2014.
Investigrile funcionale i de distribuire/redistribuire ale proteinelor

membranare se pot realiza prin alte tehnici de studiere a celulelor. Microscopia de
fluorescen reprezint o asemenea modalitate de studiu într-o multitudine de
modelri experimentale (Fig. 2. 14 i Fig. 2. 15).
Fig. 2.14. Proteine membranare identificate prin imunofluo-

rescen. (A) Proteina CD31 (abreviaie de la Cluster of Differen-
tiation 31), cunoscut i ca PECAM-1 (de la Platelet Endothelial Cell
Adhesion Molecule 1) este uniform distribuit pe suprafaa celulelor.
(B) Conexina, o protein ce formeaz jonciuni comunicante (acestea
organizându-se ca microdomenii de membran) are o distribuie în
pete în membrana celular. (Imagini puse la dispoziie, cu amabilitate
de Dr. Florea Lupu, University of Oklahoma Health Sciences Center.)
© Florea Lupu, 2014.
41
Fig. 1.15. Evidenieri prin microscopie de fluorescen a organizrii i reorganizrii unor

proteine membranare i a citoscheletului actinic la celule în repaus (A-G), respectiv dup
stimulare cu factor de cretere epidermal, abreviat EGF, (H-N). În verde, este prezentat
distribuia integrinei D2E1 (care se leag de colagen) înainte (A), respectiv dup stimularea celular
(H). Se observ c pe celulele în repaus integrina este distribuit uniform în pete mici, iar dup
expunere la EGF exist o redistribuire cu aglomerarea semnificativ a proteinei la nivelul corpului
celular, în timp ce la nivelul lamelipodiilor, extinse datorit stimulrii celulei, se pstreaz o distribuie
în pete mici. În rou, este reprezentat situaia citoscheletului actinic. Acesta este distribuit
preponderent cortical în celulele aflate în metabolism bazal (B), în timp ce dup stimulare, alturi de o
mai accentuat organizare cortical, se formeaz fibre de stres i o reea de filamente de actin la
nivelul lamelipodiilor (I). În magenta, este evideniat receptorul pentru EGF care se distribuie
respectând citoscheletul actinic în celulele aflate în repaus (C) i se expune amplu pe suprafaa
membranar a celulei stimulate (J). În imaginile D-G se prezint suprapunerile organizrii la celula în
repaus a diferitelor componente investigate pentru identificarea eventualelor co-localizri: integrina i
actina (D), receptorul pentru EGF i integrina (E), receptorul pentru EGF i actina (F) sau pentru
toate proteinele evideniate (G). Aceleai posibile co-localizri pot fi urmrite pentru celulele stimulate
în imaginile K-N: integrina i actina (K), receptorul pentru EGF i integrina (L), receptorul pentru EGF
i actina (M) sau în cazul tuturor proteinelor studiate (N). Celulele supuse modelului experimental au
fost ataate pe suprafee de cultur acoperite cu colagen tip I. © Mircea Leabu, 2014.
Din cele discutate pân aici rezult c proteinele contribuie la caracteristicile

structurale conferite membranelor de bistratul lipidic, nuanându-le. Astfel,
proteinele sporesc eterogenitatea compoziiei membranelor ca i asimetria
structural a acesteia.
42
Totui, în ciuda complexitii interaciunilor pe care proteinele membranare le

stabilesc între ele, cu lipidele membranare, sau (dup cum vei constata în
numeroase ocazii prin parcurgerea i însuirea informaiilor de biologie celular a
biomembranelor) cu elemente moleculare complexe intracelulare, ori din afara
celulelor, aceste componente responsabile de funciile metabolice sunt mobile,
micându-se în planul membranei. Punctând aspecte legate de dinamica proteinelor
membranare, vom putea înelege posibilitatea redistribuiei lor în funcie de starea în
care celulele se afl (Fig. 2.16). Mai mult, reorganizrile i redistribuirea elementelor
biochimice la nivelul membranei permit celulei s îi adapteze comportamentul la
nevoile impuse de condiiile de mediu sau de propriile necesiti.
2.3.4. Mobilitatea proteinelor membranare

Dinamicitatea proteinelor membranare se bazeaz pe dou tipuri de micri:
micri de rotaie i micri de translaie.
Micarea de rotaie a proteinelor membranare în jurul propriei axe, denumit
i difuzie rotaional, este de cel puin 1000 de ori mai lent decât a lipidelor.
Este lesne de îneles acest lucru gândindu-ne la diferenele de gabarit între lipide i
proteine.
Micarea de translaie, denumit i difuzie lateral, este i ea mult mai
lent decât a lipidelor, fiind în medie de 1Pm/s. Lentoarea difuziei laterale a
proteinelor nu trebuie îneleas numai prin diferenele de mrime între acestea i
lipide, ci i prin interaciunile pe care proteinele le stabilesc în mod dinamic între ele
sau cu alte structuri dinuntrul sau din afara celulei. Astfel aceeai protein, în
aceleai condiii de fluiditate a bistratului lipidic, se poate mica mai repede sau mai
încet în dependen de starea funcional, de moment a ei (interacioneaz sau nu cu
alte componente membranare, celulare sau extracelulare). Pe de alt parte, migrarea
lateral a proteinelor membranare poate fi limitat, din considerente impuse de
nevoile funcionale ale celulelor, numai la anumite domenii ale membranei. De
exemplu, celulele polarizate ale epiteliilor unistratificate îi creeaz i îi pstreaz o
compoziie proteic diferit la nivelul membranei apicale, fa de cea de la nivelul
membranei latero-bazale; asta deoarece cele dou domenii diferite ale membranei
celulare au funcii diferite. Mai mult, micarea proteinelor membranare este limitat
i din cauza îngrdirilor pe care le impun organizarea citoscheletului membranar i a
filamentelor de actin din citoscheletul cortical. Au fost descrise trei niveluri
ierarhice de îngrdire a mobilitii proteinelor pe distane între 2 i 300nm, numite
domenii de mezoscal: domeniul dinamicii complexelor proteice (3-10nm), domeniul
plutelor lipidice (2-20nm) i domeniul compartimentrii prin citoscheletul
membranar/actina organizat cortical [15]. Toate aceste aspecte nuaneaz dinamica
proteinelor membranare într-un mod care se rsfrânge asupra funciilor, iar lipidele
nu par a scpa de împiedicri similare de libertate, chiar dac rigoarea supunerii
acestora nivelelor de restricii menionate este mai puin rigid.
Dovezile experimentale asupra translaiei proteinelor (difuziei laterale a
proteinelor) în planul membranei au venit din observaii colaterale, nu neaprat din
experimente imaginate i conduse special pentru investigarea acesteia.
Prime dovezi au fost aduse în 1970 [16], când se urmrea obinerea de celule
hibride între om i oarece (aa-numiii heterocarioni). Pentru a se monitoriza
fuziunea celulelor i obinerea heterocarionilor, cele dou tipuri de celule au fost
marcate cu anticorpi specifici, ce purtau fluorescene de culori diferite. În celula
hibrid s-a observat c fluorescenele iniial localizate separat, s-au amestecat dup
40 de minute, distribuindu-se uniform în membrana heterocarionului. Aceast
observaie a fost explicat prin capacitatea proteinelor membranare de a difuza în
planul membranelor crora le aparin.
43
Alte dovezi au venit din observaiile asupra fenomenelor de “patching /

capping” pe care le-am putea denumi în românete ptare (maculare) /
calotare, observate chiar la microscopul electronic în experimente corespunztor
conduse [17]. Iat în ce constau aceste observaii. Limfocitele, a cror suprafa era
marcat iniial uniform cu anticorpi policlonali marcai cu feritin [17] sau cu
fluorocromi [18], prezentau în timp aglomerri în pete, iar în cele din urm feritina
sau fluorescena se adunau în întregime polar, sub forma unei tichii (calote sferice).
Explicaia acestei realiti experimentale nu putea fi dat decât acceptând c
proteinele, distribuite iniial uniform în planul membranei, pot difuza lateral liber,
iar ambivalena i caracterul policlonal al anticorpilor folosii, prin legri încruciate,
contribuiau la unirea partenerilor de reacie în complexe din ce în ce mai mari,
sfârind prin formarea unui complex singular.
Al treilea tip de experimente, de aceast dat destinate studiului difuziei
laterale a moleculelor individuale de rodopsin (cromoprotein cu fluorescen
intrinsec) din membranele discurilor celulelor cu bastonae din retin, sunt cele
care studiaz refacerea fluorescenei dup foto-stingere denumit prescurtat FRAP
(de la “Fluorescence Recovery After Photobleaching”). Asemenea experimente au
permis i estimarea coeficienilor de difuziune, aadar aprecierea cantitativ a
micrii proteinelor membranare [19]. Ele se pot realiza i pentru proteine care nu
sunt fluorescente de la sine, dup ce acestea au fost marcate cu fluorocromi. Pe scurt,
aceste experimente constau în stingerea fluorescenei unei zone micronice din
membran, prin aciunea unui fascicul de lumin intens i puternic focalizat (de
obicei raz laser) i în urmrirea refacerii fluorescenei în acea zon, datorit difuziei
moleculelor fluorescente din celelalte zone, neafectate (nestinse) ale membranei. În
acest fel se pot msura coeficieni de difuziune pentru proteine membranare din
orice tip de celul.
2.3.5. Rolul proteinelor membranare

Ca i în cazul lipidelor membranare, proteinele au atât rol structural, cât i
rol metabolic. Este evident c atâta timp cât proteinele integrale sunt cufundate în
bistratul lipidic rolul lor în organizarea membranei ca ultrastructur celular (rolul
structural) este unul intrinsec. Prezena proteinelor în bistrat nu trebuie s afecteze
funcia de barier selectiv conferit de însui elementul de baz din organizarea
membranelor. O bun exemplificare asupra rolului structural al proteinelor
membranare îl constituie comentariul aferent citoscheletului membranar (vezi mai
sus). Se poate aduga rolul unor proteine transmembranare numite caderine în
stabilirea jonciunilor dintre celule, la nivelul esuturilor sau a celor numite
integrine (vezi CASETA 2.2) implicate, de regul, în interaciunea celulelor cu
componente ale matricei extracelulare (proteine i/sau glicoproteine ce structureaz
diverse componente tisulare între celule). Rolul structural, al unor asemenea
proteine transmembranare, este acela de a menine celulele într-o ordonare coerent
în organizarea esuturilor, dar i de a permite acestora s schimbe informaii pentru
o integrare eficient, iar schimbul de informaii transcede funcia structural; aadar
atât caderinele, cât i integrinele au i funcii metabolice (vezi în capitolul 3, la
subcapitolul ”Semnalizarea celular”). Asta înseamn c nu se poate face o delimitare
între cele dou tipuri de funcii (lucru valabil i pentru lipide de altfel). Aceleai
entiti moleculare pot avea atât rol structural, cât i rol metabolic (vezi mai sus, ca
exemplu, proteina banda 3 din membrana eritrocitar). Aa stau lucrurile i pentru
integrine, respectiv caderine care au atât un important rol structural (ataarea
celulelor la substrat sau unele de altele), cât i rol în culegerea de informaii legate de
ambiana în care celulele se gsesc, ceea ce le implic în declanarea de procese
celulare menite s creeze rspunsuri specifice condiiilor concrete din mediu.
44
CASETA 2.2. Integrinele i rolul lor. Integrinele sunt glicoproteine transmembranare,

structurate ca heterodimeri (fiecare subunitate – sau – fiind o protein unipas, de tipul I),
cu rol în aderarea celulelor la matricea extracelular i în transmiterea de informaii legate de
caracteristicile fizico-chimice ale structurilor macromoleculare din mediul extracelular. Exist,
identificate în momentul de fa, 18 subuniti i 8 subuniti , care, prin diverse combinaii,
formeaz (dup informaiile de care dispunem în acest mement) 24 de tipuri distincte de integrine.
Aceti heterodimeri diferii au specificiti diverse, atât sub aspectul partenerului de interaciune
din matricea extracelular pe care îl leag, cât i sub aspectul afinitilor fa de acetia. Altfel
spus, chiar dac specificitatea integrinelor este un parametru degenerat (mai multe proteine de
matrice se pot lega de aceeai integrin i mai multe integrine pot lega aceeai protein de
matrice), afinitatea acestor interaciuni este diferit, iar semnalele pe care celula le primește dup
angajarea integrinelor în interaciunile specifice sunt, de asemenea, diferite. Dac rolul structural
al integrinelor este relativ bine caracterizat, rolul metabolic al lor (procesele de semnalizare pe care
le declaneaz) este departe de a fi cu claritate elucidat, dei nu este contestat de nimeni în
comunitatea tiinific. Integrinele sunt implicate în controlul unor procese celulare ca
diferenierea, moartea celular programat, motilitatea. Toate aceste procese sunt importante atât
în organizarea normal a esuturilor i organelor, cât i în patologii dintre cele mai diverse. În
aceste aspecte de biologie normal sau patologie celular, integrinele coopereaz cel puin cu
receptorii pentru factori de cretere. Cile de semnalizare ce sunt iniiate de integrine se
intersecteaz cu cele iniiate de receptorii pentru factori de cretere [20], nuanând într-o plaj
larg capacitile celulelor de a rspunde factorilor externi i asigurând o multitudine de
posibiliti de adaptare.
În general, atât pentru caderine, cât i pentru integrine se poate afirma c ele
determin celula s se comporte difereniat în funcie de statusul lor: un anumit
comportament, atunci când sunt angrenate în interaciuni cu alte celule, respectiv
componente ale matricei celulare i un alt fel de comportament, atunci când sunt
detaate din astfel de interaciuni, iar gradele lor de libertate sporesc.
Detalii asupra rolurilor metabolice ale proteinelor membranare sunt
prezentate în subcapitolele privind transportul membranar i semnalizarea celular.
Aici vom aminti, doar în linii generale, c rolurile metabolice ale proteinelor
membranare se manifest în ceea ce privete schimburile de substan i informaii
dintre celule sau dintre acestea i mediu. Astfel, proteinele membranare pot fi
receptori (pentru hormoni, factori de cretere, citokine, chemokine),
transportori prin membran (canale ionice, pompe ionice, conexoni, porine)
sau transportori cu membran (clatrin, caveolin: proteine ce structureaz
înveliuri ale unor microdomenii din membran pentru a permite invaginarea
acestora i detaarea sub form de vezicule, realizând procese denumite generic
endocitoz; alte proteine asigur fuzionarea unor vezicule cu membrana celular,
facilitând fenomenul de secreie prin exocitoz; vezi amnunte la transportul
membranar).
Proteinele membranare mai pot funciona ca enzime (metaloproteinaze
pentru componente de matrice extracelular, fosfolipaze – vezi diversitatea acestora,
mai sus, la seciunea despre rolul lipidelor membranare, kinaze, fosfataze) sau ca
proteine implicate în semnalizare (de exemplu, proteine platform/schel, numite
i proteine adaptoare sau proteine G). Detalii asupra mecanismelor prin care aceste
proteine membranare îi realizeaz funciile vei gsi (i trebuie folosite într-o
discuie profesionist despre aceast component molecular a membranei) pe
parcursul însuirii tuturor celorlalte informaii despre celul.
În toate aceste funcii asimetria structurrii membranei este deosebit de
important. Astfel, receptorii, dar i proteinele de adeziune (caderinele i integrinele)
prin asimetria lor structural permit prin ectodomenii interaciunea cu liganzii
specifici, iar prin endodomenii asigur transmiterea informaiei ctre interiorul
celulei i declanarea unor procese celulare care se constituie în rspuns celular la
semnalele receptate. De remarcat c în transmiterea semnalelor prin receptori sau
integrine un rol important revine domeniului transmembranar al acestor proteine
45
integrale. Domeniile transmembranare au capacitatea de a suferi rearanjri

conformaionale, induse de legarea ligandului. Aceste rearanjri conformaionale
asigur transmiterea, din afara celulei în citoplasm, a informaiei purtate de ligand
i predate prin interaciunea cu receptorul specific. Fenomenul de transmitere a
informaiei din afara celulei în citoplasm este denumit i transducie a semnalului.
Informaia, ajuns la nivelul endodomeniului receptorului, este preluat, prelucrat
i, de regul, amplificat de participanii la diversele procese de semnalizare
(mesageri secunzi i/sau efectori intracelulari, care vor fi definii la seciunea legat
de semnalizarea celular). De menionat aici c efectele asupra conformaiei
domeniilor transmembranare sunt dependente i de aspectele legate de parametrul
fizic fluiditate a membranei, detaliat mai sus, în seciunea privitoare la starea fizic a
bistratului lipidic.
În rezumat, proteinele membranare sporesc eterogenitatea compoziional i
asimetria membranelor i moduleaz proprietile fluide ale acestora, adic
accentueaz i modeleaz caracteristicile induse de bistratul lipidic. Altfel spus,
proteinele membranare coopereaz cu lipidele atât în structurarea membranei cât i
în perfectarea funcionalitii acesteia, prin rolul lor metabolic, cel care asigur
integrarea celulei cu mediul. În exercitarea rolurilor lor metabolice, proteinele
membranare pot antrena atât lipidele membranare, cât i componente citosolice sau
extracelulare.
1. Steck TL. (1974) The organization of proteins in the human red blood cell membrane. A review. J Cell
Biol. 62: 1-19.
2. Schultz AM, Henderson LE, Oroszlan S. (1988) Fatty acylation of proteins. Annu Rev Cell Biol. 4:
611-647.
3. Rodriguez-Boulan E, Powell SK. (1992) Polarity of epithelial and neuronal cells. Annu Rev Cell Biol.
8: 395-427.
4. Spiro RG. (2002) Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease
implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12: 43R-56R.
5. Marchesi VT, Furthmayr H, Tomita M. (1976) The red cell membrane. Annu Rev Biochem. 45:
667-98.
6. Helenius A, Simons K. (1975) Solubilization of membranes by detergents. Biochim Biophys Acta.
415: 29-79.
7. Chasis JA, Mohandas N. (1992) Red blood cell glycophorins. Blood. 80: 1869-1879.
8. Tayyab S, Qasim MA. (1988) Biochemistry and roles of glycophorin A. Biochem Educ. 16: 63-66.
9. Takakuwa Y. (2001) Regulation of red cell membrane protein interactions: implications for red cell
function. Curr Opin Hematol. 8: 80-84.
10. Williamson RC, Toye AM. (2008) Glycophorin A: band 3 aid. Blood Cells Mol Dis. 41: 35-43.
11. Orlandi PA, Klotz FW, Haynes JD. (1992) A malaria invasion receptor, the 175-kilodalton
erythrocyte binding antigen of Plasmodium falciparum recognizes the terminal Neu5Ac(alpha2-3)Gal-
sequences of glycophorin A. J Cell Biol. 116: 901-909.
12. Drickamer LK. (1978) Orientation of the band 3 polypeptide from human erythrocyte membranes.
Identification of NH2-terminal sequence and site of carbohydrate attachment. J Biol Chem. 253: 7242-
7248.
13. Vince JW, Reithmeier RA. (1998) Carbonic anhydrase II binds to the carboxyl terminus of human
band 3, the erythrocyte C1-/HCO3- exchanger. J Biol Chem. 273: 28430-28437.
14. Kennedy SP, Warren SL, Forget BG, Morrow JS. (1991) Ankyrin binds to the 15th repetitive unit
of erythroid and nonerythroid beta-spectrin. J Cell Biol. 115: 267-277.
15. Kusumi A, Fujiwara TK, Chadda R, Xie M, Tsunoyama TA, Kalay Z, Kasai RS, Suzuki KG.
(2012) Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction:
commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annu Rev Cell
Dev Biol. 28: 215-250. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100809-151736.
46
16. Frye LD, Edidin M. (1970) The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-
human heterokaryons. J Cell Sci. 7: 319-335.
17. de Petris S, Raff MC. (1973) Normal distribution, patching and capping of lymphocyte surface
immunoglobulin studied by electron microscopy. Nat New Biol. 241(113): 257-259.
18. Schreiner GF, Unanue ER. (1975) The modulation of spontaneous and anti-Ig-stimulated motility of
lymphocytes by cyclic nucleotides and adrenergic and cholinergic agents. J Immunol. 114(2 pt 2): 802-
808.
19. Wey CL, Cone RA, Edidin MA. (1981) Lateral diffusion of rhodopsin in photoreceptor cells measured
by fluorescence photobleaching and recovery. Biophys J. 33(2): 225-232.
20. Leabu M, Uniyal S, Xie J, Xu YQ, Vladau C, Morris VL, Chan BM. (2005) Integrin D2E1
modulates EGF stimulation of Rho GTPase-dependent morphological changes in adherent human
rhabdomyosarcoma RD cells. J Cell Physiol. 202, 754-766.
47
2.4. Componenta glucidic a membranei

În afar de lipide i proteine, în organizarea molecular a membranelor se
întâlnesc i glucide. În ceea ce urmeaz vom folosi termenul de component glucidic
a membranelor i nu de glucide membranare, pentru a fi, prin exprimare, mai
aproape de realitatea biologic. Motivaia acestei preferine este dat de faptul c, în
membranele celulare (ca i în endomembrane) glucidele nu se gsesc ca entiti
individuale, ci sunt grefate pe un purttor lipidic sau proteic, ca structuri în principal
oligozaharidice, dar i polizaharidice. Componentele biochimice complexe formate
din glucide i lipide sau din glucide i proteine poart denumirea generic de
glicoconjugate. Prile glucidice ale glicoconjugatelor sunt dispuse întotdeauna pe
faa extern a membranelor celulare, formând ceea ce denumim glicocalix. Înc de
la început, în baza afirmaiei anterioare i rememorând faptul c pe faa intern a
membranelor se afl citoscheletul asociat, putem puncta faptul c prezena acestor
dou (ultra)structuri sporete asimetria membranelor. În cele ce urmeaz, abordând
aspecte generale referitoare la prezena glucidelor în organizarea membranelor, vom
adânci argumentarea nu numai pentru caracterul asimetric al structurrii acestora,
dar i pentru eterogenitatea compoziional a lor, respectiv pentru efectele asupra
comportamentului fluid manifestat bidimensional.
2.4.1. Definiia glicocalixului i organizarea lui molecular

Glicocalixul reprezint înveliul glucidic al celulelor, constituit din structuri
oligozaharidice sau polizaharidice inserate pe lipide ale foiei externe a bistratului
sau pe proteine (adic pe ectoproteine, respectiv pe ectodomeniile proteinelor
transmembranare). În privina modului de organizare a componentei glucidice a
membranelor punctm c glicolipidele poart doar structuri oligozaharidice, în timp
ce proteinele pot purta atât structuri oligozaharidice, cât i polizaharidice.
Din punctul de vedere al structurii biochimice globale, trei sunt componentele
membranare ce particip la structurarea glicocalixului prin prile glucidice din
compoziia lor: glicolipidele, glicoproteinele i proteoglicanii. Toate cele trei
categorii de componente sunt denumite generic, repetm, glicoconjugate.
Grosimea glicocalixului este, în medie, între 20 i 50nm, variind de la un tip de celul
la altul, dar i pentru aceeai celul de la un domeniu membranar la altul (spre
exemplu la celulele epiteliilor unistratificate între polul apical i cel latero-bazal).
Sunt îns raportri de grosimi ale glicocalixului ce pot ajunge pân la 200 i chiar
2000nm [1]. O regul pe care o aplicm în înelegerea grosimii glicocalixului este c
acesta are o grosime cu atât mai mare, cu cât celulele sunt mai puin implicate în
interaciuni cu alte celule sau cu substrate din matricea extracelular. Aplicând
aceast regul vom intui c glicocalixul cel mai gros îl prezint celulele sanguine. Pe
de alt parte, la celulele epiteliilor monostratificate, polul apical are un glicocalix mai
abundent, fa de polul latero-bazal. La celulele epiteliilor în monostrat definim dou
domenii membranare11: domeniul apical, situat la polul orientat ctre
cavitile pe care aceste epitelii le cptuesc (polul apical al celulei), respectiv
domeniul latero-bazal, situat ctre spaiile dintre membranele a dou celule
învecinate ale epiteliului i, respectiv, ctre membrana bazal, element al matricei
extracelulare prin care aceste epitelii se ataeaz de structurile tisulare (polul latero-
bazal al celulei). Mai mult, acolo unde mediul din cavitatea cptuit de celulele
epiteliale monostratificate este puternic agresiv (de exemplu în stomac, sau în
intestin), glicocalixul este îngroat de secreii glicoproteice de tip mucinic (vezi, mai
11
Atragem atenia a nu se face confuzie între noiunea de domeniu membranar i cea de microdomeniu de
membran.
48
jos, prin ce se caracterizeaz glicoproteinele de tip mucinic, numite mai scurt

mucine, din mucusul diferitelor structuri).
În cele ce urmeaz vom discuta aspectele cu caracter general legate de
organizarea glicocalixului. În privina argumentrii pentru participarea componentei
glucidice la sporirea eterogenitii biochimice a membranei, nu vom proceda la
metoda clasificrii structurilor zaharidice din glicocalix. Ar fi o munc greu de dus la
bun sfârit, întrucât complexitatea i diversitatea structural a lanurilor
oligozaharidice de la nivelul acestui înveli glucidic al celulelor face abordarea
detaliilor dificil, dar i ineficient i fr justificare în raport cu scopul nostru:
cunoaterea organizrii membranei la nivel molecular, pentru a înelege funcionarea
ei ca un sistem integrat. Aceast modificare a modalitii de abordare nu va afecta cu
nimic înelegerea organizrii acestei componente moleculare a membranelor i a
rolului ei, ci doar va simplifica transmiterea cunotinelor în toat diversitatea lor.
În structurarea glicocalixului nu particip toate monozaharidele existente în
natur. Numai apte intr, de regul, în alctuirea lanurilor oligozaharidice ale
glicolipidelor i glicoproteinelor. Acestea sunt, într-o ordine lipsit de o anumit
semnificaie: glucoza (Glc), galactoza (Gal), manoza (Man), fucoza (Fuc), N-
acetil-glucozamina (GlcNAc), N-acetil-galactozamina (GalNAc) i acizii
sialici (SA). Spunem acizi sialici (la plural) i nu folosim singularul deoarece ne
referim la o clas de glucide ce deriv din structura de baz a acidului neuraminic
(Fig. 2.16), un glucid cu 9 atomi de carbon în molecul, cel din poziia 1 aflându-se
într-o grupare carboxil (de unde i numele de acid). De la acidul neuraminic deriv
primii reprezentani a dou serii: acidul N-acetil-neuraminic (NANA), cel mai
rspândit i acidul N-glicolil-neuraminic. Dar diversitatea acizilor sialici nu se
oprete aici, deoarece reprezentanii de baz pot fi O-acetilai la hidroxilii de la
carbonii 4, 7, 8 i/sau 9. inând cont c pot fi mono-, di- sau, mai rar, chiar tri-
acetilai ne facem o idee mai exact asupra diversitii entitilor moleculare incluse
sub numele de clas acizi sialici. Speciile tetra-acetilate nu se întâlnesc în glicocalix i
este lesne s raionm de ce: sunt componente deosebit de hidrofobe i nu pot fi
acomodate acolo, într-o formaiune ultrastructural prin excelen hidrofil. Aceast
diversitate enorm de tipuri de acizi sialici se constituie, iat, ca o prim
argumentare a eterogenitii structurilor glucidice ale glicocalixului.
În afar de cele apte monozaharide menionate, în proteoglicani întâlnim i
xiloza (monozaharidul prin care se poate lega structura glucidic de o serin din
partea proteic), precum i acizi uronici (acid glucuronic i acid iduronic).
Dac ar fi s ne referim la detalii fizico-chimice care caracterizeaz
monozaharidele menionate, putem afirma c numai Fuc este din seria L, toate
celelalte aparinând seriei D.
Fig. 2.16. Structurile de baz ale seriilor de acizi sialici. Acidul neuraminic nu a fost identificat ca
atare în componenta glucidic a biomembranelor, ci doar derivaii N-acetil- i N-glicolilai si.
49
Prin enumerarea monozaharidelor ce particip la structurarea lanurilor

oligo- sau poli-zaharidice ce organizeaz glicocalixul accentum ideea de
eterogenitate structural a membranelor celulare i, în general, a biomembranelor.
Dar lucrurile nu se opresc doar la acest nivel. Pentru argumentarea caracterului
eterogen al structurrii membranelor (indus de lipide, apoi amplificat de proteine,
dar i de structurile glucidice) trebuie s subliniem c îniruirea glucidelor în
lanurile oligozaharidice nu este aceeai, diferind între glicolipide i glicoproteine,
diferind între diversele glicolipide, diferind între diversele glicoproteine. Mai mult,
legarea monozaharidelor între ele se poate face în mai multe moduri, întrucât exist
mai multe grupri hidroxil disponibile. E drept c nu toate din aceste posibiliti sunt
utilizate de celule. Diversitatea de posibiliti teoretice este limitat de tipurile de
glicoziltransferaze (numele generic pentru enzimele care biosintetizeaz structuri
glucidice în celule) pe care o anumit celul le are în reticulul endoplasmic i în
complexul Golgi, organitele unde structurile glucidice din glicolipide, glicoproteine,
sau proteoglicani sunt biosintetizate. Glicoziltransferazele sunt enzime cu
stereospecificitate foarte ridicat, astfel încât legarea, pas cu pas, a glucidelor unul de
altul în structurile oligozaharidice, din glicolipide i glicoproteine, nu este
întâmpltoare.
Între glicolipide, glicoproteine i proteoglicani exist însemnate diferene
structurale la nivelul componentei glucidice.
Glicolipidele, care constituie ~10% dintre lipidele membranare, conin un
singur lan oligozaharidic, de regul neramificat. Lanurile glucidice din glicolipide
conin, în general, mai puine monozaharide (rar peste 13-15). Pentru a avea o
imagine corect a organizrii spaiale a lanurilor, vom meniona c acestea nu au
traiect liniar ci sunt “contorsionate”, tocmai datorit orientrii gruprilor hidroxil
utilizate la lungirea oligomerului glucidic (rezultat al stereospecificitii
glicoziltransferazelor).
Glicoproteinele conin uzual mai multe lanuri oligozaharidice grefate pe
lanul polipeptidic. Inserarea se poate face la azotul amidic al unei asparagine
aflate întotdeauna într-o secven consens (vezi la seciunea despre biogeneza
membranelor, în volumul al II-lea) sau la hidroxilul dintr-o serin ori dintr-o
treonin. În primul caz structurile glucidice se numesc N-glicozidice, în cel de-al
doilea O-glicozidice. Structurile O-glicozidice (legate la serin sau treonin) sunt
abundente în glicoproteinele de tip mucinic. De aceea aceste tipuri de oligozaharide
din proteine sunt denumite i structuri mucinice. Structurile N-glicozidice conin
Man, cele O-glicozidice nu. Lanurile oligozaharidice ale glicoproteinelor sunt
ramificate. Ramificarea se face dup principiul dihotomic (adic din fiecare punct de
ramificare pleac numai dou ramuri). De regul, din câte se cunoate pân în
prezent, exist unul sau dou puncte de ramificare, astfel încât fiecare structur
oligozaharidic din glicoproteine poate fi biantenar sau triantenar. Structurile
oligozaharidice ale glicoproteinelor conin, de regul, un numr semnificativ mai
mare de monozaharide, în comparaie cu cele ale glicolipidelor.
Privind succesiunea monozaharidelor în lanurile oligozaharidice din
glicolipide i glicoproteine, se pot face urmtoarele afirmaii cu caracter de regul: (i)
glucoza, atunci când se afl, nu se gsete niciodat în poziie terminal a lanului;
(ii) acizii sialici, atunci când se afl (i de regul se afl), se gsesc întotdeauna în
poziia terminal a lanului. Regula nu este înclcat nici atunci când o molecul de
acid sialic se afl subterminal. Aceasta înseamn c lanurile se pot termina cu acizi
sialici legai unul de altul. Un aspect cu semnificaie biologic (vezi mai jos la
seciunea despre rolul glicocalixului) ce trebuie punctat aici este faptul c, de regul,
structurile glucidice din glicolipide i glicoproteine se termin cu elemente
purttoare de sarcin negativ (dac nu cu acid sialic, cum se întâmpl cel mai
adesea, atunci cu un glucid care sufer o sulfatare la unul dintre hidroxili).
50
Dei proteoglicanii sunt mai slab reprezentai la nivelul membranelor celulare,

ceea ce a determinat i evidenierea mai târzie a prezenei lor în glicocalix,
contribuia acestora la structurarea componentei glucidice a membranelor nu poate
fi neglijat, din cel puin dou motive. În primul rând încrctura lor glucidic
depete cu mult componenta proteic (90-95% de mas glucide, 5-10% maxim
protein în structura proteoglicanilor, în timp ce în glicoproteine raportul masic
glucide/proteine este subunitar) i, în al doilea rând, structurile glucidice
(polizaharidice) sunt cele mai lungi dintre toate cele întâlnite la nivelul glicocalixului.
Diferenele de organizare la nivel chimic dintre glicoproteine i proteoglicani
îndreptesc biochimitii s le considere dou tipuri diferite de glicoconjugate, dei
ambele au în structur lan polipeptidic i glucide. Lanurile polizaharidice ale
proteoglicanilor poart denumirea de glicozaminoglicani. Glicozaminoglicanii
sunt structuri polizaharidice neramificate, formate din uniti dizaharidice repetitive
alctuite dintr-un zahar sau aminozahar i un acid uronic (acid glucuronic sau
iduronic). Excepia de la aceast descriere de principiu a compoziiei moleculare o
prezint keratan-sulfaii în care unitile dizaharidice repetitive conin Gal (un zahar)
i GlcNAc (derivat de aminozahar). De subliniat i în acest context, puternica
încrctur negativ a proteoglicanilor provenit atât de la acizii uronici coninui,
cât i de la sulfatrile pe care le pot conine zaharurile sau aminozaharurile prezente
în moleculele glicozaminoglicanilor. Aceast puternic încrctur negativ se
rsfrânge asupra caracteristicilor fizice ale suprafeei celulare. Toate celulele din
organism poart o sarcin negativ net pe suprafaa lor, iar aceasta se datoreaz, în
principal, structurilor glucidice din glicocalix.
2.4.2. Metodologia de studiu a glicocalixului

Prezena glicocalixului la suprafaa celulelor a fost evideniat la microscopul
electronic prin metode de citochimie ultrastructural atât nespecifice (adic
metode care evideniaz structura, fr a aduce indicii referitoare la compoziia ei
biochimic), cât i specifice (metode care permit descrierea, cel puin parial, a
biochimiei structurii).
Ca un prim exemplu de metod nespecific amintim folosirea roului de
ruteniu (Fig. 2. 18, A). Acest compus interacioneaz cu sarcinile negative de la
nivelul glicocalixului impregnându-i grosimea cu nucleii grei ai ruteniului i
conferind structurii electrono-opacitate. Putem caracteriza prin aceast metod
glicocalixul sub aspectul grosimii sale i al densitii lanurilor glucidice care îl
formeaz.
O alt modalitate nespecific de a evidenia glicocalixul este aceea de a
vizualiza densitatea de sarcini negative de la suprafaa celulelor, prin folosirea de
trasori electrono-deni purttori de sarcini pozitive. Acest lucru se poate face cu
proteine cationizate (care la pH fiziologic poart sarcin net pozitiv) adsorbite pe
particule de aur coloidal (Fig. 2. 17, B i C). Caracterul particulat al trasorilor
electrono-opaci cu aur coloidal permite evidenierea mai multor aspecte legate de
organizarea înveliului exterior al membranelor, cum ar fi: abundena de elemente
purttoare de sarcini negative, distribuia lor pe diverse microdomenii de membran,
dar i grosimea ultrastructurii purttoare a sarcinilor negative. În ciuda acestor
detalii, metodele cu rou de ruteniu i cu trasori electrono-deni cationizai rmân
nespecifice, deoarece nu se adreseaz tipurilor de elemente biochimice care
determin marcrile. tim acum c ele sunt componente glucidice purttoare de
funciuni negative (grupri carboxil sau grupri sulfat esterificate pe hidroxili ai
glucidelor).
Ca metod specific pentru studiul glicocalixului prezentm citochimia
ultrastructural cu lectine [2, 3].
51
Fig. 2. 17. Identificarea nespecific a glicocalixului de la suprafaa celulelor pe baza încrcrii

negative pe care o poart multe din glucidele componente. A. Decorarea suprafeei celulare cu
rou de ruteniu. B, C. Evidenierea încrcrii negative a suprafeei luminale a celulelor endoteliale din
capilarele creierului (B), respectiv pancreasului endocrin (C) cu ajutorul albuminei serice bovine
cationizate, adsorbit pe aur coloidal de 10nm. Calitatea preparatelor ne permite s evideniem
limpede i aspectul trilaminat al membranelor în microscopia electronic de transmisie standard.
(Imagini puse la dispoziie, cu amabilitate, de Dr. Nicolae Ghinea, Département Recherche
Translationnelle, Institute Curie, Paris.) © Nicolae Ghinea i Mircea Leabu, 2014.
Lectinele12 sunt proteine sau glicoproteine ce leag specific structuri

glucidice, au cel puin dou situri de legare identice i nu sunt de origine imun
(adic nu sunt anticorpi împotriva unor epitopi ce conin glucide). Pentru fiecare
lectin exist un monozaharid determinant al specificitii, dar ambiana molecular
în care acesta se afl este, de asemenea important. Lectinele mai sunt cunoscute i
sub denumirea de aglutinine deoarece, mulumit capacitii lor de a interaciona cu
structurile glucidice, cât i datorit faptului c prezint cel puin dou situri identice
de legare, pot aglutina celulele sanguine. Lectinele au fost iniial identificate în plante
i extrase din acestea (de regul din semine). Ulterior, activiti de tip lectinic au fost
evideniate i în organismele animale, fiind implicate într-o multitudine de procese
celulare (vezi câteva exemplificri, mai jos, la seciunea referitoare la rolul
glicocalixului).
În citochima ultrastructural lectinele pot fi folosite dup cuplare cu trasori
electrono-opaci (feritin, peroxidaz de hrean, hempeptizi, aur coloidal),
în tehnici directe sau sub form nativ, în tehnici indirecte (în sandvi), metode în
doi pai. La primul pas, suprafaa celulelor este incubat cu lectina aflat în exces în
soluia folosit, pentru saturarea interaciunilor de afinitate. Excesul de molecule de
lectin este apoi îndeprtat, rmânând numai cele ataate specific de componente
glucidice ale membranei (prin unul din siturile de legare), care sunt vizualizate, în
pasul al doilea al metodei, prin legarea de glicoproteine corespunztoare, cuplate cu
trasori electrono-opaci. Tehnicile indirecte, în doi pai, pentru citochimia
ultrastructural cu lectine exploateaz existena celor dou situri identice de legare
12 Atragem atenia a nu se confunda termenul lectin cu cel de lecitin (nume generic pentru fosfatidilcoline).
52
ale uneltei de investigare. Glicoproteinele marcate cu trasorul electrono-opac se

fixeaz pe siturile de interaciune ale lectinelor rmase disponibile, dup legarea cu
unul din situri la componentele glicocalixului. Avantajul acestor metode este c
lectinele sunt folosite cu capacitile de legare (afinitatea i specificitatea) nealterate.
Afinitatea i specificitatea acestor unelte de studiu pot fi afectate în cazul folosirii
unor conjugate lectin-trasor electrono-opac, din cauza reaciilor chimice petrecute
în timpul cuplrii sau posibilelor împiedicri sterice care pot aprea în conjugat.
A fost folosit o mare gam de lectine pentru caracterizarea parial a
glicocalixului diverselor tipuri de celule (Fig. 2. 18). Amintim aici pe cele mai des
utilizate, cu glucidul determinant al specificitii lor.
Concanavalina A (ConA), o lectin din Concanavalia ensiformis, care leag -
Man dintr-un miez trimanozidic al structurilor N-glicozidice sau -Glc aflat în
poziie terminal. Rezult c la nivelul glicocalixului ConA nu se leag de Glc, aceasta
nefiind situat în poziie terminal (Fig. 2.18, A i E).
Lectina I din Ulex europaeus (UEA I),13 care recunoate -Fuc aflat în poziie
terminal a lanului oligozaharidic.
Lectina din Dolichos biflorus (DBA) interacioneaz cu structuri ce conin -
GalNAc legat de o alt GalNAc.
O alt lectin ce leag -GalNAc, îns inserat pe o Gal, este cea din Helix
pomatia (HPA).
Pentru -Gal sunt folosite lectina din arahide (PNA) i/sau lectina I din
Ricinus communis (RCA I). Specificitile celor dou lectine sunt îns diferite. PNA
(Fig. 2.18, D) se leag exclusiv de Gal aflat în poziie terminal, în timp ce RCA I
(Fig. 2.18, C i G) poate recunoate i Gal aflat în poziie subterminal, dac acidul
sialic terminal este inserat la hidroxilul de la carbonul ase al acesteia. Mai mult,
ambiana în care galactoza terminal se afl în cadrul secvenei glucidice este diferit
pentru ce leag PNA, fa de ce leag RCA I. Aadar specificitile celor dou lectine
sunt nuanate.
Au fost folosite dou lectine i pentru evidenierea citochimic a acizilor
sialici. Acestea sunt lectina din germeni de grâu (WGA) i lectina din Limulus
polyphemus (LPA). WGA (Fig. 2.18, B i F) recunoate acidul N-acetil-neuraminic-4-
O-acetilat, dar i -GlcNAc. LPA se leag de acizi sialici atât din categoria celor N-
acetilai, cât i din categoria celor N-glicolilai.
Nuanrile din specificitile acestor lectine sunt bine cunoscute sub aspectul
secvenelor în care trebuie s se afle glucidul determinant al specificitii. Utilizarea
lor aduce astfel informaii nu numai asupra prezenei i abundenei tipurilor de
glucide din compoziia glicocalixului, dar i în ceea ce privete caracterizarea parial
a structurilor oligozaharidice, a secvenelor acestora. Cu cât spectrul lectinelor
folosite este mai larg, cu atât imaginea asupra glicocalixului este mai detaliat. În
plus, combinarea acestor metode cu folosirea exo- sau endo-glicozidazelor,
pentru degradarea specific secvenial sau global a lanurilor glucidice,
completeaz fericit caracterizarea citochimic a glicocalixului. Trebuie îns
menionat c informaiile complete asupra structurilor glucidice ale glicocalixului le
aduc tot metodele biochimice, prin care putem segrega între glicolipide, glicoproteine
i proteoglicani, putem izola i caracteriza entitile moleculare. Mai mult, subtilele
implicaii ale structurilor glucidice din glicocalix asupra funcionrii membranelor se
vor putea descifra numai prin folosirea metodelor de manipulare genetic asupra
enzimelor care elaboreaz lanurile glucidice ale suprafeelor membranare. Acestea
sunt provocri ale timpurilor (nu prea îndeprtate) ce vor s vin în cercetarea de
biologie celular i molecular.
13În toate abreviaiile care urmeaz pentru lectine, ”A” vine de la termenul aglutinin. Toate abreviaiile sunt cele
folosite internaional.
53
Fig. 2.18. Caracterizarea glicoca-

lixului pentru celule endoteliale
(A-D), respectiv monocite sangu-
ine (E-G), prin citochimie ultra-
structural cu lectine, utilizând
tehnici indirecte. Trasorii elec-
trono-opaci reprezint aur coloidal
de 5nm, adsorbit cu glicoproteine
corespunztoare specificitii lecti-
nelor utilizate. Observm c struc-
turile N-glicozidice, evideniate cu
ConA sunt abundente i uniform
distribuite pe suprafaa endote-
liului (A) i a monocitelor (E), dar în
numr mai mare pe celulele san-
guine. Acizii sialici identificai de
WGA sunt slab reprezentai pe su-
prafaa luminal a celulelor endote-
liale (B), dar abundeni la suprafaa
monocitelor (F). Structurile glucidi-
ce recunoscute de RCA I sunt
abundente atât pe suprafaa endo-
teliului (C), cât i pe cea a mono-
citelor circulante (G). Comparând
legarea abundent a RCA I pe su-
prafaa luminal a celulelor endote-
liale (C), cu legarea relativ srac a
PNA (D), deducem c la suprafaa
endoteliului avem abunden de
galactoz ce poart la hidroxilul
carbonului ase acid sialic i
srcie de structuri oligozaharidice
terminate în galactoz. © Mircea
Leabu, 2014.
54
Aadar, sperana în ceea ce privete rezolvarea problemei caracterizrii

glicocalixului i în general a biologiei glucidelor celulare, sub aspectul funciilor lor, o
reprezint biologia molecular prin capacitatea de a identifica i modela bagajul
enzimatic celular implicat.
Pentru a integra informaiile structurale prezentate mai sus, cu scopul de a
înelege organizarea spaial a glicocalixului, putem rezuma c acest înveli celular
trebuie perceput ca o lizier, ca un lstri din ce în ce mai des pe msur ce
ptrundem de la exteriorul structurii ctre bistratul lipidic. El se caracterizeaz prin
eterogenitate compoziional i de organizare, sporind asimetria membranelor,
deoarece este prezent numai pe versantul extern. Aceast organizare a sugerat i
primele idei asupra funciilor glicocalixului.
2.4.3. Rolul glicocalixului

