Obținerea unui preparat permanent: generalități, utilitate medicală practică și în cercetare,

recoltarea probelor pentru includerea în parafină; prelucrarea probelor pentru examinarea în

microscopia electronică; secționarea la gheață: indicații, avantaje.
Studiul structurii celulelor eucariote, de o deosebită complexitate morfo-funcțională, este
posibil de realizat doar într-o mică măsură cu microscopul fotonic deoarece are o putere de
rezoluție redusă.
Acest studiu necesită utilizarea unor tehnici speciale de citomorfologie, citochimie,
citoenzimologie etc., a căror atribut este conservarea integrității structurale în condiții cât mai
apropiate de cele existente în organismul viu.
Examinarea morfo-funcțională a celulelor se face pe preparate microscopice formate
din: secțiuni subțiri plane și transparente, de organe sau țesuturi, frotiuri sau amprente de organe,
așezate pe o lamă de sticlă sau portobiect cu dimensiuni standard de 76/26mm (L/l), 1,5-2mm
grosime, protejate de o lamelă de sticlă de formă pătrată sau dreptunghiulară de dimensiuni
variabile. Înainte de a fi folosite, atât lamele cât și lamele vor fi bine curățate și degresate.
Preparatele microscopice se clasifică în:
1. Preparate permanente care permit un studiu amănunțit al celulelor pe secțiuni fixate și
colorate; ele rezistă în timp și se pot realiza prin:
a. metoda secțiunilor fine;
b. metoda etalării materialului biologic în monostrat (frotiu, amprente de organe);
2. Preparate extemporanee, proaspete sau temporare

Realizarea unui preparat microscopic permanent prin metoda secțiunilor fine necesită o
anumită tehnică care se desfășoară în următoarele etape: recoltare, fixare, spălare, includere,
secționare, etalarea materialului biologic pe lamă, colorare, montare și etichetare.

SECȚIONAREA LA PARAFINĂ

1. RECOLTAREA PROBELOR TISULARE

Recoltarea include o serie de metode prin care se obțin mostre de țesut de diferite
consitențe (solide – os, mușchi, piele etc. sau fluide din cavități reale/virtuale – pleură, pericard,
peritoneu) în vederea investigării lor morfologice. Există numeroase metode de recoltare a
produsului biologic, clasificate în:
a. Metode invazive – pentru țesuturi care nu pot fi accesibile în mod direct, sau la care nu se
poate ajunge prin intermediul unor orificii naturale;
b. Metode minim invazive – pentru țesuturi superficiale, țesuturi care pot fi accesate prin
intermediul unor orificii naturale sau tehnici care nu necesită o altă formă de anestezie
decât cea locală, pentru țesuturi accesibile prin puncționare percutanată;
Exemple de metode de recoltare a țesuturilor:
- Biopsia excizională – se adresează unor leziuni accesibile direct sau indirect, îndepărtate
complet, în cadrul unei intervenții chirurgicale.
- Biopsia incizională – se adresează unor leziuni care nu sunt îndepărtate complet ci numai
explorate chirurgical după reguli precise. Chirurgul prelevă probe bioptice din diferite regiuni de
interes ale regiunii investigate.
- Biopsia de raclare – în special pentru leziuni cutanate.
Aceste tipuri de biopsii chirurgicale sunt considerate a fi invazive, oferă siguranța unui
diagnostic în aproape 100% din cazuri, fiind considerate „standardul de aur”. De asemeni petru
tumorile mici, biopsiile excizionale pot chiar curative dacă fragmentul de țesut prezină margini
de rezecție negative histopatologic. Dezavantajul îl reprezintă faptul că necesită incizii mai mult
sau mai puțin extinse ce pot lăsa cicatrici tegumentare, recuperarea durează mai mult decât în
cazul puncțiilor percutanate și au un risc mai mare de complicații.
- puncția/biopsia aspirativă cu ac fin – utilizată în principiu pentru formațiuni chistice, cu
indicații reduse pentru tumori solide, datorită celularității reduse a materialului recoltat, ce uneori
face dificilă diferențierea între o leziune malignă in situ și una invazivă. În schimb este rapidă,
facilă, cu un cost redus și este cea mai puțin invazivă.
- puncția/biopsia cu ac gros – este utilizat un ac de puncție mai gros, special, prevăzut cu un
sistem de tăiere obținându-se un cilindru de țesut suficient pentru a diferenția un țesut invaziv de
unul neinvaziv; este folosită pentru formațiuni solide.
Având în vedere că se recoltează doar fragmente de țesut, nu toată formațiunea, există
posibilitatea ca fragmentul de țesut recoltat astfel să nu conțină celule tumorale, deci, nu avem o
garanție absolută în caz de negativitate a probei.
* După recoltare, țesutul este spălat cu PBS (tampon fosfat salin) pentru îndepărtarea sângelui sau
a altor secreții și ulterior, cu ajutorul unei lame se taie fragmente de țesut de dimeniuni de
aproximativ 10/10/3mm (3mm grosimea maximă).

2. FIXAREA
Fixarea este un timp obligatoriu în realizarea preparatelor permanente și are drept scop
principali conservarea (imobilizarea) constituienților celulari într-o stare cât mai apropiată de
starea vie și de pregărirea lor în vederea manevrelor ulterioare (includere, colorare). Aceasta
depinde în primul rând de proteine, principalii constituienți ai materiei vii, ceea ce înseamnă că
un bun fixator histologic trebuie să fie în primul rând un fixator al proteinelor.
Mecanismul intim al fixării proteinelor nu este perfect cunoscut. Se cunoaște însă faptul
că fixatorii histologici determină o coagulare sau o insolubilizare a proteinelor și în majoritatea
cazurilor, un anumit grad de polimerizare a acestor elemente organice. De exemplu,
formaldehida, element principal al fixatorilor uzuali se combină cu numeroase grupări
funcționale ale moleculelor proteice, formează legături între moleculele învecinate și constituie
astfel edificii macromoleculare insolubile.
O altă consecință importantă a acestei coagulări a proteinelor este blocajul reacțiilor
enzimatice pe care le antrenează, împiedicând astfel distrugerea autolitică a țesuturilor.
Fixarea trebuie privită în funcție de:
 gradul conservării morfologice pe care dorim să-l obținem: fixarea se realizează în mod
diferit pentru microscopia electronică (unde trebuie păstrate relațiile dintre constituienții
chimici ai celulei la scară moleculară, ceea ce nu este indispensabil în același grad pentru
MF) față de cea fotonică;
 de natura constituienților chimici ce trebuie conservați: în cazul unor constituienți
macromoleculari ca proteinele care sunt ușor de fixat comparativ cu alți constituienți
(oligozaharidele de exemplu), care sunt labili și dificil de fixat;
 de volumul fragmentelor tisulare ce