Prin asemnare cu rolul protector al prii glucidice din glicoproteine
împotriva aciunii proteazelor, se poate afirma c glicocalixul protejeaz structura
membranei celulare împotriva agresiunilor fizico-(bio)chimice. Lucrul acesta nu este
departe de realitatea biologic. Modul în care glicocalixul este organizat, confer
membranei rezisten mecanic, controlând accesul oricror factori de agresiune
ctre straturile profunde ale ultrastructurii, deci ctre bistratul lipidic i ctre
componentele proteice ale acesteia. Rolul acesta este cu atât mai important cu cât
prezena factorilor agresivi este mai mare. Aceasta este o motivaie pentru care
celulele sanguine sau polii apicali ai celulelor epiteliale dispuse în monostrat au
glicocalixul abundent. Mai mult, în anumite situaii în care agresiunile pot fi mai
accentuate, membranele sunt protejate de secreii glicoproteice abundente (de
exemplu în mucoasele gastrice i intestinale).
Dar glicocalixul nu este, nici pe departe, important numai pentru acest aspect.
Prin componentele acide din structura lor (acizii sialici, acizii uronici, gruprile
sulfat), lanurile oligo-/poli-zaharidice ale glicocalixului particip la asigurarea
sarcinii negative a suprafeei celulare. Încrctura negativ a suprafeei celulare, o
caracteristic general valabil tuturor celulelor, face ca interaciunile dintre acestea
s nu se poat realiza decât sub control celular, în zone (microdomenii) ale
membranelor înalt specializate în realizarea acestei funcii. În aceste zone, se
formeaz ceea ce numim jonciuni celulare (vezi în volumul al II-lea, la subcapitolul
despre jonciunile celulare), structuri specializate ale membranelor cu organizri i
funcii diverse. Stabilirea jonciunilor celulare are la baz fenomene de recunoatere
celular în care sunt implicate i componente glucidice ale membranelor.
Participarea structurilor glucidice (de regul prin glucidul terminal) în fenomenele
de recunoatere celular reprezint o explicaie pentru care glucoza nu se gsete în
poziie terminal; glucoza este glucidul aflat liber în umorile organismelor i ar
competiiona structurile glucidice ale glicocalixului în interaciunile pe care ar trebui
s le stabileasc în diferitele procese de recunoatere, interferând cu funciile
acestora i împiedicând celula s le controleze eficient.
Aadar, componentele structurale ale glicocalixului (componentele glucidice
ale membranelor) sunt implicate în fenomene de recunoatere celular, cu rol în
organizarea de esuturi i organe, atât prin interaciuni ale celulelor între ele, cât i
prin aderarea acestora la substrate extracelulare (la componente ale matricei
extracelulare). Se formeaz astfel ultrastructuri cu caracter permanent sau cu
existen de lung durat. În ciuda caracterului lor permanent sau de lung durat,
aceste elemente ultrastructurale de la nivelul membranelor nu trebuie înelese ca
rigide i imuabile. Ele sunt într-o permanent dinamic, rspunzând nevoilor celulei
în ceea ce privete amploarea lor, capacitatea de a se forma i desface în diferite zone
ale membranelor celulare sau capacitatea de a implica în momente diferite
componente moleculare diverse, pentru a-i nuana funcia. Caracterul permanent
55
sau de lung durat al existenei lor trebuie îneles în sensul c întotdeauna celulele
prezint asemenea ultrastructuri necesare organizrii esuturilor.
Aspectele menionate mai sus ne pot da o semnificaie biologic a faptului c
toate celulele din organism poart la suprafa o sarcin negativ net. Aceast
realitate face imposibil interaciunea i agregarea nespecific (doar pe baza unor
posibile interaciuni electrostatice) a celulelor. Ca s înelegem i mai pregnant
importana acestei încrcturi electrice a suprafeei celulelor, s ne gândim ce s-ar
întâmpla dac în sânge unele celule ar purta sarcin electric de suprafa pozitiv,
iar altele negativ. Celulele ar agrega nespecific, iar circulaia sanguin ar fi blocat,
aprând fenomene de embolie; organismul nu ar putea supravieui.
Exist fenomene fiziologice care se desfoar pe baza unor modificri ale
structurilor glucidice ale suprafeei celulare. De exemplu, eritrocitele de mamifer
dup desialilarea structurilor din glicocalix sunt eliminate din circulaie la nivelul
ficatului i splinei [4]. Pierderea de acid sialic din poziia terminal a structurilor
glucidice din glicocalix reprezint semnal de îmbtrânire a acestor celule. De
asemenea, plachetele sanguine desialilate îi micoreaz timpul de via în circulaie
i determin sporirea trombocitopoiezei [5]. Eliminarea din circulaie a celulelor cu
structurile glucidice desialilate implic receptori cu activitate lectinic îndreptat
împotriva galactozei ajuns în poziie terminal, receptori aflai în membrana i
expui la suprafaa celulelor cu rol de macrofage din organele curitoare.
Fenomenele de recunoatere celular sunt implicate i în procese biologice în care
interaciunile dintre celulele participante sunt temporare i tranzitorii. Exemplificm
prin (i) ceea ce se întâmpl la extravazarea leucocitelor în zonele de inflamare
tisular i (ii) prin implicarea structurilor glucidice în procesul de fertilizare.
(i) Extravazarea celulelor sanguine (leucocitelor) are loc printr-un
proces al crui efect este trecerea lor printre celulele endoteliale, din fluxul sanguin
în esuturi, fenomen denumit diapedez. Diapedeza se produce sub aciunea unei
varieti de stimuli, care depind de i difereniaz procesele biologice ce duc la
extravazarea diferitelor tipuri de celule sanguine [6-8]. Recrutarea leucocitelor aflate
marginal în fluxul sanguin din vasele de sânge aflate la nivelul zonelor inflamatorii,
implic structurile glucidice ale glicocalixului acestora (Fig. 2.19, A). Este vorba de
interaciunea dintre o protein membranar cu activitatea de tip lectin (protein
care apare tranzitoriu la suprafaa celulei endoteliale) i o structur glucidic din
glicocalixul leucocitelor antrenate de fluxul sanguin în capilarele din zonele
inflamatorii. Cum se petrec, în linii mari, fenomenele (Fig. 2.19) descriem în cele ce
urmeaz, încercând s punctm elementele eseniale ale fenomenelor.
____________________________________________________________________________________________________________________________
Fig. 2. 19. Fenomenele celulare i moleculare care se petrec în cursul extravazrii limfocitelor
în zonele inflamatorii. Procesul este iniiat de interaciuni care implic glicocalixul limfocitului i
anume a unor structuri oligozaharidice numite antigene Lewis X (A), care sunt purtate atât de proteine
(glicoproteine), cât i de lipide (glicolipide). Aceste oligozaharide sunt legate de selectine expuse la
suprafaa celulelor endoteliale activate din zonele inflamatorii (A i B-1). Aceste interaciuni, de joas
afinitate, încetinesc limfocitele marginale i le determin o rostogolire la suprafaa luminal a
endoteliului. Evenimentul faciliteaz interaciunea unui receptor specific cu factorul de activare
plachetar (PAF), care este produs de celulele endoteliale sub aciunea stimulilor eliberai de procesul
inflamator (B-2). Interaciunea receptorului cu PAF stimuleaz limfocitul, prin aceasta rezultând ac-
tivarea integrinei DLE2, care se leag de partenerul expus constitutiv la suprafaa celulelor endo-
teliale i anume cu molecule de adeziune celular din familia imunoglobulinelor (ICAM), determinând
o ataare mai ferm a limfocitului la endoteliu (B-2). Interaciunile integrin-ICAM, de înalt afinitate,
induc etalarea limfocitului la suprafaa endoteliului i migrarea activ (sub control celular), ctre zone
joncionale dintre dou celule endoteliale (B-3), pe unde declaneaz procesul de diapedez (B-4).
Dup extravazare, limfocitul îi continu migrarea ctre locul inflamaiei pentru a-i îndeplini rolul (B-
5). © Mircea Leabu, 2014.
____________________________________________________________________________________________________________________________
56
57
Procesele inflamatorii duc la eliberarea de stimuli care acioneaz asupra unor

receptori din membranele celulelor endoteliale, conducând la expunerea pe suprafaa
luminal a acestora (în ariile inflamate) a unor glicoproteine cu activitate lectinic,
denumite P-selectine. P-selectinele, care fac parte din familia selectinelor, nu se
afl permanent la suprafaa endoteliului, în condiii de repaus ele fiind stocate în
membrana unor structuri veziculare din interiorul celulelor endoteliale. Expunerea
tranzitorie a P-selectinelor la suprafaa membranelor apicale ale celulelor endoteliale
se face numai ca rezultat al stimulilor eliberai în procesele inflamatorii, stimuli care
activeaz celulele ce cptuesc peretele vasului sanguin. P-selectinele au parteneri de
aciune expui permanent pe suprafaa limfocitelor i anume structuri glucidice din
glicocalixul acestora, numite antigene sialilate Lewis-X (Fig. 2.19, A).
Interaciunile dintre P-selectine i leucocite, care au loc în zonele inflamatorii, sunt
de joas afinitate, fcându-se i desfcându-se, asigurând dinamica unui proces de
rostogolire a leucocitelor pe suprafaa endoteliului i încetinindu-le deplasarea.
Simultan cu expunerea P-selectinelor la suprafaa endoteliului, celulele endoteliale,
activate de stimulii eliberai în procesele inflamatorii, expun factorul de activare
plachetar (PAF) 14, un compus de natur fosfolipidic, produs prin fenomene de
metabolizare a fosfatidilcolinelor.
Cele ce urmeaz descriu fenomenele ce se petrec în cazul particular al
extravazrii limfocitelor T (Fig. 2.19, B). Prin legarea de receptorii de pe suprafaa
limfocitelor, PAF activeaz integrina L2, prin mecanisme de semnalizare
dependente de RhoGTP-aze (din familia proteinelor G mici, vezi la semnalizarea
celular). Integrinele sunt compui glicoproteici transmembranari cu rol în
adeziunea celular, au afinitate ridicat i sunt structurate ca heterodimeri . Au
specificitate pentru proteine ale matricei extracelulare sau pentru proteine
transmembranare expuse pe suprafaa unor celule partenere. În starea inactiv,
domeniul extracelular al integrinelor este pliat (precum lama unui briceag în teac),
iar dup activare ectodomeniul se extinde la lungimi de 20nm (atingând zonele
superficiale ale glicocalixului i fcând siturile de interaciune accesibile), putând
astfel interaciona cu partenerii specifici. Integrina L 2 activat se leag la
molecule de adeziune celular (CAM) din superfamilia imunoglobulinelor
ICAM-1 i ICAM-2, expuse constitutiv la suprafaa celulelor endoteliale.
Interaciunile integrin L 2-ICAM duc la ataarea ferm a limfocitelor la suprafaa
endoteliului i la oprirea lor din micarea în care fluxul sanguin le antreneaz.
Totodat are loc etalarea i migrarea activ a lor pe suprafaa celulelor endoteliale
pân în zonele joncionale dintre acestea. Ajunse aici, limfocitele se insinueaz
printre dou celule endoteliale prsind lumenul vasului i trecând în esut pentru a-
i îndeplini menirea în zona tisular inflamat.
Fenomene similare se petrec i la extravazarea monocitelor (Fig. 2.20). În
acest caz integrina implicat este M 2. Aceste fenomene de extravazare nu se petrec
numai în cazul afeciunilor inflamatorii, ci i în alte situaii patologice, cum ar fi în
procesul de aterogenez, când monocitele circulante ptrund în intima arterelor
unde încearc s curee peretele vaselor de depunerile lipidice nefiziologice,
devenind celule spumoase [2, 3].
În general, orice celul sanguin imunocompetent trece, prin asemenea
fenomene, din circulaia sângelui în esuturi, pentru a se achita de sarcinile de
aprare a organismului, atunci când este cazul. Aa se explic de ce studiul acestor
fenomene a reprezentat o provocare tiinific, atât pentru fiziologia, cât i pentru
patologia celular.
14PAF rezult din derivai alchilai ai fosfatidilcolinei (alcool gras în loc de acid gras la hidroxilul 1 al glicerinei),
dup aciunea fosfolipazei A2 i acetilarea hidroxilului 2 astfel eliberat din legtura esteric iniial. Altfel spus,
PAF este 1-alchil-2-acetil-3-fosfocolino-glicerol.
58
Fig. 2.20. Monocit circulant surprins la nivelul unei zone joncionale dintre dou celule
endoteliale, pregtit s iniieze un proces de diapedez. Suprafaa ambelor tipuri celulare este
marcat pentru evidenierea structurilor glucidice N-glicozidice (manozele au legat ConA, care ulterior
a fost marcat cu o glicoprotein adecvat, adsorbit pe aur coloidal de 5nm). © Mircea Leabu, 2014.
(ii) Fertilizarea este procesul prin care spermatozoidul fuzioneaz cu

ovocitul [9-11]. Pentru realizarea acestui proces, spermatozoizii trebuie s ajung în
tractul reproductor feminin, unde sufer un fenomen de capacitare, ce dureaz 5-
6 ore la om. Capacitarea const în modificri ale compoziiei lipidice i glicoproteice
a suprafeei capului spermatozoidului, ca i în creterea metabolismului i motilitii
celulare a acestuia. Mecanismele acestor transformri structurale i funcionale nu
sunt cunoscute înc în detaliu. Ele sunt declanate de ptrunderea anionului
bicarbonat prin membrana spermatozoidului i activarea unei adenilatciclaze.
Spermatozoidul astfel capacitat poate traversa stratul celulelor foliculare ce
înconjoar ovocitul, pentru a ajunge la zona pellucida, un înveli glicoproteic al
ovocitului, format din trei glicoproteine denumite ZP1, ZP2 i ZP3. Ajuns aici, el se
leag de structuri O-glicozidice ale ZP3, prin componente ale membranei zonei
acrozomale. Zona pellucida acioneaz ca o barier ce confer specificitate de
specie fertilizrii, astfel încât aceasta nu se poate realiza între celule ale unor specii
diferite. Acest lucru a fost evideniat prin faptul c eliminarea zonei pellucida a
ovocitului permite fertilizarea elementelor aparinând unor specii diferite. Zigoii
hibrizi astfel obinui nu sunt îns viabili. Interaciunea descris mai sus între
spermatozoid i ZP3, declaneaz ceea ce se numete reacie acrozomal. Aceasta
const în eliberarea prin exocitoz a coninutului vacuolei acrozomale, ca urmare a
unui complex proces de semnalizare, indus de legarea spermatozoidului la zona
pellucida i care are ca efect creterea concentraiei Ca2+ în citosolul
spermatozoidului. Enzimele eliberate ca urmare a reaciei acrozomale (proteaze i
hialuronidaze) degradeaz local zona pellucida permiând spermatozoidului s o
penetreze ca s ajung la membrana ovocitului de care se leag i cu care fuzioneaz.
Fuziunea are la baz activitatea unei proteine de fuziune din membrana
spermatozoidului expus ca urmare a modificrilor induse de reacia acrozomal.
59
Fertilizarea se sfârete cu ceea ce se numete reacia cortical a ovocitului, care

împiedic polispermia, adic fuziunea mai multor spermatozoizi cu acelai ovocit.
Aceast reacie cortical confer protecia secundar (de lung durat) împotriva
polispermiei. O blocare primar (de scurt durat) a polispermiei are loc pe baza
depolarizrii rapide a membranei ovocitului în momentul fuziunii cu
spermatozoidul. Reacia cortical const în activarea, în momentul fuziunii ovocit-
spermatozoid, a unei ci de semnalizare prin fosfoinozitide (fosfatidilinozitoli) care
are ca efect creterea concentraiei Ca2+ în citosolul ovocitului i exocitarea
coninutului enzimatic al granulelor corticale ale acestuia. Enzimele eliberate prin
reacia cortical modific biochimic structura zonei pellucida, prin clivarea ZP2 i
degradarea componentei glucidice a ZP3. Aceste modificri asigur rezistena zonei
pellucida la legarea altor spermatozoizi. Aadar dou dintre evenimentele eseniale
ale procesului de fertilizare (reacia acrozomal a spermatozoidului i reacia
cortical a ovocitului) implic participarea direct a unor structuri glucidice.
Complexitatea celor dou fenomene prezentate mai sus ne îndreptete s
considerm c suntem departe de a întrevedea diversitatea i subtilitatea
fenomenelor celulare dependente de structurile glucidice atât de atent i cu mare
efort elaborate de celul. Fr îndoial c, odat cu dezvoltarea unor metode i
tehnici noi de investigaie a rolului structurilor glucidice, cunotinele noastre despre
celul vor avea de câtigat, cu rsfrângere în capacitatea utilizrii fenomenelor
celulare în activitatea medical.
Pe fenomene de recunoatere celular care implic structurile glucidice ale
glicocalixului se bazeaz i compatibilitile de grup sanguin ale sistemului
ABO. Purttoarele antigenelor de grup sanguin sunt structuri oligozaharidice cu
poriuni terminale identice purtate de glicolipide i glicoproteine din membranele
celulelor sanguine. Lanurile glucidice responsabile de compatibilitile de grup
sanguin au urmtoarele structuri:
Grupa O: Fuc 12Gal 14GlcNAc…
Grupa A: Fuc 12Gal 14GlcNAc…

( 13)
GalNAc
Grupa B: Fuc 12Gal 14GlcNAc…

( 13)
Gal
Grupa AB poart în amestec ambele antigene ale grupelor A i B. Bineîneles

c apartenena la una dintre grupe este dependent de tipul de glicoziltransferaze
disponibile, ca urmare a exprimrii genelor corespunztoare. Compatibilitile de
grup sanguin sunt determinate de prezena în sânge a anticorpilor anti-antigene de
grup. Indivizii din grupa A conin în plasma lor anticorpi anti-B care vor aglutina
celulele din grupele B i AB datorit legrii de structurile glucidice împotriva crora
sunt îndreptai. Indivizii din grupa B conin anticorpi anti-A, care aglutineaz
celulele din grupele A i AB. Indivizii din grupa AB nu conin nici un fel de anticorpi
i sunt primitori universali, deoarece nu exist riscul de a aglutina celulele, indiferent
crui grup ar aparine. În sfârit, indivizii din grupa O, neavând nici structurile
glucidice specifice grupei A, nici pe cele specifice grupei B sunt donatori universali,
celulele lor sanguine nefiind aglutinate indiferent de anticorpii anti-antigene prezeni
la primitor. Este de menionat, odat în plus cât de importante pot fi mici variaii ale
structurrii componentelor glicocalixului. Pentru aspectele legate de riscurile
60
medicale ale eventualelor ignorri a grupelor sanguine, responsabilitatea (pentru

dramaticele fenomene care se pot produce) o poart doar câte un monozaharid (Gal,
respectiv GalNAc) legat în aceeai poziie a unei structuri de baz.
În încheierea prezentrii aspectelor legate de rolul componentei glucidice a
(bio)membranelor, nu putem s nu facem câteva referiri i la receptorii celulari.
Structurile glucidice sunt necesare, dar nu neaprat suficiente funcionrii
receptorilor din membranele celulare. Cea mai mare parte dintre receptorii
suprafeelor celulare, evideniai pân în prezent, sunt glicoproteine. Pentru
unii dintre ei eliminarea componentei glucidice nu afecteaz esenial capacitatea de
legare a liganzilor, pentru alii da. Pentru cei care îi pierd afinitatea fa de liganzi,
nu se poate afirma cu certitudine c structura glucidic este implicat în formarea
locului de legare. Mai degrab se speculeaz c ar fi vorba de modificri
conformaionale induse de pierderea componentei glucidice, modificri ce ar avea ca
efect distrugerea geometriei sitului de legare.
Componentele glucidice ale suprafeei celulare reprezint interes deosebit
pentru înelegerea atât a fiziologiei, cât i a patologiei celulare. De exemplu, acizii
sialici terminali din glicocalixul limfocitelor T sunt implicai în aproape toate
fenomenele ce in de destinul i funciile celulei. Supravieuirea celular însoit de
fenomenele de maturare, difereniere, motilitate i moartea celular sunt dependente
de acizii sialici i de interaciunile acestora cu proteine cu activiti lectinice,
îndreptate ctre aceste glucide terminale [12]. Modificri în glicozilarea suprafeei
celulare însoesc diferite patologii, cum ar fi în cazul celulelor canceroase, cu
implicaii asupra progresiei tumorale i metastazrii [13].
Implicarea glicocalixului în fiziologia i patologia celular a fcut ca acesta s
fie considerat int terapeutic în tratamentele multor boli [1, 14-17], ca i în
modularea unor fenomene celulare dintre cele mai diverse [18, 19].
În concluzie, se poate spune despre componenta glucidic a membranelor c
nuaneaz, uneori într-o manier de mare subtilitate, funcionarea acestei
ultrastructuri care separ, dar i unete celula cu mediul.
1. Becker BF, Chappell D, Bruegger D, Annecke T, Jacob M. (2010) Therapeutic strategies
targeting the endothelial glycocalyx: acute deficits, but great potential. Cardiovasc Res. 87: 300-310.
2. Leabu M, Ghinea N, Muresan V, Colceag J, Hasu M, Simionescu N. (1987) Cell surface
chemistry of arterial endothelium and blood monocytes in the normolipidemic rabbit. J Submicrosc
Cytol. 19: 193-208.
3. Ghinea N, Leabu M, Hasu M, Muresan V, Colceag J, Simionescu N. (1987) Prelesional events
in atherogenesis. Changes induced by hypercholesterolemia in the cell surface chemistry of arterial
endothelium and blood monocytes, in rabbit. J Submicrosc Cytol. 19: 209-227.
4. Aminoff D, Bell WC, VorderBruegge WG. (1978) Cell surface carbohydrate recognition and the
viability of erythrocytes in circulation. Prog Clin Biol Res. 23: 569-581.
5. Karpatkin S, Shulman S. (1980) Asialo platelets enhance thrombopoiesis. Trans Assoc Am
Physicians. 93: 244-250.
6. Hynes RO, Lander AD. (1992) Contact and adhesive specificities in the associations, migrations, and
targeting of cells and axons. Cell. 68: 303-322.
7. Ebnet K, Vestweber D. (1999) Molecular mechanisms that control leukocyte extravasation: the
selectins and the chemokines. Histochem Cell Biol. 112: 1-23.
8. van Buul JD, Hordijk PL. (2004) Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler
Thromb Vasc Biol. 24: 824-833.
9. Wassarman PM, Jovine L, Litscher ES. (2001) A profile of fertilization in mammals. Nat Cell Biol.
3: E59-E64.
10. Wassarman PM, Jovine L, Qi H, Williams Z, Darie C, Litscher ES. (2005) Recent aspects of
mammalian fertilization research. Mol Cell Endocrinol. 234: 95-103.
11. Wassarman PM, Litscher ES. (2008) Mammalian fertilization: the egg's multifunctional zona
pellucida. Int J Dev Biol. 52: 665-676.
61
12. Bi S, Baum LG. (2009) Sialic acids in T cell development and function. Biochim Biophys Acta. 1790:
1599-1610.
13. Dafik L, d'Alarcao M, Kumar K. (2010) Modulation of cellular adhesion by glycoengineering. J Med
Chem. 53: 4277-4284.
14. Drake-Holland AJ, Noble MI. (2009) The important new drug target in cardiovascular medicine –
the vascular glycocalyx. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 9: 118-123.
15. Du J, Yarema KJ. (2010) Carbohydrate engineered cells for regenerative medicine. Adv Drug Deliv
Rev. 62: 671–682.
16. Schwardt O, Kelm S, Ernst B. (2013) SIGLEC-4 (MAG) Antagonists: From the Natural
Carbohydrate Epitope to Glycomimetics. Top Curr Chem. Nov 26. [Epub ahead of print] DOI:
10.1007/128_2013_498
17. Suzuki O, Abe M. (2013) Recent progress and new perspectives in lymphoma glycobiology.
Fukushima J Med Sci. 59(1): 1-14.
18. Ryan JM, Rice GE, Mitchell MD. (2013) The role of gangliosides in brain development and the
potential benefits of perinatal supplementation. Nutr Res. 33(11): 877-887. DOI:
10.1016/j.nutres.2013.07.021.
19. Pshezhetsky AV, Ashmarina LI. (2013) Desialylation of surface receptors as a new dimension in cell
signaling. Biochemistry (Mosc). 78(7): 736-745. DOI: 10.1134/S0006297913070067.
62
2.5. Consideraii finale asupra organizrii mo-

leculare a membranelor celulare
2.5.1. Modelul în mozaic fluid este înc actual i adaptabil
Organizarea membranelor celulare (ca i a endomembranelor) are la baz un
bistrat lipidic eterogen, asimetric, cu proprieti fluide manifestate bidimensional.
Acestuia i se adaug proteine care îi confer caracterul unui mozaic (proteine plutind
pe sau cufundate în marea lipidic ce formeaz bistratul). O asemenea organizare a
fost denumit în mozaic fluid, dup modelul introdus in 1972, de Singer i Nicolson.
Modelul mozaicului fluid pentru organizarea biomembranelor a fost
completat prin evidenierea i descrierea unor structuri adiacente: citoscheletul
asociat membranei (ultrastructur aflat pe faa intern a membranelor) i
glicocalixul (ultrastructur expus pe faa extern a membranelor, alctuit din
lanuri oligo-/poli-zaharidice din compoziia glicolipidelor, glicoproteinelor i
proteoglicanilor din membran). Aceste elemente adiacente susin asimetria
organizrii membranelor. Aadar, atât proteinele ce intr în organizarea lor, cât i
componenta glucidic a membranelor nu diminueaz, ci accentueaz i nuaneaz
caracterul eterogen, asimetric i de fluid bidimensional al structurrii membranelor
celulare.
Tot în completarea modelului în mozaic fluid sub aspect ultrastructural, dar i
funcional au fost definite noiunile de domenii i/sau microdomenii de membran.
Acestea sunt regiuni mai extinse (domeniile) sau mai reduse (microdomeniile) din
suprafaa membranelor a cror compoziie este diferit de a altor zone. Compoziiile
diferite ale domeniilor de membran (apical versus latero-bazal) sunt riguros
controlate i pstrate de celul. Compoziia i existena microdomeniilor (caveole,
plute lipidice, structuri cu înveli de clatrin i altele pe care le vei întâlni pe msur
ce vom avansa în cunoaterea celulei) au o dinamic mai accentuat, rspunzând
nevoilor în continu schimbare ale celulelor, nevoi impuse de considerente interne
ale celulei sau de stimuli externi la care celulele trebuie s rspund.
De fapt, tot ce a însemnat dezvoltarea cunoaterii legate de organizarea i
funcionarea biomembranelor, dup elaborarea modelului în mozaic fluid, nu a
contrazis, ci a dovedit valabilitatea celor stipulate de Singer i Nicolson, în 1972 [1-3].
Orice nou informaie, care a fost adugat cunotinelor despre modul în care
biomembranele sunt organizate i despre cum se comport biocomponentele la
nivelul acestora pe considerente fizice, chimice i biologice, a contribuit la rafinarea
modelului [4], dei uneori el este superficial prezentat în manuale [5]. Este îns
datoria celor care iniiaz în cunoaterea biomembranelor pe noii venii s prezinte
modelul de aa manier încât orice confuzie s fie eliminat, iar mintea s rmân
deschis noutilor. Modelul mozaicului fluid asupra organizrii biomembranelor are
o capacitate de adaptare nelimitat.
Componentele membranelor fie ele lipide, proteine, componente glucidice au
atât roluri structurale, cât i metabolice. Aceast dualitate a rolurilor este valabil, pe
de o parte, pentru clasele de componente biochimice ale membranelor i, pe de alt
parte, pentru entiti moleculare (aceeai molecul poate îndeplini atât funcii
structurale cât i metabolice).
În ciuda acestei organizri moleculare complexe (puternic eterogen i
asimetric), sau mai degrab tocmai datorit ei, biomembranele acioneaz/trebuie
s acioneze ca sisteme integrative. Detalii asupra funcionrii biomembranelor ca
atare se vor prezenta, în primul rând, la seciunile legate de transportul membranar
i de semnalizarea celular. Aspecte legate de comportamentul biomembranelor ca
sisteme integrative sunt valabile i în legtur cu alte biomembrane, cu precdere
cele care delimiteaz o serie de organite celulare, numite endomembrane.
63
În sfârit, nu putem termina prezentarea organizrii moleculare a

membranelor fr a puncta câteva lucruri legate de semnificaia biologic a
caracteristicilor fizico-chimice ale organizrii biomembranelor (eterogenitate,
asimetrie i fluiditate manifestat bidimensional) cu rsfrângere asupra
comportamentului lor.
2.5.2. Semnificaia biologic a modului de organizare

molecular a membranelor
În toate informaiile utilizate pân acum pentru înelegerea modului de
organizare a membranelor am inut permanent seama de modelul mozaicului fluid
introdus de Singer i Nicolson, în 1972. Am parcurs o multitudine de aspecte legate
de: a) diversitatea de componente moleculare de la nivelul membranelor (ceea ce
induce eterogenitate compoziional), b) distribuia inegal i/sau aranjamentul
difereniat al componentelor între cele dou fee ale membranei (ce confer asimetrie
ultrastructurii) i c) dinamicitatea componentelor la nivelul membranelor care, îns,
implic numai micri pe dou direcii (definit ca fluiditate bidimensional). Toate
aceste detalii nu le-am discutat nici de dragul (bio)chimiei, nici de dragul (bio)fizicii
la care am fcut apel, ci pentru c aceste caracteristici fizico-chimice de organizare i
de comportament al componentelor – eterogenitate, asimetrie, fluiditate manifestat
bidimensional – au semnificaii biologice, adic se rsfrâng i sunt exploatate în mod
fericit în ceea ce membrana trebuie s fac în interesul celulei, adic s o separe de,
dar s o i uneasc cu mediul. S lum pe rând aceste caracteristici i s încercm s
extragem elementele eseniale referitoare la semnificaia biologic a realitii lor,
altfel spus s înelegem de ce este important c (bio)membranele sunt organizate aa
cum sunt, sau, dac vrei, ce s-ar întâmpla dac nu ar fi aa, deoarece, din punct de
vedere logic, în acest fel trebuie s operm pentru extragerea semnificaiei a ceva.
De ce este important faptul c în membrana celular avem o diversitate uria
(putem spune fr temere) de componente biochimice? Altfel spus, la ce folosete
celulei aceast compoziie eterogen? S nu ne sfiim aici s facem o comparaie cu ce
putem percepe referitor la capacitatea unui grup de oameni de a realiza lucruri
complexe. Pentru aceasta este necesar ca în acel grup de oameni s se afle persoane
cu capaciti, înclinaii, talente, abiliti diferite, corespunztoare nevoilor impuse de
complexitatea problemelor ce trebuie rezolvate. Lucrurile nu stau altfel nici în
contextul membranei i al complexitii de fenomene prin care aceasta îi realizeaz
menirea: separarea interiorului celular de mediu, dar i conectarea celulei cu ceea ce
se afl în afara ei cu scopul determinrii unui comportament adecvat, pentru
asigurarea supravieuirii sale i a „angrenajului” (citete esutului) din care face
parte. Aadar: multitudinea de biocomponente asigur multitudinea de posibiliti
de aciune, adic diversitatea de funcii. Exist o corelaionare direct între
complexitatea de funcii pe care membrana unei celule trebuie s o asigure i
diversitatea de biocomponente de la nivelul acesteia. Cu alte cuvinte, ca s operm cu
termeni învai la matematic, dependena dintre complexitatea de funcii a
membranei unei celule i diversitatea componentelor din organizarea acesteia (adic
gradul de eterogenitate biochimic a acelei membrane) este una de proporionalitate
direct. Aceast regul odat stabilit i îneleas în semnificaia ei biologic ne
determin s putem deduce c organizarea la nivelul biocomponentelor
membranelor a dou celule diferite este diferit, chiar dac se respect principiul
organizrii în mozaic fluid, necesitatea prezenei lipidelor amfifile, aranjate sub
form de bistrat, la care se adaug proteine i o component glucidic orientat spre
exterior. Dincolo de respectarea acestor aspecte generale, tipurile de lipide sau
proporiile dintre acestea difer, exist bagaje de entiti moleculare proteice diferite
(chiar dac unele dintre proteine se pot gsi într-o mare diversitate de tipuri de
64
membrane), iar structurile glucidice difer cel puin în anumite limite care fac
membranele s difere sub aspectul biocomponentelor.
Cum se rsfrânge aranjarea asimetric a biocomponentelor membranei asupra
intereselor celulei? Adic, ce putem spune despre semnificaia biologic a asimetriei
membranelor? Faptul c cele dou fee ale membranelor expun elemente biochimice
diferite, adic asigur proprieti fizico-chimice diferite celor dou suprafee (cea
expus la exterior, respectiv cea expus ctre interiorul celulei) permite desfurarea
de fenomene diferite de o parte sau de cealalt a acestei ultrastructuri. Mai mult,
celula are mecanisme prin care poate permite acestor fenomene diferite s se
desfoare independent sau s se coreleze, în funcie de nevoile ei de supravieuire i
funcionare „ireproabil”. Altfel spus, celula poate rmâne mai mult sau mai puin
indiferent la ce se petrece în exteriorul ei, dar poate s i fie deosebit de sensibil la
ce se afl sau se petrece în afara ei pe baza informaiilor pe care le primete, le
analizeaz i le ia în consideraie.
Pentru înelegerea semnificaiei biologice a fluiditii bidimensionale a
membranei revin la exemplul utilizat la începutul acestei seciuni (cel legat de
abilitatea unui grup de oameni de a rezolva probleme complexe), dar vom extinde
exemplul la ce se întâmpl într-o instituie. De fapt încercm aici s rspundem la
întrebarea: de ce este important c în membran biocomponentele sunt într-o
permanent micare? S nu uitm c aceast micare permanent a componentelor
individuale prezint grade de libertate mai mari sau mai mici, în funcie de condiiile
concrete în care celula se poate afla. Mai întâi s punctm de ce este important c
micrile au loc în doar dou dimensiuni, adic în numai dou direcii,
corespunztoare micrii planare (adic bidimensionale). Aceast micare
bidimensional asigur meninerea asimetriei din organizarea membranei, iar
semnificaia biologic a acestui aranjament asimetric am punctat-o deja în paragraful
precedent. Dincolo de faptul c aceast micare este bidimensional, ea este
important pentru celul chiar prin faptul c exist. Ne întoarcem la exemplul
invocat, chiar dac poate prea banal; îl considerm sugestiv. Pentru ca oamenii unui
grup s realizeze activiti practice ei trebuie s fie adui în acelai loc. Pentru asta
trebuie s se deplaseze de acas la instituia unde lucreaz i s îi fac treaba cât
dureaz programul de lucru. Asta trebuie s se întâmple i cu biocomponentele
(molecule, macromolecule) dintr-o membran. Ele trebuie s se poat mica pentru a
se întâlni ca s îi fac, împreun, treaba. Spunem c ele organizeaz microdomenii
(echivalentul unor secii sau departamente într-o instituie). Numai c pentru buna
funcionare a instituiei seciile sau departamentele nu sunt total independente, ele
trebuie s interacioneze, deci trebuie s existe persoane care s se mite dintr-un loc
în altul, iar uneori este nevoie s se creeze grupuri interdepartamentale pentru
rezolvarea unor probleme. Asta se întâmpl i în membran: microdomeniile sunt
dinamice; elementele din unele se pot mica i intra în componena altor
microdomenii pentru a se implica în altceva în interesul bunei funcionri a
întregului (membrana, respectiv, mai departe, celula). Aadar, semnificaia biologic
a faptului c, în membran, componentele biochimice sunt într-o permanent
micare este aceea c pemite acestora s se asocieze într-o diversitate de modaliti,
pentru a îndeplini o multitudine de activiti. Mai mult, în membrane aceeai
component poate induce efecte multiple prin rolul su care se poate manifesta
difereniat, în funcie de partenerii de interaciune cu care se întâlnete temporar, pe
perioade mai lungi sau mai scurte de timp.
Cred c acum putem spune, în sfârit, c avem suficiente informaii care s ne
permit s credem c am îneles principial membrana celular (cum este organizat
i de ce este astfel organizat) i ne putem detaa ca s o privim cu înelepciune i s
putem aplica aceast înelegere de principiu la orice situaie particular am întâlni.
Aceast poziie va fi util în abordarea aspectelor care urmeaz, legate de
65
aprofundarea cunotinelor despre membrane, adic aspectele ce ne vor ajuta s

înelegem mai bine cum funcioneaz membranele ca sisteme integrative. De fapt, se
vor aborda aspectele legate de mecanismele prin care membrana conecteaz celula la
mediu, nefiind o barier absolut. Fenomenele prin care membrana celular
realizeaz aceast conectare a celulei cu mediul sunt de dou tipuri: fenomene de
transport membranar i fenomene de semnalizare.
1. Morange M. (2013) What history tells us XXX. The emergence of the fluid mosaic model of
membranes. J Biosci. 38(1): 3-7.
2. Nicolson GL. (2013) The Fluid-Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding
the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochim
Biophys Acta. Nov 1. pii: S0005-2736(13)00393-3. DOI: 10.1016/j.bbamem.2013.10.019. [Epub ahead
of print]
3. Bagatolli LA, Mouritsen OG. (2013) Is the fluid mosaic (and the accompanying raft hypothesis) a
suitable model to describe fundamental features of biological membranes? What may be missing? Front
Plant Sci. Nov 13; 4: 457.
4. Nicolson GL. (2013) Update of the 1972 Singer-Nicolson Fluid-Mosaic Model of Membrane Structure.
Discoveries. 1(1): e3. DOI: 10.15190/d.2013.3
5. Leabu M. (2013) The still valid fluid mosaic model for molecular organization of biomembranes.
Accumulating data confirm it. Discoveries. 1(1): e7. DOI: 10.15190/d.2013.7
66
Nucleul – partea 1
Stocarea și transmiterea informației genetice
Cursul prezintă informațiile din capitolele 5 și 7 ale Essential Cell Biology, Alberts et al., 5th Ed.
Imaginile sunt create cu BioRender sau au sursa indicată.
Biochimia ADN-ului
Toate celulele unui organism uman conțin aceeași informație genetică, codificată în genele lor,
prin succesiunea ordonată a celor patru nucleotide – A – adenozină, T – timidină, C – citidină, G
– guanozină în acidul dezoxiribonucleic (ADN).
Totalitatea genelor unui organism alcătuiesc genomul acelui organism. Genomul uman a fost
secvențiat, descifrat, acum mai bine de 10 ani, deci acum cunoaștem ordinea nucleotidelor din
ADN-ul fiecărei celule umane.
O moleculă de ADN constă din două lanțuri lungi de nucleotide, unite într-un dublu helix prin
legături de hidrogen. Fiecare lanț, sau catenă, este compus din patru tipuri de nucleotide.
Nucleotidele sunt compuse dintr-o bază azotată – adenină (A), citozină (C), guanină (G), sau
timină (T), un zahar cu cinci atomi de carbon (deoxiriboză), la care se atașează o grupare fosfat.
Nucleotidele dintr-o catenă sunt legate covalent printr-o legătură fosfodiesterică (între gruparea
OH 3’ a unui zahar cu fosfatul atașat grupării 5’ a deoxiribozei învecinate. (Figura 1). Această
modalitate de legare creează o polaritate catenei de ADN, care va avea un capăt 3’, cu o grupare
OH liberă și unul 5’, cu o grupare OH fosforilată (vezi figura de mai jos).
Fig. 1. Legătura fosfodiesterică din

catena de ADN.
Sursa: https://elearning.fondation-
merieux.org/molecular-
biology/chapter-1/page-9.php
1
Fig. 2. ADN-ul este organizat din două catene spiralate de nucleotide, unite între ele prin punți
de hidrogen.
Cele două catene dintr-o moleculă de AND sunt unite prin legături de hidrogen între bazele
azotate (Figura 2).
Ca urmare a acestor legături între componentele nucleotidelor, toate baze azotate sunt la
interiorul dublului helix, iar lanțul de deoxiriboze cuplate prin fosfat, încărcat negativ, la exterior.
Bazele nu se împerechează la întâmplare, A întotdeauna va face pereche cu T, iar G întotdeauna
cu C. Cele două catene ale helixului sunt antiparalele una față de cealaltă – adică orientate cu
polarități 3’ – 5’opuse și fiecare catenă conține o secvență de nucleotide care este exact
complementară secvenței de nucleotide a lanțului partener. Această complementaritate este de
o importanță crucială atunci când este vorba atât de copierea, cât și de menținerea structurii
ADN.
Structura cromozomilor eucariotici

În celulele eucariote, moleculele de ADN foarte lungi sunt organizate în cromozomi. Acești
cromozomi nu numai că sunt compactați în interiorul nucleului, deși puși cap la cap ating o
lungime de 2 m, dar, după ce sunt duplicați, pot fi repartizați cu precizie între cele două celule
fiice la fiecare diviziune celulară. Sarcina de împachetare a ADN-ul este realizat de proteine
specializate care se leagă de ADN, generând o serie de bucle care oferă niveluri din ce în ce mai
ridicate de organizare. ADN-ul este pliat (de o manieră dinamică) într-un mod care să îi permită
să rămână accesibil tuturor enzimelor și altor proteine care îl reproduc și îl repară, proteine care
induc expresia genelor sale.
Fiecare dintre acești cromozomi constă dintr-o moleculă de ADN liniar (două catene de
polinucleotide înfășurate ca -helix), extrem de lung, asociat cu proteine care îl compactează.
Acest complex de ADN și proteine se numește cromatină. În plus, la proteinele implicate în
ambalarea ADN-ului în cromozomi, se asociază temporar multe alte proteine implicate în
reproducerea, respectiv repararea lanțurilor polinucleotidice și în expresia genelor.
Cu excepția gameților și a unor celule foarte specializate, care nu au nucleu (cum ar fi
eritrocitele), celulele conțin fiecare două copii ale fiecărui cromozom, unul moștenit de la mamă
2
și unul de la tată, dar și doi cromozomi sexuali: un cromozom Y (moștenit de la tată) și un
cromozom X (de la mamă). (Femelele moștenesc câte un cromozom X de la fiecare părinte și nu
au cromozom Y.) O afișare ordonată a întregului set de 46 de cromozomi umani se numește
cariotip uman. Dacă se pierd, sau sunt schimbate între cromozomi părți ale unui anumit
cromozom, aceste modificări pot fi detectate prin cariotipare. Citogeneticienii analizează
cariotipurile pentru a detecta anomaliile cromozomiale care sunt asociate cu unele tulburări
moștenite și cu anumite tipuri de cancer.
Funcția cromozomilor este de a purta gene – unități funcționale ale eredității. O genă este
definită ca un segment al ADN-ului care conține instrucțiunile pentru a sintetiza o anumită
proteină sau o anumită moleculă de ARN.
Majoritatea moleculelor de ARN codificate de gene sunt utilizate pentru a produce o proteină.
Cu toate acestea, în unele cazuri, produsul final este molecula de ARN. Ca și proteinele, asemenea
molecule de ARN au funcții diverse în celulă, inclusiv structurale, catalitice și de reglementare a
expresiei genelor.
Cromozomii conțin, pe lângă gene și secvențe de nucleotide necesare pentru expresia normală a
genelor, un exces mare de ADN. Acest ADN suplimentar este uneori eronat numit de prisos, sau
"JUNK ADN," pentru că utilitatea sa pentru celulă nu a fost încă în totalitate demonstrată. Deși
acest ADN de rezervă nu codifică pentru proteine, o mare parte poate servi unor alte funcții
biologice.
Replicarea și segregarea cromozomilor

Pentru a forma un cromozom funcțional, o moleculă de ADN trebuie să facă mai mult
decât să poarte gene. Cromozomul (respectiv ADN-ul său) trebuie să fie replicat și copiile trebuie
separate și partiționate în mod egal și fiabil între cele două celule fiice, la fiecare diviziune
celulară. Aceste procese apar printr-o serie ordonată de evenimente, cu etape care sunt
cunoscute în mod colectiv ca definind ciclul celular – format din două faze: interfaza, în timpul
căreia cromozomii sunt duplicați și mitoza, etapă mult mai scurtă, când cromozomii duplicați sunt
distribuiți celor două celule fiice.
În timpul interfazei, cromozomii sunt fibre lungi și subțiri, care nu pot fi observate cu
microscoapele obișnuite. Acești cromozomi interfazici se numesc cromozomi monocromatidieni.
În timpul interfazei are loc replicarea ADN-ului. Pentru a se produce acest fenomen, cromozomii
eucariotelor conțin a serie de secvențe funcționale (Fig. 3). Două tipuri de regiuni din secvențele
de ADN, găsite în toate eucariotele, se asigură că acest proces are loc eficient. Un tip de secvență
nucleotidică, numită origine de replicare (ORF), este locul unde începe reproducerea ADN-ului;
cromozomii eucariotici conțin multe origini de replicare pentru a permite moleculelor lungi de
ADN să fie replicate rapid. Alte secvențe de ADN formează telomerele care marchează capetele
fiecărui cromozom. Telomerele conțin secvențe repetitive de nucleotide pentru repararea și
reproducerea capetelor cromozomilor. Ele servesc, de asemenea, ca un capac de protecție care
împiedică cromozomul de a fi confundat de către celulă cu ADN-ul rupt care are nevoie de
reparații. Pe de altă parte, cromozomii eucariotici conțin, de asemenea, un al treilea tip de
secvență specializată de ADN, numită centromer, care permite cromozomilor duplicați,
bicromatidieni, să fie separați între cele două celule fiice în timpul mitozei.
Cromozomii monocromatidieni, de interfază, nu sunt aleatoriu distribuiți în nucleu
3
Cromozomii în interfază sunt mult mai lungi și mai fini decât cromozomii mitotici. Fiecare tinde
să ocupe o anumită regiune, sau un teritoriu din nucleu, numit teritoriu cromozomial. În plus,
unele regiuni cromozomiale sunt atașate fizic la anumite situri din anvelopa nucleară – perechea
de membrane cu spațiul dintre ele care înconjoară nucleul – sau la lamina nucleară subiacentă,
o rețea de proteine care susține și asigură forma anvelopei nucleare.
Fig. 3. Prezentarea Figurii 5-14, din capitolul 5, ADN și Cromozomi al Essential Cell Biology, 5th Ed.
Un cromozom conține un centromer (roșu) care delimitează cele două brațe. Brațele conțin
origini de replicare (portocaliu) și se termină cu telomere (bleu). Pentru pregătirea diviziunii
celulare, în interfază, cromozomul este duplicat plecând de la originile de replicare, apoi în
diviziune este condensat, formând un cromozom mitotic, iar cromatidele surori, unite la nivelul
centromerului, sunt desfăcute și distribuite celulelor fiice.
Cromozomii sunt structuri dinamice. Nu numai ca se condensează și se decondensează în timpul

ciclului celular, dar împachetarea cromozomilor trebuie să fie suficient de flexibilă pentru a
permite, la cerere (prin fenomene de semnalizare), accesul rapid, la diferite regiuni ale
cromozomului, al complexelor de proteine implicate în replicarea ADN-ului, repararea acestuia,
sau în expresia genelor.
Nucleozomii sunt unitățile structurale și funcționale ale cromatinei

Proteinele care se leagă de ADN pentru a forma cromozomi eucariotici sunt împărțite în două
clase generale: histone și proteine non-histonice. Complexul ambelor clase de proteine cu ADN-
ul se numește cromatină.
Histonele sunt responsabile pentru nivelul de bază de asamblare a cromatinei: formarea
nucleozomilor – unitățile structurale și funcționale ale cromatinei. Nucleozomii convertesc
moleculele de ADN, dintr-un nucleu în interfază, într-o fibră de cromatină care ajunge la
aproximativ o treime din lungimea ADN-ului inițial. Aceste fibre de cromatină, atunci când sunt
4
examinate cu un microscop electronic, conțin grupuri de nucleozomi strâns ambalați. Dacă
această cromatină este supusă unor tratamente care o fac să se desfășoare parțial, poate fi apoi
văzută în microscopul electronic (un microscop foarte puternic, despre care vom învăța la
lucrările practice) ca o serie de "mărgele pe ață" (Fig. 4). „Ața” pe care se înșiră „mărgelele” este
dubla elice de ADN, iar fiecare mărgea este un nucleozom, care constă dintr-o porțiune de ADN
înfășurată în jurul unui miez de proteine histonice.
Un nucleozom individual constă dintr-un complex de opt histone – octamer histonic – câte două
molecule din fiecare dintre histonele H2A, H2B, H3 și H4 – împreună cu un segment de ADN
dublu-catenar, care înconjoară acest miez proteic (Figura 5). Nucleozomii învecinați sunt
conectați prin ADN-ul de legătură (linker) și histona H1.
Fig. 4. Reproducerea Figurii 5-19 din capitolul 5 ADN și Cromozomi, din Essential Cell Biology, 5th
Ed. Sus: o fibră de cromatină, jos aspectul de “mărgele pe ață”.
5
Fig. 5. Organizarea nucleozomului așa cum se prezintă în
Fig. 5.20 din Capitolul 5, ADN și Cromozomi, din Essential
Cell Biology, 5th Ed. ilustrând organizarea nucleozomului
– unitatea structurală și funcțională a cromatinei.
Nucleozomii sunt complexe proteice pe care se
înfășoară ADN-ului, uniți printr-o secvență de ADN (ADN
linker). Miezul proteic este format din dimeri de
proteine numite histone H2A, H2B, H3 și H4. Fiecare
proteină est ilustrată cu o culoare diferită în dimerii respectivi.
Toate cele patru histone care alcătuiesc octamerul sunt proteine relativ mici cu un procent ridicat
de aminoacizi încărcați pozitiv (lizină și arginină). Sarcinile pozitive ajută histonele să se lege
strâns de coloana vertebrală de zahar-fosfat, încărcată negativ, a ADN-ului. Fiecare dintre
histonele din octamer are, de asemenea, o coadă lungă, nestructurată, la capătul N-terminal,
care
se extinde din nucleozom. Aceste cozi de histone sunt supuse la mai multe tipuri de modificări
chimice covalente, reversibile, care controlează multe aspecte ale structurării cromatinei.
6
Fig. 6. Tipuri de histone și asamblarea lor în nucleozom, împreună cu ADN-ul linker
Împachetarea fibrei de cromatină cu ajutorul histonelor crează mai multe niveluri de

împachetare, care pot fi vizibile și în microscopie. Fibrele puțin împachetate formează
eucromatina, cele strâns împachetate, heterocromatina. Nivelul maxim de împachetare este
regăsit în cromozomul mitotic.
Modificările nucleozomului permit accesul la ADN

O celulă își poate modifica structura cromatinei pentru a expune regiuni localizate din ADN și să
permită accesul proteinelor specifice și complexelor de proteine, în special cele implicate în
exprimarea genelor și în replicare și reparare.
Celulele eucariote au mai multe moduri de a regla rapid structura locală a cromatinei lor prin:
1) complexe de remodelare cromatiniană – utilizează energie din hidroliza ATP pentru a schimba
poziția ADN-ului înfășurat în jurul miezului histonic al nucleozomilor. În timpul mitozei, multe
dintre aceste complexe sunt inactivate, ceea ce poate ajuta cromozomii mitotici să își mențină
structura lor bine împachetată.
2) enzime de modificare a histonelor. Cozile tuturor celor patru histone sunt supuse în special
acestor modificări covalente, catalizate enzimatic, care includ adăugarea (și îndepărtarea) de
acetil, fosfat sau metil.
Acetilarea lizinelor, de exemplu, poate reduce afinitatea cozilor pentru nucleozomii adiacenți,
astfel slăbind compactarea cromatinei și permițând accesul anumitor proteine nucleare implicate
în transcriere.
Din contră, metilarea lizinelor la gruparea -amino crește împachetarea prin sporirea sarcinilor
pozitive, prevenind accesul proteinelor la ADN.
7
Cromatina în interfază nu este uniform împachetată. Regiunile cromozomilor care conțin gene
care sunt exprimate în mod activ sunt, în general, mai despachetate, în timp ce cele care conțin
gene silențiate, inactive, sunt mai condensate. Astfel, structura detaliată unui cromozom
monocromatidian, de interfază, poate diferi de la un tip de celulă la altul, ajutând la determinarea
genelor care sunt “pornite” și care sunt „închise”. Majoritatea tipurilor de celule exprimă doar
cam jumătate din genele pe care le conțin și multe dintre acestea sunt active la niveluri foarte
scăzute.
Cea mai condensată formă de cromatină în interfază se numește heterocromatină (din limba
greacă, heteros –"diferite"). Restul cromatinei se numește eucromatină (din greacă eu,
"adevărat" sau "normal"). Fiecare tip de cromatină este stabilit și întreținut de diferite seturi de
modificări ale cozilor histonelor, care atrag seturi distincte de proteine cromozomiale non-
histonice. Odată ce heterocromatina a fost stabilită, aceasta se poate răspândi la regiunile vecine
ale ADN-ului, deoarece prin modificările sale, coada histonei metilate va atrage un set de proteine
specifice heterocromatinei, care apoi va adăuga aceleași modificări la coada histonelor din
nucleozomi adiacenți. Aceste modificări, la rândul lor, recrutează mai multe proteine specifice,
cauzând un val de cromatină condensată, care se propagă de-a lungul cromozomului. Această
regiune extinsă de heterocromatină va continua să se răspândească până când se confruntă cu o
secvență de ADN- barieră, care oprește propagarea. De exemplu, unele secvențe bariere conțin
situri de legare pentru acetiltransferaze care competiționează pentru aceeași lizină cu
metiltransferaze; acetilarea blochează metilarea lizinei respective, prevenind orice răspândire
ulterioară a heterocromatinei.
O mare parte din ADN-ul care este împachetat în heterocromatină nu conține gene. Deoarece
heterocromatina este atât de compactă, gene care accidental sunt ambalate în heterocromatină
nu reușesc să fie exprimate. Astfel ambalarea necorespunzătoare a genelor în heterocromatină
poate provoca boli: la om, gena care codifică β-globină – o proteină care face parte din molecula
de hemoglobină purtătoare de oxigen – este situată în apropierea unei regiuni heterocromatină.
Într-o persoană cu o deleție moștenită a secvenței-barieră, heterocromatina se răspândește și
dezactivează gena β-globinei, care cauzează anemie severă.
Poate cel mai frapant exemplu de utilizare a heterocromatinei pentru a inactiva genele este
inactivarea unui cromozom X la sexul feminin. La întâmplare, unul sau altul dintre cei doi
cromozomi X din fiecare nucleu devine foarte condensat în heterocromatină la începutul
dezvoltării embrionare și această modificare este transmisă mai departe descendenților.
Când o celulă se divide, transmite celulelor fiice modificările sale histonice, structura cromatinei,
și modele de expresie a genelor. O astfel de "memorie celulară" transmite informații despre care
gene sunt active și care nu sunt – un proces esențial pentru stabilirea și menținerea diferitelor
tipuri de celule în timpul dezvoltării unui organism multicelular complex.
Transmiterea informației genice

Celulele organismul uman sunt extraordinar de variate. Celule adipoase, celulele pielii, celulele
osoase, celulele nervoase sunt foarte diferite între ele. Cu toate acestea, toate aceste tipuri de
celule sunt descendenții celulei ou fertilizate și toate, (cu mici excepții) conțin copii identice ale
genomului uman.
Diferențele apar din modul în care celulele utilizează selectiv instrucțiunile lor genetice în funcție
de indicii pe care le obțin de la mediul lor înconjurător, în embrionul în curs de dezvoltare.
8
Când celula are nevoie de o anumită proteină, secvența de nucleotide a părții corespunzătoare a
ADN-ului, extrem de lung, dintr-un cromozom este copiată mai întâi la ARN (un proces numit
transcriere).
Aceste copii ARN ale segmentelor ADN sunt utilizate direct pentru a direcționa sinteza proteinei
(un proces numit traducere). Fluxul de informații genetice în celule este, prin urmare, de la ADN,
la ARN și, mai departe, la proteine (Fig. 7). Toate celulele, de la bacterii la oameni, își exprimă
informațiile genetice în acest fel – un principiu fundamental al biologiei, numit dogma centrală a
biologiei moleculare.
Fig. 7. Dogma centrală a biologiei moleculare arată fluxul informației în toate celulele.
Fig.8. Structura unei gene eucariote.

9
O genă este formată dintr-un promotor, o secvență codificantă, formată din introni (secvențe
care nu codifică aminoacizi) şi exoni (secvențe care codifică aminoacizi) şi zone „cis” reglatorii
(Fig. 8). Acestea pot fi localizate imediat înaintea promotorului (zona cis proximală), dar şi la
distanță de mii de perechi de baze de promotor sau la sfârșitul genei. Regiunile cis sunt secvențe
de legare a proteinelor care pot iniția sau inhiba transcrierea genică, cum ar fi de exemplu factorii
generali ai transcrierii (de care vom vorbi mai departe) sau factori speciali de transcriere, activați
prin procese de semnalizare celulară (despre care vom vorbi la cursul de semnalizare celulară).
Instrucțiunile genetice codificate în gene sunt citite și exprimate prin procesele de transcriere și
traducere. Deoarece multe copii ARN identice pot fi sintetizate plecând de la aceeași genă, iar
fiecare moleculă de ARN poate direcționa sinteza multor molecule de proteine identice, celulele
pot sintetiza o cantitate mare de proteine rapid, atunci când este necesar. Dar fiecare genă poate
fi, de asemenea, transcrisă și tradusă cu o eficiență diferită, permițând celulei să facă cantități
mari de anumite proteine și cantități mai mici din altele. În plus, o celulă poate schimba (sau
regla) expresia fiecăreia dintre genele sale în funcție de nevoile momentului – cel mai frecvent
prin controlul sintezei de ARN.
ARN-ul dintr-o celulă se obține prin transcrierea ADN-ului. Transcrierea începe cu deschiderea și
detensionarea unei mici părți din ADN-ul dublu helicoidal pentru a expune bazele de pe fiecare
catenă de ADN. Una dintre cele două catene ale ADN-ului dublu-helix acționează apoi ca un
șablon pentru sinteza unei molecule de ARN. Chiar în spatele regiunii în care ribonucleotidele
sunt adăugate, lanțul ARN nou format se desprinde și helixul de ADN se reface. Astfel, moleculele
monocatenare de ARN produse prin transcriere sunt eliberate de pe matrița de ADN. Eliberarea
aproape imediată a catenei de ARN de pe ADN, pe măsură ce prima este sintetizată, înseamnă că
mai multe copii ARN pot fi făcute pe aceeași genă într-un timp scurt.
Enzimele care efectuează transcrierea sunt numite ARN polimeraze. Ele catalizează formarea
legăturilor fosfodiesterice care leagă nucleotidele împreună pentru a forma un lanț. ARN
polimeraza se mută pas cu pas de-a lungul ADN-ului și îi detensionează helixul, chiar înainte de
situl activ, pentru a expune o nouă regiune a catenei matriță necesară adiției, prin
complementaritate, de nucleotide. În acest fel, lanțul ARN în creștere este extins cu o nucleotidă
în direcția 5’ la 3’. Substratul folosit este reprezentat de nucleotide sub forma trifosfat (ATP, CTP,
UTP și GTP); hidroliza legăturilor trifosfat, macroergice furnizează energia necesară pentru a
conduce reacția mai departe.
Majoritatea genelor din ADN-ul unei celule specifică secvența de aminoacizi a unei proteine;
moleculele de ARN care sunt copiate din aceste gene (care în cele din urmă induc sinteza directă
a proteinelor) sunt numite molecule de ARN mesager (ARNm).
Cu toate acestea, produsul final al unei minorități de gene este ARN-ul în sine. Există mai multe
tipuri de ARN-uri care nu codifică proteine (non-codante):
- ARN-uri nucleare mici (snRNA) – molecule care direcționează splicing-ul ARN-ului pre-
mesager pentru a forma ARNm matur;
- ARN ribozomal (ARNr) moleculele care intră în alcătuirea ribozomilor;
- ARN-ul de transfer (ARNt) – molecule adaptoare care selectează aminoacizii și îi transferă în
ribozom pentru încorporarea lor în proteine;
- molecule de microARN (miARN) și molecule mici de interferență ARN (siRNA) – servesc drept
regulatori cheie ai expresiei genelor eucariote.
10
Pentru a transcrie cu precizie o genă, ARN polimeraza trebuie să recunoască locul de pe genom
unde trebuie să înceapă biosinteza și unde să o termine. Inițierea are loc la promotorul genei, iar
terminarea la finalul secvenței care codifică coada poli-A a ARNm.
Promotorul unei gene conține o secvență scurtă cis reglatorie, localizată la 25 perechi de baze
(pb) înaintea punctului de start transcriere, implicată în inițierea transcrierii, care dictează modul
în care proteina codificată de genă este transcrisă: constitutiv (de la sine) sau semnalizat
(controlat). Cea mai cunoscută astfel de secvență cis este numită TATA (TATA-box), deoarece este
bogată în nucleotide T şi A. Unele gene conțin în promotor o secvență asemănătoare TATA (TATA-
like), iar altele au secvențe bogate CG, care pot fi metilate, cum am discutat mai sus, inhibând
transcrierea genei. Secvența TATA este recunoscută de o proteină din complexul factorilor
generali ai transcrierii (TF- transcription factor), care recrutează ARN polimeraza II la gena care
urmează să fie transcrisă (Fig. 9). Celelalte secvențe cis reglatorii se pot distanța la până 50.000
de perechi de nucleotide de promotor. O mare parte din acest ADN servește ca secvențe
"distanțier", la care proteinele de reglare a expresiei genice nu se leagă direct, dar acest ADN
poate oferi flexibilitatea necesară pentru realizarea eficientă a buclelor fibrei de cromatină şi
asigurarea conformației 3D a cromozomilor eucariotici.
Fig. 9. Inițierea transcrierii genice. Inițierea transcrierii are loc la promotor, o secvență de
nucleotide care poate lega ARN polimeraza. Aceasta e recrutată de factorii de transcriere, care
se leagă de secvențe cis reglatorii. În imagine sunt ilustrați factorii generali ai transcrierii, care se
leagă de secvența TATA sau TATA-like. Recunoaștere și mulțumire: imagine Shadma Nafis,
BioRender.
11
În primul rând, proteinele de reglare a expresiei genelor, cunoscute sub numele de activatori
transcripţionali trebuie să se lege de secvențe specifice de ADN și ajută la atragerea ARN
polimerazei II, la începutul secvenței de transcriere. În al doilea rând, inițierea transcrierii
eucariote in vivo necesită prezența unui complex proteic cunoscut sub numele de Mediator, care
permite proteinelor activatoare să comunice în mod corespunzător cu polimeraza II și cu factorii
generali de transcriere. În cele din urmă, inițierea transcrierii într-o celulă eucariotă necesită de
obicei recrutarea locală de enzime care modifică cromatina, inclusiv complexe de remodelare a
cromatinei.
Transcrierea este doar prima din mai multe etape necesare pentru a produce un ARNm. Alte
etape critice sunt modificarea covalentă a capetelor ARN-ului și îndepărtarea secvențelor
intronice care sunt eliminate pe parcursul transcrierii ARN prin procesul de ARN splicing.
Ambele capete ale ARN-urilor eucariote sunt modificate: prin modificarea (numită capping) a
capătului 5’ și prin poli-adenilare a capătului 3’. Aceste modificări speciale permit celulei să
evalueze dacă ambele capete ale unei molecule de ARNm sunt prezente (iar mesajul este, prin
urmare, intact) înainte de a exporta secvența ARN din nucleu și o traduce la proteine, în citosol.
De îndată ce ARN polimeraza II a produs aproximativ 25 de nucleotide de ARN, capătul 5’ al
moleculei de ARNm nou sintetizate este modificat prin adăugarea unui capac de 7-metil
guanozină (5’-7mG). Capătul 5’-7mG semnifică sfârșitul 5' al ARNm la eucariote și acest punct de
reper ajută celulele să distingă ARNm-urile de celelalte tipuri de molecule de ARN prezente în
celulă. În nucleu, capul 5’-metil-guanozinic se leagă de un complex proteic care ajută ARN-ul să
fie corect prelucrat şi exportat din nucleu prin porul nuclear – o deschidere în învelișul nuclear.
Capul 5’-metil-guanozină are, de asemenea, un rol important în traducerea ARNm la proteine, în
citosol, fiind recunoscut de factorii de inițiere la eucariote (eIF), care pornesc traducerea și
formarea proteinelor la nivelul ribozomului.
Poziția capătului 3' al fiecărei molecule ARNm este specificată printr-un semnal codificat în
genom (poli-A în Fig. 8). Capătul 3’ este modificat prin adăugarea, la un moment dat, a
aproximativ 200 de nucleotide A, de către o enzimă numită poli-A polimeraza. Precursorul
nucleotidelor pentru aceste adăugiri este ATP, iar același tip de legături 5‘ – la – 3‘ sunt formate,
ca în cazul celor convenționale din sinteza ARN-ului. Spre deosebire de ARN polimerazele uzuale,
poli-A polimeraza nu necesită un șablon; Prin urmare, coada poli-A a ARNm-urilor eucariote nu
este direct codificată în genom. Pe măsură ce coada poli-A este sintetizată, proteinele care leagă
poli-A se asamblează pe ea, participând la determinarea lungimii finale a cozii, la transportul
ARNm din nucleu, în citosol şi direcționarea sintezei de proteine în ribozom.
Splicingul. Atât secvențele intronice, cât și cele exonice sunt transcrise într-un transcript primar
de ARNm. Secvențele intronice sunt îndepărtate din ARNm nou sintetizat (numit ARNm precursor
sau pre-ARNm) prin procesul de splicing. ARNm matur este acel ARN obținut doar după
procesarea capetelor 5‘ și 3‘ și după realizarea splicing-ului. Spre deosebire de celelalte etape ale
producției ARNm, splicingul este efectuat de molecule de ARN non-codificante mici, (short
nuclear ARN – snRNA), complexate cu proteine.
Uneori, în procesul de splicing poate fi excizat unul sau mai mulți exoni, rezultând ARNm diferite,
care codifică pentru proteine ușor diferite, dar din aceeași clasă, care pot fi în continuare
12
funcționale. Acest proces este responsabil de varietatea de proteine din celulă și explică parțial
de ce proteomul celular (totalitatea tipurilor de proteine exprimate într-o celulă) este mult mai
variat ca genomul.
ARNm matur va fi transportat în citosol pentru traducere la proteine. Totuși, celula poate exercita
și la nivel citosolic un control al traducerii, numit reglare post-transcriere. Un mecanism folosit în
reglarea prost-transcriere este producerea unor specii de microARN-uri, care interacționează cu
secvențe din ARNm și fie blochează traducerea, fie induc degradarea acestuia.
Nucleolul este structura cea mai evidentă observată în nucleul unei celule eucariote
Nucleolul este o componentă a nucleului vizibilă la microscop. Este locul unde are loc biosinteza,
prelucrarea ARN-urilor ribozomale și asamblarea lor în subunități ribozomale. Nu are o
endomembrană proprie, ci este practic un mare agregat de macromolecule, incluzând genele
pentru ARNr, precursorii ARNr, ARNr matur, enzime de prelucrare a ARNr, alte specii non-
codante (small nucleolar RNAs – snoRNAs), proteine ribozomale.
Nucleolul este cel mai evident exemplu de organizare cromozomială în interfază. În timpul
interfazei, părțile diferiților cromozomi care poartă gene care codifică ARN-urile ribozomale se
asociază împreună pentru a forma nucleolul. În celulele umane, câteva sute de exemplare dintre
aceste gene sunt distribuite în 10 clustere, situate în apropierea vârfurilor a cinci perechi
cromozomiale diferite.
În plus față de rolul său important în biogeneza ribozomilor, nucleolul este, de asemenea, locul
unde sunt produse alte ARN-uri și sunt asamblate alte complexe ARN-proteine. De exemplu, o
specie de snRNP care intervine în splicingul pre-ARNm-ului, telomeraza și particula de
recunoaștere a semnalului (pe care o vom discuta la compartimentalizarea celulei și la reticulul
endoplasmatic), se crede, de asemenea, că sunt asamblate la nucleol, în baza unor dovezi
experimentale mai mult sau mai puțin directe. În cele din urmă, ARNt care transportă aminoacizii
pentru sinteza proteinelor sunt prelucrați acolo; ca și genele ARNr, cele de codificare a ARNt-
urilor sunt grupate în nucleol.
Reglarea expresiei genice

Acest curs prezintă informații din Capitolul 8 din Essential Cell Biology, Alberts et al., 5th Ed.
Toate celulele unui organism multicelular conțin același genom, dar sunt diferite din punct de
vedere fenotipic și funcțional. Diferențierea celulelor se realizează prin modificări în expresia
genelor.
Expresia genică este un proces complex prin care celulele sintetizează atât proteine, cât și ARN-
uri codificate în genomul lor. Deși fiecare tip de celulă dintr-un organism multicelular exprimă
preponderent un anume grup de gene, aceste gene nu sunt mereu aceleași, de-a lungul vieții
celulei. Grupul de genele care se exprimă într-o celulă diferențiată poate varia dinamic în timpul
vieții celulei, fără ca fenotipul să se schimbe. Celulele specializate sunt capabile să-și adapteze
modelele de expresie genică în urma unor semnale extracelulare, cum ar fi semnalele primite de
13
la hormoni. De exemplu, molecule care se acumulează în inflamație pot declanșa activarea unor
gene care codifică proteine implicate în răspunsul antiinflamator.
Expresia genică poate fi modificată și prin semnale provenite din interior, cum ar fi de exemplu,
semnale de stres venite de la reticulul endoplasmatic – organit delimitat de endomembrane
implicat în sinteza proteinelor.
Fiecare etapă din dogma centrală a biologiei celulare, calea care duce de la ADN, la proteine,
poate fi, în principiu, controlată. Astfel, o celulă poate controla proteinele pe care le conține prin:
(1) momentului transcrierii și cât de des are loc, (2) modul în care ARN-ul trancris este clivat sau
prelucrat, (3) selectarea ARN-urilor mesager care să fie exportate din nucleu, (4) reglarea vitezei
de degradare a unor anumite molecule de ARNm, (5) selectarea tipurilor de ARNm care sunt
traduse la proteine pe ribozomi, sau (6) reglarea modului în care proteinele specifice sunt
distruse rapid sau lent după ce au fost sintetizate. Totuși, principalul mecanism prin care celulele
controlează expresia genică este controlul trancrierii, pentru că formarea unor transcripte ARN
nefolositoare ar încărca nejustificat etapele următoare de reglare.
Vom discuta mai departe despre două mecanisme de control: reglarea transcrierii genice și
controlul post-transcriere
1. Reglarea transcrierii genice
Am discutat puțin mai sus de secvențele care se regăsesc în structura unei gene și cum ele intervin
în procesul de transcriere. Regiunea promotor a unei gene leagă ARN polimeraza. Promotorii
includ un situs de inițiere a transcrierii, unde începe sinteza ARN și secvențe care conțin situsuri
de recunoaștere pentru proteine care se asociază cu ARN polimeraza: factorii generali ai
transcrierii. În plus față de promotor, marea majoritate a genelor includ secvențe reglatoare de
ADN, care sunt utilizate pentru a activa sau inhiba expresia genei. Pentru a avea un efect, aceste
secvențe trebuie să fie recunoscute de proteine numite factori de reglare a transcrierii (speciali,
diferiți de cei generali care se leagă de promotor).
Proteinele care recunosc o anumită secvență de nucleotide fac acest lucru deoarece suprafața
lor prezintă o potrivire aproape perfectă cu caracteristicile de suprafață ale ADN-ului dublu
catenar din acea regiune. Deoarece aceste caracteristici de suprafață vor varia în funcție de
secvența nucleotidelor, este nevoie de proteine diferite care să lege ADN-ul, de unde și nevoia
de a avea mai mulți factori de transcriere. În cele mai multe cazuri, proteinele dimerizează și intră
în curbura majoră a ADN-ului dublu catenar, făcând o serie de contacte bazate pe interacțiuni
necovalente cu perechile de nucleotide din interiorul curburii. Deși fiecare contact individual este
slab, 10 până la 20 de contacte care se formează de obicei la interfața ADN-proteină se combină
pentru a se asigura că interacțiunea este atât foarte specifică, cât și și foarte puternică.
Factorii de reglare a transcrierii pot fie activa, fie reprima expresia unei gene. Drept urmare,
secvența de nucleotide de care ei se leagă poate fi o secvență activatoare sau inhibitoare. Aceste
secvențe de reglare pot fi localizate și la zeci, sute sau chiar mii de perechi de baze distanță de
promotor, dar din punct de vedere spațial ele vor fi aduse în imediata vecinătate prin organizarea
spațială a cromatinei. ADN-ul dintre secvența-enhancer și promotor formează o buclă, aducând
14
proteina activator în vecinătatea imediată a promotorului. Adesea, proteine suplimentare
servesc drept adaptoare pentru a închide bucla; cea mai importantă dintre acestea este cea
numită Mediator. Împreună, toate aceste proteine atrag factorii generali ai transcrierii și ARN-
polimeraza la promotor, formând un complex de inițiere a transcrierii. Proteinele eucariote
represoare fac opusul: ele scad transcrierea prin prevenirea asamblării acestui complex.
Proteinele activatoare și inhibitoare pot exploata mecanismele utilizate la împachetarea ADN-
ului pentru a ajuta la activarea și inactivarea genelor. Structura cromatinei poate fi modificată
prin complexe de remodelare (a cromatinei) și cu ajutorul enzimelor care induc modificări
covalente ale histonelor din miezul nucleozomilor. Multe proteine activatoare genice folosesc
aceste mecanisme de decondensare a cromatinei prin atragerea unor astfel de proteine, care
modfică cromatina în zona promotorilor. De exemplu, recrutarea de histon-acetiltransferaze
promovează atașarea grupărilor acetil la anumite lizine din cozile histonelor; aceste grupări acetil
atrag, ele însele, proteine care promovează transcrierea, inclusiv pe unii dintre factorii generali
ai transcrierii.
În mod similar, proteinele represoare ale genelor pot modifica cromatina reducând eficiența
inițierii transcrierii. De exemplu, multe proteine represoare atrag histon-deacetilazele – enzime
care îndepărtează grupări acetil de pe cozi de histone, inversând astfel efectele pe care acetilarea
le are asupra inițierii transcrierii. Deși unele proteine eucariote represoare acționează doar
asupra unei singure gene, altele pot orchestra formarea unor zone mari de cromatină inactivă
din punct de vedere al transcrierii. Un mecanism de inactivare dus la extrem este formarea
cromozomului X inactiv, din celulele mamiferelor femele.
La eucariote, o genă este rareori controlată de un singur factor de transcriere. Transcrierea
pentru majoritatea genelor este reglată prin controlul combinat al acțiunii mai multor factori. O
genă tipică este controlată de zeci de factori de reglare a transcrierii, care se leagă de secvențe
reglatoare ce pot fi răspândite pe zeci de mii de perechi de nucleotide. Împreună, acești factori
de reglare a transcrierii direcționează asamblarea Mediatorului, a complexelor de remodelare a
cromatinei, a enzimelor care modifică histonele, a factorilor generali ai transcrierii și, în cele din
urmă, a ARN polimerazei.
In unele cazuri, un singur factor de reglare a transcrierii poate iniția formarea nu doar a unui tip
de celulă, ci a unui întreg organ, la organisme inferioare (cum ar fi, de exemplu, formarea ochiului
la musculița de oțet, la care o mutație a unei singure gene duce la formarea de insecte fără ochi).
Un astfel de factor de reglare se numește factor principal al reglării transcrierii și stă la vârful unei
rețele de reglare (Fig. 10). Acești factori principali sunt atât de puternici, încât pot schimba
fenotipul unei celule de la unul diferențiat la unul asemănător unei celulei stem nediferențiate.
Acest proces se numește reprogramare, sau dediferențiere și stă la baza formării celulelor stem
pluripotente induse (iPS), prin exprimarea artificială a doar trei factori de transcriere într-o celulă
specializată, cum ar fi un fibroblast sau leucocit.
15
Factor
principal al
transcrierii
Factor Factor
reglator 1 reglator 2
Proteina 1 Proteina 2 Proteina 3
Fig. 10. Diferențierea unei celule poate fi indusă de un singur factor principal de reglare, care
poate declanșa, în cascadă, expresia genică a altor factori de transcriere. Adaptată după figura 8-
17, capitolul 8 din Essential Cell Biology, Alberts et al., Ed. 5.
2. Controlul post-transcriere
Durata de viață a ARNm este dictată de secvențe specifice de nucleotide din regiunile netraduse,
aflate atât în amonte, cât și în și în aval de secvența de codificare a proteinelor. Aceste secvențe
conțin adesea situsuri de legare pentru proteinele care sunt implicate în degradarea ARN. Dar ele
poartă, de asemenea, informații care specifică dacă și cât de des ARNm trebuie să fie tradus în
proteine.
Multe alte specii de ARN produse în urma transcrierii sunt ARN-uri necodificatoare, care au un
rol crucial în reglarea expresiei genice și, prin urmare, sunt denumite ARN-uri reglatoare. Aceste
ARN-uri reglatoare includ microARN-uri, ARN-uri mici de interferență și ARN-uri lungi
necodificatoare.
MicroARN-urile, sau miARN, sunt molecule mici de ARN (câteva zeci, maxim sute de nucleotide)
care controlează expresia genelor prin hibridizare cu ARNm specifice și reducerea atât a
stabilității acestora, cât și a traducerii lor în proteine. Ca și alte ARN-uri, miARN suferă modficări
pentru a produce molecula de miARN matură și funcțională. miARN-ul matur de aproximativ 22
nucleotide în lungime, este asociat cu proteine specializate pentru a forma un complex de
silențiere indus de ARN (RISC), care patrulează în citosol, în căutare de ARNm cu secvențe
complementare cu miARN-ul legat (a se vedea filmulețul de pe YouTube). Odată ce un ARNm
țintă se hibridizează cu un miARN, fie este distrus imediat (de o nuclează care face parte din RISC),
fie i se blochează traducerea.
16
Unele dintre aceleași componente care procesează și împachetează miARN-uri joacă și un alt rol
crucial în viața unei celule: ele servesc ca mecanism de apărare celulară. În acest caz, sistemul
este utilizat pentru a elimina molecule de ARN "străine" – în special molecule lungi, dublu
catenare de ARN. Astfel de ARN-uri sunt rareori produse de gene normale, dar adesea ele servesc
drept intermediari în ciclurile de viață ale virusurilor.
Un virus are abilitatea de a insera propriul material genetic în genomul celulei, de regulă acolo
unde găsește cromatina deschisă – fie o regiune care se transcrie consitutiv, fără a fi nevoie de
semnale din afara nucleului, fie o genă care tocmai a fost despachetată pentru transcriere de
către factori reglatori ai transcrierii. Dacă virusul este de tip ARN, adică materialul lui genetic e
format din ARN și nu ADN, prima dată el va suferi o revers-transcriere a ARNului la ADNul
complementar, care va fi inserat în genom. Atunci când regiunea din genom va fi din nou
transcrisă de ARN polimerază, odată cu secvența proprie va fi inclusă în transcriere și secvența
virală, care se va regăsi în ARNm produs (Fig. 11). Această formă de detectare a acestor ARN-uri,
numită interferență ARN (iARN), păstrează aceste elemente potențial distructive sub control. În
prima etapă a iARN, ARN-urile străine dublu catenare (aproximativ 22 de perechi de nucleotide
în lungime) sunt tăiate în citosol în fragmente mai mici, de o proteină numită Dicer – aceeași
proteină folosită pentru a genera ARN intermediar în cadrul sintezei de miARN. Fragmentele de
ARN dublu-catenar rezultate, numite ARN-uri mici de interferență (ARNsi), sunt apoi preluate de
aceleași proteine RISC care transportă miARN. RISC elimină una din catenele ARNsi și utilizează
ARN-ul monocatenar pentru a căuta și distruge molecule de ARN complementar. În acest fel,
celula infectată folosește în mod eficient ARN-ul străin împotriva lui însuși.
17
Fig. 11. Procesul de interferență ARN se bazează pe recunoașterea unui ARN străin și
împiedicarea traducerii lui în proteine virale, care ar putea fi folosite la reasamblarea virusului.
Imagine creată cu BioRender.
ARN-urile lungi necodificatoare formează o clasă de molecule de ARN care sunt definite ca având
mai mult de 200 de nucleotide în lungime. Unele ARN-uri lungi necodificatoare se pliază în
structuri tridimensionale specifice, prin asocierea de baze complementare (a se vedea și
filmulețul YT) pentru a aduce împreună proteine care intervin în același proces (transcriere,
împachetarea cromatinei).
Termeni cheie
Genom
Cromozom interfazic/monocromatidian
Cromozom mitotic
Cromatină
Nucleozom
Genă
Promotor
Intron
Exon
Transcriere
Traducere
ARN codant/non-codant
Nucleol
expresie genică
factor de reglare a transcrierii
celule stem pluripotente induse (iPS)
interferență ARN (iARN)
ARN lung necodificator
microARN (miARN)
18
Biologie Celulară și Moleculară 2020
SINTEZA PROTEINELOR
Proteinele sunt molecule complexe care îndeplinesc o varietate de funcții în interiorul celulelor: unele au rol
structural, altele sunt implicate în mișcare, altele în activitatea enzimatică, iar altele în interacțiunea cu
exteriorul celulei. Fiecare celulă este compusă din mii de proteine, fiecare dintre ele având o structură și o
funcție diferite. Funcțiile proteinelor sunt foarte variate și sunt dependente de secvențele unice de aminoacizi
care le compun și de structurile tridimensionale extrem de complexe pe care le adoptă.
Proteinele sunt polimeri de aminoacizi aranjați într-o secvență liniară. Ribozomii sunt organitele responsabile
de sinteza lanțurilor de aminoacizi care formează proteinele.
RIBOZOMII
Ribozomii sunt organite nedelimitate de endomembrane (complexe ribonucleoproteice) care realizează sinteza
proteinelor prin formarea legăturilor peptidice între aminoacizii transportați de ARNt într-o secvența specifică
fiecărei proteine, secvență impusă de o moleculă de ARNm. Procesul de sinteză a proteinelor se numește
traducere.
În toate organismele, informația genetică este codificată de ADN. ADN codifică informația pentru proteine și
numeroase tipuri de ARN.
Pentru a fi folosită în sinteza proteinelor, informația ADN trebuie copiată sau transcrisă într-un polimer de
legătură - ARN. Transcrierea este urmată de traducere, proces prin care mesajul codat conținut în ARN
mesager (ARNm) este citit în ribozomi cu ajutorul ARN de transfer (ARNt) pentru a forma un polipeptid. Sinteza
tuturor proteinelor (traducerea) este realizată de ribozomi în citosol. Pentru proteinele destinate secreției
celulare procesul de sinteză este finalizat în lumenul reticulului endoplasmatic.
Celulele eucariote sintetizează foarte multe tipuri de ARN 1, unele conțin informația necesară sintezei
proteinelor (ARN codant - ARNm), altele sunt implicate atât în procesul de transcriere cât și în procesul de
traducere fiind efectori (ARNr, ARNt) sau reglatori ai proceselor menționate (microARN, ARNsi, ARNsn, etc).
1ARN‐urile nu sunt transcrise pur și simplu ca produse finite. Formele mature, funcționale ale tuturor speciilor de ARN sunt generate
prin prelucrare post‐transcriere. Exemple de tipuri de ARN:
 ARNm – ARN mesager, codifică proteine

 ARNr – ARN ribozomal, formează structura de bază a ribozomilor și catalizează sinteza proteinelor (75% din totalul ARN‐
urilor)
 ARNt – ARN‐uri de transfer, important în sinteza proteinelor, funcționează ca adaptor între ARNm și aminoacizii
corespondenți codonilor,
 microARN – reglează expresia genelor prin blocarea traducerii unui ARNm specific și determină degradarea acestuia,
 ARNsn – ARN nuclear mic, rol în multe procese nucleare, inclusiv în scindarea pre‐ARNm,
 ARNsno – ARNA nucleolar mic, rol în procesarea/modificarea ARNr,
 ARNsi – ARN mici de interferență, determină compactarea cromatinei și degradarea selectivă a ARNm pentru anumite gene
(scad expresia genică),
 ARNlnc– ARN lung non‐codant, reglează diferite procese celulare, inclusiv inactivarea cromozomului X.
1
Ribozomii sunt complexe macromoleculare compuse din ARN ribozomal (ARNr) și proteine ribozomale.
Ribozomii sunt particule electronodense ce măsoară 15 – 20 nm în diametru și sunt formați dintr-o subunitate
mică și o subunitate mare care interacționează în procesul de traducere. Ribozomii eucariotelor și procariotelor
sunt similari ca structură și funcție. Ambele tipuri sunt compuse dintr-o subunitate mare și o subunitate mică
care se potrivesc pentru a forma un ribozom complet.
Diferite tipuri de ribozomii sunt prezente în citosolul celulelor eucariote, în mitocondrii și în celulele procariote.
Cele trei tipuri de ribozomi conțin molecule de ARNr și proteine diferite, au compoziție moleculară diferită și
dimensiuni diferite.2
Tipuri de ribozomi:
- 70 S3– în celulele procariote (2,7 MDa) cu subunități 50S și 30S.
- 80 S – în citosolul celulelor eucariote (4,3 MDa) cu subunități 60S și 40S
- 55 S – în mitocondrii (~3 MDa) cu subunități 39S și 28S
Fiecare subunitate a unui ribozom conține molecule ARNr de lungimi diferite, precum și numeroase tipuri de
proteine. Diferitele tipuri de ribozomii conțin un număr diferit de molecule de ARNr:
 3 molecule ARNr – procariote (23S, 5S în subunitatea mare și 16S în subunitatea mică)
 3 molecule ARNr – mitocondrii (16S, CPtRNA în subunitatea mare și 12S în subunitatea mică)
 4 molecule ARNr – eucariote (28S, 5.8S, 5S în subunitatea mare și 18S în subunitatea mică)
Proteinele ribozomale sunt de obicei bazice, mici (10-30 kDa) și majoritatea sunt legate de suprafața
ribozomilor. Sunt cunoscute aproximativ:
 54 proteine în ribozomii procariotelor
 80 proteine în ribozomii eucariotelor (citosol)
 82 proteine în ribozomii mitocondriilor.
2 Diferențele dintre structura ribozomilor procariotelor (bacterii) și cei ai eucariotelor au fost exploatate de cercetători care au
descoperit compuși chimici (antibiotice) care se leagă la ribozomii bacterieni, stopând astfel o infecție bacteriană fără a afecta celulele
eucariote ale individului infectat. Capacitatea de a traduce cu acuratețe ARNm în proteine este o caracteristică fundamentală a întregii
vieți de pe Pământ. Deși ribozomul și alte molecule care îndeplinesc această sarcină complexă sunt foarte similare între organisme,
există unele diferențe subtile în modul în care bacteriile și eucariotele sintetizează ARN și proteinele.
Multe dintre cele mai eficiente antibiotice sunt compuși care acționează prin inhibarea expresiei genice bacteriene, dar nu și a celei
eucariote. Unele dintre aceste medicamente exploatează micile diferențe structurale și funcționale între ribozomii bacterieni și
ribozomii eucariotelor, astfel încât să interfereze preferențial cu sinteza proteinelor doar în bacterii. Acești compuși pot fi astfel luați
în doze mari, suficiente pentru a ucide bacteriile fără a fi toxice pentru oameni. Pentru că diferitele antibiotice se leagă de diferite
regiuni ale ribozomului bacterian, aceste medicamente inhibă adesea diferite etape în sinteza proteinelor. Mai multe tipuri de
antibiotice, cum ar fi aminoglicozidele (streptomicina), macrolidele (eritromicină), lincosamidele (clindamicină), tetraciclinele și
cloramfenicolul inhibă sinteza proteinelor prin legarea în segmente diferite ale ribozomilor bacterieni.
Multe antibiotice comune au fost izolate pentru prima dată din fungi. Fungii și bacteriile ocupă deseori aceleași nișe ecologice și, pentru
a câștiga un avantaj competitiv, ciupercile au creat, în timp, toxine puternice care ucid bacteriile dar sunt inofensive pentru ele însele.
Deoarece fungii și oamenii sunt eucariote și sunt astfel mult mai strâns înrudite între ele decât cu bacteriile, am reușit să împrumutăm
aceste arme pentru a combate infecțiile bacteriene. În același timp, din păcate, bacteriile au dezvoltat rezistență la multe dintre aceste
medicamente. Astfel, este o provocare continuă pentru noi să rămânem cu un pas înaintea inamicilor noștri microbieni.
O modalitate de a genera noi terapii este aceea de a genera molecula ARN care să acționeze specific asupra agenților infecțioși
(https://doi.org/10.1016/j.jmb.2015.11.013). Puteți încerca și voi https://eternagame.org/ .
3Dimensiunile ribozomilor, subunităților ribozomale și ARN‐urilor sunt date în mod tradițional în unități S (Svedberg), coeficientul de
sedimentare măsurat într‐o ultracentrifugă. Moleculele sedimentează funcție de masa, densitatea și forma particulei prin
ultracentrifugare în gradient de sucroză. Astfel dimensiunea S a unui complex macromolecular nu reprezintă suma subunităților
componente.
2
Ribozomii sunt formați din 2 subunități:

- SUBUNITATE MICĂ asigură legarea ARNt și decodarea ARNm,
- SUBUNITATE MARE asigură funcția enzimatică a ribozomilor – ribozimă – este o peptidil transferază,
realizează legătura covalentă peptidică între aminoacizii aduși de ARNt din citosol.
Subunitățile ribozomale libere în citosol interacționează pentru a forma o unitate funcțională atunci când traduc
o moleculă de ARNm. Decodarea ARNm și sinteza polipeptidului are loc într-o cavitate formată între cele 2
subunități ribozomale. Suprafața acestei cavități nu conține proteine, aici interacționează ARNr cu ARNm și
ARNt.
Cavitatea formată între cele două subunități ribozomale prezintă mai multe spații specifice:
- A – situs acceptor al RNAt-aminoacilat (situs de decodare, asigură interacțiunea codon-anticodon
între ARNm-ARNt).
- P – situs peptidil, locul în care este poziționat ARNt purtător al lanțului polipeptidic.
- E – situs de ieșire al RNAt deacilat (fără aminoacid).
- În subunitatea mare există un tunel de ieșire a lanțului polipeptidic sintetizat prin adăugarea succesivă
a câte unui aminoacid.
Ribozomii din citosolul celulelor eucariote sunt 80S (cu subunitate mare 60S și subunitate mică 40S ) și pot
fi liberi în citosol sau atașați membranelor reticulului endoplasmatic (care, din acest motiv, este numit rugos -
RER) sau atașați anvelopei nucleare. Ribozomii liberi nu sunt asociați niciunei endomembrane și sunt structural
și funcțional identici cu cei asociați RE. Numărul ribozomilor (câteva milioane pentru o celulă eucariotă tipică)
variază în diferite tipuri de celule și sunt cu atât mai numeroși cu cât celula are o sinteză proteică mai intensă 4.
Poliribozomii sau polizomii sunt grupurile de ribozomi care formează structuri spiralate în care mai mulți
ribozomi sunt atașați de o moleculă de ARNm citoplasmatic (distanțați la 80 de nucleotide). Un polizom traduce
o singură moleculă ARNm și produce simultan mai multe copii ale unei proteine.
4
Bazofilia citoplasmatică este caracteristică celulelor care produc mari cantități de proteine care vor rămâne în celulă (număr crescut
de ribozomi, implicit de ARN). Astfel de celule și produșii lor includ eritrocite în formare (hemoglobină), celule musculare în formare
(proteine contractile actină și miozină), celule nervoase (neurofilamente) și keratinocitele pielii (keratina). În plus, majoritatea
enzimelor din mitocondrie sunt sintetizate de polizomi liberi și transferate în organit. Bazofilia în aceste celule a fost denumită anterior
ergastoplasmă și este determinată de prezența unor cantități mari de ARN. În acest caz, ribozomii și polizomii sunt liberi în citoplasmă
(nu sunt atașați de endomembranele reticulului endoplasmatic). Corpii bazofili mari ai celulelor nervoase, care sunt numiți corpi Nissl,
constau în RER și numeroși ribozomi liberi. Toți ribozomii conțin ARN; bazofilia citoplasmei este determinată de grupările fosfat ale
ARN ribozomal și nu de componenta membranară a reticulului endoplasmatic.
3
Biogeneza ribozomilor.
Subunitățile ribozomale sunt sintetizate în nucleol și sunt transferate separat în citosol. În celulele eucariote
clusterele de gene (300 – 400 de copii ale genelor pentru ARNr) ce codifică informația pentru ARNr sunt situate
pe cromozomii 13, 14, 15, 21, 22. Segmentele de ADN care sunt transcrise în ARNr sunt în majoritate situate
în regiuni specializate ale nucleului – nucleolii.
Nucleolul este un subdomeniu al nucleului specializat în biogeneza ribozomilor și prezintă următoarele zone:
- zona fibrilară - centrul de organizare nucleolară (NOR- nucleolar organisation region) – conține ADN -
genele pentru ARNr,
- zona densă fibrilară (ZDF) – zona de transcriere activă a ADN în ARNr,
- zona granulară (ZG) – conține ARNr precursor complexat cu proteine (subunități în formare).
Transcrierea ADN ce codifică ARNr are loc sub acțiunea ARN polimerazelor:
- ARN-polimeraza I acționează în nucleol (la nivelul zonei dens fibrilare) pentru transcrierea unui pre-
ARNr 45S (precursor din care vor rezulta ARNr 28S, 5.8S și 18S),
- ARN-polimeraza III în nucleu, în afara nucleolului, pentru transcriere ARNr 5S care va fi translocat în
nucleol ulterior.
La nivelul nucleolului are loc procesarea unui precursor pre-ARNr (45S) și complexarea moleculelor rezultate
cu aproximativ 80 de proteine ribozomale importate din citosol în nucleu. Formarea subunităților ribozomale în
nucleol implică interacțiunea a aproximativ 200 de proteine și a peste 100 de ARNsno (ARN mici nucleolare /
small nucleolar RNA). Proteinele ribozomale acționează ca șaperone în procesul de asamblare a subunităților
și sunt co-factori în procesul de traducere.
Subunitățile ribozomale (60S și 40S) sunt transferate separat în citosol prin porii nucleari unde are loc procesul
de maturare finală. Subunitățile ribozomale se asamblează în citosol formând ribozomii în timpul procesului de
traducere prin legarea unei molecule de ARNm.
Moleculele de ARNr sunt mari (dimensiuni variabile, 121 -5000 nucleotide) și se pliază formând anse și
segmente dublu catenare generate atât de interacțiuni convenționale (complementaritatea bazelor) cât și de
interacțiuni neconvenționale între nucleotidele componente. Împachetarea moleculelor de ARNr determină
formarea unor structuri tridimensionale compacte iar proteinele ribozomale asigură stabilitatea acestora.
Sinteza proteinelor se realizează la nivelul ribozomilor pe baza informației din ARNm cu ajutorul ARNt.
ARN mesager - ARNm. ARNm este format în nucleu prin transcriere, proces prin care codul genetic pentru o
proteină este transcris din ADN înntr-o moleculă precursor de ARNm (pre-ARNm) sub acțiunea ARN-
polimerazei II. După modificările post-transcriere ale moleculei de pre-RNAm (care includ splicingul ARN,
excizia intronilor, reunirea exonilor și adăugarea cozii poli(A) la capătul 3’ și a unui capișon de metilguanozină
la capătul 5’) molecula de ARNm rezultată părăsește nucleul și migrează în citoplasmă.
ARNm matur este o moleculă monocatenară cu lungime variabilă și conține codul necesar sintezei unei singure
proteine în celulele eucariote (ARNm monocistronic). O moleculă de ARNm în celulele procariote codifică de
obicei mai multe proteine (ARNm policistronic).
ARNm mature ale eucariotelor sunt exportate din nucleu. Dintre toate pre-ARNm sintetizate într-o celulă,
doar o mică parte – secvențele conținute în ARNm mature – va fi folosită. Fragmentele de ARN care au rămas
în urma procesării pre-ARNm – introni excizați, ARN-uri defecte sau transcriptele rezultate din splicingul aberant
– sunt degradate în nucleu iar nucleotidele rezultate sunt refolosite pentru transcriere.
Transportul ARNm din nucleu în citosol are selectivitate înaltă: doar ARNm procesat corect este exportat și
disponibil pentru traducere. Acest transport selectiv este mediat de complexele porilor nucleari care conectează
nucleoplasma cu citosolul și acționează ca niște porți care controlează macromoleculele ce pot intra sau ieși
din nucleu. Eticheta „bun de export” pe o moleculă de ARNm este pusă de un set special de proteine care
recunosc, fiecare în parte, segmente diferite din molecula de ARNm matur. Aceste set include proteine care
leagă coada 3’ poli-A și proteine care leagă capacul 5’ ARN.
4
O moleculă de ARNm prezintă următoarele segmente structurale:

• capătul 5`- tri-fosfo-7-metil-guanozină permite legarea proteinelor care inițiază sinteza
polipeptidelor (aceste proteine sunt numite factori de inițiere)
• regiune netradusă 5`UTR (untranslated region) conține o regiune de legare a subunității
mici a ribozomilor
• codon START – AUG într-o secvență numită Kozak consensus sequence (ACCAUGG)
• segment codant - de lungime variabilă ce codifică un lanț polipeptidic specific unei
proteine (succesiune de codoni)
• codon STOP – UGA, UAG, UAA
• regiune netradusă 3` UTR (cu rol reglator post-traducere)unde se pot lega molecule de ARN
reglatorii
• capătul 3` poliadenilat (50 – 200 de reziduuri de adenină) asigură exportul din nucleu și
stabilitatea ARNm în citosol.
Moleculele ARNm mature sunt traduse și degradate în citosol. Transcrierea este urmată de traducere -
proces prin care mesajul codat conținut în ARNm este citit de ribozomi pentru a forma un polipeptid. ARNm
este codant, informația conținută este codată în secvențe de 3 nucleotide numite codoni. Există 64 de codoni
din care 61 codifică aminoacizi iar 3 codoni semnalizează încheierea sintezei proteice (codoni STOP: UAA,
UGA, UAG). Codonul ce codifică metionina (AUG) este situat întotdeauna în prima poziție a secvenței codante.
Chiar dacă metionina este întotdeauna primul aminoacid din lanțul polipeptidic nou sintetizat, metionina poate
să nu fie prezentă în structura unei proteine mature (poate fi îndepărtat în procesul de maturare al proteinei).
Fiecărui codon din molecula de ARNm îi corespunde un aminoacid iar secvența codonilor determină secvența
aminoacizilor în lanțul polipeptidic sintetizat de ribozomi.
Deoarece o singură molecula ARNm poate fi tradusă de mai multe ori în proteină, durata de viață a unei
molecule de ARNm în celulă influențează semnificativ cantitatea de proteină produsă.
Fiecare moleculă de ARNm este în cele din urmă degradată în nucleotide de către ribonucleazele (ARN-aze)
prezente în citosol, dar durata de viață a moleculelor de ARNm diferă considerabil – în funcție de secvența de
nucleotide din ARNm și tipul celulelor. În bacterii (procariote), majoritatea moleculelor de ARNm sunt degradate
rapid, având o durată de viață tipică de aproximativ 3 minute. Moleculele de ARNm din celulele eucariote
persistă de obicei mai mult: unele, cum ar fi cele care codifică β-globină, au durată de viață mai mare de 10 ore,
în timp ce altele rezistă mai puțin de 30 de minute. Aceste diferențe în durata de viață a moleculelor de ARNm
sunt parțial determinate de secvențe de nucleotide situate cel mai adesea în regiunea 3ʹ netradusă, care se află
între capătul 3ʹ al secvenței de codare și coada poli-A. Durata de viață diferită a diferitelor ARNm ajută celula
să controleze cantitatea de proteine ce va fi produsă. În general, proteinele realizate în cantități mari, cum ar fi
5
β-globina, sunt traduse din ARNm care au durată de viață îndelungată, în timp ce proteinele produse în cantități
mai mici sau cele ale căror niveluri variază rapid ca răspuns la diferite semnale sunt sintetizate de obicei din
ARNm cu durată de viață scurtă.
ARN-urile de transfer (ARNt) sunt molecule adaptor care preiau aminoacizii din citosol și îi poziționează în
ribozomi conform secvenței impuse de ARNm prin legare de codonii acestuia.
Moleculele de ARNt potrivesc aminoacizii cu codonii din ARNm
Codonii dintr-o moleculă de ARNm nu recunosc direct aminoacizii pe care îi specifică: codonii (seturile de trei
nucleotide) nu se leagă direct de aminoacizi. Traducerea ARNm în proteină depinde de moleculele adaptor care
se leagă cu un segment de un codon și cu alt segment se leagă de un aminoacid. Acești adaptori constau din
un set de molecule ARN mici cunoscute sub denumirea de ARN-uri de transfer (ARNt), fiecare cu o lungime de
aproximativ 80 de nucleotide.
ARNt sunt transcrise inițial sub forma unor precursori pre-ARNt în nucleu (aproximativ 500 de gene) sub
acțiunea ARN-polimerazei III. ARNt conține pe lângă nucleotidele obișnuite (A, C, G, U) și nucleotide atipice (Ψ
–pseudouridină, D - dihidrouridină , I – inozină, etc). Aceste nucleotide modificate post-transcriere (epigenetic)
sunt necesare realizării structurii tridimensionale specifice ARNt și modificărilor conformaționale în timpul
procesului de traducere din ribozom.
Moleculă de ARNt se pliază într-o structură tridimensională prin formarea unor legături între baze
complementare situate în regiuni diferite ale moleculei. Dacă regiunile de complementaritate sunt suficient de
mari se vor plia în jurul propriei axe astfel că, vor forma structuri dublu-helix asemănătoare celor formate de
ADN-ul dublu catenar.
Patru segmente scurte din ARNt pliat sunt dublu spiralate și generează o structură care seamănă cu o frunză
de trifoi dacă este reprezentată schematic (structura secundară). Frunza de trifoi se poate plia și mai mult,
pentru a forma o structură tridimensională compactă (asemănătoare literei L; structură terțiară) care este
menținută prin legături de hidrogen între regiuni diferite ale moleculei.
ARNt este moleculă dublu-catenară de aproximativ 80 nucleotide (3,8S) care are

spațial forma unui trifoi cu patru foi și prezintă 4 situsuri funcționale:
- pol acceptor (3’-CCA-OH / citozină-citozină-adenină-OH) leagă
aminoacidul corespunzător unui anticodon
- pol anticodon – secvență de 3 baze azotate complementară unui codon
al ARNm
- braț T – asigură interacțiunea cu ribozomul (în situsurile funcționale A, P,
E)
- braț D – asigură interacțiunea cu ARNt-sintetaza corespunzătoare care
leagă un aminoacid specific
Două regiuni cu nucleotide nepereche situate la fiecare capăt al moleculei de ARNt în formă de L sunt esențiale
pentru funcția ARNt în sinteza proteinelor. Una dintre aceste regiuni formează anticodonul, un set de trei
nucleotide consecutive care se leagă, prin asocierea bazelor, de codonul complementar dintr-o moleculă de
ARNm. Cealaltă regiune monocatenară este scurtă, situată la capătul 3ʹ al moleculei de ARNt; acesta este locul
unde aminoacidul care se potrivește codonului este atașat covalent la ARNt 5.
5Codul genetic este „degenerat” deoarece numeroși aminoacizi sunt codificați de mai mulți codoni (codoni sinonimi). In celulele
eucariote exista 48 de molecule distincte de ARNt care recunosc specific 20 de aminoacizi și 61 de codoni. Un ARNt poate lega
6
Aminoacil-ARNt-sintetaze - enzime care cuplează specific un aminoacid cu ARNt corespunzător

(funcționează ca adaptori între aminoacizi și ARNt). Există 20 de aminoacil-ARNt-sintetaze - câte una pentru
fiecare din cei 20 de aminoacizi (una atașează glicina la toate ARNt care recunosc codonii pentru glicină, alta
atașează fenilalanina la toate ARNt care recunosc codonii pentru fenilalanină, ș.a.m.d.).
Reacția de acilare a ARNt are loc în doi pași:

- aminoacid + ATP → aminoacil-AMP + PPi
- aminoacil-AMP + ARNt → aminoacil-ARNt + AMP.
Se cunosc 2 clase de aminoacil-ARNt-sintetaze:

– clasa I: atașează restul aa- de –OH din 2’ al adenozinei (la capătul 3’ –CCA al ARNt),
– clasa II: atașează restul aa- de –OH din 3’ al adenozinei (la capătul 3’ –CCA al ARNt).
Capacitatea fiecărei aminoacil-ARNt-sintetaze de a recunoaște un ARNt adecvat este asimilată cu un al doilea

cod genetic. Un proces precis de recunoaștere este necesar pentru a menține fidelitatea informațiilor genetice.
Dacă un aminoacid ar fi atașat greșit la un ARNt, secvența de aminoacizi a polipeptidului ar fi incorect tradusă.
Pentru a preveni acest lucru, aminoacil-ARNt sintetazele sunt enzimele foarte precise (erorile sunt sub 1 la
100.000 de evenimente). Regiunea anticodon a ARNt, secvențe nucleotidice ale brațului D și secvențe al
brațului acceptor sunt recunoscute specific de aminoacil-ARNt-sintetaza corectă.
Reacția de atașare a aminoacidului la capătul 3’ al ARNt catalizată de sintetază este una dintre reacțiile care
necesită energie eliberată de hidroliza ATP. Reacția produce o legătură de înaltă energie între ARNt și
aminoacid. Energia acestei legături este mai târziu folosită pentru legarea covalentă a aminoacidul în lanțul
polipeptidic în formare.
SINTEZA PROTEINELOR ARE LOC ÎN CITOSOL ȘI ESTE REALIZATĂ DE RIBOZOMI.

Decodarea ARNm și sinteza polipeptidului are loc într-o cavitate formată între cele 2 subunități. Suprafața
acestei cavități nu conține proteine, aici interacționând ARNr, ARNm și ARNt.
Subunitate mică asigură legarea ARNm și decodarea acestuia de ARNt. Subunitate mare asigură funcția
enzimatică a ribozomilor (ribozimă) catalizează formarea legăturilor peptidice între aminoacizii aduși de
moleculele de ARNt în secvența impusă de ARNm.
Ribozomii funcționează cu o eficiență remarcabilă: un ribozom eucariot adaugă aproximativ 2 aminoacizi la un
lanț polipeptidic în fiecare secundă; un ribozom bacterian operează și mai repede, adăugând aproximativ 20
aminoacizi pe secundă.
ETAPELE SINTEZEI LANȚULUI POLIPEPTIDIC ÎN RIBOZOMI:

1. INIȚIEREA SINTEZEI (factori de inițiere – IF),
2. ELONGAREA LANȚULUI (factori de elongare - EF),
3. TERMINAREA SINTEZEI (factori de eliberare – RF).
aminoacizi diferiți . Un aminoacid poate fi purtat de ARNt diferite (ilustrând abundența acestuia în proteine). Un ARNt poate recunoaște
codoni diferiți datorită modului atipic de interacțiune (wobble base pairing) dintre nucleotidele anticodonului cu nucleotidele
codonului.
Mai mulți codoni diferiți pot specifica un singur aminoacid (codul genetic este redundant). Unii aminoacizii au mai mult de un ARNt,
iar unele molecule de ARNt necesită o corelare exactă a bazelor numai la primele două poziții ale codonului și pot tolera o nepotrivire
(sau wobble) la a treia poziție. Această împerechere imprecisă explică de ce atât de mulți codoni alternativi pentru un aminoacid diferă
doar la cel de‐al treilea nucleotid. Împerecherile de baze de tip „wobble” fac posibilă potrivirea celor 20 de aminoacizi cu cei 61 de
codoni folosind mai puțin de 31 de molecule ARNt diferite. Numărul exact de tipuri diferite de ARNt diferă de la o specie la alta. De
exemplu, oamenii au aproximativ 48 de molecule diferite de ARNt (cu 48 de anticodoni diferiți).
7
Factorii de inițiere, de elongare și de terminare sunt proteine g mici din superfamilia Ras GTP-azelor care
asigură specificitatea interacțiunilor moleculare și energia necesară etapelor de sinteza a proteinelor.
Cele două subunități ribozomale se reunesc pe o moleculă de ARNm, aproape de capătul său 5ʹ, pentru a
începe sinteza unei proteine. ARNm este apoi tras prin ribozom ca o bucată lungă de bandă. Pe măsură ce
ARNm este deplasat în direcția 5ʹ–3ʹ, ribozomul traduce secvența de nucleotide într-o secvență de aminoacizi,
câte un codon pe rând, folosind ARNt ca adaptor. Prin urmare, fiecare aminoacid este adăugat în secvența
corectă la sfârșitul lanțului polipeptidic în creștere. Când se termină sinteza proteinei, cele două subunități ale
ribozomului se separă.
Pe lângă un loc de legare pentru molecula de ARNm, fiecare ribozom conține trei situsuri de legare pentru
molecule de ARNt (situs A, situs P și situs E).
Traducerea unui ARNm începe cu codonul start AUG, pentru care este necesar un ARNt încărcat special. Acest
ARNt inițiator poartă întotdeauna aminoacidul metionină (sau o formă modificată de metionină, formilmetionină
în bacterii). Astfel, toate proteinele recent sintetizate au metionină ca prim aminoacid la capătul lor N-terminal,
capătul care se sintetizează primul. Această metionină este de obicei îndepărtată ulterior de către o protează
specifică.
În eucariote, ARNt inițiator, încărcat cu metionină, este legat inițial în situsul P al subunității mici ribozomale,
împreună cu proteine adiționale numite factori de inițiere a traducerii (proteine g mici) și formează complexul
de inițiere. Molecula de ARNt inițiator este diferită de ARNt care transportă în mod normal metionină. Dintre
toate moleculele de ARNt, doar molecula de ARNt inițiator este capabilă să se lege ferm în situsul P în absența
subunității mari ribozomale.
În continuare, subunitatea ribozomală mică încărcată cu ARNt inițiator se leagă la capătul 5ʹ al unei molecule
de ARNm, care este marcată de capacul 5ʹ prezent la toate moleculele ARNm eucariote. Subunitatea
ribozomală mică scanează apoi ARNm, în direcția 5ʹ3ʹ, până când întâlnește primul AUG. Când acest AUG
este recunoscut de ARNt inițiator, mai mulți dintre factorii de inițiere se disociază de subunitatea ribozomală
mică pentru a face loc subunității ribozomale mari să se lege și să completeze ansamblul ribozomal. Deoarece
ARNt inițiator este legat de situsul P, sinteza proteinelor este gata să înceapă cu adăugarea următorului ARNt
încărcat în situsul A.
Pentru a adăuga un aminoacid lanțului peptidic în creștere (elongare), un nou ARNt încărcat intră în situsul A și
se leagă de codonul complementar de pe molecula ARNm. Aminoacidul său este apoi adăugat în lanțul peptidic
în creștere care este ținut pe loc de către ARNt din situsul P vecin. În continuare, subunitate ribozomală mare
înaintează, mutând ARNt descărcat în situsul E înainte de a-l expulza.
Acest ciclu de reacții se repetă de fiecare dată când este adăugat un nou aminoacid la lanțul polipeptidic, care
crește de la capătul amino la capătul carboxil, până când apare un codon stop în ARNm iar capătul carboxil
este hidroxilat și lanțul polipeptidic este eliberat.
Sfârșitul traducerii este marcat de prezența unui codon din ARNm numit codon stop – UAA, UAG sau UGA –
care nu este recunoscut de ARNt și nu specifică nici un aminoacid dar semnalizează ribozomului să oprească
traducerea. Proteinele cunoscute ca factori de eliberare (au o structură tridimensională asemănătoare cu ARNt)
leagă orice codon stop ajunge în situsul A al ribozomului.
Legarea factorului de eliberare alterează activitatea peptidil transferazei din ribozom determinând-o să
catalizeze adiția unei molecule de apă în locul unui aminoacid la ARNt-peptidil (din situsul P). Această reacție
eliberează capătul carboxil al lanțului polipeptidic legat de molecula de ARNt; deoarece această este singura
legătură care ține lanțul polipeptidic în formare de ribozom.
Odată finalizat, lanțul polipeptidic este imediat eliberat. În acest moment, ribozomul eliberează și ARNm iar cele
două subunități disociază putându-se asambla pe o altă moleculă de ARNm și poate începe o nouă rundă de
sinteză a unei proteine.
8
Controlul interacțiunii corecte dintre ARNr, ARNm și ARNt se realizează prin mecanisme multiple:
- complementaritatea interacțiunii bazelor: codon – anticodon;
- plierea ribozomului (schimbarea conformației) pe bazele cu complementaritate corectă permite
continuarea procesului;
- hidroliza GTP din factorii de inițiere/elongare/terminare și disocierea acestora (control cinetic – dacă
reacția codon– anticodon este specifică, legătura este stabilă iar hidroliza GTP are loc datorită
schimbărilor conformaționale implicate de legarea specifică).
Proteinele sunt produse cu eficiență crescută de poliribozomi. Sinteza majorității proteinelor are loc între
20 de secunde și câteva minute. De obicei, chiar și în această perioadă scurtă, mai muți ribozomi se leagă de
fiecare moleculă de ARNm care este tradusă. Dacă un ARNm începe să fie tradus eficient, un nou ribozom se
va atașa în capătul 5ʹ al acestuia aproape imediat ce ribozomul precedent a tradus suficient din secvența de
nucleotide pentru a-i face loc unui nou ribozom. Moleculele de ARNm care sunt traduse se găsesc, de regulă,
sub formă de poliribozomi, cunoscuți și sub denumirea de polizomi. Aceste mari ansambluri citosolice sunt
alcătuite din mai mulți ribozomi distanțați la aproximativ 80 de nucleotide de-a lungul unei singure molecule de
ARNm. Cu mai mulți ribozomi care lucrează simultan pe un singur ARNm, pot fi făcute multe mai multe molecule
din aceeași proteină într-un timp mai scurt decât ar fi posibil dacă fiecare moleculă ar fi trebuit finalizată înainte
de începerea sintezei următoarei molecule.
Localizarea celulară a proteinelor
Ribozomii liberi (neatașați de membranele RER) sintetizează proteine care vor rămâne în celulă ca elemente
structurale sau funcționale citoplasmatice. Proteine destinate nucleului, mitocondriilor sau peroxizomilor sunt
sintetizate tot de către ribozomii liberi și apoi eliberate în citosol de unde vor fi direcționate către compartimentul
țintă. Ribozomii atașați RER sintetizează câteva proteine care rămân permanent în membranele sau lumenul
RER și foarte multe proteine care sunt livrate aparatului Golgi pentru procesare și secreție ulterioară sau pentru
compartimentul endolizozomal.
Secvențe specifice de aminoacizi din proteinele nou sintetizate - secvență semnal - direcționează
transportul co-traducere sau post-traducere al polipeptidelor/proteinelor către destinația structurală și
funcțională.
În absența unei secvențe semnal, proteinele care sunt sintetizate de ribozomii liberi rămân în citosol.
SECVENȚĂ SEMNAL Semnal

+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu- import în reticul
Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln- endoplasmic
sau
-Lys-Asp-Glu-Leu-COO–
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- import în nucleu
-Met-Glu-Glu-Leu-Ser-Gln-Ala-Leu-Ala-Ser-Ser-Phe- export din nucleu
+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu- import în mitocondrie
Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-
-Ser-Lys-Leu-COO– import în peroxizomi
În afară de situația specifică a preluării de proteine de către RER și care reprezintă un proces co-traducere (în
timpul procesului de sinteză), pentru toate celelalte organite proteinele sunt importate din citosol, după ce au
fost sintetizate integral, prin procese post-traducere specifice.
Cele mai multe proteine care sunt sintetizate pentru export sau pentru a deveni o parte din organite specifice
(cum ar fi membrana plasmatică, matricea mitocondrială, reticulul endoplasmatic sau nucleul) au nevoie de
semnale de sortare care direcționează proteinele către destinația corectă. Peptide semnal sunt cel mai adesea
9
regăsite în secvența primei grupe de 15-60 de aminoacizi de la capătul amino-terminal al unei proteine nou
sintetizate.
De exemplu, aproape toate proteinele care sunt transportate în RER au o secvență semnal constând din 5-10
aminoacizi hidrofobi la capătul amino-terminal. Secvența semnal a peptidei în formare interacționează cu
particula de recunoaștere a semnalului (SRP, o ribonucleoproteină) care se leagă de ribozom și de secvența
semnal a polipeptidului în formare și oprește alungirea lanțului polipeptidic (blochează temporar ribozomul și
procesul de traducere). Complexul care conține SRP–ribozom împreună cu polipeptidul în formare, a cărui
alungire a fost oprită, este relocat către membrana RER. Legarea SRP la o proteină de acostare pe suprafața
citoplasmatică a RER aliniază ribozomul cu un complex proteic transmembranar al RER numit translocon.
Legarea ribozomului de translocon conduce la disocierea complexului SRP–proteină de acostare de ribozom și

de membrana RER, deblocând transcrierea și permițând ribozomului să reia sinteza proteinei. Transloconul
introduce lanțul polipeptidic în porul său hidrofil, permițând accesul proteinei nou formate, pe măsură ce se
alungește, în lumenul cisternei RER. Pentru proteine secretorii simple, polipeptidul continuă să fie inserat de
către translocon în lumen, pe măsură ce este sintetizat. Secvența semnal este îndepărtată din polipeptid de o
peptidază specifică, aflată pe fața internă a membranei RER, chiar înainte ca sinteza întregului lanț să fie
finalizată. Pentru proteine integrale de membrană, secvențe de-a lungul polipeptidului dirijează proteina în
formare să treacă înainte și înapoi prin membrană, creând domeniile funcționale pe care proteina le va prezenta
în membrana de destinație (vezi cursul de reticul endoplasmatic). La finalizarea sintezei proteinelor destinate
RER, ribozomul se detașează de translocon și subunitățile sale sunt din nou libere în citoplasmă.
Mecanisme celulare de pliere a proteinelor nou sintetizate

Într-o celulă eucariotă, moleculele de ARNm trebuie sintetizate, prelucrate și exportate în citosol unde sunt
traduse în ribozomi pentru a produce o proteină. Proteinele nou sintetizate trebuie să se plieze în forma
tridimensională (structura terțiară) corectă pentru a fi funcționale.
Unele proteine fac acest lucru în mod spontan, pe măsură ce ies din ribozom - pliere spontană. Anumite
secvențe de aminoacizi din lanțul polipeptidic pot interacționa și determină plierea spontană a lanțului. Aceste
secvențe nu au rol în funcția proteinei (de obicei sunt eliminate din proteina matură). În funcție de poziția acestor
secvențe putem vorbi de pliere spontană de:
- tip I – secvențe din capătul N-terminal (primul care iese din ribozom),
- tip II – secvențe din capătul C-terminal.
Plierea spontană de tip I poate începe din tunelul de ieșire din ribozom. Tunelul de ieșire a polipeptidului din
ribozom are un diametru de 20Å și o lungime de 100Å putând permite plierea unor secvențe/domenii cu <50
aminoacizi.
Cele mai multe proteine necesită asistență din partea altor proteine - proteine șaperon, care le direcționează
în procese de pliere eficiente și împiedică agregarea lor în interiorul celulei.
ȘAPERONE – grup de proteine care asigură (realizează și mențin activ) plierea corectă a altor proteine și previn
agregarea proteinelor nepliate complet. Mai multe șaperone pot acționa secvențial pentru plierea corectă a unei
proteine și menținerea structurii tridimensionale corecte. Co-șaperone – șaperone care asistă alte șaperone în
plierea proteinelor.
Șaperonele sunt localizate în toate compartimentele celulare (acolo unde sunt proteine!): în citosol,
reticul endoplasmic, aparat Golgi, mitocondrii sau nucleu. 6
6 Ambre J. Sala et al. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. J Cell Biol 2017;216:1231‐1241
10
Șaperonele sunt specifice pentru diferitele compartimente celulare și sunt specifice pentru fiecare țesut. Din
cele peste 20.000 de gene care codifică proteine peste 300 de gene codifică șaperone. Defecte în structura și
funcția șaperonelor sunt descrise în diferite patologii.
Șaperonele pot fi clasificate în:

- holdaze - ATP independente, leagă situsurile hidrofobe ale proteinelor pe care le asistă în plierea
necovalentă și previne agregarea (DnaJ, Hsp33, etc),
- foldaze - ATP dependente, asigură plierea activă și specifică a proteinelor sau complexelor proteice
(Hsp60, Hsp70, etc).
Multe dintre șaperone fac parte din clasa proteinelor de șoc termic – (HSP - heat shock proteins) – un set de
proteine șaperon induse de expunerea scurtă a celulelor la temperatură crescută (~42°C). 7
Pe lângă faptul că se pliază corect, multe proteine – odată ce părăsesc ribozomul – necesită ajustări
suplimentare înainte de a fi utile celulei. Unele proteine sunt modificate covalent – de exemplu, prin fosforilare
sau glicozilare. Altele se leagă de molecule mici, cofactori, sau se asociază cu subunități proteice suplimentare.
Astfel de modificările post-traducere sunt adesea necesare pentru ca o proteină nou sintetizată să devină
complet funcțională. Prin urmare, concentrația finală a unei proteine depinde de rata de realizare a fiecărei
etape din procesul parcurs de la ADN la proteina matură, funcțională. În principiu, fiecare etapă poate fie
controlată de celulă astfel încât concentrația proteinei să fie adaptată conform necesităților. În orice caz, inițierea
transcrierii este punctul principal de control al expresiei unei gene.
Mecanisme celulare de degradare a proteinelor incorect pliate sau în surplus

După ce o proteină este eliberată din ribozom, o celulă poate controla activitatea și longevitatea acesteia în
diferite moduri. Numărul de copii ale unei proteine dintr-o celulă depinde, ca și numărul de organisme dintr-o
populație, nu numai de cât de repede apar indivizi noi, ci și de cât timp supraviețuiesc. Durata de viață a
proteinelor variază enorm. Proteinele structurale care devin parte dintr-un țesut relativ stabil, cum ar fi osul sau
mușchiul, pot dura luni sau chiar ani, în timp ce alte proteine, cum ar fi enzimele metabolice și cele care
reglementează creșterea și divizarea celulelor, durează doar câteva zile, ore sau chiar secunde.
Celulele produc multe proteine a căror misiune este de a descompune alte proteine în aminoacizii lor constitutivi
(un proces denumit proteoliză). Aceste enzime, care degradează proteinele, în primul rând în peptide scurte și
în final la aminoacizi individuali, sunt cunoscute colectiv ca proteaze. Proteazele acționează prin tăierea
(hidroliza) legăturilor peptidice dintre aminoacizi. O funcție a proteazelor este de a degrada rapid acele proteine
a căror viață trebuie să fie scurtă. O altă funcție este recunoașterea și eliminarea proteinelor care sunt
deteriorate sau pliate greșit. Eliminarea proteinelor pliate necorespunzător este esențială pentru un organism,
întrucât proteinele pliate greșit tind să se aglomereze, iar agregatele proteice pot deteriora celulele și chiar pot
declanșa moartea celulelor. În cele din urmă, toate proteinele – chiar și cele cu viață lungă – acumulează defecte
și sunt degradate prin proteoliză. Aminoacizii rezultați din proteoliză pot fi apoi reutilizați de către celulă pentru
a face noi proteine.
În celulele eucariote, proteinele sunt degradate de complexe macromoleculare proteice mari numite
PROTEAZOMI, prezenți atât în citosol, cât și în nucleu (în jurul porilor nucleari). Un proteazom are forma unui
butoiaș și conține un cilindru central format din proteaze ale căror site-uri active privesc spre interior. Fiecare
capăt al cilindrului este conectat la un complex proteic mare format din cel puțin 10 tipuri de subunități proteice.
Aceste capace leagă proteinele destinate degradării și apoi – folosind hidroliza ATP pentru a alimenta această
activitate – desfășoară proteinele condamnate și le introduce în camera interioară a cilindrului. Odată ce
proteinele sunt în interior, proteazele le taie în peptide scurte, care sunt apoi evacuate prin celălalt capăt al
7 Pentru detalii http://pdslab.biochem.iisc.ernet.in/hspir/chaperone.php.
11
proteazomului. Poziționarea proteazelor în interiorul camerei de degradare moleculară are sens, deoarece
împiedică enzimele să funcționeze agresiv asupra proteinelor din celulă.
Proteazomii acționează în primul rând asupra proteinelor care au fost marcate pentru distrugere prin atașarea
covalentă a unei proteine mici numită ubiquitină.
UBICUITINĂ este o proteină globulară mică (8,5 kDa; 76 aminoacizi) care are la capătul N terminal metionină,
la capătul C terminal glicina (poziția 76; leagă lizina) și are 7 reziduuri de lizină (în pozițiile Lys6-, Lys11-, Lys27-
, Lys29-, Lys33-, Lys48-, Lys63-). Ubiquitina (Ub), o proteină de semnalizare, formează lanțuri ca rezultat al
legăturii covalente între oricare dintre cele șapte lizine sau metionina N-terminală a unei subunități și capătul C-
terminal al altei molecule de ubiquitină. Funcție de modul de structurare al lanțurilor de Ub intervine în multe
procese celulare, de la degradare proteazomală, la semnalizare sau reglare a altor proteine. 8
Enzime specializate marchează acele proteine care sunt destinate degradării rapide cu un lanț scurt de
molecule de ubiquitină. Proteinele destinate degradării sunt „marcate” prin legare covalentă cu minimum 4
molecule de ubiquitină prin intervenția în cascadă a 3 enzime (ATP-aze): E1 enzimă de activare, E2 enzimă de
conjugare, E3 ligază. Aceste proteine ubiquitinilate sunt apoi recunoscute, depliate și introduse în proteazomi
de către proteinele din capac. Aici sunt proteinele hidrolizate iar aminoacizii rezultați sunt eliberați în citosol
pentru a fi refolosiți în sinteza altor proteine.
La nivelul proteazomilor citosolici sunt degradate proteine citosolice și proteine retro-translocate din lumenul
RER poliubiquitinate.
Proteinele care trebuie să fie active pe o durată scurtă de timp conțin adesea o secvență scurtă de aminoacizi
care marchează proteina ca fiind una ce trebuie ubiquitinilată și degradată în proteazomi. Proteinele deteriorate
sau greșit pliate, precum și proteinele care conțin aminoacizi oxidați sau anormali sunt, de asemenea,
recunoscute și degradate de acest sistem proteolitic dependent de ubiquitină. Enzimele care adaugă un lanț de
poliubiquitină la astfel de proteine recunosc semnalele care sunt expuse ca urmare a plierii sau deteriorări
chimice – de exemplu, secvențe de aminoacizi sau motive conformaționale care sunt în mod tipic ascunse și
inaccesibile într-o proteină „sănătoasă”.
PROTEOMUL este totalitatea proteinelor exprimate într-o celulă, țesut sau organism la un anumit moment.
Menținerea unui echilibru constant între sinteza și degradarea proteinelor celulare asigură buna funcționare a
celulei respective, a țesutului și a organismului.
8 Alfano C, Faggiano S, Pastore A. The Ball and Chain of Polyubiquitin Structures. Trends Biochem Sci. 2016;41(4):371‐85].
12
CONCEPTE ESENȚIALE
 Fluxul informației genetice în toate celulele vii este ADN → ARN → proteină (dogma centrală a biologiei celulare).
 Conversia instrucțiunilor genetice din ADN în ARN și proteine este denumită expresie genică.
 Pentru a exprima informația genetică conținută în ADN, secvența de nucleotide a unei gene este transcrisă mai întâi în
ARN. Transcrierea este catalizată de o enzimă - ARN polimerază, care folosește secvențe de nucleotide din molecula
de ADN pentru a determina ce catenă să folosească ca șablon și unde să înceapă și să înceteze transcrierea.
 ARN diferă de ADN: conține riboză în loc de dezoxiriboză și baza azotată uracil (U) în loc de timină (T). ARN-urile din
celule sunt sintetizate sub formă de molecule monocatenare, care se pliază adesea în forme tridimensionale complexe
(structura tridimensională asigură funcția specifică).
 Celulele realizează mai multe tipuri de ARN-uri: ARN-urile mesagere (ARNm), care poartă instrucțiunile pentru sinteza
proteinelor; ARN-urile ribozomale (ARNr) care sunt componentele cruciale ale ribozomilor; și ARN-uri de transfer (ARNt)
care acționează ca molecule adaptoare/traducători în sinteza proteinelor.
 Majoritatea genelor care codifică proteine în celulele eucariote sunt compuse dintr-un număr de regiuni codificatoare,
numite exoni, interpuse între regiuni mai mari, care nu codifică, numite introni. Când o genă eucariotă este transcrisă din
ADN în ARN, atât exonii cât și intronii sunt copiați.
 Intronii sunt îndepărtați din transcriptele ARN în nucleu prin splicing ARN, o reacție catalizată de complexe formate de
mici ribonucleoproteine cunoscute sub numele de snRNP. Splicingul elimină intronii din ARN și unește exonii – adesea
într-o varietate de combinații, permițând producerea mai multor proteine din aceeași genă.
 Pre-ARNm la eucariote trec prin mai multe etape suplimentare de procesare a ARN-ului înainte de a părăsi nucleul sub
formă de ARNm, incluzând căpăcirea capătului 5ʹ ARN și poliadenilare 3ʹ. Aceste reacții, împreună cu splicingul, au loc
pe măsură ce pre-ARNm este transcris.
 Traducerea secvenței de nucleotide a unui ARNm într-o proteină are loc în citoplasmă, în complexe ribonucleoproteice
mari numite ribozomi. Pe măsură ce ARNm se deplasează prin ribozom, mesajul său este tradus în proteină.
 Secvența de nucleotide din ARNm este citită în seturi de trei nucleotide consecutive numite codoni; fiecare codon
corespunde unui aminoacid.
 Corespondența dintre aminoacizi și codoni este specificată de codul genetic. Combinațiile posibile ale celor 4 nucleotide
diferite din ARN dau 64 de codoni diferiți în codul genetic. Majoritatea aminoacizilor sunt specificați de mai mult de un
codon (cod genetic redundant).
 ARNt acționează ca molecule adaptoare în sinteza proteinelor (48 molecule de ARNt în citosolul celulelor eucariote).
Enzimele numite aminoacil-ARNt-sintetaze (20 de sintetaze diferite) leagă covalent aminoacizii la moleculele de ARNt
adecvate. Fiecare ARNt conține o secvență de trei nucleotide, anticodon, care recunoaște un codon din ARNm prin
împerecherea bazelor complementare.
 Sinteza proteinei începe atunci când un ribozom se asamblează pe codonul de inițiere (AUG) dintr-o moleculă de ARNm,
un proces care depinde de proteine numite factori de inițiere a traducerii. Lanțul proteic complet este eliberat din ribozom
atunci când se ajunge la un codon stop (UAA, UAG sau UGA) din ARNm.
 Legarea treptată a aminoacizilor într-un lanț polipeptidic este catalizată de o moleculă de ARNr din subunitatea mare
ribozomală, care acționează astfel ca o enzimă ARN (ribozimă).
 Concentrația unei proteine într-o celulă depinde de rata de sinteză și de degradare a ARNm și a proteinei. Degradarea
proteinelor poliubiquitinilate are loc în citosol, în complexe proteice mari numite proteazomi.
 Biosinteza tuturor proteinelor este inițiată în citosol și este realizată de ribozomi (continuată în RER pentru proteine
specifice).
 Biosinteza proteinelor necesită cooperarea ARNr, ARNm, ARNt, (IF, EF, RF)
 Proteinele nou sintetizate necesită maturare – pliere corectă, procesare co-/post-traducere, spontană sau asistată de
șaperone.
 Proteinele incorect pliate, nefuncționale sau în exces sunt degradate de proteazomi după poliubicuitinare (minim 4
molecule de ubiquitină).
 Proteinele corect pliate sunt direcționate către compartimentele celulare specifice conform unor „secvențe semnal” (care
pot fi liniare sau conformaționale).
13
Bibliografie
1. Essential Cell Biology. Bruce Alberts, Karen Hopkin, Alexander D Johnson, David Morgan,
Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter. 5th edition. WW Norton, 2019. ISBN13: 9780393680362
2. Ross Histologie: tratat si atlas. Corelații din biologia moleculară și celulară. Wojciech Pawlina.
Ediția în limba română coordonată de Mihail Hinescu, Angela Borda, Irina-Draga Căruntu,
Laurențiu Mogoanță, Marius Raica. Editura: Ediția a șaptea. Hipocrate 2020. ISBN:
9786069457580 (capitolele 1-3)
3. Biomembranele - Unitate în diversitate. Mircea Leabu, Marina Nechifor. Editura medicală
Amaltea, Bucuresti, 2014.
14
3.1. Consideraii generale asupra funcionrii

biomembranelor
Dei, dup cum am constatat în capitolul anterior, organizarea molecular a
biomembranelor se caracterizeaz prin mare diversitate de biocomponente, aflate
într-o agitaie permanent, complexitatea acesteia nu complic, ci eficientizeaz
funcionarea ultrastructurii care separ, dar i unete celula cu mediul. Ceea ce se
complic este calea noastr de a elucida mecanismele prin care membranele îi
îndeplinesc menirea. Totui, pe msur ce reuim s descifrm ceea ce se întâmpl,
din punct de vedere molecular, la nivelul biomembranelor ne dm seama cât de
important este faptul c ele sunt aa cum sunt.
Toate componentele membranare coopereaz în asigurarea funciei
ultrastructurii, iar colaborarea dintre biocomponentele ce o organizeaz asigur o
combinatorie larg, ce permite celulei ci dintre cele mai diverse de a schimba
substane i/sau de a comunica între ele, ori cu mediul extracelular. Complexitatea
molecular a membranelor se rsfrânge într-o complexitate funcional care asigur,
pe de o parte, investigarea a tot ceea ce se afl împrejurul celulei (spaiul extracelular
sau alte celule) i, pe de alt parte, declanarea rspunsurilor celulare adecvate
adaptrii la mediul înconjurtor. În toat aceast aciune, caracteristicile organizrii
moleculare a membranei (eterogenitate, asimetrie, comportament de fluid
bidimensional) capt o deosebit importan. Departe de a fi doar o structur
eterogen sumativ (elemente aruncate acolo, la grmad), coninând o multitudine
de tipuri de lipide/glicolipide i proteine/glicoproteine, membrana celular se
constituie ca un sistem biologic ce integreaz marea diversitate de biomolecule
exploatând-o în scopul rezolvrii problemelor pe care le impun existena i
supravieuirea celulei în condiiile concrete ale mediului înconjurtor. Aadar, prin
toat discuia referitoare la funcionarea membranei ca sistem integrativ,
cunotinele referitoare la organizarea molecular a acestei ultrastructuri vor sta la
baza înelegerii fenomenelor. Cum menirea membranei este aceea de a separa, dar a
i uni celula cu mediul, aceste roluri implic asigurarea unui schimb de substan
i/sau informaie cu exteriorul, riguros controlat. Asta înseamn c biomembranele
trebuie s îndeplineasc rolul de barier selectiv, în interesul adaptrii i
supravieuirii celulelor.
Pentru o sistematizare a proceselor, vom include ceea ce ine de schimbul de
substane dintre celul i mediu într-o seciune intitulat “Transportul
membranar”, iar ceea ce ine de schimbul de informaie sub titlul “Semnalizarea
celular”. Trebuie subliniat faptul c în realitate nu se poate face, de fapt, o
separaie între cele dou tipuri de fenomene, ele coexistând i cooperând în
realizarea eficient a funciilor membranelor. Mai concret spus, transportul
membranar este dependent (controlat i modulat) de fenomene de semnalizare
celular, iar semnalizarea celular implic adesea fenomene de transport
membranar.
Aadar, nimic din ceea ce se întâmpl la nivelul membranei nu poate fi scos
din context (ca de altfel tot ce se întâmpl în celul, în ansamblul su). Membrana
asigur celulei informaiile necesare pentru supravieuire i aciune în funcie de ce
se întâmpl în jurul su. Astfel, simultan, celula primete informaii pe multiple ci,
pe care le prelucreaz i apoi, inând cont de toate, rspunde printr-un
comportament adecvat. Aceast capacitate a celulei de a primi i analiza informaii
multiple, culese prin diverse componente, din variate surse poate fi denumit în
românete diafonie (termenul în englez, folosit pentru a denumi aceste fenomene
este „cross-talk”). Este vorba de interferene între cile de semnalizare, care
moduleaz reciproc efectele diverselor informaii primite de celule i prin care se
realizeaz rspunsul cel mai optim i cea mai adecvat comportare a celulelor în
69
contextul dat. Un exemplu de diafonie este cel ce determin motilitatea celular, care
se desfoar sub aciunea semnalelor primite prin factori de cretere, citokine sau
chemokine, semnale care influeneaz activitatea integrinelor [1-5]. Astfel, pentru a
decide s migreze dintr-un loc în altul în esuturi, celulele utilizeaz informaiile
primite prin receptori pentru diveri factori chemo-/cito-tactici, ca i prin integrine a
cror interaciune cu substratul (biocomponente din matricea extracelular) i
distribuie membranar sunt modulate i adaptate, pentru a favoriza complexele
procese ce însoesc micarea celulei. Analiza semnalelor ce vin de la receptori i
integrine conduce la declanarea unor reorganizri ale citoscheletului, cu efecte
asupra morfologiei celulare i forelor necesare deplasrii. Mai mult, dincolo de
semnificaia fiziologic a ceea ce se întâmpl la nivelul membranei, procese
patologice dintre cele mai diverse sunt însoite de alterri ale acestor colaborri [5-7].
În cele ce urmeaz vom detalia mai întâi aspecte legate de transportul
membranar, dup care ne vom direciona atenia asupra complexitii proceselor de
semnalizare celular.
1. Ciobanasu C, Faivre B, Le Clainche C. (2013) Integrating actin dynamics, mechanotransduction
and integrin activation: The multiple functions of actin binding proteins in focal adhesions. Eur J Cell
Biol. 92(10-11): 339-348. DOI: 10.1016/j.ejcb.2013.10.009.
2. Sasaki AT, Firtel RA. (2006) Regulation of chemotaxis by the orchestrated activation of Ras, PI3K,
and TOR. Eur J Cell Biol. 85(9-10): 873-895.
3. Ayuso-Sacido A, Graham C, Greenfield JP, Boockvar JA. (2006) The duality of epidermal
growth factor receptor (EGFR) signaling and neural stem cell phenotype: cell enhancer or cell
transformer? Curr Stem Cell Res Ther. 1(3): 387-394.
4. Leabu M, Uniyal S, Xie J, Xu YQ, Vladau C, Morris VL, Chan BM. (2005) Integrin D2E1
modulates EGF stimulation of Rho GTPase-dependent morphological changes in adherent human
rhabdomyosarcoma RD cells. J Cell Physiol. 202, 754-766.
5. Bershadsky A, Chausovsky A, Becker E, Lyubimova A, Geiger B. (1996) Involvement of
microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction. Curr Biol. 6(10): 1279-1289.
6. Miyazono K. (2009) Transforming growth factor-beta signaling in epithelial-mesenchymal transition
and progression of cancer. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85(8): 314-323.
7. Bierie B, Moses HL. (2010) Transforming growth factor beta (TGF-beta) and inflammation in cancer.
Cytokine Growth Factor Rev. 21(1): 49-59. DOI: 10.1016/j.cytogfr.2009.11.008.
70
3.2. Transportul membranar

Prin transport membranar1 înelegem totalitatea proceselor prin care celula
folosete componentele membranei pentru schimbul de substan pe care îl
efectueaz cu mediul. În funcie de felul în care substanele anorganice sau organice
solubilizate ori unele materiale insolubile (cum ar fi bacterii, debriuri celulare etc.)
ptrund în sau ies din celul, adic în funcie de calea pe care substanele/materialele
o urmeaz în cursul schimbului dintre celul i mediu, ca i de mecanismele
implicate, transportul membranar poate fi clasificat în dou categorii principale:
1. Transport prin membran, atunci când substanele strbat membrana (din
exterior spre interior sau invers) fie direct printre lipidele bistratului, fie prin
biostructuri specializate organizate de proteinele transmembranare;
2. Transport cu membran (transport vezicular), atunci când substanele
sunt introduse în celul sau eliminate din aceasta prin intermediul unor
vezicule delimitate de (endo)membrane care se desprind de membrana celular
sau fuzioneaz cu ea, pentru a efectua schimbul.
Transportul prin membran este specific ionilor i moleculelor mici (< 10Å;
M < 800Da). Transportul cu membran realizeaz schimbul de molecule mari (>
10Å; M > 800Da), de macromolecule, respectiv de particule. Indiferent de sensul în
care are loc schimbul (din exterior în celul sau din celul ctre exterior), aceast
selectare rmâne valabil între cele dou tipuri de transport. De remarcat c
parametrii referitori la gabaritul compuilor transportai sunt valori mediate i ar fi
valabile la modul absolut doar pentru structuri sferice/globulare. În realitate,
procesul de transport al moleculelor mici prin membran depinde i de geometria
acestora, molecule alungite, care depesc 800Da, putând fi transportate prin
membran (spre exemplu prin jonciunile comunicante; vezi în volumul al II-lea).
3.2.1. Transportul prin membran

Fenomenele de transport prin membran sunt de o mare diversitate, ceea ce
impune, pentru o mai uoar abordare i înelegere, sistematizri pe mai multe
niveluri. Calea cea mai util pentru sistematizare e reprezentat de clasificarea pe
criterii din ce în ce mai de detaliu.
În funcie de necesarul de energie care se consum pentru desfurarea sa,
transportul prin membran se clasific în urmtoarele dou mari categorii (Fig. 3.1.):
1. Transport pasiv, care nu necesit consum energetic concomitent pentru
trecerea de substan prin membran;
2. Transport activ, care necesit consum de energie în momentul trecerii prin
membran a substanei transportate.
Pe de alt parte, transportul prin membran se poate face direct printre lipidele
bistratului (ceea ce se mai numete difuziune simpl; Fig. 3.1, exemplul 1) sau prin
structuri organizate de proteine (transport facilitat; Fig. 3.1, exemplele 2 i 3).
Transportul prin membran care necesit proteine specific organizate
transmembranar se poate desfura fie de la concentraie mare la concentraie mic,
acesta numindu-se difuziune facilitat (Fig. 3.1, exemplul 2), fie de la concentraie
mic spre concentraia mare, ceea ce necesit consum energetic (Fig. 3.1, exemplul
3), acesta numindu-se transport activ, tocmai pentru c necesit energie (în greaca
1 Suntem nevoii s facem specificaia nuanrii în limba român a denumirilor: fenomenele de transport ce se
petrec la nivelul membranelor le denumim global prin sintagma ”transport membranar”. Aceasta deoarece prima
clasificare, legat de criteriul cii urmate de substanele transportate i mecanismele implicate, aduce expresia
”transport prin membran”, care ar putea fi confundat cu termenul general (într-un limbaj simplist), dar care
are o definire concret ce respect complexitatea de fenomente de transport de la nivelul membranelor.
71
veche înseamn activitate). Dup aceast nuanare a viziunii asupra

complexitii fenomenelor de transport prin membran, vom detalia informaiile
legate de acesta urmând clasificarea dup criteriul consumului de energie. Aadar
vom aborda mai întâi transportul pasiv, dup care vom completa cunotinele cu
aspecte legate de transportul activ.
3.2.1.1. Transportul pasiv
Transportul pasiv mai este denumit i transport disipativ, deoarece implic
difuziunea care reprezint micarea de substan de la concentraie mare la
concentraie mic. În contextul discuiei noastre, transportul pasiv disipeaz practic
gradiente de concentraie aflate de o parte sau de alta a barierei pe care membranele
o reprezint; tocmai de aceea transportul pasiv nu necesit energie. Cum trebuie
îneles acest transport i cum îl putem sistematiza prin clasificri, pentru
simplificarea înelegerii?
Unele molecule mici (în limita de gabarit specificat mai sus) pot strbate
membrana strecurându-se printre lipidele membranare (Fig. 3.1, exemplul 1). Acest
lucru este uor de îneles dac ne gândim c lipidele, aezate în bistrat, au micri de
o mare diversitate i nu organizeaz o structur cu o compactitate rigid, lsând în
permanen între ele spaii de dimensiuni i geometrii variabile. În aceste spaii, o
serie de molecule mici se pot insinua (dac dimensiunile le permit) i în felul acesta
pot trece mai repede sau mai încet dintr-o parte în cealalt a membranei. Acest tip de
trecere se face fr a necesita consum concomitent de energie i este, de aceea,
transport pasiv.
Fig. 3.1. Clasificri ale transportului prin membran în termeni vizuali. Poziiile 1 i 2 reprezint
situaii de transport pasiv, adic difuziune simpl (1) care se desfoar direct printre lipidele
bistratului, respectiv difuziune facilitat (2) care se desfoar prin structuri transmembranare
organizate de proteine (transportori sau canale). Poziia 3 reprezint transport activ, facilitat de
asemenea de structuri transmembranare organizate de proteine specializate în a folosi energie pentru
trecerea de substane dintr-o parte în alta a membranei, împotriva gradientelor de concentraie.
Sgeile indic sensuri dependente de condiiile concrete în care fenomenele de transport se petrec.
© Mircea Leabu, 2014.
72
Calea transportului pasiv printre moleculele lipidelor membranare poate fi

urmat de moleculele nepolare sau hidrofobe (spre exemplu: molecule de gaze – O2,
N2, CO2, NO, CO, eter etilic, benzen i asemntoare), dar i de moleculele polare
mici (cu masa molecular sub 100Da; de exemplu: H2O, etanolul, ureea, glicerina),
care se pot strecura în i prin spaiile dintre lipide. Acest transport, care se
desfoar prin trecerea substanelor printre lipidele membranare, este numit i
difuziune simpl.
Pentru moleculele polare mari (cu greutatea molecular între 100 i 800Da),
cât i pentru ioni, transportul prin membran se face numai cu implicarea unor
proteine transmembranare ale cror domenii ce strbat bistratul organizeaz
structuri specifice care se constituie drept ci de traversare a planului membranei
pentru compuii transportai. Aceste proteine poart denumirea de transportori
(pentru molecule polare mari: glucoz, aminoacizi, nucleotide) sau canale ionice
(firete, pentru ioni: H+, Na+, HCO3-, K+, Ca2+, Cl-, Mg2+). Transportorii menionai
precum i canalele ionice efectueaz tot un transport pasiv (fr consum concomitent
de energie), deoarece trecerea se face de la concentraie mare ctre concentraie
mic. Transportul pasiv prin transportori sau prin canale ionice se numete i
difuziune facilitat.
În funcie de numrul tipurilor de substan transportate simultan,
transportul facilitat (inclusiv difuziunea facilitat) poate fi clasificat în (Fig. 3.2): (i)
transport singular numit i transport uniport (Fig. 3.2, exemplul 1), când este
transportat o singur entitate (bio)chimic (ion sau molecul) sau (ii) transport
cuplat, numit i co-transport, când sunt transportate simultan (adic într-un
singur ciclu) dou sau mai multe entiti (bio)chimice (ioni, molecule sau ioni i
molecule). La rândul su, transportul cuplat se poate clasifica în dou tipuri, în
funcie de sensul în care sunt transportate diferitele substane. Când toate
substanele sunt transportate în acelai sens, transportul cuplat este numit simport
(Fig. 3.2, exemplul 2). Dac cel puin una dintre substanele transportate este purtat
în sens opus celorlalte, co-transportul este numit antiport (Fig. 3.2, exemplul 3).
Fig. 3.2. Tipuri de tran-

sport pasiv prin mem-
bran, facilitat de pro-
teine (difuziune facilita-
t), definite în funcie
de numrul de entiti
(bio)chimice transporta-
te simultan (adic în de-
cursul unui ciclu de
transport). 1 – uniport; 2
– simport; 3 – antiport.
Sgeile colorate indic,
în parte, sensul de mi-
care al fiecrei entiti
chimice transportate.
© Mircea Leabu, 2014.
73
Fig. 3.3. Co-transportorul de glucoz i sodiu din membrana apical a enterocitelor, ca

exemplu de simport. Proteina transmembranar care structureaz transportorul leag doi ioni de
sodiu (concentraie mare) i o molecul de glucoz (concentraie mic) din lumenul intestinal (1).
Legarea entitilor transportate atrage modificri în conformaia proteinei, cu trecerea ionilor i
glucidului prin cile transmembranare de transport, organizate de protein i cu asigurarea blocrii
trecerii altor elemente (2). Eliberarea compuilor transportai în citosol determin rearanjri în
conformaia transportorului cu refacerea, în ectodomeniu, a siturilor de legare a ionilor i glucozei (3),
un nou ciclu de transport putând fi iniiat. © Mircea Leabu, 2014.
Ca exemplu de transportor uniport, amintim transportorul de glucoz din

membrana eritrocitar (GLUT1) [1]. Este o protein multipas, cu masa molecular de
~45kDa, având 12 treceri în D-helix prin planul membranei, la nivelul crora, alturi
de aminoacizi hidrofobi, gsim i Ser, Thr, Asn i Gln, aminoacizi polari responsabili,
în timpul procesului de transport, de interaciunea cu molecula de glucoz pentru
trecerea ei prin membran. Ambele capete terminale ale lanului polipeptidic sunt
expuse în citosol. În membrana eritrocitar exist peste 200 000 de molecule de
transportor GLUT1 pentru o celul. GLUT1 face parte dintr-o familie de transportori
de glucoz cu 14 membri (GLUT1-14), toi cu câte 12 treceri în D-helix prin planul
membranei i cu capetele N- i C-terminale în endodomeniu. Transportorii GLUT
sunt întâlnii i în membranele altor tipuri de celule animale, nu numai în eritrocite
sau în linia hematopoietic eritroid [2-5]. În condiii bazale, în celulele musculare i
în adipocite GLUT4 sufer un proces continuu, dar cu dinamic sczut de reciclare
între membran i câteva compartimente intracelulare, cu numai 5% din totalitatea
74
moleculelor expuse în membrana celular. Dup stimulare cu insulin, în 2-3

minute, celulele modific echilibrul între cantitatea de GLUT4 aflat în
compartimente intracelulare i cea expus în membran, care crete la 50% [5].
Aceste observaii susin afirmaia fcut mai sus cum c transportul i semnalizarea
sunt procese membranare ce se influeneaz reciproc.
Ca transportor simport (Fig. 3.3), merit amintit co-transportorul de
sodiu/glucoz (SGLT1) din membrana apical a enterocitelor (celulele absorbante
din intestin) [6, 7]. De remarcat faptul c acest transportor folosete disiparea
gradientului de Na+, pentru a prelua glucoza din lumenul intestinal în citosolul
enterocitelor, împotriva gradientului de concentraie a glucidului. Un asemenea
transport mai este numit i transport activ secundar, deoarece se bazeaz
practic pe energia consumat anterior de celul pentru meninerea gradientului de
Na+ (12mM în celul, 145mM în exterior), ceea ce se realizeaz prin activitatea
pompei de sodiu i potasiu, un antiport (vezi mai jos la 3.2.1.3. Transportul
activ). Asta înseamn c glucoza, transportat împotriva gradientului de
concentraie prin disiparea celui al sodiului, este eficient absorbit din lumenul
intestinal ctre spaiul de sub epiteliu de unde este preluat în circulaia sanguin.
SGLT1 este protein transmembranar multipas cu 14 treceri în D-helix prin planul
membranei, dintre care trecerile 10-14 au fost dovedite ca structurând calea de
trecere a glucozei. Ambele capete ale lanului polipeptidic sunt în ectodomeniu. În
bucla hidrofil N-terminal SGLT1 este glicozilat, dar structurile glucidice nu sunt
necesare activitii biologice. Lanul polipeptidic al SGLT1 are 664 de aminoacizi i o
mas molecular de ~73kDa. Un ciclu al mecanismului de transport co-transport 2
ioni de sodiu i o molecul de glucoz. În membranele latero-bazale ale enterocitelor
se gsete un transportor uniport de glucoz (GLUT2) prin care glucoza introdus în
celul de SGLT1 este transportat în spaiul subepitelial [7]. SGLT1 face parte dintr-o
familie de co-transportori sodiu/glucoz ce conine peste 220 de membri în celulele
eucariote i procariote, iar la om 11 membri [6]. Genele ce codific cei 11 membri duc
predictibil la proteine cu greuti moleculare între 60 i 80kDa, coninând de la 580
pân la 718 aminoacizi. Cu excepia a doi dintre membri, ceilali realizeaz 14 treceri
în D-helix prin planul membranei.
Ca exemplu de transport antiport, readucem în atenie canalul de schimb
anionic HCO3-/Cl- din membrana eritrocitar [8, 9], denumit simbolic prin banda
3, dar pentru care se folosete i abreviaia AE1 (vezi detalii structurale la
subcapitolul „Proteine membranare”, seciunea „Exemple de proteine
membranare”). Schimbul anionic (1:1) poate fi inversat în funcie de concentraiile
bicarbonatului în celul, respectiv mediul extracelular. Proteine similare se întâlnesc
i în alte tipuri de celule, iar familia acestora poart denumirea de schimbtori
anionici (prescurtat AE, de la sintagma englezeasc Anion Exchanger). În celulele
noneritroide au fost identificate AE2 i AE3 [10, 11]. Alturi de controlul
homeostaziei eritrocitare i tisulare a CO2, prin schimbul HCO3-/Cl-, aceste canale
acioneaz i în controlul i reglarea pH-ului celular i al sângelui [11]. Aceast
activitate de reglare a pH-ului sângelui (respectiv urinei) se manifest i la nivelul
nefrocitelor, unde la schimbul pasiv HCO3-/Cl- se adaug activitile unui canal
uniport de Cl-, necesar meninerii homeostaziei intracelulare a anionului i ale unei
pompe protonice, destinat eliminrii H+ rezultat din hidroliza acidului carbonic,
obinut prin hidratarea CO2.
Un alt antiport, prezent în membrana celor mai multe celule excitabile sau
secretoare [12], este schimbtorul de Ca2+/Na+, care efectueaz tot un transport
activ secundar, eliminând un ion Ca2+ prin introducerea a 3 ioni Na+. (De fapt sunt
raportate valori diferite de ioni Na+ schimbai cu un ion Ca2+, astfel încât mai
circumspect ar fi s spunem c stoichiometria antiportului este mai mult de 2 Na+,
pentru 1 Ca2+ [13]). Familia de proteine transmembranare cu aceast funcie este
75
notat prescurtat cu NCX (de la Natrium-Calcium eXchanger), fiind identificai la

mamifere trei membri: NCX1, NCX2 i NCX3. NCX1 se afl în aproape toate
esuturile, dar este exprimat mai abundent în inim, creier i rinichi [14]. NCX1 are
938 aminoacizi (110kDa, mas deductibil din secvena de aminoacizi) i are 9
domenii transmembranare în D-helix [15]. Captul amino terminal al lanului
polipeptidic se afl la suprafaa membranei, aadar NCX1 este protein
transmembranar tip I, iar între segmentele transmembranare 5 i 6 se structureaz
o bucl citosolic (adic pe faa intern a membranei) de 550 de aminoacizi (mai
mult de jumtate din lungimea lanului polipeptidic) esenial pentru reglarea
activitii canalului. Activitatea schimbtorului Na+/Ca2+ este dependent de
concentraiile extracelular, respectiv citosolic ale cationilor schimbai, dar i de
concentraia H+, a ATP i a fosfoinozitidelor bis-fosforilate [13]. În funcie de
potenialul de membran i de concentraiile aflate de o parte sau de cealalt a
membranei pentru cationii transportai, schimbul poate fi inversat. De remarcat este
faptul c în celula muscular cardiac, unde contribuia de calciu citosolic necesar
contraciei se datoreaz masiv (~70%) eliberrii din reticulul sarcoplasmic, iar numai
în mic msur (~30%) invaziei de calciu extracelular, eliminarea procentelor de
Ca2+ din citosol, necesar procesului de relaxare se face în principal prin NCX i nu
prin pompa de calciu sarcolemal (adic pompa de calciu din membrana celulei
musculare). În cazul reintroducerii Ca2+ în reticulul sarcoplasmic, contribuia revine
în exclusivitate pompei de calciu din membrana organitului [16]. De regul NCX
transport de 10, 15 ori mai mult Ca2+ în afara celulei decât pompa membranar de
calciu [14].
Transportul pasiv, oricum s-ar desfura, se petrece în sensul de diminuare a
gradientului de concentraie al componentei transportate. De aceea se mai numete
i transport disipativ, transport entropic sau transport la vale (de la
concentraie mare, la concentraie mic). Acest tip de transport se poate desfura,
teoretic, pân când concentraia componentei transportate se egalizeaz de cele dou
pri ale membranei prin care se desfoar. Aceast situaie ipotetic nu se
realizeaz în realitate, în cazul ionilor, datorit mecanismelor de control al activitii
canalelor.
Asupra acestor aspecte, legate de activitatea canalelor ionice membranare, se
pot face comentarii suplimentare. Canalele nu sunt permanent deschise, iar celula
poate controla/comanda funcionarea lor. În funcie de mecanismul prin care este
controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot împri în trei categorii
(Fig. 3.4):
1. Canale ionice controlate (operate) electric (prin voltaj), adic prin
modificarea potenialului de membran (Fig. 3.4, exemplul 1). Acestea sunt
închise (Fig. 3.4, 1a) atunci când potenialul membranei este cel normal (adic
50 – 70mV, cu minus pe partea citosolic). Canalele controlate electric se
deschid atunci când potenialul de repaus al membranei se modific (Fig. 3.4,
1b).
2. Canale ionice controlate (operate) chimic (prin liganzi) (Fig. 3.4,
exemplul 2), adic se deschid atunci când proteina, care formeaz structura
transmembranar destinat transportului, leag un compus chimic (ligandul)
care schimb conformaia complexului (Fig. 3.4, 2b). Ligandul se poate lega în
ectodomeniul proteinei care structureaz canalul (sau al uneia dintre
subuniti, dac este multimer) fiind ligand extracelular sau, pentru alte tipuri
de canale, la endodomeniu (ligand intracelular sau citosolic).
3. Canale ionice controlate mecanic, adic a cror stare deschis/închis
este dependent de exercitarea unor tensiuni mecanice asupra membranei (Fig.
3.4, exemplul 3).
76
Fig. 3.4. Tipuri de canale ionice i strile lor. 1 – canal controlat electric: închis (a), în condiii de
repaus (potenialul membranei normal); deschis (b), când potenialul membranei este modificat;
inactiv (c), devenit refractar la persistena modificrii potenialului membranei. 2 – canale controlate
chimic (prin ligand): închis (a), în absena ligandului legat de complexul proteic transmembranar;
deschis (b), ca urmare a legrii ligandului; inactiv (c), în conformaie închis, dei ligandul este legat.
Este evideniat faptul c, pentru canalele comandate chimic, ligandul poate fi extracelular sau
citosolic. 3 – canale controlate mecanic: închis (a), în absena tensiunii/stresului mecanic; deschis (b),
atunci când se exercit o tensiune mecanic asupra membranei; inactiv (c), când dei stresul
mecanic persist, canalul adopt conformaie închis, devenind refractar la stimul. Este reprezentat
faptul c, la inactivare, închiderea se realizeaz (de regul) în zona endodomeniului, ca urmare a
schimbrilor citosolice locale în homeostazia ionilor transportai. © Mircea Leabu, 2014.
Trebuie menionat c activarea canalelor respect un mecanism ciclic. Acesta

asigur inactivarea lor chiar în condiiile care au determinat deschiderea (adic în
condiiile persistenei stimulului), deoarece pot prezenta trei stri:
- starea închis (Fig. 3.4, situaiile a), de repaus, în absena stimulului
(modificarea potenialului, legarea ligandului sau tensiunea mecanic);
- starea deschis, care permite trecerea ionilor, dup apariia stimulului (Fig. 3.4,
situaiile b);
- starea inactiv, închis la prezena prelungit a stimulului (Fig. 3.4, situaiile c);
aceasta înseamn pentru cele trei tipuri de canale: (i) conformaie închis sub
potenial de membran modificat (alt conformaie decât cea închis de
repaus), (ii) ocupat de ligand dar închis i (iii) închis în prezena tensiunii
mecanice care a determinat deschiderea.
77
Aceast trecere într-o stare refractar a canalelor ionice asigur meninerea

homeostaziei ionice intracelulare în condiiile de persisten a semnalelor, refacerea
potenialului membranar, desprinderea ligandului i, eventual, metabolizarea sa, cu
revenirea celulei la starea bazal, adic starea de neexcitaie, astfel încât s devin
sensibil la o nou stimulare. De remarcat c trecerea în stare refractar se petrece
datorit modificrilor spaio-temporale în homeostazia ionic din citosolul
subcortical (de regul), ceea ce atrage schimbri de conformaie a endodomeniilor
transportorilor [17-19]. Aceste schimbri care induc inactivarea canalelor pot fi sau
nu însoite de modificri chimice ce se petrec asupra lanului polipeptidic [20, 21].
Dintre cele trei tipuri de canale ionice, cele controlate mecanic (Fig. 3.4,
exemplul 3) au fost ultimele descoperite i sunt i cele mai dificil de investigat,
începând chiar cu stabilirea faptului c sunt controlate mecanic. Dificultile se
datoreaz urmtoarelor aspecte [22]:
(i) celulele mecano-senzitive nu sunt numeroase în organism i sunt împrtiate
printre multe alte tipuri celulare, spre deosebire de celulele care conin canale
din celelalte tipuri;
(ii) numrul de canale controlate mecanic în membranele celulelor mecano-
senzitive este de câteva ordine de mrime mai sczut decât numrul canalelor
comandate electric sau chimic (de exemplu, eritrocitele au 1,2x106 molecule de
banda 3, membrana celulelor cu bastonae conine aproximativ 4x107
molecule de rodopsin, celulele olfactive în jur de 1,7x107 receptori olfactivi, în
timp ce celulele proase din organul lui Corti au între 50 i 100 de canale
controlate mecanic);
(iii) dovedirea proprietilor mecano-senzitive ale eventualilor candidai este
dificil cu tehnicile clasice.
În ciuda acestor dificulti, interesul pentru studiul canalelor controlate
mecanic este deosebit de actual, atâta timp cât dorim s cunoatem mecanismele
celulare i moleculare ale receptrii, controlrii i reglrii presiunii sanguine, ale
senzaiilor tactile, ale percepiei sunetelor, gravitaiei i acceleraiei. Din ceea ce se
cunoate pân în prezent, canalele controlate mecanic sunt împrite în patru tipuri
[22]: degenerine/canale epiteliale de sodiu (abreviere DEG/ENaC, de la
DEGenerin/Epitelial Natrium Channel), canale receptor tranzient de potenial
(prescurtat canale TRP, de la Transient Receptor Potential), canale de potasiu cu
doi pori (notate K2P) i canale mecano-senzitive de conductan mic (abreviat MscS,
de la Mechanosensitive channel of Small conductance). O trstur comun a
acestor canale controlate mecanic este aceea c genereaz semnale electrice foarte
rapide, cu o laten de sub 1ms.
Suntem la un capitol destinat înelegerii funcionrii biomembranelor ca
sisteme integrative, ceea ce înseamn nu doar c toate tipurile de componente ce le
organizeaz (lipide, proteine i componenta glucidic) particip la funciile
membranelor, dar i c putem exemplifica modul în care coopereaz elemente cu
funcii variate în fenomene celulare complexe. Pentru înelegerea faptului c
evenimentele celulare nu se petrec individual, ci într-o permanent cooperare i
completare, ca i pentru contientizarea faptului c celulele se comport adecvat
situaiilor în care sunt puse numai datorit acestei conlucrri a componentelor lor,
inclusiv a componentelor membranare, putem exemplifica prin ceea ce se petrece la
nivelul jonciunilor neuro-musculare în momentul stimulrii celulei musculare
pentru contracie, de ctre sistemul nervos (Fig. 3.5). Este vorba aici de o cooperare
eficient între diferite tipuri de canale (în cazul acesta între canale comandate
electric i canale comandate prin ligand).
78
Fig. 3.5. Cooperarea diferitelor tipuri de canale la nivelul jonciunii neuro-musculare. A.

Jonciunea aflat în repaus, deoarece impulsul nervos nu a ajuns la butonul terminal. Canalele de
calciu controlate electric, care comand exocitarea acetilcolinei, sunt închise. Sgeile roii sugereaz
direcia de propagare a semnalului. B. Jonciunea neuro-muscular activat. Stimularea nervoas a
ajuns la butonul terminal, canalele de calciu operate electric sunt deschise, iar creterea concentraiei
de Ca2+ în citosolul de la nivelul butonului terminal determin secreia de acetilcolin. Acetilcolina
secretat în fanta sinaptic se leag de canalele de sodiu pe care le comand, le deschide i
determin, prin depolarizarea local a membranei, activarea unor canale de sodiu comandate
electric. În acest fel se extinde depolarizarea sarcolemei, ceea ce induce deschiderea unor canale de
calciu comandate electric, iar calciul extracelular intrat în citosolul celulei musculare, duce i la
afectarea canalelor de calciu de la nivelul reticulului sarcoplasmic, determinând eliberarea de calciu i
crescând concentraia de Ca2+ în citosolul miocitului. Unele fenomene sunt mai complexe decât se
prezint în aceast figur. © Mircea Leabu, 2014.
Jonciunea neuro-muscular, numit i sinaps neuro-muscular, reprezint

o apoziie dintre membrana butonului terminal al unui axon i un microdomeniu al
membranei celulei musculare. Între cele dou membrane, aflate în apoziie la nivelul
sinapsei, în spaiul numit fant sinaptic, se creeaz un microclimat favorabil
transmiterii de semnale între celula nervoas i celula muscular. Ce se întâmpl la
acest nivel, când un semnal nervos ajunge la butonul terminal al axonului?
Propagarea semnalului nervos de-a lungul axonului se materializeaz prin
depolarizarea membranei axonale secvenial, de-a lungul acestuia. Când semnalul,
79
deci depolarizarea membranei axonale, ajunge la butonul terminal, are loc

deschiderea unor canale de Ca2+ operate electric. Deschiderea acestor canale permite
ionilor de calciu din spaiul extracelular (unde concentraia este cu patru ordine de
mrime mai ridicat, adic 10-3M) s intre în citosolul de la nivelul butonului axonal
(unde concentraia este mic, de ordinul 10-7M). Creterea concentraiei de Ca2+ în
butonul axonal induce secreia de acetilcolin (depozitat în vezicule de secreie de la
nivelul butonului axonal) în fanta sinaptic. Acetilcolina secretat în fanta sinaptic
se leag de canalele de sodiu controlate chimic prezente în membrana sinaptic a
celulei musculare pe care le deschide. Ionii Na+ ptrund în celula muscular
depolarizând membrana acesteia la nivelul jonciunii neuro-musculare.
Depolarizarea membranei la nivelul sinapsei duce la deschiderea unor alte canale de
Na+ comandate electric, extinzând modificarea potenialului membranei celulei
musculare. Aceast depolarizare extins duce la deschiderea la nivelul membranei
celulei musculare a unor canale de Ca2+ operate electric, ca i a unor canale de calciu
din membrana reticulului sarcoplasmic. Ptrunderea Ca2+ (atât din exteriorul celulei,
cât i din reticulul sarcoplasmic) în citosolul celulei musculare determin contracia
celulei. Relaxarea celulei musculare presupune eliminarea ionilor de Ca2+ din citosol,
prin aciunea canalelor de schimb Na+/Ca2+ i a unor pompe de Ca2+. Dup
transmiterea semnalului, la nivelul fantei sinaptice acetilcolina este fie metabolizat
la colin i acid acetic de o colinesteraz, fie reintrodus în vezicule de secreie, în
butonul axonal prin endocitoz. Scderea concentraiei de acetilcolin în fanta
sinaptic, alturi de relaxarea celulei musculare prin scderea concentraiei citosolice
de Ca2+ asigur pregtirea celulei pentru reluarea ciclului. Este evident, celulele fac
toate aceste lucruri mult, mult mai repede decât descriem noi în cuvinte. (Din
fericire!)
3.2.1.2. Transportul apei prin membrana celular
Nu putem încheia aspectele legate de transportul pasiv prin membrane fr s
vorbim despre transportul apei, solventul fiziologic. De acest transport depinde
echilibrarea presiunilor coloidosmotice i supravieuirea celulelor. Trecerea apei
printr-o membran poart denumirea de osmoz. Acesta este un termen util în
biofizic, unde mecanismele care se ascund în spatele acestei treceri nu conteaz. În
biologia celular, îns, unde vrem s desluim mecanismele care se petrec în celul
sau la nivelul diferitelor componente celulare (cum este acum membrana celular) în
toat diversitatea i complexitatea lor, termenul osmoz (chiar dac nu trebuie
ignorat) nu este deosebit de util. Mai degrab poate crea confuzie, dac nu este corect
îneles. Mult vreme s-a considerat c osmoza implic numai trecerea apei printre
lipidele bistratului (intrarea apei în celul sau prsirea celulei de ctre moleculele
polare, mici ale apei). Ei bine, prin membrana celular apa trece atât prin difuziune
simpl (adic printre lipidele bistratului), cât i prin difuziune facilitat, deoarece
multe celule i-au produs complexe proteice transmembranare destinate
transportului pasiv al apei. Aceste complexe proteice transmembranare, destinate
transportului facilitat al apei prin membranele celulare, poart denumirea de
aquaporine.2 Termenul osmoz implic trecerea apei prin biomembrane prin
ambele mecanisme, cumulat. Rolul aquaporinelor este acela de a eficientiza trecerea
apei prin membrane, astfel încât, pe de o parte, fenomenele fiziologice s se petreac
dup o dinamic adecvat i, pe de alt parte, la apariia unor dezechilibre osmotice
accidentale homeostazia celular s nu sufere dramatic i s pun în pericol
supravieuirea.
2 Proteinele care structureaz aquaporine au fost pentru prima dat identificate în membrana eritrocitar, iar
rolul lor a fost intuit de românul Gheorghe Benga. Studii consecvente referitoare la aceti transportori ai apei prin
membrane au fost efectuate ulterior de grupul lui Peter Agree, acesta primind, în 2003, Premiul Nobel pentru
chimie cu urmtoarea motivaie a juriului: "for the discovery of water channels".
80
Aquaporinele sunt proteine identificate în toate organismele (de la bacterii, la

mamifere i în plante) i sunt ubicuitare în organismele multicelulare, fiind
exprimate în diferite grade în toate tipurile de celule [23, 24]. La om au fost
identificai cel puin 13 membri ai familiei proteice a aquaporinelor [24], desemnate
abreviat prin AQPx (cu x începând de la 0, AQP0 fiind aquaporina din cristalin,
numit iniial proteina integral major, abreviat MIP, de la Major Integral
Protein, de unde i tendina de a denumi astfel superfamilia de proteine creia îi
aparin i aquaporinele). Identitatea molecular a primei aquaporine (AQP1) a fcut
obiectul articolului publicat de echipa lui Peter Agree în 1992. Agree i colaboratorii,
microinjectând ovocite de Xenopus laevis cu ARNm al proteinei CHIP28, abundent
exprimat în membrana eritrocitar, au constatat o cretere semnificativ a
permeabilitii osmotice a apei [25]. Aquaporinele (Fig. 3.6) sunt proteine
transmembranare cu masa molecular de ~30kDa (masa molecular predictibil a
monomerilor de aquaporine este între 26 i 34kDa), au ase treceri în D-helix prin
bistratul lipidic (Fig. 3.6, notaiile TM1-TM6) i dou segmente scurte, tot
helicoidale, care strjuiesc vestibulele citoplasmatic (Fig. 3.6, notaia B1), respectiv
extracelular (Fig. 3.6, notaia B2) ale canalului organizat de cele ase domenii
transmembranare [25-27]. Capetele amino- i carboxi-terminale ale lanului
polipeptidic se afl pe faa citosolic. În membrane, monomerii astfel organizai
transmembranar se asociaz câte patru formând homotetrameri. Fiecare monomer al
complexului tetrameric reprezint uniti funcionale. Pentru AQP4 homotetramerii
se asociaz la un nivel superior în reele octogonale prin interaciuni ale unor motive
(secvene mici de aminoacizi) specifice din regiunea capetelor amino-terminale ale
monomerilor.
Apa poate trece prin canalele aquaporinelor în ambele sensuri, depinzând de
presiunile coloidosmotice existente de cele dou pri ale membranei. Reglarea
activitii aquaporinelor i importana acestora în controlul presiunilor
coloidosmotice reprezint teme tiinifice de interes în momentul de fa [27, 28]. În
prezent, cunoatem c reglarea activitii se face prin protonare, dar i prin
fosforilare sau legare de ali cationi [27], fr ca mecanismele de control i reglare s
fie deplin elucidate, alte modaliti de reglare sugerate fiind în studiu. Exprimarea
adecvat a aquaporinelor în celule este important pentru multe fenomene
fiziologice: absorbia adecvat la nivelul cilor urinare pentru formarea urinei,
semnalizare neuronal prin modularea transportului prin canale ionice, motilitate
celular prin asigurarea dinamicii lamelipodiilor, hidratarea pielii, proliferarea
celular, metabolismul lipidic (implicarea aquagliceroporinelor, aquaporine cu
transport dual pentru ap i glicerin) [24]. Mai mult, deficiene în exprimarea
aquaporinelor pot induce sau însoi diverse patologii: cataract, diabet insipid, edem
cerebral, obezitate [23].
Fig. 3.6. Aranjarea lanului polipep-

tidic al aquaporinelor în bistratul
lipidic. Cele 6 domenii transmem-
branare (TM1-TM6) formeaz canalul
de trecere a apei/glicerinei, iar cele
dou bucle, citosolic (B1), respectiv
extracelular (B2), asigur selectivita-
tea primar a complexului, strjuind
vestibulele intern, respectiv extern ale
cii de trecere. © Mircea Leabu, 2014.
81
3.2.1.3. Transportul activ

Pân aici am detaliat aspecte legate de transportul în sensul diminurii
concentraiei componentei/componentelor transportate, adic transportul pasiv sau
entropic. Celulele au îns nevoie de transport de molecule mici i/sau ioni i
împotriva gradientelor de concentraie existente la un moment dat sau existente
permanent la nivelul membranelor. Pentru rezolvarea acestor nevoi, în membrane
sunt organizate biostructuri proteice capabile s transporte molecule mici i ioni
împotriva gradientului de concentraie al acestora, prin consum de energie provenit
din scindarea unor molecule macroergice (de regul ATP). Aceste structuri proteice
membranare poart denumirea de pompe. Transportul efectuat de ele se numete
transport activ, transport antientropic sau transport la deal.
Ca exemplu de transport activ vom aborda pompa de Na+/K+, numit i
Na+/K+-ATPaz3. Pompa este o structur complex din punct de vedere biochimic
[29], organizat ca un tetramer format din dou subuniti D, mari (care reprezint
unitatea catalitic i transportoare) i dou subuniti E, mici (glicoproteice,
reglatoare, neimplicate direct în pomparea ionilor, dar necesare pentru împachetarea
conformaional corect a subunitilor D în reticulul endoplasmic, în momentul
biosintezei, asamblrii în membran i maturrii). În unele organe, se altur un al
treilea tip de lan polipeptidic, subunitatea J (un polipeptid foarte mic, capabil s
moduleze afinitatea pentru ionii transportai i pentru ATP). Toate cele trei tipuri de
subuniti sunt proteine transmembranare.
Subunitile D (Fig. 3.7) sunt neglicozilate. Ele au o mas molecular de
~110kDa (putând conine între 1014 i 1028 de aminoacizi), au 10 treceri în D-helix
prin bistratul lipidic membranar (notate abreviat cu TM1 – TM10; în Fig. 3.7. sunt
numerotate în ordine, cu cifrele 1-10), iar ambele capete amino- i carboxi-terminale
ale lanului polipeptidic se afl în endodomeniu [29]. Exist patru izoforme de
subuniti D: D1, care are un lan polipeptidic format din 1024 aminoacizi, D2, cu
1021 aminoacizi, D3, cu doar 1014 aminoacizi i D4, cu cel mai lung lan polipeptidic,
coninând 1028 de aminoacizi [29, 30]. Domeniul extracelular este minor i format
din dou bucle mici, prima între domeniile transmembranare TM1 i TM2 (cam 12
aminoacizi, responsabil de interaciunea cu ouabaina, care inhib activitatea
pompei) i o a doua între TM7 i TM8 (în jur de 39 de aminoacizi). Celelalte bucle
extracelulare sunt nesemnificative (câte 3-4 aminoacizi) în privina participrii la
organizarea domeniului extracelular al proteinei. Domeniul citosolic este abundent,
fiind format din: (i) poriunea N-terminal a subunitii (primii 90-97 de aminoacizi
ai lanului polipeptidic), (ii) o bucl de lungime medie, între domeniile
transmembranare TM2 i TM3 (format din ~143 de aminoacizi), (iii) bucla mare
format de lanul polipeptidic între TM4 i TM5 (are în jur de 439 de aminoacizi i
conine atât acidul aspartic ce se fosforileaz în ciclul de activitate a pompei, cât i
situl de legare a ATP), (iv) alte dou bucle semnificativ mai mici între TM6, TM7 (28
de aminoacizi) i între TM8, TM9 (27 de aminoacizi) i (v) captul C-terminal, mic
(format din ultimii 21 de aminoacizi ai lanului polipeptidic) [31]. La nivelul acestui
complex endodomeniu sunt prezente siturile de legare a sodiului (sunt legai
simultan 3 ioni), care au mare afinitate pentru cation. Siturile de legare a ionului de
sodiu sunt accesibile numai în starea în care pe endodomeniu, la nivelul buclei mari
se afl legat ATP. Starea în care subunitatea D prezint legai concomitent ATP i cei
trei ioni de sodiu reprezint iniierea ciclului de pompare (vezi mai jos etapele
mecanismului de pompare).
3 Pompa de sodiu a fost descoperit în 1950 de chimistul danez Jens Christian Skou, care 47 de ani mai târziu, în
1997, a fost distins cu Premiul Nobel în chimie cu urmtoarea motivaie a juriului: "for the first discovery of an
ion-transporting enzyme, Na+,K+-ATPase". Denumirea de Na+/K+-ATPaz se datoreaz faptului c scindeaz
enzimatic ATP pentru energia necesar transportului antientropic.
82
Fig. 3.7. Elementele din organizarea în membran a domeniilor subunitii D (subunitatea

transportoare) a pompei de sodiu i potasiu. Cele 10 domenii transmembranare organizate în D-
helix (TM) sunt numerotate, în ordine, de la 1 la 10. Se observ ectodomeniul slab reprezentat, format
în principal de dou bucle mici: prima între TM1 i TM2, iar a doua între TM7 i TM8. Endodomeniul
este foarte bogat coninând captul N-terminal al subunitii, pe lungimea primilor 97 de aminoacizi ai
proteinei, captul C-terminal, relativ scurt (ultimii 21 de aminoacizi ai proteinei), dou bucle mici între
TM6 i TM7, respectiv TM8 i TM9, o bucl de lungime medie între TM2 i TM3 i bucla citosolic
major, realizat de lanul polipeptidic între TM4 i TM5, care conine situl de legarea a ATP i acidul
aspartic ce se fosforileaz în cursul ciclului de funcionare a pompei. © Mircea Leabu, 2014.
Rolul celorlalte subuniti E (respectiv J, când aceasta exist) este destul de

controversat, înc, deoarece i rezultatele experimentale sunt destul de diverse în
semnificaia lor.
Subunitatea E este glicoprotein transmembranar unipas, tip II cu un
endodomeniu mic format dintr-o poriune scurt a captului N-terminal i un
ectodomeniu mare format din mai mult de jumtate din întregul lan polipeptidic cu
captul C-terminal. Exist trei izoforme de subuniti E: E1, care are 304 aminoacizi
i trei situri de posibil N-glicozilare, E2 cu 290 de aminoacizi în structur i 4 pân
la 9 situri de glicozilare, depinzând de specie (4 la pasre, 7 la obolan, 8 la om, 9 la
oarece) i E3, având 279 de aminoacizi [29]. Nu se cunoate dac toate aceste
posibile situri de glicozilare sunt utilizate ca atare, dar toate izoformele sunt, cu
certitudine, mai puternic sau mai slab glicozilate. Dei inhibarea glicozilrii cu
tunicamicin nu blocheaz activitatea pompei i nici sensibilitatea acesteia la
ouabain, este totui dovedit, pentru subunitile E neglicozilate, afectarea
echilibrului de asamblare DE. Aceste rezultate experimentale sugereaz rolul
subunitii E în corecta împachetare a subunitii D în timpul biosintezei, la nivelul
reticulului endoplasmic i formarea eficient a complexelor proteice ale pompei [29].
O alt caracteristic structural important a subunitii E este capacitatea de a
forma trei puni disulfidice în ectodomeniu. La obolan aceste puni, ce asigur
împachetarea corect a subunitii E1, se formeaz între Cys125-Cys148, Cys158-Cys174 i
Cys212-Cys275. Chiar dac poziiile relative ale cisteinelor implicate în formarea
punilor nu sunt conservate la izoformele E2 sau E3, punile sunt prezente, ceea ce
83
sugereaz importana lor pentru o aranjare tridimensional corect, funcional.

Desfacerea celor trei puni disulfidice cu ageni reductori duce la pierderea funciei
pompei, iar o singur mutaie punctiform care elimin numai una dintre cisteinele
în discuie împiedic asamblarea corect a heteromerilor DE [32].
Referitor la asamblarea complexelor proteice ale Na+,K+-ATPazei se cunoate
c subunitile E au domeniul transmembranar în apropierea domeniilor TM7 i
TM10 ale subunitii D i c mai interacioneaz cu bucla dintre TM7 i TM8 a
ectodomeniului subunitii catalitice [33]. Cât privete asamblarea subunitii J(la
complexele de transport în care ea exist), domeniul transmembranar al acesteia se
localizeaz într-un an dintre TM2, TM6 i TM9 al subunitii D, dar interacioneaz
i cu subunitatea E la nivelul ectodomeniului, respectiv cu endodomeniul subunitii
D la nivelul buclelor dintre domeniile transmembranare TM6/TM7 i TM8/TM9 [33-
35]. Toate aceste interaciuni ce sunt nuanate prin asocierile diferite dintre cele 4
izoforme de subuniti D, trei izoforme de subuniti E i apte izoforme de
subuniti J asigur modulri de mare finee ale funciei pompei în diverse tipuri
celulare [29, 33].
Cât privete structura biochimic a subunitii J, aceasta este o protein
transmembranar unipas, tip I i au fost identificate 7 izoforme, cu mase moleculare
între 8 i 14kDa [29, 33]. Toate aceste izoforme au fost dovedite a se asocia cu
pompele de Na+/K+ [33], modulând activitatea acestora. Subunitatea J se exprim în
special la nivelul rinichiului, având rol i în adaptarea, respectiv supravieuirea
celulelor în condiii hipertone [36].
Ce se cunoate despre mecanismul de aciune al Na+,K+-ATPazei? Ciclul de
pompare are 7 etape i duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ i introducerea a 2 ioni de
K+ în celul, pe baza unor modificri de conformaie între dou forme: E1 cu acidul
aspartic din situl catalitic nefosforilat i E2 cu acidul aspartic fosforilat [37]. Etapele
ciclului de pompare sunt (Fig. 3.8):
1. Legarea ATP pe endodomeniul subunitii D i expunerea siturilor de legare a
ionilor Na+;
2. Legarea a trei ioni Na+ în poriunea citosolic (endodomeniul) subunitii D a
pompei, pe situri de înalt afinitate;
3. Fosforilarea unui aspartat prin scindarea ATP la ADP (consumul energetic
necesar activitii pompei), cu schimbarea conformaiei proteinei, ceea ce duce la
conducerea celor trei ioni Na+ în ectodomeniul subunitii D, pe situri de
interaciune de joas afinitate;
4. Disocierea i expulzarea în exterior a ionilor Na+ i legarea pe ectodomeniul
subunitii D a doi ioni de K+, pe situri de mare afinitate expuse prin modificrile
de conformaie ce se petrec în etapele 2 i 3;
5. Hidrolizarea aspartilfosfatului i schimbarea conformaiei subunitii D, ceea ce
atrage transferul ionilor K+ în endodomeniu pe situri de joas afinitate;
6. Eliberarea ionilor K+ de pe endodomeniul subunitii D, în citosol;
7. Încheierea ciclului prin refacerea sitului specific i legarea ATP, pentru refacerea
conformaiei cu expunerea siturilor de mare afinitate pentru ionii Na+ i
pregtirea unui nou ciclu de pompare.
Pompa de Na+/K+ este electrogenic, adic prin eliminarea a 3 ioni de Na+ i
introducerea a numai 2 ioni K+, contribuie la realizarea i/sau meninerea
potenialului membranar. Se întâlnete în membranele tuturor celulelor animale.
Importana prezenei i activitii sale poate fi probat i de faptul c adesea ea
consum jumtate din cantitatea celular de ATP. Inhibarea activitii ei prin
ouabain duce la incapacitatea celular de a menine echilibrul Na+/K+, cu afectarea
potenialului membranar i din asta rezult complicaii asupra fiziologiei celulare.
84
Fig. 3.8. Etapele unui ciclu funcional pentru subunitatea a pompei de sodiu si potasiu. În
fazele 1, 2, 6 i 7 subunitatea D are conformaii corespunztoare formei E1, în timp ce în fazele 3, 4 i
5 conformaiile sunt pentru forma E2. Ciclul începe cu legarea celor trei ioni de sodiu pe siturile de
mare afinitate din endodomeniu (1), ceea ce atrage lizarea ATP cu fosforilarea restului aspartat i
eliberarea ADP (2); fosforilarea (P) acidului aspartic duce la modificri conformaionale ale subunitii
D, cu transferarea celor trei ioni de sodiu în ectodomeniul proteinei transmembranare, pe situri de
joas afinitate (3), de unde sunt expulzai cu expunerea siturilor de mare afinitate pentru ionii de
potasiu (4); ectodomeniul leag cei doi ioni de potasiu (5) ceea ce conduce la hidroliza aspartil-
fosfatului, cu eliberarea de acid fosforic i schimbarea conformaiei, care favorizeaz transferul ionilor
de potasiu pe situri de joas afinitate din endodomeniu (6); eliberarea ionilor de potasiu în citosol
duce la refacerea sitului de legare a ATP (7), iar legarea compusului macroergic pe endodomeniu
reface siturile de mare afinitate pentru sodiu, ciclul putând reîncepe. © Mircea Leabu, 2014.
Pompa discutat mai sus face parte din tipul P de ATPaze (ATPaze de tip
plasmalemal), alturi de pompa protonic (H+-ATPaz), pompa H+/K+ (H+,K+-
ATPaz) i de pompa de calciu (Ca2+-ATPaz). P-ATPazele au aceeai structur
catalitic i mecanisme asemntoare celui descris pentru pompa de Na+/K+.
La nivelul endomembranelor a fost evideniat i tipul V de ATPaze (ATPaze
de tip vacuolar), care pompeaz protoni în endozomi sau lizozomi. Organizarea
acestora este mult mai elaborat, având nevoie de cel puin 11 subuniti ca s îi
îndeplineasc funcia, ceea ce duce la formarea unor complexe proteice de ~1000kDa
[38].
În sfârit, menionm c la nivelul celulelor eucariote mai exist tipul F de
ATPaze (cu F de la „phosphorilation Factor”), care sintetizeaz ATP folosind
energia rezultat din disiparea unui gradient protonic existent la nivelul membranei
85
în care sunt organizate i tipul E de ATPaze (cu E de la „Extracellular ATP”), care

sunt enzime ale suprafeei celulare cu rol în hidroliza diverilor nucleozid-trifosfai
(inclusiv ATP) extracelulari, cu implicare în diferite fenomene de semnalizare i nu în
transportul activ. V-ATPazele i F-ATPazele au similitudini de organizare (complexe
proteice cu numr mare de subuniti) i reprezint, pe baza mecanismului de
funcionare, ceea ce numim motoare moleculare [38, 39].
Pentru argumentare suplimentar a imaginii cooperrilor dintre diversitatea
de componente ale membranei celulare prin funciile lor, la cele prezentate mai sus
(Fig. 3.5) adugm prezentarea unor fenomene care se completeaz reciproc în
interesul bunei funcionri a celulei, exemplificând colaborarea dintre diveri
transportori la nivelul celulelor intestinale absorbante denumite enterocite (Fig. 3.9).
Enterocitele sunt celulele responsabile de preluarea din hrana digerat a
compuilor biochimici utili rezultai (între alii glucoza). Aceste celule formeaz
epiteliul simplu columnar care delimiteaz lumenul intestinal. Enterocitele sunt
celule polarizate, adic celule ale cror membrane au organizare molecular (cel
puin ca tipuri de proteine) diferit la nivelul lumenului intestinal (pol apical, unde
suprafaa membranei este mult sporit prin structurarea unor digitaii numite
microvili), fa de zonele dinspre esuturi (pol latero-bazal).
Fig. 3.9. Cooperarea proceselor de transport

activ (transport activ secundar, respectiv
transport activ primar) i pasiv la nivelul
enterocitului. La nivelul membranei apicale se
afl transportorul simport pentru glucoz i sodiu
(SGLT) care faciliteaz preluarea glucozei prin
transport activ secundar pe baza disiprii
gradientului ionilor de sodiu. Glucoza, astfel
introdus în citosolul enterocitului, este eliminat în
spaiul interstiial subepitelial, printr-un uniport de
glucoz (GLUT) aflat în membrana latero-bazal,
care efectueaz transport pasiv (concentraia de
glucoz absorbit din lumenul intestinal creeaz
un gradient al monozaharidului, care este mai
abundent în citosol, decât în spaiul bazal). Sodiul
preluat din lumenul intestinal, aparent din
considerente energetice impuse de activitatea
antiportului SGLT, este eliminat activ din enterocit
tot în spaiul subepitelial prin aciunea pompei de
sodiu i potasiu. Asta înseamn c fenomenele
asigur preluarea concomitent a glucozei i
sodiului din alimentaie. N.B. Sgeata cu
traiectorie întoars, îndreptat dinspre glucoz
ctre zona jonciunilor ocludente, semnific faptul
c pe acolo monozaharidul nu poate s treac (ca
de altfel nici alte substane, în afar de unii ioni,
acetia cu mari restricii). © Mircea Leabu, 2014.
86
Aadar, membrana apical conine, cel puin în parte, o serie de proteine care
nu sunt localizate în membranele lateral, respectiv bazal, ca de altfel i reciproc
(anumite proteine nu se gsesc decât în membranele latero-bazale). De menionat c
celula controleaz eficient aceast polarizare, chiar din momentul biogenezei acestor
domenii de membran (apical, respectiv latero-bazal) i este ajutat în meninerea
acestui caracter polarizat prin jonciunile ocludente pe care le organizeaz.
Care sunt procesele care coopereaz în asigurarea funciei enterocitului în
contextul exemplului nostru? La nivelul membranei apicale se afl transportorul
simport SGLT1, care introduce glucoza în citosolul enterocitului, alturi de 2 ioni Na+
prin mecanismul de transport activ secundar, prezentat anterior la seciunea 3.2.1.1.
Transportul pasiv. Acest proces de transport are o parte bun (preluarea glucozei
i sodiului din alimente), dar i una periculoas (introducerea de Na+ în exces în
citosolul enterocitelor, ceea ce ar afecta potenialul membranar). Glucoza, preluat
prin activitatea SGLT1, este mai departe expulzat în spaiul subepitelial de
transportorul uniport GLUT2 aflat în membrana latero-bazal, pentru a fi predat
circulaiei sanguine i transportat acolo unde organismul are nevoie de ea. De
excesul de Na+ se ocup pompa de Na+/K+ aflat tot în membrana latero-bazal a
enterocitului, care eliminând 3 ioni de Na+ din enterocit i introducând 2 ioni K+ în
celul asigur meninerea homeostaziei ionice intracelulare, ca i potenialul
membranar în limite normale. Prin aceste cooperri ale transportorilor din
membranele apical, respectiv latero-bazal ale enterocitului se asigur preluarea
glucozei din intestin chiar împotriva gradientului de concentraie, ceea ce conduce la
creterea concentraiei de glucoz în citosolul enterocitului, cretere care asigur
funcionarea transportorului pasiv GLUT2, deoarece concentraia glucozei în
interstiiul peretelui intestinal este mai mic decât în enterocit, dar se asigur i
meninerea homeostaziei Na+ în enterocit, deoarece ceea ce introduce simportul
SGLT1 este compensat de expulzarea efectuat de pompa Na+/K+.
Încheiem discuiile referitoare la transportul activ prin membran, amintind
de o clas de transportori cu deosebit semnificaie fiziologic i, mai larg, medical,
cunoscui sub denumirea de transportori ABC (cu ABC de la ATP-Binding
Casette). Semnificaia fiziologic i medical a acestor transportori activi rezid în
faptul c induc rezisten multipl la medicamente („multidrug-resistance”), fiind
capabili s elimine din celule o multitudine de compui cu utilitate terapeutic,
indiferent de modul prin care acetia pot ptrunde în celula int. Se gsesc atât la
procariote, cât i la eucariote. La procariote, transportorii ABC permit adaptare i
rezisten la antibiotice. La eucariote, menirea lor principal este aceea de a elimina
substane inutile, toxice. De menionat c transportorii ABC sunt principalii
responsabili de inducerea rezistenei celulelor canceroase la chimioterapie [40, 31].
Transportorii ABC sunt de o mare diversitate i au capacitatea de a transporta
o mare varietate de substane plecând de la ioni, glucide, aminoacizi, vitamine,
lipide, antibiotice i medicamente (inclusiv xenobiotice) i ajungând pân la
oligozaharide, oligopeptide sau chiar proteine cu mas molecular mare [40-44]. În
ciuda acestei mari diversiti de tipuri, se pstreaz câteva reguli în organizarea
structurilor proteice transmembranare care reprezint transportorii ABC. În funcie
de modul în care sunt respectate aceste reguli, transportorii ABC se pot împri în: (i)
sisteme importatoare mici, la care fiecare element de organizare structural este
asigurat de un alt polipeptid; (ii) sisteme importatoare mari, la care organizarea
implic dou subuniti proteice identice (homodimeri) sau diferite (heterodimeri);
(iii) sisteme exportatoare organizate ca dimeri (numite i hemi-transportori, half-
transporter în englez) sau ca monomeri (numite i transportori întregi, full-length
transporter) [38, 41]. La om sunt identificate aproape 50 de tipuri de transportori
ABC [44].
87
Fig. 3. 10. Organizarea pe dome-

nii a transportorilor ABC. Este
prezentat organizarea unui sis-
tem importator mare, cu dou sub-
uniti. Cele 12 domenii trans-
membranare (câte 6 pentru fiecare
subunitate), notate TMD, asigur
structurarea V-ului care, prin ori-
entarea deschiderii ctre citosol,
respectiv ctre suprafaa membra-
nei, asigur funcionalitatea trans-
portorului. Orientarea deschiderii
în V este dependent de legarea
ATP pe endodomeniile celor dou
subuniti notate cu NBD. În apo-
ziie cu ectodomeniile subunitilor
transportoare este prezent unita-
tea de legare a solutului (SBD).
Sgeile verzi, mediene din dese-
nul complexului proteic, arat
direcia de micare a moleculei
transportate. © Mircea Leabu,
2014.
În încercarea de a înelege cum funcioneaz transportorii ABC s detaliem,

într-o oarecare msur, modul cum sunt ei structurai i organizai la nivelul
membranei (Fig. 3.10). Toate cele trei tipuri de sisteme de transportori ABC conin
domenii transmembranare (notate abreviat cu TMD, de la TransMembrane
Domains) care realizeaz canalul prin care trece compusul transportat i domenii
de legare a nucleotidelor (abreviat NBD, de la Nucleotide-Binding Domains),
pe faa citosolic a membranei, cu rol în legarea i hidrolizarea catalitic a ATP.
Alturi de aceste domenii, sistemele importatoare mai conin domenii de legare a
soluilor transportai (abreviat SBD, de la Solute-Binding Domains), pe faa
extern a membranei, cu rol în preluarea i transferarea compusului transportat
ctre TMD [38]. Complexele proteice funcionale conin dou TMD miez, a cror
asociere sub forma unui V rsturnat (adic având deschiderea ctre citosol)
determin formarea canalului de transport a solutului i dou NBD care leag dou
molecule de ATP i le poziioneaz în vecintate, dar antiparalel [38, 41].
De regul, sistemele importatoare mici au fiecare dintre domeniile menionate
formate din polipeptide independente ce se asociaz conducând la formarea
complexului funcional [38, 41]. Sistemele importatoare mari i sistemele
exportatoare sunt formate fie din dou subuniti (formând complexe homo- sau
hetero-dimerice la hemi-transportori), fie dintr-o singur protein (la transportorii
întregi). La hemi-transportori cele dou subuniti structureaz pe baza aceluiai lan
polipeptidic atât un TMD, cât i un NBD, iar la transportorii întregi se structureaz în
prima jumtate a lanului polipeptidic un TMD i un NBD, iar în cea de-a doua
jumtate a lanului a doua pereche TMD, NBD. TMD miez respect regula organizrii
cu 6 segmente transmembranare în D-helix, dei exist i sisteme care au TMD
format din numai 5 segmente transmembranare sau altele care au 10 segmente
transmembranare pentru fiecare TMD [38]. La transportorii cu mai mult de 6
segmente transmembranare pe TMD exist dovezi experimentale care sugereaz
rolul segmentelor suplimentare în reglarea i modularea funciei.
Cum funcioneaz aceste complexe transmembranare în procesul de
transport? Mecanismul de aciune presupune modificri ciclice ale conformaiei i
88
poziiei relative a celor dou TMD datorate hidrolizei ATP legat la nivelul NBD [38,
41]. Etapele ciclului de transport pentru sistemele importatoare sunt:
1. Legarea i acostarea la nivelul complexului transportor a solutului, prin SBD;
2. Legarea ATP la NBD i adoptarea conformaiei acestor domenii care s plaseze
în poziie antiparalel cele dou molecule de nucleotid;
3. Modificarea poziiei TMD i inversarea deschiderii V ctre suprafaa
membranei, datorit interaciunilor de la nivelul NBD ocupate de ATP;
4. Avansarea solutului în profunzimea deschiderii V a celor dou TMD;
5. Hidrolizarea ATP cu eliberarea de pe NBD a ADP rezultat i inversarea
deschiderii V a TMD cu eliberarea solutului în citosol, ceea ce readuce
conformaia complexului la cea iniial, capabil s intre într-un ciclu nou.
Ciclul de aciune pentru sistemele exportatoare are un numr mai mic de etape:
1. Intrarea solutului în adâncitura V a TMD;
2. Legarea ATP pe endodomenii i interaciunea dintre cele dou NBD pentru
aezarea antiparalel a moleculelor de nucleotid;
3. Modificarea poziiei TMD cu inversarea deschiderii V i eliberarea solutului în
spaiul extracelular;
4. Hidrolizarea ATP i inversarea deschiderii V, cu formarea conformaiei iniiale
a complexului transportor.
În cele mai bine de trei decenii de când au fost identificai, transportorii ABC au
reprezentat biostructuri membranare pentru care interesul tiinific a fost în
permanent cretere. Suntem departe de a cunoate suficiente detalii legate de
funcionarea acestora, care s ne permit s îi exploatm eficient în medicin.
Transportorii ABC rmân mai departe structuri ale membranei celulare de mare i
acut interes pentru ceea ce numim medicin translaional, adic acele cercetri din
bio-medicin care s duc la o cât mai eficient aplicare a rezultatelor în clinic.
3.2.3. Transportul cu membran

Transportul cu membran este dependent fie de capacitatea unor
microdomenii membranare de a se invagina sub forma unor vezicule, urmat de
desprinderea (fisionarea) membranei lor de cea la nivelul creia se formeaz i
introducerea în celul a substanelor captate în volumul veziculei, fie de capacitatea
endomembranelor veziculelor/vacuolelor de secreie de a fuziona cu membrana
celular i eliberarea în spaiul extracelular a substanelor din interior. Transportul
cu membran permite celulelor s fac schimb de substan cu exteriorul, ca i
transportul prin membran detaliat în subcapitolul anterior, dar folosind mecanisme
diferite, care implic nu doar proteinele membranare, ci microdomenii membranare
(adic poriuni de membran ce solidarizeaz structural i funcional anumite
lipide/glicolipide i anumite proteine/glicoproteine cu scopul de a le facilita
funcionarea împreun).
În funcie de sensul în care se efectueaz, transportul cu membran se împarte
în trei tipuri:
1. Endocitoz, atunci când componentele transportate sunt preluate din exterior
i introduse în celul;
2. Exocitoz, prin care se elimin componente din interiorul celulelor în afara
lor;
3. Transcitoz, care este specific celulelor ce organizeaz epitelii unistratificate
i presupune preluarea de substane din exteriorul celulei pe una din feele
epiteliului (la polul apical, adic din lumenul delimitat de epiteliu, sau la polul
latero-bazal, adic din spaiul interstiial subepitelial), transportarea lor dintr-o
89
parte în cealalt a celulei epiteliale i eliminarea materialului transportat trans-

epitelial în exteriorul celulei, pe cealalt fa a epiteliului.
3.2.3.1. Endocitoza
Procesele de preluare de substan de ctre celul din spaiul extracelular se
pot clasifica în funcie de caracteristicile fizico-chimice ale materialelor endocitate
sau în funcie de mecanismele prin care se desfoar.
În funcie de caracteristicile materialelor preluate de celul, endocitoza se
împarte în dou categorii:
1. Fagocitoz (de la termenii greceti – a mânca + ky – vas,
recipient, celul + – sufix pentru proces, fenomen), atunci când sunt
endocitate materiale particulate (de exemplu bacterii, fragmente celulare,
virusuri), adic celula mnânc.
2. Pinocitoz (de la termenii greceti – a bea + ky – vas, recipient,
celul + – sufix pentru proces, fenomen), când sunt endocitate substane
solubilizate în fluidul extracelular, adic celula bea.
Diferena între cele dou tipuri de endocitoz nu const numai în tipul de
material transportat în celul, ci i în mecanismele prin care acestea se desfoar,
chiar dac nu mecanismele au reprezentat criteriul pentru clasificare.
Fagocitoza a fost descris cu mai bine de un secol în urm de Ilia Iliici
Mechinikov4 în 1882, iar denumirea ei a aprut pentru prima dat într-un articol al
acestuia din 1884. O scurt istorie a evoluiei cunotinelor despre fagocitoz este
prezentat într-un relativ recent articol de sintez [45]. Subtilitile fenomenului de
fagocitoz sunt departe de a fi pe deplin elucidate. Ceea ce se întâmpl de regul,
chiar dac exist variaii ale mecanismelor, pare a fi general valabil (Fig. 3. 11). Dei
fenomenele care se petrec în timpul proceselor de fagocitoz sunt complexe i
deosebit de bine controlate de celul, ele se pot sistematiza prin câteva consideraii
de principiu. Procesul presupune capacitatea membranei celulei fagocitare de a
recunoate particula de endocitat, prin proteine membranare destinate, ceea ce
declaneaz fenomene care implic atât alte componente ale membranei, cât i
elemente din citosol. Fagocitoza presupune extinderea de pseudopode (prelungiri
citoplasmatice delimitate de domenii de membran a cror dinamic este controlat
de rearanjri ale citoscheletului de actin) de-a lungul particulei care urmeaz s fie
endocitat. În acest proces rolul filamentelor de actin este acela de a antrena, din
interiorul celulei, membrana pentru formarea prelungirilor care învluie particula de
endocitat prin formarea a ceea ce se numete cup fagocitar sau cup de
fagocitare.
La nivelul membranei sunt implicai receptorii de fagocitare care se ataeaz
de componente de pe suprafaa particulei care urmeaz a fi endocitat, componente
care se numesc opsonine. De regul aceste componente sunt anticorpi care
recunosc proteine ale suprafeei structurii fagocitate. Aceast decorare a particulelor
fagocitate cu anticorpi poart denumirea de opsonizare. În momentul în care
particula fagocitat este complet îmbrcat de prelungirile celulei care fagociteaz,
membrana fuzioneaz i particula este inclus într-o vacuol, în interiorul celulei
fagocitante. Vacuola poart denumirea de endozom, în general, sau fagozom în cazul
particular al fagocitozei. Fagozomul fuzioneaz ulterior cu lizozomul, componenta
fagocitat este digerat, iar elementele biochimice rezultate sunt utilizate de celula
fagocitar. De menionat c organismul este dispus i la „pierderi”; în cile aeriene,
macrofage tisulare migreaz în spaiile echivalente exteriorului organismului, cur
sacii alveolari i traiectele respiratorii de materialele insolubile i sunt expectorate.
4Ilia Iliici Mecinikov este laureat al Premiului Nobel în fiziologie sau medicin în 1908, premiul fiind împrit cu
Paul Ehrlich. Motivaia juriului a fost: „in recognition of their work on immunity”.
90
Fig. 3. 11. Evenimente celulare ce se petrec în fenomenul de fagocitare a unei bacterii. A.

Detalii moleculare asupra iniierii fenomenului: 1 – Fenomenul de opsonizare se petrece prin legarea
de anticorpi (ac) de proteine expuse la suprafaa bacteriei (ag), ducând la învelirea ei în domenii Fc
cu receptori pe suprafaa macrofagelor. 2 – Bacteria opsonizat este recunoscut de macrofage, prin
receptorii pentru Fc (RFc), fiind fixat pe suprafaa celulelor destinate s curee organismul de
invadatori. Dup primele interaciuni, ali RFc sunt mobilizai ctre locul de fixare a bacteriei pentru a
spori interaciunile. 3 – Prin interaciunile dintre RFc i opsoninele de la suprafaa bacteriei, începe
emiterea prelungirilor citoplasmatice (pseudopode) ale macrofagului cu iniierea formrii cupei de
fagocitare, la care particip filamente de actin prin dinamicitatea lor. B. Continuarea procesului în
contextul întregii celule. 1 – Procesele iniiate conform celor prezentate detaliat continu cu
definitivarea formrii cupei fagocitare în care este înglobat bacteria. 2 – În final, prelungirile
citoplasmei ajung s conflueze, iar bacteria este internalizat într-o structur delimitat de membran
numit fagozom, care este direcionat ctre lizozomi, unde are loc degradarea tuturor materialelor
care formeaz celula procariot, iar compuii de baz (aminoacizi, glucide, nucleotide etc.) eliberai
prin digestie sunt folosii de celula fagocitar pentru propriul metabolism. © Mircea Leabu, 2014.
Fenomenele prezentate mai sus succint, principial sunt în realitate mult mai
complexe. Ele implic pe de o parte fluidizarea membranelor pentru facilitarea
relocaiei receptorilor la opsonine (adic la imunoglobuline, prin legarea la domeniile
Fc ale acestora), ca i depolarizri ale membranelor prin activarea unor canale de
calciu care modific tranzitoriu potenialul de membran pentru receptori (canale
sensibile la o multitudine de stimuli [46]), alturi de activri de kinaze pentru
fosfoinozitide [47, 48]. Toate aceste componente se implic în facilitarea formrii
cupei de fagocitoz i realizarea procesului de endocitare a bacteriilor. Fagocitoza
este un fenomen specific proceselor vitale de aprare/curare a esuturilor de
materiale insolubile periculoase (de exemplu în procese imune anti-bacteriene) sau
de prisos (în cazul currii corpilor apoptotici). Cum ceea ce este fagocitat ajunge s
91
fie degradat în lizozomi i refolosit de celul, putem spune c fagocitoza este o

exprimare în lumea vie a legii conservrii materiei: ”În natur nimic nu se pierde,
nimic nu se creeaz, totul se transform”, învat la chimie, în contextul legii
conservrii masei, lege datorat lui Antoine-Laurent de Lavoisier care a postulat-o în
cartea sa Traité élémentaire de chimie, publicat în 1789, dar anticipat de
Mihail Vasilievici Lomonosov care, într-o scrisoare ctre Leonhard Euler din 5 iulie
1748, a stipulat: ”Orice schimbare în natur are loc astfel încât atâta cât se ia dintr-un
corp, atâta se adaug altuia. Astfel, dac o cantitate de materie descrete într-un loc,
ea crete altundeva.”
Fagocitoza este un fenomen specific unor anumite tipuri de celule din
organism cum sunt macrofagele, dar i polimorfonuclearelor, numite i microfage.
De menionat c pentru moartea celular programat, corpii apoptotici care se
formeaz declaneaz procesul de fagocitoz la celulele din jur, fr ca acestea s fie
neaprat macrofage profesioniste, ducând la o curare a esutului, fr a se produce
inflamaii [49, 50]. Dei fenomenele care se petrec sunt principial asemntoare, la
nivel molecular exist diferene semnificative [51]. Atragerea macrofagelor, respectiv
activarea pentru fagocitoz a celulelor înconjurtoare (neprofesioniste în fagocitoz)
este determinat de factori chemotactici eliberai de celulele intrate în apoptoz (de
exemplu lizofosfatidilcolinele sau sfingozin 1-fosfatul, derivat al echivalentului
acidului fosfatidic din categoria sfingolipidelor, care rmâne fr acidul gras amidat).
Fagocitoza propriu-zis (formarea cupei fagocitare) este declanat de prezena la
suprafaa corpilor apoptotici a fosfatidilserinelor, ”flopate”5 din foia intern a
bistratului lipidic membranar în momentele de iniiere a apoptozei i care acioneaz
ca semnale denumite sugestiv (chiar metaforic) ”mnânc-m”. Aceasta în linii mari,
deoarece i în acest caz al fagocitrii corpilor apoptotici mecanismele sunt mai
complexe i implic participarea i a altor componente membranare care sunt
exprimate de celula curitoare în momentele eseniale.
Pinocitoza, adic endocitoza de compui macromoleculari solubilizai, pare
a fi mult mai divers din punctul de vedere al mecanismelor prin care se realizeaz.
De aceea, se definesc mai multe tipuri de pinocitoz, pe baza mecanismelor prin care
se efectueaz.
O prim form este pinocitoza constitutiv. Aceasta presupune preluarea
în vezicule de endocitoz a unor volume de lichid extracelular, cu tot ce conine
acesta solubilizat, printr-un proces ce se desfoar de la sine, continuu, asemenea
unui act reflex, cum ar fi respiraia organismului. Evident, printr-un asemenea
proces, cantitile de substane endocitate sunt proporionale cu concentraiile în
care acestea se afl în mediul extracelular. Referitor la intensitatea cu care se
desfoar pinocitoza constitutiv, putem s gândim c aceasta poate fi modulat de
celul în conformitate cu nevoile ei concrete, fr a exista în momentul de fa dovezi
experimentale în aceast direcie i fr s se schimbe caracterul ei constitutiv, dac
aceast modulare a frecvenei s-ar întâmpla.
O a doua form este pinocitoza mediat de receptori, numit mai uzual
endocitoz mediat de receptori, cum vom face i noi pe mai departe.
Termenul a fost introdus în 1976 de Joseph L. Goldstein i Michael S. Brown,6
preocupai de metabolizarea LDL (lipoproteinelor de densitate joas; prescurtarea
vine de la termenul englezesc Low Density Lipoprotein) i rolul acestor lipoproteine
în controlul i modularea colesterolemiei i în ateroscleroz [52]. Ei au descris
5 Aa cum la rsturnarea fosfolipidelor în membran, cu trecerea dintr-o foi a bistratului în cealalt, am preluat
termenul din limba englez ”flip-flop” fr ezitare, aici, numim ”flopare” trecerea fosfatidil-serinelor din foia
intern (unde este localizat în condiii normale) în cea extern a bistratului. Nu exist nici o temere de confuzie,
deoarece aceste cuvinte nu exist în limba român, dar nici alte cuvinte care s defineasc succint i sugestiv
procesele nu avem în lexic. Aadar, considerm justificate aceste preluri de termeni.
6 Joseph L. Goldstein i Michael S. Brown sunt laureai ai Premiului Nobel pentru fiziologie sau medicin în 1985,
iar motivaia juriului a fost: „for their discoveries concerning the regulation of cholesterol metabolism”.
92
preluarea LDL prin endocitoz mediat de receptori de ctre fibroblaste [53, 54].
Prin acest proces sunt internalizate de ctre celul proteine (liganzi) care mai întâi
sunt recunoscute i legate de receptori specifici expui la suprafaa membranei (Fig.
3. 12).
Fig. 3. 12. Endocitoza mediat de receptori: mecanism i ultrastructur. A. Unitatea de clatrin

(un heterodimer) conine un lan greu (subunitatea mare), reprezentat în verde închis i un lan uor
(subunitatea mic), în verde deschis. Heterodimerii clatrinei se asociaz în trischelioni care, prin
interaciuni reciproce, pot forma ochiuri hexagonale sau pentagonale, prin jocul dintre acestea
realizându-se cuca de clatrin a unei vezicule de endocitoz mediat de receptori. Asocierea
trischelionilor la endodomeniile receptorilor ce internalizeaz liganzii se face prin intermediul unor
proteine adaptoare (AP), în cazul prezentat AP2. B. Dinamica procesului de endocitoz mediat de
receptori. Dup interaciunea cu liganzii, receptorii sunt adunai în structuri cu înveli de clatrin de la
nivelul membranei, având loc un fenomen de nucleaie. Zona de nucleaie se constituie ca
microdomeniu care concentreaz receptorii purttori de liganzi, conducând la sporirea ariei acoperite
cu clatrin i la adâncirea poriunii de membran din ce în ce mai puternic, datorit organizrii cutii
de clatrin. În final, poriunea de membran capt o form sferic, se desprinde de membran i îi
pierde înveliul de clatrin (aceasta i proteinele adaptoare reciclându-se). Vezicula fr clatrin se
transform în endozom timpuriu. C. Imagini de microscopie electronic de transmisie, tehnica de
îngheare-fracturare-sublimare, aezate sugestiv în relaie cu evenimentele prezentate în B, prin care
se evideniaz creterea cutii de clatrin. D. Imagini ale structurilor cu înveli de clatrin, aa cum se
pot vedea în microscopie electronic de transmisie, tehnica standard. © Mircea Leabu, 2014.
93
Dup ce receptorul interacioneaz cu ligandul, complexele receptor-ligand

sunt adunate în adâncituri ale membranei tapetate pe faa intern cu un complex de
endoproteine a crui component de baz este clatrina [55]. Clatrina este un
heterodimer cu un lan greu i un lan uor, fiind capabil s se autoasocieze în
structuri ternare numite trischelioni (Fig. 3.12, A).
Microdomeniile adâncite ale membranei învelite cu clatrin sunt denumite
structuri cu înveli (în englez, „coated pits”). Acestea se formeaz permanent,
aglomerând fie receptorii în ateptarea liganzilor, fie complexele ligand-receptor,
dup formare. Pe msur ce receptorii expui la suprafaa celulelor sau complexele
receptor-ligand se aglomereaz în microdomeniul corespunztor al membranei, iar
înveliul de clatrin se formeaz, adâncitura membranei crete pân la definitivarea
formei sale sferice i desprinderea de membrana la nivelul creia s-a format, sub
forma unei vezicule cu înveli. Rolul clatrinei este acela de a aglomera complexele
ligand-receptor în zona membranar destinat endocitrii (pentru unii dintre
receptori), de a controla adâncirea microdomeniului membranar, care devine
structur cu înveli i de a definitiva formarea veziculei cu înveli. Acest rol are la
baz capacitatea clatrinei de a se asambla în trischelioni [56, 57], care mai departe
pot forma ochiuri hexagonale i pentagonale într-o geometrie asemntoare peticelor
mingii de fotbal, care duc la formarea veziculei. Formarea trischelionilor i
înreelarea acestora se realizeaz prin participarea unor molecule proteice ajuttoare,
numite proteine adaptoare, prescurtat AP (de la numele englezesc Adaptor
Protein). Proteinele adaptoare sunt complexe heterotetramerice formate din dou
subuniti mari (D i E de ~100kDa) i dou subuniti mai mici (P i V, de ~50kDa,
respectiv ~19kDa). Au fost identificate patru tipuri de AP, notate de la AP1 la AP4.
Subunitile sunt notate la rândul lor cu D1 – D4, E1 – E4, P1 – P4, respectiv V1 – V4.
Maleabilitatea complexelor AP este conferit de organizarea lor, având un corp cu
dou urechi i elemente balama care le conexeaz (Fig. 3.12, A). Înveliul de clatrin
al veziculelor de endocitoz mediat de receptor se dezasambleaz imediat dup
desprinderea veziculei de membrana celular, iar structura membranar devine
endozom timpuriu. La nivelul endozomului au loc diverse fenomene de sortare a
ceea ce a fost internalizat pentru a fi direcionat, difereniat, mai departe. Una dintre
cile de direcionare o reprezint calea lizozomal, prin fuzionarea cu organitul
preexistent în celul.
Analizând dinamica procesului de endocitoz mediat de receptori, deducem
c acest tip de transport cu membran este unul care se caracterizeaz prin
concentrarea componentei endocitate, ceea ce o deosebete de pinocitoza
constitutiv. Ligandul este introdus în celul la o concentraie mai mare decât cea în
care el se afl în mediu. Aceast caracteristic se datoreaz faptului c, înainte de a fi
endocitat, ligandul este acumulat i concentrat la nivelul structurii cu înveli prin
complexele receptor-ligand. Endocitoza mediat de receptori a fost descris pentru
unele lipoproteine plasmatice, pentru transferin sau pentru unii factori de cretere.
Destinaia materialului endocitat prin medierea receptorilor este diferit,
fenomenele de sortare de la nivelul endozomilor timpurii fiind eseniale în destinul
materialului endocitat. LDL se elibereaz în endozom, sub aciunea pH-ului acid i
este direcionat ctre lizozomi, în timp ce receptorul este reciclat la suprafaa celulei
pentru un nou ciclu de endocitoz. Sub aciunea aceluiai mediu acid din endozom,
transferina pierde fierul, iar eliberarea ionului metalic face proteina s rmân
ataat de receptor, ca apotransferin. Întoars ca apotransferin la suprafaa celulei,
unde gsete un pH neutru, se desprinde de receptor pentru a reintra într-un nou
ciclu de transport al fierului. Reciclarea receptorului la LDL i a complexului
receptor-transferin se face prin intrarea lor în apendice tubulare ale endozomilor
timpurii. Procesele de aglomerare i sortare din endocitoza mediat de receptori sunt
riguros reglate de celul. În aceste fenomene de reglare particip i ubiquitina (vezi i
94
CASETA 3.2) care conjug receptorii prin ceea ce se numete mono-ubiquitinilare

sau multi-ubiquitinilare (mai multe ubiquitine ataate în poziii diferite ale lanului
polipeptidic), acestea fiind diferite de fenomenul de poli-ubiquitinilare a proteinelor
citosolice care urmeaz s fie degradate în proteazomi (organite nedelimitate de
endomembrane specializate în degradarea proteinelor citosolice nefuncionale).
Merit reinute aceste funcii diferite ale ubiquitinei în celul bazate pe mecanisme
difereniate sensibil.
Relativ recent a fost evideniat i o a treia form de pinocitoz, tot mediat de
receptori, dar pentru molecule mici. Acest proces de transport membranar a fost
denumit potocitoz (de la termenii greceti – a bea + ky – vas, recipient,
celul + – sufix pentru proces, fenomen). Ca i pinocitoza constitutiv,
potocitoza se efectueaz prin intermediul caveolelor, invaginri ale membranei
organizate prin implicarea caveolinei (Fig. 3.13). Potocitoza a fost evideniat prima
dat pentru acidul folic i denumit astfel în 1992 de Richard G. W. Anderson [58,
59]. Procesul de potocitoz, dup legarea moleculelor mici la receptori (ectoproteine
cu ancor glicofosfatidilinozitolic [60]) i sechestrarea lor în caveole, pentru a fi
astfel transportate, permite trecerea liganzilor direct în citoplasm prin anumite
canale din membrana caveolar. Aceste canale se deschid în momentul în care
caveolele îi închid comunicarea cu exteriorul. În momentul de fa, Anderson i ali
cercettori care studiaz funciile caveolelor încearc s extind procesul de
potocitoz la toate fenomenele de transport care sunt efectuate de caveole prin
evitarea cii ctre lizozom [61].
Exist în prezent o preocupare susinut pentru înelegerea la nivel molecular
a diverselor forme de pinocitoz ceea ce a condus la o clasificare a lor în endocitoz
dependent de clatrin i endocitoz independent de clatrin (ceea ce
înseamn o difereniere la nivelul mecanismelor ce erau incluse în pinocitoza
constitutiv) [62, 63]. La rândul ei endocitoza independent de clatrin poate fi
endocitoz dependent de caveolin sau endocitoz independent de
caveolin, dar dependent de alte tipuri de proteine care s asigure invaginarea i
desprinderea veziculelor de membran. Dac majoritatea tipurilor de endocitoz
sunt efectuate de structuri veziculare, au fost evideniate i procese de endocitoz ce
implic invaginri membranare sub forma de structuri tubulare [62, 63].
Departe de a fi doar o cale de a prelua materie din spaiul extracelular,
endocitoza este un fenomen care permite celulei s controleze funciile membranei,
prin modularea componentelor acesteia [62, 64].
Fig. 3.13. Aspectul caveolelor în imagini de

microscopie electronic de transmisie. Fr
investigaii specifice nu se pot face diferenieri
între caveolele implicate în pinocitoz con-
stitutiv, potocitoz sau transcitoz (exist do-
vezi experimentale cum c procesele pot implica
aceleai caveole, cu sortarea i direcionarea
ulterioar, în endozomi). © Mircea Leabu, 2014.
95
Prin endocitoz, celula poate ascunde componente ale organizrii membranei,

permiând reciclarea acestora în funcie de nevoile celulei sau le poate elimina
temporar degradându-le, pentru a le biosintetiza din nou i expune la suprafaa
celulei atunci când este cazul [65]. Aa se întâmpl cu o mare parte dintre
componentele implicate în semnalizarea celular (vezi mai jos), iar aceast realitate
este un alt exemplu de cooperare între fenomenele ce definesc cele dou mari roluri
ale membranei: schimbul de substan (transportul membranar) i schimbul de
informaie (semnalizarea celular). Endozomii care se formeaz dup desprinderea
de membran a structurilor de endocitoz asigur sortri ale componentelor
endocitate i chiar sunt implicai în continuarea proceselor de semnalizare [66].
3.2.3.2. Exocitoza
Procesul prin care celula elimin substane produse în diverse procese celulare
(inclusiv biosinteze de compui destinai secreiei) i acumulate temporar în structuri
delimitate de endomembrane numite vezicule sau vacuole de secreie poart numele
de exocitoz. Exocitoza este ultimul pas al unui proces celular complex, care implic
în cascad mai multe organite (ribozomi, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, sistem
endozomal), proces numit secreie celular. (Despre procesul de secreie celular
vom vorbi în volumul al II-lea, la capitolul ”Biogeneza i traficul intracelular al
membranelor”). Din punctul de vedere al mecanismelor prin care este controlat,
exocitoza poate fi constitutiv sau semnalizat. Aceasta înseamn c, pe de o parte,
unele produse destinate secreiei sunt eliminate din celul pe msur ce se formeaz
veziculele secretorii i acestea ajung la membrana celular unde are loc fuzionarea
membranelor i secreia, prin procese constitutive, care se desfoar de la sine. Pe
de alt parte, anumite componente produse în celul sunt acumulate i stocate în
zone juxtamembranare, pân când celula primete un semnal care comand secreia
lor. Aceast exocitoz semnalizat este dependent de creterea concentraiei de Ca2+
din citoplasm în zona de stocare a veziculelor de secreie [67]. Mecanismul
exocitozei (Fig. 3.14) presupune urmtoarele etape [68, 69]:
1. Transportul veziculelor (în englez „vesicle trafficking”) de secreie din
locul de formare în locul de stocare din apropierea membranei la nivelul creia
se face secreia. Acest transport este efectuat de aa-numitele motoare
moleculare (izoforme de miozin pentru transportul pe calea filamentelor de
actin, sau dynein ori kinezin pentru transportul pe calea microtubulilor);
2. Ancorarea veziculelor (în englez „vesicle tethering”) prin factori de
ancorare de natur proteic la o distan de ~25nm de membrana celular;
3. Acostarea veziculelor (în englez „vesicle docking”) la membrana celular,
adic aducerea acestora la o distan de 5 – 10nm (cât grosimea unei
membrane) între cele dou membrane (celular, respectiv vezicular);
4. Capacitarea veziculelor (în englez „vesicle priming”) care presupune o
serie de evenimente legate de rearanjrile dependente de ATP i de Ca2+ ale
proteinelor i lipidelor membranei veziculare, rearanjri necesare efecturii
ultimei etape. (În exocitoza constitutiv aceast etap se pare c nu exist.);
5. Fuzionarea veziculelor cu membrana celular i expulzarea produilor de
secreie [70]. Fuzionarea este realizat de nite proteine numite abreviat
SNARE (de la “Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein
REceptor”) care sunt v-SNARE (în membrana veziculelor) i t-SNARE (în
membrana int, cu t de la englezescul target). Trebuie menionat faptul c
interaciunile bazate pe complementaritatea v-SNARE/t-SNARE sunt
importante i pentru fenomenele care se petrec în etapele anterioare.
Ce se întâmpl cu membranele veziculelor de secreie pare a depinde de tipul
de exocitoz. La exocitoza constitutiv este acceptat c membranele poart, de
96
regul, componente noi pentru membrana celular, astfel încât acestea migreaz în
planul membranei int [71]. La exocitoza semnalizat (mai în detaliu investigat),
veziculele reintr în citosol fiind reciclate.
Fig. 3.14. Desfurarea procesului de exocitoz. A. În prima faz, dup ce vezicula de secreie a
fost direcionat ctre membrana pe unde se face exocitoza, are loc ancorarea la microdomeniul
specific. Acest fenomen este facilitat de nite proteine numite factori de ancorare, care sunt controlate
de proteine G mici (sunt definite la seciunea despre semnalizarea celular). B. Etapa urmtoare
implic interaciunile dintre partenerii veziculari i cei ai membranei int (v-SNARE i t-SNARE),
realizându-se acostarea. C. Interaciunile dintre v-SNARE i t-SNARE induc capacitarea membranei
veziculare în vederea deschiderii la nivelul porozomului, proces complex ce implic ioni de calciu
dehidratai. D. Deschiderea veziculei este însoit de expulzarea parial a materialului de exocitat,
dup care vezicula se reînchide revenind în citosol, proces care nu este prezentat în imagine.
Structurile albastre din interiorul veziculei de secreie reprezint componenta care contribuie la o bun
compactare a materialului de secreie. În anumite celule, aceast funcie de compactare revine unor
proteoglicani intraveziculari. Sgeile roii indic avansarea procesului. © Mircea Leabu, 2014.
97
Fig. 3. 15. Porozomi

în celulele pancrea-
sului exocrin (A, C,
D) i în neuroni (E,
F). A. Imagine de
microscopie de for
atomic (AFM) de la
polul apical al unei
celule acinare pan-
creatice vii, care evi-
deniaz prezena
adânciturii (sgeata
galben) cu poro-
zomi la nivelul ei
(sgeata bleu-gri). B.
Desen schematic re-
prezentând adâncituri
i cupe ale porozo-
milor, la care granule
de zimogen (ZG),
vezicule secretorii din
celulele pancreasului
exocrin, acosteaz i
fuzioneaz tranzitoriu
pentru a elibera en-
zime digestive din ce-
lul. C. Micrografie
AFM cu patru porozomi (unul indicat prin cap de sgeat, bleu-gri). Porozomii din membranele
celulelor pancreasului exocrin variaz în dimensiuni (între 100 i 180nm diametru). D. Aspectul în
microscopie electronic de transmisie al unui porozom din membrana apical (PM) a unei celule
acinare pancreatice. Este indicat membrana cu porozom (POM, cap de sgeat, în galben) asociat
membranei unei vezicule secretorii (ZGM). În insert, structura inelar (capete de sgeat, albastru)
care formeaz gâtul complexului porozomal. E. Imagine de microscopie electronic a unui porozom
neuronal (capetele de sgeat, în rou), asociate unei vezicule sinaptice (SV) din membrana
presinaptic (Pre-SM) dintr-o terminaie nervoas; abreviaia Post-SM din imagine indic membrana
postsinaptic. Este de observat o plomb central în complexul porozomal. F. O imagine
tridimensional AFM a unui porozom neuronal din membrana presinaptic într-o celul viabil.
Plomba central este evident (cap de sgeat, în rou). Porozomul neuronal este cu un ordin de
mrime mai mic (10-12nm diametru) fa de cel prezent în membrana celulelor pancreasului exocrin
(100-180nm diametru). (Imaginile au fost puse la dispoziie, cu generozitate, de Dr. Bahnu Jena,
George E. Palade University Professor, Department of Physiology, Wayne State University School of
Medicine and Director, NanoBioScience Institute, Detroit, Michigan, USA. Figura reprezint imagini
compozite publicate anterior în: Proc Natl Acad Sci USA. 94: 316-321 (1997); Biophys J. 85: 2035-
2043 (2003); Cell Biol Int. 28: 699-708 (2004); J Microscopy. 232: 106-111 (2008). ©Bhanu Jena)
98
În prezent exist un mare interes pentru înelegerea momentului final al

exocitozei, procesul de fuzionare a veziculelor secretorii cu membrana. Se pare c
fuzionarea (cel puin în unele tipuri de celule) se face la nivelul unor structuri
preexistente în membrana int, structuri care favorizeaz deschiderea veziculelor i
care au fost denumite porozomi [72-76], de unii autori, în timp ce alii opteaz
pentru sintagma pori de fuziune [77], care se formeaz în momentul interaciunii
intime a celor dou membrane, cea a veziculei, cu cea int. Indiferent de cum ar fi
denumite structurile care favorizeaz i faciliteaz fuzionarea veziculelor cu
membrana celular i expulzarea materialului de secretat, fenomenul de exocitoz se
petrece principial la fel, aa cum a fost prezentat mai sus (Fig. 3. 14).
Porozomii (Fig. 3.14 i Fig. 3.15) sunt complexe supramoleculare, lipido-
proteice, de la nivelul membranei, având fom de cup. La aceste complexe veziculele
de secreie acosteaz tranzitoriu pentru a fuziona cu membrana i a expulza o parte
din coninut, proces ce poate fi asemnat cu o erupie vulcanic. Vezicula se
reînchide i revine, parial golit, în citosol. Determinarea organizrii moleculare i a
dinamicii porozomilor la rezoluie nanometric i în timp real (adic pe celule vii),
izolarea lor, stabilirea compoziiei (atât proteine, cât i lipide), ca i reconstituirea
funcional a lor în bistraturi lipidice artificiale sunt etape experimentale care au fost
realizate i acestea recomand porozomii ca pori universale de secreie în celulele
specializate în acest fenomen.
Bhanu Jena, descoperitorul porozomului i cel care a propus denumirea, trece
dincolo de disputa porozom sau por de fuziune (disput pe care pare a o considera
caduc) i propune un posibil mecanism de aciune a acestei nanostructuri prezente
în membrana celulelor specializate în secreie. Prin acest mecanism, la baza
porozomului, în momentul eliberrii materialului secretat, se formeaz porul de
fuziune între membrana veziculei acostate i membrana celulei (vezi i legenda Fig.
3.15, d). Aadar, porozomii, care preexist în membrana int acioneaz prin
deschiderea unui por de fuziune. Mecanismul propus, nu numai c explic
fenomenele membranare care se petrec în procesul de exocitoz, dar este i o
pledoarie care ne arat c biologicul folosete la un nivel superior legile chimiei i
fizicii, exploatându-le în interesul fenomenelor ce constituie viul. Ceea ce se întâmpl
la nivelul porozomului, de exemplu crearea acelei tensiuni mecanice care contribuie
la formarea porului de fuziune, vine s demonstreze odat în plus c membrana
integreaz participarea componentelor biochimice în fenomenele complexe pe care
trebuie s le asigure celulei, folosind toate posibilitile chimice i fizice cu scopul
gsirii celor mai bune soluii pentru a face bine ceea ce are de fcut i pentru a
supravieui ea i angrenajul din care face parte. Aceast capacitate integrativ este
valabil pentru celul în ansamblul ei. Se vorbete deja în biologia celular despre
”ambiana social” a celulelor sau de integrare în contextul social al celulelor, iar
pentru toate acestea celulele au la suprafaa lor biocomponente care le ajut s fie
”buni membri ai societii”, prin organizare de elemente specializate în asemenea
funcii (de exemplu jonciuni celulare, pe care le vom aborda în volumul al II-lea al
crii, domenii sau microdomenii specializate ale membranelor).
Dup ce am prezentat fenomenele de transport cu membran prin care
celulele preiau, pentru propriile nevoi, substane din exterior (endocitoz) sau
elimin în exterior substane pentru a se ”comporta corect” fa de structura
biologic în care sunt angrenate sau chiar fa de întreg organismul (exocitoz), este
timpul s abordm i un comportament ”altruist” al celulelor, care implic transport
cu membran, adic procesul de transcitoz, prin care celulele mut dintr-o parte în
alta substane (între spaii pe care trebuie s le separe), pentru a le favoriza
ajungerea la locurile unde este nevoie de ele.
99
Fig. 3.15. Vezicule de secreie acostate la complexele porozomului în membrana presinaptic a

unei terminaii nervoase. a. Imagine AFM a unei vezicule sinaptice (SV), obinut în suspensie,
acostat la complexul în form de cup al porozomului (P), pe faa citosolic a membranei
presinaptice. De observat diametrul de 35nm al SV acostate la complexul porozomului de 15nm. b.
Imagine de microscopie electronic (EM) evideniind asemntor o SV de 35nm acostat la
porozomul de 15nm din membrana presinaptic. De notat plomba central a porozomului, ce se
poate evidenia i prin EM. c. Confirmarea celor observate prin AFM i EM referitor la organizarea
porozomului, prin tehnica împrtierii la unghi mic a razelor X, în soluie (SAXS), care a permis
reconstrucia tridimensional a unei vezicule sinaptice (în violet) acostat la complexul porozomului
cu form de cup (în roz) din membrana presinaptic a unor sinaptozomi izolai. De remarcat c toate
tehnicile (AFM, EM i SAXS) duc la rezultate similare referitor la acostarea i interaciunea veziculei
sinaptice cu complexul porozomului, în neuroni. d. Desen care sistematizeaz un posibil mecanism al
implicrii porozomului (P) în acostarea veziculelor sinaptice la membrana presinaptic (PSM) i
eliberarea neurotransmitorului. Mecanismul implic cinci etape: 1. Vezicul acostat la complexul
porozomului. De notat braul (A) al plombei centrale (CP) care permite micarea vertical a acesteia,
pe direcia indicat de sgeata roie cu dou capete. Când baza plombei centrale (B) este împins
ctre interiorul veziculei, ca urmare a stimulrii, se formeaz o mic ridictur cu dimensiuni apropiate
de diametrul bazei plombei (aproximativ 3-4nm diametru). În consecin, membrana de la baza
porozomului, care formeaz ridictura de 3-4nm, este supus unei mari tensiuni conducând la o
strâns apropiere i contact cu foia citosolic a membranei veziculare, ceea ce favorizeaz
interaciunile v-SNARE/t-SNARE dup geometria unui inel sau rozete ducând la fuzionarea
membranelor, cu formarea unui por de fuziune i eliberarea neurotransmitorului (prezentat în etapa
notat cu 3 în figur). 4. Ulterior, prin retragerea plombei porozomale în poziia de repaus, tensiunea
dispare i are loc reînchiderea porului format tranzitoriu. 5. Vezicula implicat în proces se desprinde
de porozom i este recirculat, fiind reîncrcat prin intermediul transportorilor de neurotransmitor
100
3.2.3.3. Transcitoza
Dei privit simplist ar prea o însumare a endocitozei i exocitozei, lucrurile
nu sunt aa. Transcitoza este un proces al crui mecanism, chiar dac neelucidat în
momentul de fa, este departe de a însemna o endocitoz urmat de o exocitoz.
Termenul a fost introdus de Nicolae Simionescu în 1979 [78] privitor la trecerea prin
celulele endoteliale de macromolecule dinspre plasm ctre esut i invers, prin
structuri delimitate de membrane, numite la început, pentru celulele endoteliale
vezicule plasmalemale, ulterior fiind numite caveole în cazul tuturor tipurilor
celulare.
Fig. 3.16. Modificrile în procesul fisiunii membranare atrag creterea ultrastructurilor

neconvenionale de endocitoz/transcitoz, în celulele endoteliale din plmânul de oarece
care exprim un domeniu (SH3A) al intersectinei-1s. a1. Ultrastructura endoteliului este afectat
de modelarea experimental a exprimrii domeniului intersectinei-1s, astfel încât alturi de caveole,
componentele normale, apar unele elemente neconvenionale de transport cu membran: invaginri
cu structuri cu înveli de clatrin (asterisc în caseta delimitat de linia punctat alb), sau structuri
tubulare (casetele punctate în negru), coninând componenta de transportat (albumin seric marcat
cu aur coloidal). Elementele tubulare sunt mai bine evideniate în inserturile a1.1 i a1.2. a2. Alte
forme de structuri neconvenionale datorate aceleiai modulri a proteinei exprimate de celulele
endoteliale. Este vorba de ciorchini de caveole mari, nefireti (sgeata neagr i caseta delimitat de
linie punctat alb, respectiv insertul a2.1), coninând acelai compus transportat marcat cu aur
coloidal. Bare dimensionale: 200 nm (a1.1); 100 nm (a1 i a2); 50 nm (a1.2). Imagini de microscopie
electronic de transmisie puse cu amabilitate la dispoziie de Dr. Sanda Predescu, Department of
Pharmacology/Pulmonary and Critical Care Medicine, Rush University Medical Center, Chicago,
Illinois. © 2012. Dan N. Predescu et al. [81], articol cu acces liber, sub licena Creative Commons
Attribution.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________
(Continuare legend Fig. 3.15)

(NTT) din membrana SV, pentru a fi gata în efectuarea unui nou ciclu de exocitoz (acostare,
fuzionare, expulzare de neurotransmitor). (Imaginile au fost realizate i puse la dispoziie, cu
generozitate, de Dr. Bahnu Jena, George E. Palade University Professor, Department of Physiology,
Wayne State University School of Medicine and Director, NanoBioScience Institute, Detroit, Michigan,
USA. Figura reprezint imagini compozite publicate anterior în: Cell Biol Int. 28:699-708 (2004) i
Micron. 56:37-43 (2014). ©Bhanu Jena)
____________________________________________________________________________________________________________________________
101
Transcitoza este un proces specific celulelor ce formeaz epitelii simple

(monostratificate). Celulele endoteliale de la nivelul capilarelor sunt exemplul clasic
de celule care efectueaz transcitoz [79-81]. Studiul mecanismelor transcitozei la
nivelul endoteliului reprezint un domeniu de mare interes atât pentru cunoaterea
fenomenului normal, cât i în vederea modulrii sale, inclusiv pentru scopuri
terapeutice. Exist modaliti de afectare a procesului de transcitoz prin exprimarea
selectiv de proteine celulare care pot interfera cu fenomenele membranare care
însoesc transcitoza i contribuie la formarea unor structuri de transport nefireti
(Fig. 3.16).
Procesul transcitozei se petrece i la nivelul altor epitelii cum ar fi epiteliul
absorbant intestinal. Hepatocitele efectueaz i ele transcitoz pentru
dimeri/polimeri de IgA de la polul sanguin la polul biliar, unde sunt eliberai cu o
component secretorie, ectodomeniul receptorului implicat în transcitoz [82].
Imunoglobulina A astfel eliminat ajunge în bil i mai departe în tubul digestiv
unde au loc prime activiti de aprare imun legate de alimentaie. Exemplul
transportului trans-hepatocit al dimerilor de IgA reprezint dup toate dovezile o
transcitoz mediat de receptori [83]. De altfel, transportul prin transcitoz al
unor polimeri imunoglobulinici pare a fi o proprietate a tuturor epiteliilor simple ce
cptuesc organe cavitare, cu rol în iniierea aprrii imune înc din aceste spaii,
echivalente topologic cu exteriorul organismului. Spre exemplu, acest tip de
transcitoz a fost dovedit i pentru epiteliul uterin [84].
Celor interesai de noutile referitoare la transcitoz sub aspectul diversitii
epiteliilor la nivelul crora se petrece i asupra mecanismelor prin care se produce, le
recomandm un relativ recent articol de sintez scris de Pamela Tuma i Ann L.
Hubbard, de la Johns Hopkins University, Baltimore [85]. În acest articol se va vedea
c, dei transcitoza a fost definit ca proces specific celulelor epiteliale simple, ea se
petrece i în sisteme neepiteliale. De interes este i articolul de sintez redactat de
Aleksandr Treyer i Anne Müsch, de la Albert Einstein College of Medicine,
Department of Developmental and Molecular Biology, Bronx, New York, prezentând
detalii legate de anumite procese de transcitoz (unele surprinztoare) în hepatocite
[86], cu referire la unele implicaii patologice.
3.2.4. Consideraii finale asupra transportului membranar

Celula nu poate supravieui dac nu schimb substane cu mediul: preluarea
de produi utili metabolismului su i eliminarea de compui inutili, care ar putea
deveni toxici, sau de compui destinai cooperrii cu alte celule din organism
(compui destinai secreiei). Cum substanele care trebuie s ajung în celul, ca i
cele care trebuie s o prseasc, sunt de o mare diversitate (unele lipofile, altele
hidrofile, iar între acestea din urm putem vorbi de substane purttoare de sarcin
sau nu, ca i de molecule mici sau macromolecule), este firesc s înelegem c la
nivelul membranei se petrec mecanisme specifice, pentru a facilita celulei preluarea
sau eliminarea acestei mari diversiti de compui.
Aadar, o diversitate de tipuri de compui de transportat (iar dac ar fi s ne
gândim la diversitatea de entiti chimice de transportat, aceasta este i mai mare,
adic avem mai multe specii ionice, mai multe specii de molecule polare, mai multe
proteine etc.) atrage, fr doar i poate, o diversitate de fenomene responsabile de
transportul membranar. Cum avem de-a face cu o mare diversitate de fenomene de
apropiat, de îneles i, eventual, de însuit, cea mai comod modalitate de a acoperi
realizarea elului este clasificarea lor pe diverse criterii. Acest lucru l-am i fcut în
acest subcapitol legat de transportul membranar. Astfel, exist fenomene de
transport prin membran, în care substanele transportate strbat planul membranei
i exist fenomene de transport cu membran, prin care substanele transportate
sunt introduse în sau expulzate din celul prin structuri delimitate de membrane.
102
Fiecare dintre aceste dou mari tipuri de fenomene de transport membranar include,
la rândul su, multiple variante în funcie de caracteristicile fizico-chimice ale
substanelor transportate.
Între substanele care pot realiza transport prin membran, unele difuzeaz
relativ nestingherite prin bistrat (substanele liposolubile, dar i substane polare cu
mase moleculare sub 100Da), difuzând dinspre spaiul cu concentraie mare (fie el
citosol, fie exteriorul celular) ctre spaiul cu concentraie mic, ceea ce se numete
transport prin difuziune simpl.
Ionii i moleculele polare mai mari (pân în 800Da) au nevoie la trecerea prin
planul membranei de proteine ce organizeaz ci transmembranare de strbatere, iar
aceste elemente de transport sunt numite canale pentru ioni i transportori pentru
celelelate tipuri de molecule polare mici (adic glucide, aminoacizi, nucleotide etc).
Ca i la difuziunea simpl, i în acest caz, motorul transportului îl reprezint
diferenele de concentraie în care aceti compui se afl de o parte, respectiv de
cealalt a membranei. Deoarece transportul necesit proteine organizate
transmembranar, aceste modaliti de transport prin membran poart denumirea
de difuziune facilitat. Termenul difuziune, ca i în fizic, are semnificaia de micare
de la concentraie mare la concentraie mic, iar asta se face fr consum de energie.
În aceste situaii vorbim de transport pasiv, form de transport corespunztoare unei
clasificri fcute în funcie de energetica procesului. Când fenomenul de transport
necesit consum de energie, avem de-a face cu ceea ce numim transport activ. Nevoia
de consum de energie apare atunci când prin membran trebuie s fie transportate
componente împotriva gradientului de concentraie. Dac energia necesar trecerii
substanei prin membran se consum concomitent cu realizarea transportului,
atunci acesta este denumit transport activ primar, iar dac energia a fost consumat
anterior transportrii compusului de interes pentru celul, vorbim de transport activ
secundar.
Fenomenele de transport prin membran se pot clasifica i în funcie de
numrul de tipuri de substane transportate într-un ciclu al fenomenului. Dac se
transport un singur compus odat, atunci transportul este singular sau uniport.
Dac simultan sunt transportate cel puin dou tipuri de substane atunci vorbim de
transport cuplat sau co-transport. În sfârit, fenomenele de co-transport se clasific
la rândul lor în funcie de sensul în care se mic substanele ce trec simultan prin
membran, prin aceeai formaiune proteic transmembranar. Dac toate
substanele transportate în cadrul unui ciclu de activitate trec prin membran în
acelai sens, transportul este simport. Dac cel puin un compus transportat se mic
în sens opus celuilalt/celorlali, atunci vorbim de transport antiport.
Toate fenomenele de transport prin membran, identificate pân în prezent,
se pot asocia diferitelor categorii definite prin diversele tipuri de clasificri, menite s
uureze cunoaterea i înelegerea.
Prin diversitatea de tipuri de transport cu membran, celulele, pe de o parte,
îi completeaz nevoile de substane i/sau cur organismul i îl apr de ”intrui”
(cum se întâmpl prin procesele imune) sau de materiale rezultate din procese
fiziologice (apoptoz) sau patologice (resturi de celule necrozate), dar contribuie, pe
de alt parte i la buna organizare i/sau funcionare ale esuturilor, respectiv
organismului în ansamblul su. Pentru aceste scopuri, celulele i-au dezvoltat o
multitudine de tipuri de fenomene endocitotice prin care îi asigur capacitatea de a
prelua diverse componente macromoleculare (pinocitoza, potocitoz, endocitoz
mediat de receptori) sau materiale insolubile, cum ar fi bacterii, debriuri celulare
(fagocitoz). Mai mult, dincolo de grija pentru sine i responsabilitatea pentru
meninerea curat a organismului, implicarea unora dintre celule (cele care
organizeaz epitelii monostratificate ce cptuesc organe cavitare) în meninerea
bunei funcionri a esuturilor i a organismului în ansamblul su a necesitat
103
instituirea unor procese de transport de substan dintr-o parte în alta a spaiilor pe

care le separ, transcelular. Aceste procese care pot fi dependente sau nu de unii
receptori poart denumirea de transcitoz, care poate fi uneori transcitoz mediat
de receptori.
În sfârit, desfurarea normal a tuturor acestor procese de transport
membranar (prin membran, respectiv cu membran) contribuie la starea de
sntate a organismului. Multe patologii pot fi însoite sau determinate de dereglri
în desfurarea fenomenelor de transport membranar i, de aici, rezult interesul i
justificarea acestuia pentru cunoaterea în detaliu a proceselor i pentru gsirea de
soluii în vederea utilizrii terapeutice a lor. De mult vreme sunt cunoscute
modaliti terapeutice care exploateaz modularea funciei canalelor ionice sau a
pompelor (de exemplu în cardiologie). Dar nici fenomenele de transport cu
membran nu sunt de ignorat. Exist modelri experimentale din care rezult c
pinocitoza i transcitoza pot fi exploatate în interes terapeutic [87].
1. Montel-Hagen A, Sitbon M, Taylor N. (2009) Erythroid glucose transporters. Curr Opin Hematol.
16: 165-172.
2. Uldry M, Thorens B. (2004) The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters. Pflugers
Arch. 447: 480-489.
3. Hou JC, Pessin JE. (2007) Ins (endocytosis) and outs (exocytosis) of GLUT4 trafficking. Curr Opin
Cell Biol. 19: 466-473.
4. Cheeseman C. (2008) GLUT7: a new intestinal facilitated hexose transporter. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 295: E238-E241.
5. Mavros Y, Simar D, Singh MA. (2009) Glucose Transporter-4 expression in monocytes: a systematic
review. Diabetes Res Clin Pract. 84: 123-131.
6. Wright EM, Turk E. (2004) The sodium/glucose cotransport family SLC5. Pflugers Arch. 447: 510-
518.
7. Wright EM, Hirayama BA, Loo DF. (2007) Active sugar transport in health and disease. J Intern
Med. 261: 32-43.
8. Williamson RC, Toye AM. (2008) Glycophorin A: Band 3 aid. Blood Cells Mol Dis. 41: 35-43.
9. Satchwell TJ, Shoemark DK, Sessions RB, Toye AM. (2009) Protein 4.2: a complex linker. Blood
Cells Mol Dis. 42: 201-210.
10. Alper SL. (1991) The band 3-related anion exchanger (AE) gene family. Annu Rev Physiol. 53: 549-
564.
11. Jay DG. (1996) Role of band 3 in homeostasis and cell shape. Cell. 86: 853-854.
12. Barzilai A, Rahamimoff H. (1987) Stoichiometry of the sodium-calcium exchanger in nerve
terminals. Biochemistry. 26: 6113-6118.
13. DiPolo R, Beaugé L. (2006) Sodium/calcium exchanger: influence of metabolic regulation on ion
carrier interactions. Physiol Rev. 86: 155-203.
14. Yang YC, Fann MJ, Chang WH, Tai LH, Jiang JH, Kao LS. (2010) Regulation of sodium-calcium
exchanger activity by creatine kinase under energy-compromised conditions. J Biol Chem. 285(36):
28275-28285. doi: 10.1074/jbc.M110.141424.
15. Ren X, Nicoll DA, Philipson KD. (2006) Helix packing of the cardiac Na+-Ca2+ exchanger:
proximity of transmembrane segments 1, 2, and 6. J Biol Chem. 281: 22808-22814.
16. Bers DM. (2000) Calcium fluxes involved in control of cardiac myocyte contraction. Circ Res. 87: 275-
281.
17. Engbers JD, Anderson D, Zamponi GW, Turner RW. (2013) Signal processing by T-type calcium
channel interactions in the cerebellum. Front Cell Neurosci. 7: 230. DOI: 10.3389/fncel.2013.00230.
18. Van Petegem F, Lobo PA, Ahern CA. (2012) Seeing the forest through the trees: towards a unified
view on physiological calcium regulation of voltage-gated sodium channels. Biophys J. 103(11): 2243-
2251. DOI: 10.1016/j.bpj.2012.10.020.
19. Catterall WA. (2012) Voltage-gated sodium channels at 60: structure, function and pathophysiology. J
Physiol. 590(Pt 11): 2577-2589. DOI: 10.1113/jphysiol.2011.224204.
20. Li WG, Xu TL. (2012) Emerging approaches to probing ion channel structure and function. Neurosci
Bull. 28(4): 351-374. DOI: 10.1007/s12264-012-1248-0.
104
21. Findlay I. (2004) Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels: one switch. J
Physiol. 554(Pt 2): 275-283.
22. Arnadóttir J, Chalfie M. (2010) Eukaryotic mechanosensitive channels. Annu Rev Biophys. 39: 111-
137.
23. Zeidel ML. (2012) Water homeostasis: evolutionary medicine. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123: 93-
105.
24. Verkman AS. (2011) Aquaporins at a glance. J Cell Sci. 124: 2107-2112.
25. Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, Agre P. (1992) Appearance of water channels in Xenopus
oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science. 256(5055): 385-387.
26. Verkman AS, Mitra AK. (2000) Structure and function of aquaporin water channels. Am J Physiol
Renal Physiol. 278(1): F13-28.
27. Perez Di Giorgio J, Soto G, Alleva K, Jozefkowicz C, Amodeo G, Muschietti JP, Ayub ND.
(2014) Prediction of Aquaporin Function by Integrating Evolutionary and Functional Analyses. J Membr
Biol. 247(2): 107-25. DOI: 10.1007/s00232-013-9618-8.
28. Day RE, Kitchen P, Owen DS, Bland C, Marshall L, Conner AC, Bill RM, Conner MT.
Human aquaporins: Regulators of transcellular water flow. Biochim Biophys Acta. 2013 Sep 30. pii:
S0304-4165(13)00435-2. doi: 10.1016/j.bbagen.2013.09.033. [Epub ahead of print] Accesibil la:
http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.09.033 (vizualizat în 21 decembrie 2013).
29. Blanco G, Mercer RW. (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in
function. Am J Physiol. 275(5 Pt 2): F633-F650.
30. Blanco G. (2005) Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion
regulation. Semin Nephrol. 25: 292-303.
31. Axelsen KB, Palmgren MG. (1998) Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase
superfamily. J Mol Evol. 46: 84-101.
32. Beggah AT, Jaunin P, Geering K. (1997) Role of glycosylation and disulfide bond formation in the b
subunit in the folding and functional expression of Na,K-ATPase. J Biol Chem. 272: 10318–10326.
33. Geering K. (2008) Functional roles of Na,K-ATPase subunits. Curr Opin Nephrol Hypertens. 17: 526-
532.
34. Füzesi M, Gottschalk KE, Lindzen M, Shainskaya A, Küster B, Garty H, Karlish SJ. (2005)
Covalent cross-links between the gamma subunit (FXYD2) and alpha and beta subunits of Na,K-ATPase:
modeling the alpha-gamma interaction. J Biol Chem. 280: 18291-18301.
35. Lindzen M, Gottschalk KE, Füzesi M, Garty H, Karlish SJ. (2006) Structural interactions
between FXYD proteins and Na+,K+-ATPase: alpha/beta/FXYD subunit stoichiometry and cross-
linking. J Biol Chem. 281: 5947-5955.
36. Berl T. (2009) How do kidney cells adapt to survive in hypertonic inner medulla? Trans Am Clin
Climatol Assoc. 120: 389-401.
37. Faller LD. (2008) Mechanistic studies of sodium pump. Arch Biochem Biophys. 476: 12-21.
38. Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H. (2000) The cellular biology of
proton-motive force generation by V-ATPases. J Exp Biol. 203(Pt 1): 89-95.
39. Nakanishi-Matsui M, Sekiya M, Nakamoto RK, Futai M. (2010) The mechanism of rotating
proton pumping ATPases. Biochim Biophys Acta. 1797: 1343-1352.
40. Biemans-Oldehinkel E, Doeven MK, Poolman B. (2006) ABC transporter architecture and
regulatory roles of accessory domains. FEBS Lett. 580: 1023-1035.
41. Oldham ML, Davidson AL, Chen J. (2008) Structural insights into ABC transporter mechanism.
Curr Opin Struct Biol. 18: 726-733.
42. Huang Y, Sadée W. (2006) Membrane transporters and channels in chemoresistance and -sensitivity
of tumor cells. Cancer Lett. 239: 168-182.
43. Oostendorp RL, Beijnen JH, Schellens JH. (2009) The biological and clinical role of drug
transporters at the intestinal barrier. Cancer Treat Rev. 35: 137-147.
44. Nagao K, Kimura Y, Mastuo M, Ueda K. (2010) Lipid outward translocation by ABC proteins.
FEBS Lett. 584: 2717-2723.
45. Tissières P, Pugin J. (2009) The role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative bacteria.
Curr Opin Infect Dis. 22: 286-291.
46. Yin J, Kuebler WM. (2010) Mechanotransduction by TRP channels: general concepts and specific
role in the vasculature. Cell Biochem Biophys. 56(1): 1-18. doi: 10.1007/s12013-009-9067-2.
47. Koyasu S. (2010) Vanilloid flavor for a good appetite? Nat Immunol. 11(3): 187-189. doi:
10.1038/ni0310-187.
48. Link TM, Park U, Vonakis BM, Raben DM, Soloski MJ, Caterina MJ. (2010) TRPV2 has a
pivotal role in macrophage particle binding and phagocytosis. Nat Immunol. 11(3): 232-239. doi:
10.1038/ni.1842.
105
49. de Almeida CJ, Linden R. (2005) Phagocytosis of apoptotic cells: a matter of balance. Cell Mol Life
Sci. 62: 1532-1546.
50. Elliott MR, Ravichandran KS. (2010) Clearance of apoptotic cells: implications in health and
disease. J Cell Biol. 189: 1059-1070.
51. Han CZ, Ravichandran KS. (2011) Metabolic connections during apoptotic cell engulfment. Cell.
147(7): 1442-1445. doi: 10.1016/j.cell.2011.12.006.
52. Goldstein JL, Basu SK, Brunschede GY, Brown MS. (1976) Release of low density lipoprotein
from its cell surface receptor by sulfated glycosaminoglycans. Cell. 7: 85-95.
53. Goldstein JL, Brown MS. (1976) The LDL pathway in human fibroblasts: a receptor-mediated
mechanism for the regulation of cholesterol metabolism. Curr Top Cell Regul. 11: 147-181.
54. Brown MS, Ho YK, Goldstein JL. (1976) The low-density lipoprotein pathway in human fibroblasts:
relation between cell surface receptor binding and endocytosis of low-density lipoprotein. Ann N Y Acad
Sci. 275: 244-257.
55. Pearse BM. (1976) Clathrin: a unique protein associated with intracellular transfer of membrane by
coated vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 73: 1255-1259.
56. Ungewickell E. (1983) Biochemical and immunological studies on clathrin light chains and their
binding sites on clathrin triskelions. EMBO J. 2: 1401-1408.
57. Popova NV, Deyev IE, Petrenko AG. (2013) Clathrin-mediated endocytosis and adaptor proteins.
Acta Naturae. 5(3): 62-73.
58. Anderson RG, Kamen BA, Rothberg KG, Lacey SW. (1992) Potocytosis: sequestration and
transport of small molecules by caveolae. Science. 255: 410-411.
59. Matsue H, Rothberg KG, Takashima A, Kamen BA, Anderson RG, Lacey SW. (1992) Folate
receptor allows cells to grow in low concentrations of 5-methyltetrahydrofolate. Proc Natl Acad Sci U S
A. 89: 6006-6009.
60. Anderson RGW. (1998) The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem. 67: 199-225.
61. Mineo C, Anderson RG. (2001) Potocytosis. Robert Feulgen Lecture. Histochem Cell Biol. 116: 109-
118.
62. Doherty GJ, McMahon HT. (2009) Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78: 857-902.
63. Hansen CG, Nichols BJ. (2009) Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell
Sci. 122(Pt 11): 1713-1721.
64. Grant BD, Donaldson JG. (2009) Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nat Rev Mol
Cell Biol. 10: 597-608.
65. Masilamani M, Peruzzi G, Borrego F, Coligan JE. (2009) Endocytosis and intracellular
trafficking of human natural killer cell receptors. Traffic. 10: 1735-1744.
66. Murphy JE, Padilla BE, Hasdemir B, Cottrell GS, Bunnett NW. (2009) Endosomes: a
legitimate platform for the signaling train. Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 17615-1722.
67. Barclay JW, Morgan A, Burgoyne RD. (2005) Calcium-dependent regulation of exocytosis. Cell
Calcium. 38: 343-353.
68. Mayer A. (2002) Membrane fusion in eukaryotic cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 18: 289-314.
69. Verhage M, Sørensen JB. (2008) Vesicle docking in regulated exocytosis. Traffic. 9: 1414-1424.
70. Leabu M. (2006) Membrane fusion in cells: molecular machinery and mechanisms. J Cell Mol Med.
10; 423-427.
71. Morgan A. (1995) Exocytosis. Essays Biochem. 30: 77-95.
72. Jena BP. (2012) Porosome: the secretory portal. Exp Biol Med (Maywood). 237(7): 748-57. DOI:
10.1258/ebm.2012.012110.
73. Jena BP. (2009) Functional organization of the porosome complex and associated structures
facilitating cellular secretion. Physiology (Bethesda). 24: 367-376. doi: 10.1152/physiol.00021.2009.
74. Jena BP. (2008) Porosome: the universal molecular machinery for cell secretion. Mol Cells. 26: 517-
529.
75. Jena BP. (2004) Discovery of the Porosome: revealing the molecular mechanism of secretion and
membrane fusion in cells. J Cell Mol Med. 8: 1-21.
76. Jena BP. (2003) Fusion pore or porosome: structure and dynamics. J Endocrinol. 176(2):169-174.
77. Vardjan N, Jorgacevski J, Zorec R. (2013) Fusion pores, SNAREs, and exocytosis. Neuroscientist.
19(2): 160-174. DOI: 10.1177/1073858412461691.
78. Simionescu N. (1979) The microvascular endothelium. Segmental differentiation, transcytosis:
selective distribution of anionic sites. În „Advances in Inflammation Research”. Editat de Gerald
Weissmann, Bengt Samuelsson i Rodolfo Paoletti. Raven Press, New York, 1979, vol. I, pp. 61-70.
79. Predescu SA, Predescu DN, Malik AB. (2007) Molecular determinants of endothelial transcytosis
and their role in endothelial permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293(4): L823-L842.
106
80. Predescu SA, Predescu DN, Palade GE. (1997) Plasmalemmal vesicles function as transcytotic
carriers for small proteins in the continuous endothelium. Am J Physiol. 272(2 Pt 2): H937-H949.
81. Predescu DN, Neamu R, Bardita C, Wang M, Predescu SA. (2012) Impaired caveolae function
and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-
1s expression in mouse lung endothelium. Biochem Res Int. 2012:672705. DOI: 10.1155/2012/672705.
82. Solari R, Schaerer E, Tallichet C, Braiterman LT, Hubbard AL, Kraehenbuhl JP. (1989)
Cellular location of the cleavage event of the polymeric immunoglobulin receptor and fate of its
anchoring domain in the rat hepatocyte. Biochem J. 257(3): 759-768.
83. Geuze HJ, Slot JW, Strous GJ, Peppard J, von Figura K, Hasilik A, Schwartz AL. (1984)
Intracellular receptor sorting during endocytosis: comparative immunoelectron microscopy of multiple
receptors in rat liver. Cell. 37: 195-204.
84. Richardson JM, Kaushic C, Wira CR. (1995) Polymeric immunoglobin (Ig) receptor production
and IgA transcytosis in polarized primary cultures of mature rat uterine epithelial cells. Biol Reprod. 53:
488-498.
85. Tuma PL, Hubbard AL. (2003) Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol Rev. 83: 871-932.
86. Treyer A, Müsch A. (2013) Hepatocyte polarity. Compr Physiol. 3(1): 243-287. DOI:
10.1002/cphy.c120009.
87. In J, Lukyanenko V, Foulke-Abel J, Hubbard AL, Delannoy M, Hansen AM, Kaper JB,
Boisen N, Nataro JP, Zhu C, Boedeker EC, Girón JA, Kovbasnjuk O. (2013) Serine protease
EspP from enterohemorrhagic Escherichia Coli is sufficient to induce shiga toxin macropinocytosis in
intestinal epithelium. PLoS One. 8(7): e69196. DOI: 10.1371/journal.pone.0069196.
107
Compartimentarea celulară și traficul vezicular
Notițele de curs prezintă informații din Chapter 15 – Intracellular Compartments and Protein Transport,
Essential Cell Biology Alberts et al, 5th ed. Am păstrat numerotarea figurilor și tabelelor din capitolul
respectiv, pentru a le putea identifica mai ușor dacă doriți detalii suplimentare.
Imaginile originale sunt obținute la Institutul Victor Babeș, în Laboratorul de patologie ultrastructurală,
condus de doamna conferențiar dr. Mihaela Gherghiceanu, iar diagramele proprii sunt create cu
BioRender.
Celulele eucariote sunt compartimentate de membrane aflate la interior, formând organite delimitate
de endomembrane, fiecare conținând un set diferit de molecule mici și mari și îndeplinind o funcție
specifică, după cum rezultă din tabelul de mai jos.
TABELUL 15–1 PRINCIPALELE FUNCȚII ALE ORGANITELOR DELIMITATE DE ENDOMEMBRANE ALE UNEI
CELULE EUCARIOTE (Alberts et al. Ed.5)
Compartiment Funcție principală

conține multe căi metabolice (Capitolele 3 și 13); sinteza proteinelor
Citosol
(Capitolul 7); citoscheletul (Capitolul 17)
conține cea mai mare parte a genomlui (Capitolul 5); sinteza ADN-ului și
Nucleu
ARN-ului (Capitolele 6 și 7)
Reticul sinteza majorității lipidelor (Capitolul 11); sinteza proteinelor necesare altor
Endoplasmatic organite sau membranei celulare (acest capitol)
modificarea, sortarea și împachetarea proteinelor și lipidelor fie pentru
Aparat Golgi
secreție, fie pentru livrare către alte organite (acest capitol)
Lizozomi digestia intracelulară (acest capitol)
Endozomi sortarea materialului endocitat (acest capitol)
Mitocondrii sinteza ATP prin fosforilare oxidativă (Capitolul 14)
Peroxizomi degradarea oxidativă a moleculelor toxice (acest capitol)
Fiecare organit conține una sau două endomembrane care delimitează un lumen (apare ca un spațiu
clar pe imaginile TEM) sau o matrice (o ultrastructură mai electronodensă).
Figura 1. Organite delimitate de endomembrane în microscopie electronică de transmisie, care au la interior un lumen sau o matrice.
Fiecare organit are o morfologie specifică, descrisă ca ”ultrastructură” și care va fi detaliată în cursurile
și lucrările practice respective (Fig. 2).
Figura 2. Diverse organite delimitate de endomembrane.
SORTAREA PROTEINELOR
Am aflat din cursurile de până acum că proteinele sunt componentele biochimice din celulă care îi
asigură diversitatea de funcții. De asemenea am aflat că proteinele sunt biosintetizate în celulă de
organitul denumit ribozom. Orice proteină care trebuie produsă într-o celulă începe să fie sintetizată
pe poliribozomi liberi aflați în citosol. Pentru unele biosinteza se și termină în citosol (cele care își
îndeplinesc funcțiile chiar în citosol, ca și multe dintre cele care trebuie să ajungă în nucleu, în
mitocondrii sau în peroxizomi. Pe de altă parte, proteinele destinate organizării și funcționării reticulului
endoplasmic, cele destinate eliminării din celulă (pentru a opera în spațiile dintre celule sau în
interacțiune cu alte celule), cele destinate aparatului Golgi, lizozomilor sunt preluate de reticulul
endoplasmatic înainte de a li se fi terminat biosinteza. Oricare ar fi situația, deci oricare ar fi tipul de
proteină care începe să fie produsă, se pune întrebarea cum știe celula să distingă între ele și să le
direcționeze către locul din celulă căruia îi sunt destinate.
Așadar, pentru mitocondrii și nucleu, proteinele sunt preluate direct din citosol. Pentru altele elemente
morfologice delimitate de endomembrane (aparatul Golgi, lizozomi, endozomi și membrana nucleară
internă) proteinele și lipidele sunt preluate indirect prin intermediul RE, un sediu important al sintezei
lipidelor și proteinelor. Proteinele ajung la RE direct din citosol, cu ajutorul unui complex
macromolecular de control și reglare, particula de recunoaștere a semnalului (un complex
ribonucleoproteic). Peroxizomii folosesc ambele căi, dar preponderent calea importului direct din
citosol. Deși peroxizomii primesc o parte din proteinele membranare din RE, cea mai mare parte a
enzimelor lor ajung direct din citosol.
Sinteza tuturor proteinelor din celulă începe la nivelul ribozomilor din citosol (cu excepția unor proteine
mitocondriale, codificate de ADN-ul mitocondrial și biosintetizate de ribozomii mitocondriali).
Destinația finală a proteinei este codificată în secvența sa de aminoacizi, print-un semnal de sortare.
Proteinele care nu au astfel de semnale rămân la nivelul citosolului; cele care posedă un semnal de
sortare se deplasează din citosol la organitul corespunzător.
Există trei mecanisme prin care proteinele sunt transportate către/în organite:
1. Cu ajutorul unor receptori - În nucleu proteinele intră prin porii nucleari, prin transport activ cu
macromolecule specifice ( proteine numite receptori care recunosc semnale specifice) și sunt de două
categorii: importine și exportine.
2. traversând membrana organitelor, prin transportatori de proteine localizați transmembranar.
Proteinele întră prin acest mecanism în RE, mitocondrii sau peroxizomi. Spre deosebire de transportul
prin porii nucleari, proteina transportată trebuie să se deplieze, pentru ca transportatorul să o ghideze
prin stratul hidrofob al membranei.
3. prin vezicule de transport, care se desprind dintr-un compartiment și fuzionează cu un altul.
Proteinele care părăsesc RE sunt transportate prin acest mecanism.
1. Transportul prin anvelopa nucleară
Nucleul este cel mai mare organit delimitat de endomembrane din celulă, vizibil atât în microscopie
optică (MO), cât și electronică. În MO apare ca o structură bazofilă, rotund-ovalară, alungită sau turtită,
sau polimorfă (forma de regulă depinde de forma celulei) localizată în centrul, la baza sau periferia
celulei, depinzând de tipul celular. Nucleii palid colorați sunt descriși ca eucromatici, cei intens colorați
ca heterocromatici. De regulă, o celulă prezintă un nucleu, dar există și excepții (de ex.: celule anucleate
– eritrocitele mature, keratinocitele din stratul superficial al pielii, polinucleate – osteoclastele).
Ultrastructural (în ME), nucleul are patru componente: înveliș nuclear (anvelopă nucleară), cromatină,
nucleol și matrice. Dintre acestea, nucleolul și cromatina (eucromatina, respectiv heterocromatina)
sunt vizibile și în MO.
Organizarea anvelopei nucleare
Anvelopa nucleară constă din două membrane care fuzionează din loc în loc, la nivelul porilor nucleari.
Pe fața internă, anvelopa nucleară prezintă lamina nucleară – o rețea de proteine denumite lamine,
care asigură sprijin structural pentru anvelopa însăși şi puncte de ancorarea pentru heterocromatină.
Cele două membrane sunt diferite atât sub aspectul compoziției biochimice, cât şi al funcției.
Membrana nucleară internă conține proteine specifice de ancorare a cromatinei și a laminei nucleare.
Membrana nucleară externă este continuă cu membrana RER. Ca și membrana RER, membrana
nucleară externă prezintă ribozomi atașați, implicați în sinteza proteinelor. Aceste proteine sunt ulterior
transportate în spațiul dintre cele două membrane, numit cisterna nucleară, continuă cu lumenul RER.
Structura porului nuclear (PN)
Proteinele porului nuclear se numesc nucleoporine, sunt prezente în mai multe copii pentru fiecare por
şi sunt aranjate într-o simetrie octogonală. Un por nuclear este format din 4 tipuri de subunități:
columnare, care formează cea mai mare parte a peretelui, în număr de 8, dispuse circumferențial;
anulare care sunt dispuse tot circumferențial, dar orizontal (ca un ecuator pe interiorul porului);
lumenale, proteine transmembranare, perpendiculare pe cele columnare, care se extind către interiorul
porului, ca o mare de alge; inelare, care formează unele inelul citoplasmatic şi altele pe cel nuclear.
În funcție de masa și caracteristicile biochimice ale moleculei transportate, transportul este activ sau
pasiv.
Transportul pasiv prin porul nuclear
Ca și prin alte porți hidrofile (cum ar fi conexonii – discutați în cursul de joncțiuni și lucrarea practică ce
prezintă membrana celulară) spațiul axial al fiecărui PN poate fi traversat de molecule mici (5000 daltoni
sau mai puțin), hidrosolubile, care difuzează pasiv. Pentru proteine cu greutate de până la 60.000 de
daltoni se poate observa o difuziune lentă prin por (viteza de trecere a acestor proteine prin por este
cu atât mai mare cu cât macromolecula are o masă moleculară mai mică). Difuzia pasivă este limitată
de structura intrinsecă a porului, care prezintă proteine ce formează in canalul porului o rețea cu ochiuri
mici, (sugestiv descrisă în Alberts ca „un pat de alge din ocean”) prevenind intrarea moleculelor mari.
Transportul activ prin porul nuclear
Ribozomii citoplasmatici maturi, de exemplu, sunt de aproximativ 30 nm diametru și astfel nu pot difuza
pasiv prin PN, limitând astfel sinteza proteinelor la nivelul citoplasmei. Subunitățile ribozomale sau
molecule mari cu localizare nucleară, cum ar fi ADN și ARN polimeraze, se leagă de receptori specifici şi
sunt transportate activ. Localizarea nucleară a unei proteine este semnalizată printr-o secvență
specifică, SLN – semnal de localizare nucleară. În multe proteine, semnalele constau dintr-una sau două
secvențe scurte ( de ex: 5 aminoacizi), care sunt bogate în aminoacizii încărcați pozitiv, lizină și arginină,
recunoscute de receptori specifici.
Multe proteine care funcționează în nucleu, inclusiv histone, ADN și ARN polimeraze, proteine reglatorii
sau factori de transcriere sunt importate selectiv în compartimentul nuclear, de la locul de sinteză
(citoplasmă). Pe de altă parte, ARNt și ARNm sunt sintetizați în nucleu și apoi exportați în citoplasmă.
Ca și importul, exportul este selectiv; ARNm, de exemplu, este exportat numai după ce a fost maturat.
În unele cazuri, procesul de transport este complex. Proteinele ribozomale, de exemplu, sunt sintetizate
în citoplasmă și importate în nucleu, unde se asociază ARN-urilor ribozomale nou sintetizate pentru a
forma subunități ribozomale. Subunitățile sunt apoi exportate în citoplasmă, unde se asamblează în
ribozomi. Fiecare dintre acești pași necesită transport selectiv prin anvelopa nucleară.
Importul nuclear se realizează cu ajutorul unor receptori care recunosc specific subseturi de proteine
purtătoare ale semnalului de localizare nucleară (SLN). Acești receptori se leagă și de proteinele
filamentoase ale porului nuclear, mai precis de secvențele repetitive fenilalanină-glicină (FG) existente
în mod specific în structura acestor proteine. Complexele receptor-proteină nucleară se deplasează de-
a lungul căii de transport prin legarea repetată, disocierea și apoi re-legarea la secvențe FG adiacente.
În acest fel, complexele sar de la o proteină a PN, la alta pentru a traversa interiorul încâlcit al CPN-ului.
Odată ajuns în interiorul nucleului, importinele se disociază de încărcătura lor și se reîntorc în
citoplasmă.
Exportul nuclear funcționează similar importului, bazându-se pe receptori specifici care recunosc
semnale de export nuclear existente în secvența de aminoacizi a proteinelor de transportat. Similar
importinelor, exportinele se leagă de proteinele filamentoase ale CPN pentru a-și găsi drumul către
citosol.
Transportul prin porul nuclear este controlat de o proteină G mică, numită Ran, membru al superfamiliei
Ras, de proteine G monomerice.
Proteinele G monomerice (numite și proteine G mici) sunt implicate în numeroase procese celulare (de
ex.: transport prin porul nuclear, trafic vezicular, organizare/reorganizare a citoscheletului și
semnalizare celulară) și acționează ca niște comutatori moleculari care pot porni sau opri procesele
enumerate.
Mecanismul prin care acționează aceste proteine este acela de modificare a conformației partenerului
de interacțiune. Ele se leagă de anumite proteine cărora le schimbă conformația, activându-le sau
pregătindu-le mai departe să interacționeze, la rândul lor, cu alți parteneri. În cazul transportului
nuclear, ele schimbă conformația receptorului făcându-l apt (exportină) sau inapt (importină) să se lege
de proteina de transportat.
Pentru a putea acționa, proteinele G mici trebuie, ele însele, să fie activate. Calitatea de comutator
molecular a proteinelor G mici derivă din abilitatea lor de a oscila între o stare activă și una inactivă.
Activarea lor depinde de gradul de fosforilare al guanozinei legate, dacă este în formă di- (GDP) sau tri-
fosforilată (GTP). În stare activă, proteina G mică leagă GTP, dar această activare nu durează mult,
deoarece GTP-ul va fi hidrolizat la GDP chiar de proteina G, care astfel se va auto-inactiva. Deoarece
proteinele G mici au abilitatea de a hidroliza GTP-ul, ele se numesc GTP-aze. Ritmul de inactivare al
proteinelor G mici poate fi accelerat de o proteină accesorie – GAP (de la GTPase Activating Protein).
Reactivarea proteinei G mici se realizează prin schimbarea GDP-ului legat cu GTP-ul, schimb realizat prin
modificare conformațională, în urma căruia site-ul de legare a GDP-ului se modifică și nucleotida este
eliberată. Golul creat va fi ocupat de GTP, care este mult mai abundent în citosol decât GDP-ul. Această
activare prin schimbarea GDP cu GTP este mediată de o altă proteină accesorie – Guanosin Exchange
Factor (GEF) (Fig. 3).
Figura 3. Ciclul de activare-inactivare al proteinelor G mici.
Transportul prin porul nuclear este coordonat de o proteină G mică – Ran GTPaza.
Ran se găsește atât în citoplasmă, cât și în nucleu și este necesară atât pentru importul, cât și pentru
exportul nuclear. Deoarece Ran-GAP este situat în citoplasmă și Ran-GEF este situat în nucleu, Ran este
regăsit în formă inactivă în citoplasmă și activată în nucleu. Acest gradient al celor două forme
conformaționale ale lui Ran este responsabil de direcția transportului nuclear.
Receptorii de import cuplați cu proteina care trebuie dusă în nucleu întâlnesc în nucleu Ran-GTP, pentru
care au o afinitate foarte mare. Legarea Ran-GTP determină modificarea conformației receptorului și
eliberarea proteinei transportate. După ce a descărcat proteina în nucleu, importina cu Ran-GTP legată
este transportată înapoi prin complexul por în citoplasmă. Acolo, Ran-GAP activează Ran-GTPaza,
pentru a hidroliza GTP-ul legat, transformându-o astfel în Ran-GDP, care disociază de importină.
Receptorul de import este apoi gata pentru un alt ciclu. Deoarece Ran-GDP-ul din citoplasmă nu are
afinitate pentru receptor și nu poate interveni în legarea acestuia de proteina-țintă, eliberarea cargoului
are loc numai pe partea nucleară a CPN-ului, în prezența Ran-GTP.
Exportul nuclear se produce printr-un mecanism similar – Ran-GTP în nucleu promovează legarea
cargoului la receptorul de export și nu disocierea complexului, așa cum se întâmplă la import. Odată ce
exportina se deplasează prin pori la citoplasmă, Ran-GTP întâlnește Ran-GAP și hidrolizează GTP. Ca
rezultat, receptorul de export eliberează atât încărcătura, cât și Ran-GDP-ul în citoplasmă. Exportinele
libere sunt apoi readuse în nucleu pentru a finaliza ciclul.
2. Transportul proteinelor prin membranele organitelor se face în formă depliată, prin
transportatori.
Astfel de fenomene de transport se întâlnesc în cazul preluării de proteine de către RE, mitocondrii
și peroxizomi și vor fi discutate în cursurile respective.
3. Transportul vezicular
Transportul vezicular presupune încărcarea proteinelor de transportat în vezicule delimitate de
membrane. Conținutul acestor vezicule este, de regulă, specific (conțin doar o anumită proteină sau un
anumit set de proteine) și este selectat cu ajutorul unor receptori din membrana organitului care
formează vezicula.
Transportul vezicular este specific unui grup mare de proteine, numite proteine de ultrastructuri
implicate în ciclul secretor, deoarece urmează toate aceeași cale intracelulară (ER-Golgi-destinație
finală). Aceste proteine au în comun existența unei peptide semnal, despre care s-a amintit în cursul
despre homeostazia proteomului și vom discuta și la RE. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele
membranare (din membrana celulară sau membranele anumitor organite, respectiv din lumenul
acestor organite) și proteinele secretate (de exemplu hormoni, proteine de matrice extracelulară).
Un alt exemplu de transport vezicular a fost deja discutat în cursul de Transport membranar –
transportul cu membrană. Conținutul veziculelor este variat, în funcție de tipul de transport, dar
mecanismele sunt asemănătoare cu cele prezentate în continuare.
Transportul vezicular trece prin mai multe etape:
1 – transportul proteinelor în curs de formare de la ribozomi la reticulul endoplasmic (ER) – discutat în

cursul de homeostazia proteomului și care va fi reluat în cursul de RE;
2 – ER împachetează proteina în vezicule;
3 – Veziculele sunt transportate la destinație folosind citoscheletul – un organit fără endomembrană,

care servește drept suport pentru traficul celular.
Încărcarea în vezicule presupune selectarea proteinei de transportat cu ajutorul unui receptor și

înmugurirea membranei compartimentului donor, cu formarea veziculei. Înmugurirea și detașarea
veziculei se face cu ajutorul unor proteine de înveliș ( de exemplu clatrină, COP). În imaginea de mai jos,
vă este prezentat procesul de formare a unei vezicule în cursul endocitozei, care are loc la nivelul
membranei celulare, dar procesul este, în mare, asemănător în oricare alt compartiment donor.
Diferența principală constă în tipul de proteină de înveliș care structurează vezicula. Clatrina formează
vezicule care sunt destinate compartimentului endozomal, iar COP (COP de la coat protein) formează
vezicule care circulă între RE și aparatul Golgi.
th
Fig. 15-21 Veziculele acoperite de clatrină transportă molecule selectate. Essential Cell Biology, 5 Ed.
Livrarea la destinație, în procesele de trafic vezicular între organite, implică două procese de
recunoaștere între proteine partenere, pereche. Vezicula va fi ancorată la membrana compartimentului
acceptor de către o proteină de ancorare, proprie acceptorului, care va recunoaște proteina G mică
asociată veziculei. Ancorarea aduce în imediata proximitate alte două proteine partenere, din familia
SNARE: v-SNARE (cu v de la vesicular – fiind proteină transmembranară a veziculei transportoare) și t-
SNARE (cu t de la target – fiind proteină transmembranară a membranei țină, a compartimentului
acceptor). Aceste două proteine se vor lega strâns una de cealaltă, ducând la fuziunea celor două
membrane. Procesul defuzionare a celor două membrane implică și derivați de fosfatidil-inozitoli și
creșterea locală a concentrației de Ca2+.
Ca și transportul proteinelor prin învelișul nuclear, traficul vezicular este bidirecțional: veziculele care
pleacă de la RE către celelalte elemente delimitate de membrane merg anterograd (transportul este
anterograd, iar cele care merg către RE execută transport retrograd.
Transportul retrograd are rolul de a returna compartimentului donor membrane și proteine proprii,
pentru a putea fi refolosite.
Termeni cheie
Compartimentare
Peptidă/secvență semnal
Înveliș nuclear
Por nuclear
Proteină G mică
Trafic vezicular
Proteină de înveliș (clatrină, COP)
Compartiment donor/acceptor
Proteine SNARE (v-SNARE, t-SNARE)
Transport anterograd/retrograd
Anticorpii – instrumente
folosite în investigarea
celulelor
În lucrarea practică de azi vom învăța
• Ce sunt anticorpii
• Cum sunt utilizați ca terapie biologică
• Ce înseamnă imunomarcare și care este rolul ei
• Care sunt tehnicile de cercetare și cele din
practica medicală care folosesc anticorpi
Anticorpi : Definiţie
• ANTICORP – O proteină în forma
literei Y, produsă de limfocitele B
ca răspuns la un stimul antigenic
(bacterian, viral sau orice altă
proteină străină), ce Situs de legare a
antigenului
neutralizează antigenul legându-
se specific de el; o
imunoglobulină.
N.B. Antigen – orice proteină sau

peptidă non-self capabilă să
stimuleze producerea de anticorpi
Terminologie
Antigen în cercetare înseamnă o proteină de interes

pe care o identificăm cu ajutorul anticorpilor
specifici
Atât antigenul cât și anticorpul pot fi proteine, dar

provenind de la specii diferite
De ex: O proteină umană este antigenică (poate să

genereze un răspuns imun) pentru altă specie (de
ex: şoarece)
Anticorpi : structura generală
Situs de legare a
antigenului
1
1. Regiunea Fab
4 2. Regiunea Fc
3. Lanţ greu
4. Lanţ uşor
3
2
Anticorpii în cercetarea biomedicală
• În cercetare, exploatăm afinitatea mare a

anticorpilor pentru substratul specific (de obicei,
dar nu exclusiv, o proteină), pentru a identifica
prezenţa unei anumite molecule (ex. un receptor
celular, o proteină virală) într-un produs biologic.
Doar o parte a proteinei (numită EPITOP) este

responsabilă (și necesară) pentru generarea de
anticorpi
Anticorpii în cercetarea biomedicală
Purificarea proteinelor umane (vezi metode în lp 10)

a permis generarea de anticorpi specifici pentru
proteina respectivă, prin injectarea ei la un animal
de laborator.
Anticorpii cu cea mai mare specificitate de substrat

și cel mai bun răspuns biologic sunt cei
”monoclonali” și sunt folosiți și în practica medicală
ca terapii biologice
Anticorpii în clinică
Terapiile biologice cu anticorpi monoclonali folosesc

anticorpi numiți ”umanizați” (humanized
monoclonal antibodies):
• Fab provine de la șoareci/șobolani de laborator,
în care s-a injectat proteina țintă
• Fc este cât mai asemănător structurilor primară,
secundară și terțiară ale anticorpilor umani,
pentru a preveni generarea de răspuns imun al
pacientului împotriva terapiei
Anticorpii în clinică
Medicamentele moleculare care sunt anticorpi
monoclonali se termină in ”-mab” (monoclonal antibody)
(de ex: adalimumab, bevacizumab ș.a.)
- Patologiile adresate cel mai frecvent prin astfel de
terapii sunt:
- inflamatorii cronice (artită reumatoidă, boală
Crohn)
- ținta: proteine de reacție inflamatorie (de ex:
TNFα)
- onocologie - proteine țintă: receptori prin a căror
blocare se întrerupe un semnal de proliferare
Anticorpii în biologia celulară
Pentru a genera o terapie moleculară este nevoie

de 10-15 ani de testări în cercetarea pre-clinică:
modele in vitro și in vivo (modele animale) (Lp12).
Biologia celulară folosește frecvent anticorpi

pentru:
• identificarea prezenței unei proteine
• studii de localizare celulară/tisulară
• (semi)cuantificare
Metode de biologie celulară pe bază de
anticorpi
• Microscopie (imunohistochimie – IHC,
imunofluorescenţă, imunoelectronomicroscopie)
• Citometrie în flux și sortarea populaţiilor celulare

(FACS – fluorescence-activated cell sorting, MACS –
magnetic-activated cell sorting)
• Metode de cercetare și diagnostic (IHC, determinarea

grupelor de sânge – ABO, teste ELISA – enzyme-linked
immunosorbent assay, western blot)
Imunomarcarea
Ca și cu alte metode studiate până acum, se pune

problema vizualizării rezultatului.
Pentru a vizualiza legarea antigenului de anticorp

trebuie ca:
1- anticorpul să fie legat de un marcaj vizualizabil
(colorat, fluorescent) = imunomarcare
2- să existe o cantitate suficientă de perechi
antigen-anticorp care să genereze un semnal vizibil
Imunomarcarea
• Include toate tehnicile ce utilizează anticorpi

marcați pentru localizarea antigenelor
corespondente
• În preparate tisulare
• Criosecţiuni
• Secţiuni incluse în parafină
• În culturi celulare
• În alte probe biologice (ex. sânge periferic)
Imunomarcarea
• Imunomarcarea în microscopia optică (în funcţie de

marcaj)
• Imunohistochimie
• Imunofluorescenţă
• Imunomarcarea în microscopia electronică
• Imunoelectronomicroscopie
Principiul metodei
• Interacţiuni specifice între antigen (Ag) şi anticorp (Ac)
• Ac sunt cuplaţi cu un sistem de detecţie:

- Enzimă ce acţionează asupra unui substrat ce va fi
transformat în compus colorat
(IMUNOHISTOCHIMIE); vizualizare în microscopia
optică
- Molecule fluorescente vizualizate la microscopul de
fluorescenţă (IMUNOFLUORESCENŢĂ).
Imunohistochimie
ENZIMĂ SUBSTRAT
http://www.ihcworld.com/products/ihc-detection-system/Chromogen.htm
BCIP/NBT
DAB+ kit
Imunohistochimia în practica medicală
Este una din principalele metode ale diagnosticului

anatomopatologic.
Utilitate:
- diagnostic (identificarea tipului de tumoră în
funcție de anumiți markeri/proteine)
- identificarea originii unei tumori în funcție de tipul
de proteină din filamente intermediare
- determinarea agresivității unei tumori, prin
detecția unor proteine implicate în diviziune
celulară
Comparație între o secțiune HE și o imunohistochimie
pentru Ki67 - marker de proliferare celulară
Roychowdhury, M. Ki67. PathologyOutlines.com website.

http://www.pathologyoutlines.com/topic/stainski67.html.
Imunofluorescenţa
• Foloseşte anticorpi marcaţi cu fluorocromi
Fluorocrom (fluorofor) – o moleculă capabilă de a

emite fluorescenţă; când este excitată de lumină
cu o anumită lungime de undă, va emite o radiaţie
electromagnetică cu o lungime de undă mai mare,
în spectrul vizibil
Spectrul electromagnetic
Energie (eV)
3,1 eV 1,77 eV
Spectrul electromagnetic
• Radiația electromagnetică este purtătoare de

energie. Această energie crește cu frecvența și
este invers proporțională cu lungimea de undă.
Lumina vizibilă corespunde fotonilor cu energie
cuprinsă între 1,77 eV (corespunzătoare la λ=700
nm) și 3,1 eV (λ=400 nm). Razele X, care sunt
nocive în cantitate mare, ajung la aproape 2500
eV, iar razele gamma, care sunt letale, la aprox
8 000 000 eV (8MeV)
Tipuri de microscopie de fluorescență
Microscop cu Microscop de
câmp larg Microscop confocal superrezoluție
d*= 250 nm d= 200 nm d= 50 nm

*d – cea mai mică distanţă la care două puncte pot fi observate distincte şi nu suprapuse;
este invers proporţională cu rezoluţia unui sistem optic
Exemple de imagini de microscopie de fluorescență-
același anticorp, aceeași cultură celulară
M. cu camp larg M. confocal

Desmină
SMA - smooth muscle actin
Imunoelectronomicroscopie
- Tehnică utilă în detecţia şi localizarea foarte precisă

a proteinelor în diferite compartimente celulare,
datorită puterii de mărire şi rezoluţiei înalte
- Foloseşte anticorpi adsorbiţi pe particule de aur (5-

30 nm) sau conjugate cu enzime
Granule de secreţie
ce conţin prolactină
Folosirea anticorpilor în metode de
diagnostic
• ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay
(anticorpul utilizat este conjugat cu o enzimă)
• pentru detectarea proteinelor (ex. biomarkeri

pentru cancer, hormoni)
• pentru detectarea unui răspuns imun (ex.

detecţia anticorpilor împotriva unui anumit virus)
ELISA - Principiu
Este o reacție Ag-Ac marcat enzimatic, în care

cantitatea de Ag se poate cuantifica prin
intensitatea culorii generate din reacția enzimatică.
triplicate
de probe
control
negativ
Blotarea (Western blot) - Principiu
• Metoda prin care se identifică o proteină de o
anumită masă moleculară, separată prin SDS
PAGE dintr-un amestec, folosind un anticorp
specific.
29
Western blot
semnal absent:
proteina nu se
sintetizează
sau este atât de puțină
încât e sub limita de
detecție
proteină
supraexprimată, care
se poate
semicuantifica prin
raportarea intensității Control pozitiv
semanlului la cel al
actinei corespondente
Determinarea grupelor
de sânge ABO
• Eritrocitele au pe suprafaţa lor antigene pentru
grupele de sânge (A, B, AB dacă ambele antigene
sunt prezente, 0 dacă niciun antigen nu este
prezent)
• Legarea de anticorpi specifici va duce la

hemaglutinare şi hemoliză
Hemaglutinare la determinarea
grupelor de sânge ABO
Anti-A Anti-B Anti-A şi B
Grupa 0
Grupa A
Grupa B
www.safetransfusionmanual.org
Imunofenotiparea
Identificarea unui tip celular pe baza unei proteine/

unui set de proteine specifice
- de regulă, aceste proteine sunt membranare
(expuse la suprafaţa celulei şi uşor accesibile
anticorpilor specifici, pentru identificare)
Această metodă este utilă pentru identificarea acelor

tipuri celulare care nu au un fenotip morfologic
distinct (de ex: celulele stem, tipuri limfocitare)
Imunofenotipare limfocitară
Incubarea sângelui cu anticorpi marcați cu

fluorocromi, care au ca țintă proteine specifice
de pe suprafața limfocitelor.
- unele dintre aceste proteine sunt notate cu
indicativul CD (cluster of differentiation): CD4,
CD8 s.a.m.d.
Aplicaţie clinică:
evaluarea numerică și procentuală a principalelor
subseturi limfocitare - T, B şi NK.
Imunofenotiparea prin citometrie în flux
(CF)
• CF măsoară şi ulterior analizează anumite
proprietăţi fizice şi chimice ale unor celule pe
măsură ce acestea trec individual, în flux, prin
dreptul unui fascicul laser.
• Avantajul principal al CF: capacitatea de

analiză a unui număr relativ mare de
parametri (20) pentru un număr mare/foarte
mare de particule (106), într-un timp relativ
scurt (zeci de secunde – minute).
CF - Principiul de funcționare
La trecerea prin dreptul razei laser, lumina este dispersată de

particule în toate direcțiile în funcție de indicele de refracție, de
mărimea și complexitatea celulei
dispersie laterală ( side scatter =SS, SSC)
rază de
excitație
dispersie anterioară (forward scatter=FS, FSC)

Dispersia luminii – trombocite, limfocite
Dispersia luminii – monocite, granulocite
Mărimea aproximativă a celulelor (micrometri)
Dimensiunile sunt date cu titlu informativ, gama în care variază poate fi mai mare.
Eritrocitele (eliminate în mod uzual prin hemoliză) prezintă o distribuție mare
pe FSC datorită formei de lentile biconcave, care conduce la o diversitate mare
a secțiunilor de la nivelul punctului de interogare (intersecția cu raza laser).
Fenotiparea celulară folosind citometria în
flux
Dacă nu se poate
apela la marcarea
fluorescentă, simpla
trecere a celulelor
prin analizor poate
indica principalele
populații celulare
sangvine, pe baza
dimensiunilor și
granularității lor
Markeri de suprafață folosiți în
fenotiparea limfocitară
Limfocite Limfocite B Limfocite T Limfocite T Limfocite NK

T helper/inducer supresor/citotoxic
CD3+ CD3-CD19+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-(CD16+)

CD56+CD8-/low
CD - cluster of differentiation= proteine exprimate pe

suprafața celulelor, caracteristice unei anumite
populații
Utilizarea anticorpilor în sortarea
populaţiilor celulare
• Prezenţa antigenelor specifice pe suprafaţa
populaţiilor celulare permite separarea lor dintr-
un amestec de celule (ex. obținerea unei culturi
celulare pure sau izolarea celulelor stem
hematopoietice din sângele ombilical)
• Fluorescence-activated cell sorting (FACS)

• Magnetic-activated cell sorting (MACS)
Fluorescence-activated cell sorting
Laser
- +
- +
Celule fără Celule

fluorescenţă fluorescente
Magnetic-activated cell sorting
Nanoparticule magnetice
Rezumat
• Interacţiunea Ag-Ac are un grad înalt de specificitate
• Ac sunt utili în identificarea proteinelor

(extra)celulare, separarea populaţiilor celulare
• Ac sunt folosiţi în cercetare ca unelte de diagnostic

şi în clinică drept terapie biologică
• Metodele de detecţie folosesc cel mai frecvent

fluorocromi sau reacţii enzimatice de culoare
MICROSCOPIA ELECTRONICĂ
OBIECTIVELE LUCRĂRII PRACTICE
• Înțelegerea principiului de funcționare a microscopului electronic
şi cum ne ajută în studiul celulei
• Recunoaşterea unei imagini obţinute prin microscopie electronică
• Întelegerea principalelor diferenţe faţă de microscopul optic
• Descrierea tipurilor de microscoape electronice, precum şi a altor

tipuri de tehnici, înrudite cu microscopia, care permit obţinerea de
detalii până la nivel atomic
Ochiul uman
0,1 mm OCHIUL UMAN
detectează lungimi
https://www.diag2tec.com/plasmos/
de undă între~ 400-
800 nm.
REZOLUȚIE
MO
0,2 μm
10 µm Microscopul optic
poate detecta o
lungime de unda de
200 nm.
2 µm Microscopul
electronic poate
ajunge la o
ME
rezolutie de 2pm
0,002 nm 10 nm
https://www.fei.com/image-gallery/80S-Ribosome/
MICROSCOPUL ELECTRONIC
Folosește un fascicul de electroni în locul unui fascicul de lumină.

Studiul celulelor cu ajutorul ME a permis, în anii 1950-1970,
identificarea organizării celulelor și a organitelor celulare
Poate fi caracterizat folosindu-se aceiași parametri ca și pentru MO:

• Puterea de mărire → aproximativ 1.000.000 x
• Rezoluție ∼ 0,002 nm (variabilă dependentă de tensiunea de
accelerare a electronilor, de viteză acestora)
MICROSCOPUL ELECTRONIC - PRINCIPIU DE FUNCŢIONARE
• Formarea imaginii în ME depinde de interacțiunea electronilor din

flux cu nucleele și electronii atomilor din preparat (probă)
• Celulele și țesuturile nu au contrast, motiv pentru care se folosesc
pentru pregătirea probei săruri de metale grele, care se leagă
selectiv de diverse molecule (fosfolipide, proteine, etc) pentru a
crește contrastul în preparat
• Cu ajutorul microscopului electronic putem examina structuri
celulare de mici dimensiuni, denumite ultrastructuri (complexe
macromoleculare și organite)
TRANSMISIE REFRACȚIE REFLEXIE
Interacțiunea
electronilor cu
proba
influențează
comportamentul DIFRACȚIE ABSORBȚIE ÎMPRĂȘTIERE
electronilor
TIPURI DE MICROSCOAPE ELECTRONICE
• Microscop electronic de transmisie – detectează electronii

transmiși prin probă
• Furnizează detalii de rezoluție înaltă (∼ 0,2 nm)
• Microscop electronic de baleiaj (scanning) – detectează electroni

reflectați de probă
• Furnizează detalii ale suprafeței probei analizate ( ∼ 50 nm)
PRINCIPIUL DE FUNCȚIONARE AL ME
ME constă dintr-un cilindru vidat în care sunt accelerați electronii

extrași dintr-un filament (de regulă de tungsten) prin aplicarea
unei tensiuni de accelerare de ordinul sutelor de mii de volți. O
serie de lentile opto-electronice focalizează fasciculul de
electroni care trece prin probă și este vizualizat pe un ecran
fluorescent sau este captat de un detector electronic.
MICROSCOPUL ELECTRONIC DE TRANSMISIE
FILAMENT –
Folosește un fascicul de electroni în locul unui

sursă de electroni
LENTILĂ
fascicul de lumină
CONDENSOR
Pentru focalizarea electronilor într-un fascicul
Secțiuni prin celule
pe o grilă (ø 3mm) coerent se folosesc lentile electromagnetice
LENTILĂ amplasate într-o incintă vidată
OBIECTIV
LENTILĂ
PROIECTOR Puterea de mărire și rezoluția sunt dependente
de viteza de accelerare a electronilor în incinta
Ecran fosforescent vidată a ME.
/Detector electronic
MICROSCOPUL ELECTRONIC DE TRANSMISIE
Fasciculul de electroni, controlat de lentile
electromagnetice, trece printr-o felie foarte subţire
de ţesut
• electronii care trec („transmiși”) sunt proiectați
pe un ecran fluorescent (sau înregistrați de
camere digitale speciale), generând puncte
luminoase
• ultrastructurile celulare care au „respins”
electronii datorită nucleelor de metale grele
legați, vor crea umbre pe ecranul captator
ETAPELE OBŢINERII PREPARATULUI PENTRU
ME DE TRANSMISIE CLASICĂ
MO ME
Recoltare (biopsie, necropsie) Recoltare (doar biopsie)
Fixare (fizică, chimică) Fixare (fizică/chimică)
Includere (parafină) Includere (răşini epoxidice)
Secționare (microtom) Secționare (ultramicrotom)
Montare (lamă, lamelă) Montare (grilă de cupru)
Colorare (coloranți) Contrastare (săruri de metale grele)
RECOLTAREA
• Biopsie – prelevare de țesut viu
• Culturi celulare
FIXARE
• este obligatorie pentru ME (nu se pot examina celule vii)

• trebuie făcută înainte (în cultura celulară) sau imediat după
recoltarea țesutului prin biopsie
• trebuie făcută foarte rapid după recoltare - orice degradare
la nivel molecular/celular va fi redată de microscop
FIXAREA
• FIZICĂ – prin înghețare rapidă - vitrificare (azot lichid, la - 190°C)

• CHIMICĂ
• Glutaraldehidă (timp de fixare rapid – 5 secunde, putere de
penetrare scăzută în țesut – 0,5mm)
• Tetraoxid de osmiu (OsO4) – numită postfixare, permite
conservarea fosfolipidelor (vizualizarea membranelor)
• aldehidele și agenții oxidanți (OsO4) acționează prin
formarea de legături covalente cu grupările funcționale ale
macromoleculor din celule/țesuturi
INCLUDEREA
• Includerea încorporează piesa de țesut într-o materie solidă,

potrivită pentru a obține secțiuni cât mai subțiri (50-100 nm),
care pot fi examinate la microscop (electronii o pot străbate)
• Este precedată de deshidratare pentru a înlocui apa și a permite
materialului de includere, o rășină hidrofobă epoxidică, să
pătrundă în probă
Țesut
SECȚIONAREA
• Secționarea se realizează cu un aparat special (ultramicrotom)

pentru a obține secțiuni subțiri de 0,04 – 0,1 µm
Piesa de țesut este inclusă în epon Secționarea se face la ultramicrotom Piesele se recoltează pe apa și apoi se montează pe o grilă
SECȚIONAREA - CONTRASTARE
grilă
CONTRASTAREA (ME)
• Este echivalentă colorării pentru MO; este necesară pentru a

putea discrimina diferite componente ale preparatului
• Se face cu săruri de metale grele (citrat de plumb, acetat de uranil,

etc), ale căror nuclee se leagă de anumite componente din
preparat, blocând trecerea electronilor
• Depunerea metalelor grele nu este specifică dar este

reproductibilă astfel încât creșterea contrastului se realizează
consecvent pe anumite structuri
CONTRASTAREA (ME)
• secțiune necontrastată • secțiune contrastată

IMAGINILE DE
MICROSCOPIE
ELECTRONICĂ APAR
ÎN ALB, NEGRU ŞI
TONURI DE GRI
INTERPRETAREA IMAGINILOR
• moleculele care leagă mulți

nuclei grei (de osmiu, uraniu,
plumb, fier ș.a.) vor produce
dispersia e- – zone
electronodense (întunecate)
• moleculele care nu leagă
nuclei grei vor permite
trecerea e- – zone
electronoclare
INTERPRETAREA IMAGINILOR
Imagine de MET a
unor celule
(încercuite cu
roșu, la putere de
mărire scăzută
(vezi scara de Cromatină condensată
mărire)
Nucleu
Detaliu al imaginii
precedente
(vezi scara de
mărire).
Insertul roșu este
Cromatină condensată
mărit în imaginea
următoare
Detaliu al unei
zone de Centriol
citoplasmă din
imaginea
precedentă. În
centru se
observă un
centriol
PUTERE MARE DE MĂRIRE
ME – PUTERE MARE DE MĂRIRE
molecula de ADN
Pas de 2,4 nm al spiralei de ADN - A

Nano Lett., 2012, 12 (12), pp 6453–6458
CONTRASTARE NEGATIVĂ
Contrastare pozitivă Contrastare negativă
• Contrastarea negativă se folsosește in

special pentru stucturi proteice (perete
celular, filamente, complexe
macromoleculare) peste care se adaugă
un volum foarte mic de soluție de
contrastare care se usucă. Electronii vor
trece prin structurile proteice care nu
leagă soluția de contrastare si vor fi
reflectați acolo unde ea se acumuleaza -
la marginea preparatului
• Escherichia coli -
imagine MET obținută
prin contrastare
negativă
100 nm
E. coli negatively stained with 1% Uranyl acetate

Courtesy of Alexander Mironov
https://www.fei.com/image-gallery/
Taken by Tecnai microscope
• Imagine MET obținută

prin contrastare
negativă a
filamentelor de actină
100 nm
Alberts B at al. Molecular biology of the cell / 6th ed. 2015

• Ce tehnică de microscopie
electronică a fost folosită pentru
a obține această imagine?
CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE
Probele biologice aflate în soluție sunt puse direct pe o grilă și

scufundate în azot sau etan lichid. Se formează astfel o peliculă
de apă vitrificată (fără cristale) care conține proba. Aceste grile
sunt vizualizate în MET cu dispozitive speciale de menținere
constantă a temperaturii la -190⁰C.
Contrastul în aceste probe este scăzut fiind generat doar de
atomii componenți ai probelor biologice. Imaginile sunt
achiziționate automat și prelucrate și analizate cu ajutorul unor
softuri speciale.
Această tehnică a primit premiul Nobel pt Chimie in 2017
• Probele biologice sunt

vitrificate direct pe grilă
și vizualizate în condiții
de temperatură scăzută
(-190°C) în MET
https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2017/press-release/
ER - galben
cis C - verde
cis V - verde deschis
medial C - magenta
medial V - roz
trans C - albastru
trans V - albastru deschis
TGN - violet
Alte membrane și ribozomi - gri
eLife 2017;6:e32493 DOI: 10.7554/eLife.32493

MICROSCOPIA ELECTRONICĂ DE BALEIAJ
• Oferă imagini tridimensionale ale

suprafețelor celulelor, țesuturilor, organisme
• Același principiu al interacțiunii unui fascicul REFLECTAȚI
de electroni cu o probă care trebuie (SEM)
acoperită cu un strat subțire metalic (pentru

stabilitate și contrast)
• Imaginea este formată de electronii reflectați
de pe suprafața preparatului și colectați de
un detector
Fire de păr
stereocili
Alberts B at al. Molecular biology of the cell.
6th ed. 2015
Cili și mivrovili
https://microscopy.stanford.edu/
http://www2.optics.rochester.edu/
• Celule nervoase crescute

în cultură
Courtesy of Dr. Mark McClendon , Northwestern University
Taken by Quanta SEM microscope
Magnification: 8,000X
Sample: Embryonic Nerve Cell
Detector: SE
Voltage: 3kV
Vacuum: 2 e-3Pa
Horizontal Field Width: 20um
Working Distance: 6
Spot: 3
https://www.fei.com/image-gallery/
organism microscopic din ape termale acarian colorat digital
https://www. fei.com
ÎNGHEŢARE - FRACTURARE
• Permite vizualizarea suprafețelor rezultate prin clivajul
anumitor structuri (ex: clivajul membranei celulare)
• Se îngheață celulele
• Se introduc într-o cameră vidată și se lovesc cu un cuțit
• Celulele se fracturează in zonele hidrofobe (unde gheața nu s-a
format)
• Se realizează un mulaj metalic (Au, C) al suprafeței expuse în
urma clivajului – se realizează o replică a suprafeței
• Se examinează această replică metalică la MET
ÎNGHEŢARE - FRACTURARE
TEHNICĂ REZULTAT
Startul extracelular
proteine Fața internă a stratului extracelular (fața E)

Cuțit
Membrana plasmatică Startul citoplasmatic

Fața externă a stratului citoplasmatic (fața P)
http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/c8.7x4.freeze.fracture.jpg
PRINCIPII CONSTRUCTIVE
COLORARE VS. CONTRASTARE
Colorarea MO Contrastarea ME
• Cu substanţe chimice, de obicei acizi
• Componentele celulare care leagă
sau baze
săruri de metale grele vor bloca
- Coloranţii acizi se leagă de substrat trecerea electronilor, apărând
acidofil (sarcini +) întunecate pe imagini
- Ex. EOZINĂ – un colorant roz, deci
substratul bazic care îl leagă va • Restul componentelor vor fi mai
apărea colorat în roz mult sau mai puţin permeabile
- Coloranţii bazici se leagă de substrat pentru fluxul de electroni, care vor
bazofil (sarcini -) traversa preparatul şi vor ajunge la
- Ex. HEMALAUN – un colorant violet, ecranul de captură, producând un
deci substratul acid care îl leagă va fi zone mai luminoase
colorat violet
CARE SUNT NIVELURILE DE
DETALIERE ALE UNEI CELULE?
(MICRO ŞI NANO)
• MO oferă detalii despre forma generală a celulelor, nucleu şi câteva detalii
despre organite (folosind metode specifice).
• ME oferă detalii despre organite, membrana celulară sau moleculele
componente (până la nivel atomic)
• Putem “vedea” structura chimica a unei molecule?
- cristalografia cu raze X
- spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară
- microscopul de forță atomică (MFA) - măsoară interacțiunea dintre un
senzor și atomii din preparat
Metode de vizualizare a (macro)moleculelor
Tehnică Rezultat Interpretare
Cristalografia cu raze X -model de difracție un model de structură terțiară/
cuaternară
(radiație
electromagnetică cu
lungime de undă 0,01-10
https://www.jic.ac.uk/staff
nm) /david-lawson/xtallog/ modelare bioinformatică
summary.htm
Spectroscopia de
rezonanță magnetică spectru de rezonanță
nucleară (radiație al atomilor de C, H sau al
electromagnetică în grupelor funcționale
domeniul undelor radio) https://www.exova.com/sectors/
pharmaceuticals/material-sciences-testing/
nmr-spectroscopy/
Microscopia de forță -”harta” interacțiunilor dintre atomii

moleculelor unei suprafețe și un scanner
atomică
www.creative-biolabs.com/drug-
discovery/therapeutics/atomic-force-
microscopy.htm
Microscopie optica Microscopie electronica
Secțiune de 1µm Secțiune de 100 nm
MO ME
40x 5000x
www.intechopen.com
MO ME
Ob. 20x 20.000x
http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html
REZUMAT
• Pregătirea preparatului pentru MO şi ME (de transmisie) trece prin
etape asemănătoare
• Cu ajutorul MO putem vizualiza structura componentelor din
preparat - organizarea ţesuturilor în fragmentul de organ,
componente tisulare (ce permit identificarea tipului de ţesut), tipuri
celulare
• Cu ajutorul ME putem vizualiza ultrastructura componentelor din
preparat - detalii la nivel celular: organite celulare, organizarea
membranelor
• Există metode care ne permit identificarea atomilor și aranjamentul
lor în structuri terțiare/complexe macromoleculare
Anexa 1 CARACTERISTICĂ MICROSCOPUL MICROSCOPUL ELECTRONIC
OPTIC
Spectrul FOTONI ELECTRONI

electromagnetic
spectrul vizibil electroni
760 nm ÷ 390 nm ~ 0,004 nm
Lentile (sisteme de modulare a sticlă electromagnetice

undelor)
Puterea de rezoluție 0,2 µm (200 nm) 0,002 nm (2pm)
Puterea de mărire maximă x 2.000 x 10.000.000
Imaginea este produsă de o sursă de lumină albă / UV / LASER sursă de electroni

sursă de radiații
Mediul de examinare aer vid
Proiecția imaginii directă indirectă

ochiul uman / film fotografic / ecran fluorescent / film
camere video de înaltă rezoluție /camere video de înaltă
rezoluție
Imagini colorate de cele mai multe ori nu

CARACTERISTICĂ MICROSCOPUL OPTIC MICROSCOPUL
ELECTRONIC
Preparatul celule fixate sau vii doar celule fixate

examinat
Fixarea diverse substanțe Glutaraldehidă

(uzual formaldehidă) OsO4
* *
crio-fixare crio-fixare
Includere parafină / înghețare rășini (plastic) / vitrificare

(consitență)
Grosimea secțiunii ~ 5 µm ~ 50 nm
Obținerea coloranți / fluorocromi metale grele

contrastului
Suport pentru lama de sticlă grilă de cupru

preparat
Metode de studiu al acizilor nucleici
În această lucrare practică vom învăța
• Noțiuni de bază în biologia acizilor nucleici
• Principiul de funcționare al metodelor moleculare care
studiază acizi nucleici
• Diverse metode pe scurt: principiu, aplicabilitate în practica
medicală
Noţiuni de bază în biologia acizilor nucleici
• Molecula de ADN eukariotic este un dublu helix format din două
catene complementare de nucleotide (numite primă şi
complementară); cea de-a doua catenă poate fi generată în
laborator prin revers-sinteză pe baza primeia, folosită ca matrice.
• De exemplu, pentru o catenă primă formată din 4

nucleotide(ACTG), secvenţa catenei complementare este CAGT.
ADN-ul este un dublu helix de catene unite prin legături de hidrogen
• Legăturile de hidrogen sunt

desfăcute în mod normal în
procesele de replicare și
transcriere, de proteine care
facilitează apoi acțiunea
polimerazelor – enzime care
sintetizează catene noi de
ADN pe baza unui model
(matriță).
Essential Cell Biology, Alberts et al. 8th Ed

Replicarea ADN (de ex, în diviziune celulară) prin ADN polimerază, formează o catenă nouă pe baza
modelului oferit de catena matriță. Formarea noii catene prin hibridizare între nucleotide pereche are loc
în direcția 5’-3’, pornind de la capătul 3’ al matriței

• Secvența de ADN
nucleotide a ADN-
ului codifică toată
informația de care o trancriere
celulă are nevoie ARN
pentru a funcționa
• Transcrierea unei traducere
gene/secvențe ADN Proteină
în ARN se numește în
aminoacizi
biologie moleculară
”expresie genică”

• ADN-ul unei celule este structurat în cromozomi- fragmente de ADN împachetat
care conțin un set specific de gene
• În prezent, cunoaștem secvența de nucleotide pentru fiecare cromozom în parte

și se cunosc boli cu determinism genetic (care sunt cauzate de un defect genetic)
• Defectele genetice pot afecta:

• O singură nucleotidă (mutație punctiformă - patologică sau polimorfism nucleotidic – posibil
fără încărcătură patologică)
• O secvență/fragment dintr-un cromozom
• Întreg cromozomul
Principiul de functionare al metodelor de
studiul al acizilor nucleici
Metodele de biologie moleculară se bazează în marea lor
majoritate pe tendința normală a secvențelor complementare de
a se lega una de cealaltă
= hibridizarea fragmentelor pereche ( de ex: ACTG la CAGT).
Aceasta presupune că adaugarea unor fragmente ATCG marcate

cu fluorocromi într-un amestec de fragmente de ADN, va duce la
legarea lor de toate secvențele complementare CAGT
Metode de biologie celulară în studiul
acizilor nucleici –aplicații practice
• Detectează modificări ale materialului genetic propriu
(mutații, deleții, translocări samd)
• Prezența unor organisme străine și tipul acestora ( virusuri,

bacterii, inclusiv detectarea unor tulpini patogene)
• ADN fetal izolat din sângele matern
• ADN liber, circulant

Principiul de functionare al metodelor de
studiul al acizilor nucleici
În funcție de defect, diverse
metode sunt potrivite pentru
diagnostic.
Created with BioRender.com

Reacţie de amplificare în lanţ sau PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
• Metodă folosită pentru obţinerea unui număr de copii ale unei
gene, suficient de mare cât să lege un număr de molecule
fluorescente de marcaj
• Secvența genei trebuie cunoscută dinainte pentru a putea folosi

PCR, deoarece reacția de multiplicare este inițiată de primeri -
oligonucleotide customizate, adaugate în mediul de reacție
11
PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
• Vizualizarea rezultatului PCR se face prin electroforeză

PCR – Aplicaţii practice
• Identificarea unei mutaţii, folosind primeri customizați,
complementari cu secvenţa mutată
• Identificarea unei alele modificate prin deleţii, adiţii
• Detectarea de ADN viral/bacterian pentru:
• Diagnosticul unei infecţii
• Evaluarea eficacităţii unei terapii
Rezultatul reacției de PCR
- Cantitativ: nr de copii ale genei detectate
- De ex: pentru detecția unor virusuri, se
traduce în nr copii virale/ml sange -
încărcătură virală
- Calitativ: detectarea unei deleții/adiții - pentru

vizualizarea rezultatului se face electroforeză
Electroforeza
• Metodă de separare a unor molecule dintr-un amestec, într-un
câmp electric
• Sarcina electrică a acizilor nucleici este (-), iar separarea lor se face
în funcţie dimensiunea fragmentului analizat, dat practic de nr de
perechi de baze care îl formează (bp sau kilo bp – kbp)
• Vizualizarea se face prin adăugarea unei substanțe fluorescente

care se leagă de ADNdublu catenar
Electroforeza acizilor nucleici
Creşte nr de perechi
Standard
de baze
Exemplu: diagnosticul unei mutații la
pacienţi cu policitemia vera
qPCR (quantitative PCR)
- Metodă de măsurare a expresiei genice, adică a unui
anumit ARNm dintr-o probă
- Ilustrează gradul de activare a genei pe baza căreia
se sintetizează ARNm
Principiu: este un PCR precedat de o etapă preliminară

de reverstranscriere a ARN în ADNcomplementar
(ADNc) pe baza căruia va avea loc ulterior amplificarea
18
Proba al cărui semnal de fluorescenţa apare primul,
are cea mai mare cantitate de ARNm la iniţierea reacţiei
A 2a probă ca abundenţă
Nr de cicluri de amplificare necesare obţinerii unei cantităţi suficente

de probă fluorescentă
Secvenţierea genică
Metodă de identificare a secvenţei de nucleotide într-

o genă sau fragment de ADN
- Utilă în identificarea mutaţiilor noi, necunoscute
anterior
- Metoda actuală se numeşte “Next generation
sequencing”
Secvenţierea genică
• Principiu: adăugarea de nucleotide

marcate cu fluorocromi (fiecare
nucleotidă A, T, C, G cu fluorocromul ei)
şi sintetizarea catenei complementare pe
baza unei secvenţe necunoscute.
Succesiunea culorilor fluorocromilor în
ADNul dc va oferi secvenţa iniţială
Interacţiunea specifică a nucleotidelor
• Pentru vizualizare, se marchează nucleotidele cu fluorocromi

•A- se leagă de T
•T se leagă de A
•C se leagă de G
•G- se leagă de C
Interacţiunea specifică a nucleotidelor
• ? ? ? ? ? ?
Nucleotide marcate fluorescent
Hibridizarea in situ
• Metodă prin care se detectează localizarea unei gene/secvenţe
ADN pe cromozomi
• Principiu:
• Se folosesc sonde (secvenţe scurte de ADN complementare
unei părţi din secvenţa ţintă) marcate fluorescent
Se folosește pentru diagnosticul unor modificări deja cunoscute
din literatură ca fiind asociate unor boli
FISH pe cromozomi in metafaza cu
sonde fluorescente specifice de locus
- Un marcaj fluorescent verde de
cromozom (în acest caz, cz 22)
- Un marcajroșu pentru secvenţa de
interes
Distribuţie normală presupune:
- Prezenţa a două marcaje de interes
(pentru fiecare alelă) asociate
sondei specifice cromozomului pe care
sunt localizate
Hibridizarea genomică comparativă (CGH)
Metodă prin care se pot detecta modificări la nivelul întregului
genom al unei probe ( de exemplu deleții, inserții de fragmente
cromozomiale) comparativ cu un control
Este o metodă care permite identificare de novo a unor defecte

cromozomiale
*CGH – comparative genomic hybridization

Manipularea materialului genetic în scop
terapeutic
• Există mai multe metode de modificare a genomului
unei celule și chiar a unui organism
• Introducerea de secvețe noi de ADN (transfecții, infecții)
• Editarea unei secvențe de ADN (exicizia sau înlocuirea
unui fragment)
• Aceste metode sunt folosite în special în cercetare,
dar încep să fie utilizate și în clinică
Transfecţii și infecții
• Introducerea în celulă de material genetic folosind plasmide
bacteriene (trasfecții) sau virusuri (infecții)
• Folosite în practica medicală pentru producerea proteinelor
recombinante utilizate în terapiile biologice (insulina,
eritropoietina)
• culturi bacteriene sunt transfectate cu plasmide conținând
gena proteinei de interes, iar bacteriile vor produce proteina
umană cu propriul aparat de sinteză și o vor elibera în
mediu, de unde va fi purificată ulterior
Editarea genică
• Metodă prin care se
elimină un fragment
de ADN dintr-o
celulă, cu ajutorul
unei nucleaze
ghidată la destinație
de o secvență
customizată de ARN
Created with BioRender.com

Editarea genică
• Metodă prin care se poate modifica o secvenţă ADN din genomul

celulei: eliminarea unei secvenţe, adăugarea alteia sau modificarea
punctiformă a unei secvenţe
• Principiu:
O enzimă, (Cas9) capabilă să taie ADN dc, va fi direcționată cu
ajutorul unei secvenţe complementare, către gena de interes.
Odată legată, ea va exciza gena de interes.
Celula va folosi propriile mecanisme şi enzime să repare defectul
(capetele libere care rezultă din tăiere)
Terapia genică
• Metodă de introducere a unor gene într-un organism, pentru
corectarea unui defect (o deleție sau suplimentarea unei gene
inactive)
• Folosește drept curier de livrare a genei virusuri care pătrund în
celulă și se inserează în genom
• Cel mai frecvent folosit este AAV - adeno-associated virus
Este încă la nivel experimental, deoarece nu se poate controla

locul de inserție al virusului în genom și distribuția lui la nivel
tisular (practic ajunge în tot organismul, nu doar în țesutul bolnav)
Exemplu de terapie genică
https://learn.genetics.utah.edu/content/genetherapy/success/
Metode de biologie moleculară
Metode de studiu al proteinelor
În lucrarea practică de azi vom învăța
• Noțiuni de bază referitoare la structura și

funcționarea proteinelor
• Să corelăm informațiile oferite de analiza genelor
cu impactul asupra proteinelor codificate de
acestea în contextul funcției lor biologice,
celulare
• Care sunt câteva dintre metodele de studiu al
proteinelor și ce fel de informații ne oferă ele
Metode de biologie moleculară pentru studiul
celulei
Reprezintă metode de cercetare fundamentală, care
investighează comportamentul celular în relaţie cu
expresia sau activarea uneia sau mai multor molecule
Noțiuni de bază în biologia proteinelor
• Celula se bazează în mare măsură pe proteine

pentru:
• efectuarea unor acțiuni (de ex: diviziune -
proteine de ciclu celular, migrare, trafic
intracelular - proteine motor)
• comunicare (de ex: receptori)
• metabolism (de ex: enzime).
Fenotipul celular în relație cu fenotipul
proteic
Fenotipul morfologic celular, pe care îl putem studia
la microscop, este o consecință a specializării
celulei.
Această specializare este susținută de fenotipul
proteic -combinația specifică de proteine produse
de o celulă.
de ex: marginea în perie a enterocitelor (celulelor din mucoasa
intestinului subțire) este o adaptare morfologică (formarea de
microvili) menită să acomodeze cât mai multe proteine
transmembranare transportor pentru nutrienți (aminoacizi,
monozaharide)
Corelație genotip-fenotip proteic
Toate celulele unui organism au, teoretic, același

material genetic, provenit de la ovocitul fecundat.
Conform dogmei biologiei celulare, informația

genetică este exprimată în ARNm care este tradus în
proteine.
Acest flux de informație poate fi pornit sau oprit

pentru o anumită genă, într-un anumit moment al
vieții celulei, prin împachetarea cromatinei sau
interferențe ARN
Corelație genotip-fenotip proteic
Într-un organism multicelular, unele celule au o

anumită combinație de gene active, spre deosebire
de altele, de unde și specializările lor diferite
Corelații genă-proteină
• Unele dintre modificările constatate în cazul

studierii proteinelor au la bază mutații genetice.
• Există și mutații genetice fără impact asupra

expresiei/funcției proteinei pe care o codifică
• Se poate ca atât mutația, cât și proteina

modificată să nu influențeze efectul biologic
Pentru a putea transfera în clinică un rezultat de

cercetare, trebuie urmărit efectul biologic!
• Proteinele sunt lanțuri de aminoacizi, organizați

structural pe mai multe planuri: secundar,
terțiar, cuaternar
• secundar: lanțuri α și pliuri β
• terțiar: mai multe structuri secundare sunt
conectate spațial în motive structurale, unite
prin regiuni de tranziție
• cuaternar: mai multe structuri terțiare sunt
asamblate in di-tri-...n-meri, eventual cu
grupări prostetice adapate funcței proteinei
Exemple de domenii și motive ale structurii terțiare:

buzunarul enzimatic, motiv de legare de ADN (factori
de transcriere)
Loop
https://www.nature.com/scitable/content/common-dna-binding-motifs-109024850
Buzunarul enzimatic (în centrul imaginii )are o zonă de acomodare a
substratului și o zonă catalitică, în imediata vecinătate
Primul domeniu implicat în formarea

buzunarului enzimatic este format din
mai multe alfa helixuri, unite prin
lanțuri oligopeptidice nestructurate
Al doilea domeniu este format din mai

multe alfa helixuri, care înconjoară o
structură de betapliu; în mijloc se
observă domeniul catalitic, ilustrat cu
https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00161
ajutorul unor sfere colorate
Motivul bazic de legare de ADN ”elice-buclă-elice” are două regiuni
structurate pe alfa elice: regiunea de dimerizare (mov) și regiunea de
legare de ADN (verde), formată predominant din aminoacizi bazici
https://www.nature.com/scitable/content/common-dna-binding-motifs-109024850
Aplicații clinice
Captoprilul a fost primul medicament obținut pe

baza informațiilor oferite și de structura 3D a unei
enzime (angiotensin convertaza)
• O clasă de enzime intens studiate în prezent,

datorită implicării lor în cancer sunt kinazele -
enzime caracterizate prin prezența unui buzunar
în care leagă ATP-ul pentru a-l folosi la fosforilarea
(adăugarea unei grupări fosfat) substratului
Aplicații clinice
• Blocarea acestui buzunar cu o moleculă sintetică

de dimensiuni foarte mici stă la baza unei noi
categorii de medicamente administrate în
diverse tipuri de cancere - inhibitori de kinaze
• de ex: vemurafenib pentru melanomul malign
• Efectele biologice induse de proteine au la bază:

• modificări ale structurii terțiare/cuaternare - de ex: flectarea
capului miozinei în contracția musculară,
închiderea/deschiderea unui canal ionic sau a unui buzunar
enzimatic, cu expunerea lui pentru substrat
• relocalizarea proteinei (de ex: translocarea GLUT din sistemul

endozomal la membrana celulară sub acțiunea semnalizării
insulinei)
• mici modificări posttranslaționale tranzitorii

• adăugare de grupări funcționale: fosfat (fosforilări), metil
(metilări), acetil (acetilări)
Studiul proteinelor în biologia celulară
Deoarece proteinele sunt responsabile de foarte multe

efecte biologice, ne interesează dacă:
• o proteină este prezentă/exprimată într-o
celulă/produs biologic (metode calitative)
• o proteină este supra/subexprimată față de normal
în condiții patologice (metode semi-/ cantitative)
• o proteină este activată în anumite condiții
• o proteină este localizată într-un anumit
compartiment celular, eventual co-localizată cu alte
proteine
• Metode de separare și purificare

• Metode de caracterizare a structurilor (primare,
terțiare, cuaternare)
• Metode de identificare
• bazate pe caracteristici fizico-chimice (masă, sarcină
electrică)
• bazate pe anticorpi (mai multe detalii în Lp -
Metode bazate pe anticorpi)
• Metode de studiu al efectului biologic (discutate în
Lp - Studiul celulelor vii, modele animale)
Aceste metode pot fi folosite pentru:

• izolarea/caracterizarea/identificarea/(semi)cuant
ificarea unei singure proteine (single protein
analysis)
• detectarea/(semi)cuantificarea unui set de
proteine (multiplexare, array)
• analiza compoziției proteice a unui produs
biologic (ser, lacrimi, fragment de tumoră,
cultură celulară) (proteomică)
Materia primă de lucru:
• soluţie de proteine (=lizate proteice), extrase din
celule cu detergenţi (pentru a asigura şi extracţia
proteinelor membranare),
• produse biologice
! Proteinele membranare, spre deosebire de cele

citosolice, au domenii hidrofobe care interacționează
cu bistratul lipidic al membranei. Prin urmare,
solubilitatea lor în soluții apoase e scăzută
Principii generale în studiul proteinelor
• Pentru a identifica, vizualiza și cuantifica proteinele
de interes ne bazăm pe:
• proprietăți fizico-chimice (sarcină electrică,
capacitate de ionizare, punct izoelectric -(pH -ul la
care o proteină are număr egal de sarcini electrice
pozitive și negative))
• interacțiuni specifice (enzimă-substrat, antigen-
anticorp)
! Proteinele sau fragmente peptidice umane sunt imunogene pentru

alte specii - pot genera anticorpi dacă sunt injectate la animale de
laborator
Metode de separare
• Electroforeza
• Cromatografia
Aplicații:
• separarea unor compuși dintr-un amestec pe baza
diferitelor caracteristici fizico-chimice (greutate,
sarcină electrică, solubilitate în solvenți)
• purificare pentru identificare viitoare
Cromatografia este o metodă frecvent folosită de (bio)chimiști. Noi
vom discuta în continuare doar despre electroforeze
Metode de separare - Electroforezele
Principiu - separarea, într-un gel cu ochiuri de diverse

mărimi sau în fază fluidă, folosind un câmp electric, a
proteinelor dintr-un amestec, pe baza proprietăților lor
fizico-chimice :
• greutate moleculară - electroforeza SDS-PAGE
(sodium dodecilsulfat în gel de poliacrilamidă),
• sarcini electrice - izofocusare (în gradient de pH),
electroforeza capilară (în fază lichidă)
Electroforeza SDS-PAGE
https://www.youtube.com/watch?v=eaETFKXtNRA
Vizualizarea rezultatului electroforezei SDS-PAGE
prin colorarea nespecifică a proteinelor
MW
standard
(kDa)
Fiecare linie albastră reprezintă
proteine oprite din migrare
acolo unde nu au mai putut
104 trece, datorită marimii lor, de
83
ochiurile gelului de
poliacrilamidă. Se poate estima
greutatea moleculară a
49 proteinei respective prin
raportare la un standard - un
amestec de proteine cu
37
greutate cunoscută (prima
29
banda din stânga)
20
Comparație electroforeză ADN/proteine
1, 6 - standard de mărime 1,8- - standard de greutate moleculară

2-5 - un produs de amplificare PCR 2,3 - o proteină purificată
4,5 - amestec de proteine de pește
6,7 -lizat de E. coli
https://bioprep.community.uaf.edu/the-basics-of-gel- http://www.bio-rad.com/en-uk/product/coomassie-
electrophoresis/ stains?ID=2ef88af8-1ca6-44ef-9702-3ebcfe0ad35b
Metode de caracterizare
Structurile terțiare și cuaternare ale proteinelor sunt

responsabile de funcția biologică.
Dincolo de structura primară (identificabilă prin
secvențiere proteică) interesează:
● identificarea organizării tridimensionale a
proteinei: cristalografia cu raze X, crio-
electronomicroscopia (crioEM)
● modificările de structura 3D care apar la activarea
proteinei/formarea de complexe (crioEM, AFM)
Cristalografia cu raze X
Principiu:
Metodă prin care modelul de împrăștiere a razelor X la
trecerea printr-o proteină cristalizată este folosit
pentru stabilirea aranjamentului tridimensional al
atomilor
Rezultatul primar este transformat cu ajutorul unor
softuri dedicate într-un model de structură terțiară
Cristalizarea se face în soluție, deci metoda este

aplicabilă doar proteinelor hidrosolubile (citosolice)
Modelul unei proteine obţinut prin
cristalografie cu raze X
www.dynamicdevices.com
Crioelectronomicroscopia
Principiu: metodă de microscopie electronică de

transmisie în care fluxul de electroni străbate o probă
necontrastată, înghețată foarte rapid la temperaturi
foarte joase (în azot lichid)
Se achiziționează imagini cu un număr mare de particule individuale

din probă (proteine purificate/virusuri) care sunt apoi suprapuse cu
ajutorul unui software pentru reducerea zgomotului de fundal si
creșterea contrastului. Pe baza imaginii îmbunătățite se poate
genera o reconstrucție 3D – model molecular.
Exemplu de imagine obținută prin crioEM
Imagine a unor
complexe proteice
purificate, dintre care
unele sunt surprinse
frontal (imagini
circulare) iar altele
lateral (imagini
dreptunghiulare)
http://life.nthu.edu.tw/~labcjw/BioPhyChem/EM/bbsem.htm
Crioelectronomicroscopia
• Aplicații: permite analiza structurii native a unor

proteine, care sunt prea mari pentru a fi
cristalizate eficient
• În plus față de de cristalografie, crioEM poate fi
utilizată pentru proteine membranare, complexe
proteice
https://www.youtube.com/watch?time_continue=8
7&v=m8QNXbW1ySI
Metode de identificare
Produsele biologice sunt, de regulă, amestecuri de

proteine în diverse concentrații.
• unele proteine sunt abundente (de ex: albumina
în plasmă) și ușor de detectat prin diverse
metode
• unele sunt extrem de puțin exprimate sau chiar
nedetectabile, dar această situație se poate
schimba în condiții patologice (de ex: producerea
de anticorpi specifici în infecții)- alegerea
metodei depinde de contextul biologic
Metode de identificare
• bazate pe anticorpi (western blot, multiplexarea,

array)
• bazate pe proprietăți fizice (masă și sarcină
electrică) - spectrometria de masă
Aceste metode au, de regulă și o componentă de

cuantificare, prin care se poate aprecia abundența
proteinei identificate în amestecul inițial
Spectrometria de masă
Principiu: transformarea ionilor din fază lichidă →

ioni în fază gazoasă, accelerarea si separarea
acestora în funcție de raportul masă/sarcină
electrică, detecția și înregistrarea spectrului
Este tehnologia de bază în proteomică, deoarece

permite identificarea unui număr foarte mare de
peptide/proteine dintr-un singur produs biologic
Un exemplu de rezultat de spectrometrie
de masă
m/z
Vârfurile reprezintă peptide caracterizate printr-o combinaţie unică masă/sarcină

Câteva domenii de aplicație ale
spectrometriei de masă
Clinic: profil proteic, analiza hemoglobinei, testare
toxicologică pentru depistarea unor droguri sau
intoxicaţie cu metale
Biotehnologia:
• caracterizarea purității unui compus - spectrul ar
trebui să indice prezența unui singur vârf de detecție
• evaluarea stabilității în timp a unui produs - o proteină
recombinantă instabilă sau care suferă proteoliză va
genera în timp un spectru cu mai multe vârfuri de
masă mai mică
Metode de cuantificare (măsurare)
• absolute - măsurate în unități ale SI

• relative - raportate la un control intern
Principii:
- reacție de culoare, măsurată prin
spectrofotometrie și raportată la o curbă
standard
- măsurarea intensității fluorescenței, raportată la
un control
Metode de cuantificare
În celulă există proteine constitutive, produse în

mod constant, fără a avea nevoie de semnale
externe, utile celulei pentru procese de bază,
derulate în condiții normale
• de ex: enzime ale metabolismului glucidic,
proteine ale citoscheletului (actina)
Aceste proteine pot fi folosite drept control al unei

determinări sau drept referință pentru metode
semicantitative

Biocel Curs + LP

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biocel Curs + LP

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Mircea Leabu i Marina T.

Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.1. Consideraii generale asupra membranelor

2.1.2. Repere istorice în cunoaterea organizrii membranei

cunotinelor despre natura (bio)chimic a membranei celulare a fost Charles

de baz a unei membrane este un bistrat lipidic cu proprieti fluide manifestate

Fig. 2.1. Biomembranele (membranele celulare i endomembranele) se evideniaz în imaginile

Membranele, organizate în mozaic fluid (Fig. 2.3), se caracterizeaz prin

În ceea ce urmeaz ne propunem s abordm organizarea molecular i

2.1.3. Compoziia chimic global a membranei celulare

2.2. Lipidele membranare

2.2.2. Definiia lipidelor membranare

Lipidele membranare reprezint o categorie larg de substane organice

2.2.3. Descrierea lipidelor membranare i caracterizarea

2.2.3.2. Clasificarea lipidelor membranare

Fig. 2.4. Structura schematic, de principiu, a unui fosfoglicerid. În

Echivalentul fosfatidilcolinelor pentru sfingofosfolipidele membranare sunt

Fig. 2.5. Structura unei fosfatidilcoline (1-stearil-2-oleil-fosfatidil-

Dup prime argumente referitoare la eterogenitatea lipidelor membranare,

nesaturai, cu catena hidrocarbonat neramificat. În ceea ce privete poziionarea

Aceast capacitate de micare a lipidelor în cadrul membranei determin

Dup cum vom vedea, fluiditatea membranelor este modulat i nuanat i

2.2.4. Rolul lipidelor membranare

Pentru exemplificarea efectelor celulare, datorate aciunii fosfolipazelor,

Fig. 2.8. Locurile specifice de aciune pentru diferitele tipuri

Fig. 2.9. Cascada fosfoinozitide-

Dei rolul colesterolului în procesele metabolice de la nivelul membranei a

2.3. Proteinele membranare

2.3.2. Clasificri ale proteinelor membranare

Fig. 2.10. Diversitatea de proteine membranare i exemplificarea clasificrilor acestora. 1 –

Pe de o parte, pentru unele ectoproteine a fost evideniat o cuplare prin

Proteinele integrale (Fig. 2.10, exemplele 5-7) reprezint, de regul, ~75%

În funcie de poziia fa de bistrat a captului amino al lanului polipeptidic,

2.3.3. Exemple de proteine membranare

funcia transportorului prin furnizarea anionului bicarbonat [13]. Au fost identificate

10 Atragem atenia c noiunea de citoschelet se utilizeaz i pentru organitul nedelimitat de endomembrane

Fig. 2. 12. Organizarea citoscheletului membranar, ca o reea dinamic de endoproteine cu

Revenind la metodologia electroforetic de studiere a proteinelor

Fig. 2.13. Investigare prin „western blot” a

Investigrile funcionale i de distribuire/redistribuire ale proteinelor

Fig. 2.14. Proteine membranare identificate prin imunofluo-

Fig. 1.15. Evidenieri prin microscopie de fluorescen a organizrii i reorganizrii unor

Din cele discutate pân aici rezult c proteinele contribuie la caracteristicile

Totui, în ciuda complexitii interaciunilor pe care proteinele membranare le

2.3.4. Mobilitatea proteinelor membranare

Alte dovezi au venit din observaiile asupra fenomenelor de “patching /

2.3.5. Rolul proteinelor membranare

CASETA 2.2. Integrinele i rolul lor. Integrinele sunt glicoproteine transmembranare,

integrale. Domeniile transmembranare au capacitatea de a suferi rearanjri

2.4. Componenta glucidic a membranei

2.4.1. Definiia glicocalixului i organizarea lui molecular

jos, prin ce se caracterizeaz glicoproteinele de tip mucinic, numite mai scurt

Prin enumerarea monozaharidelor ce particip la structurarea lanurilor

Dei proteoglicanii sunt mai slab reprezentai la nivelul membranelor celulare,

2.4.2. Metodologia de studiu a glicocalixului

Fig. 2. 17. Identificarea nespecific a glicocalixului de la suprafaa celulelor pe baza încrcrii

Lectinele12 sunt proteine sau glicoproteine ce leag specific structuri

ale uneltei de investigare. Glicoproteinele marcate cu trasorul electrono-opac se

Fig. 2.18. Caracterizarea glicoca-

Aadar, sperana în ceea ce privete rezolvarea problemei caracterizrii

2.4.3. Rolul glicocalixului

Procesele inflamatorii duc la eliberarea de stimuli care acioneaz asupra unor

(ii) Fertilizarea este procesul prin care spermatozoidul fuzioneaz cu

Fertilizarea se sfârete cu ceea ce se numete reacia cortical a ovocitului, care

2.1.2. Repere istorice în cunoaterea organizrii membranei

2.2.3. Descrierea lipidelor membranare i caracterizarea

Fig. 2.10. Diversitatea de proteine membranare i exemplificarea clasificrilor acestora. 1 –

În funcie de poziia fa de bistrat a captului amino al lanului polipeptidic,

10 Atragem atenia c noiunea de citoschelet se utilizeaz i pentru organitul nedelimitat de endomembrane

Fig. 2. 12. Organizarea citoscheletului membranar, ca o reea dinamic de endoproteine cu

Investigrile funcionale i de distribuire/redistribuire ale proteinelor

Fig. 1.15. Evidenieri prin microscopie de fluorescen a organizrii i reorganizrii unor

CASETA 2.2. Integrinele i rolul lor. Integrinele sunt glicoproteine transmembranare,

Fig. 2. 17. Identificarea nespecific a glicocalixului de la suprafaa celulelor pe baza încrcrii

Aadar, sperana în ceea ce privete rezolvarea problemei caracterizrii

2.5. Consideraii finale asupra organizrii mo-

veche înseamn activitate). Dup aceast nuanare a viziunii asupra

notat prescurtat cu NCX (de la Natrium-Calcium eXchanger), fiind identificai la

Trebuie menionat c activarea canalelor respect un mecanism ciclic. Acesta

Aceast trecere într-o stare refractar a canalelor ionice asigur meninerea

Jonciunea neuro-muscular, numit i sinaps neuro-muscular, reprezint

sugereaz importana lor pentru o aranjare tridimensional corect, funcional.

în care sunt organizate i tipul E de ATPaze (cu E de la „Extracellular ATP”), care

În încercarea de a înelege cum funcioneaz transportorii ABC s detaliem,

parte în cealalt a celulei epiteliale i eliminarea materialului transportat trans-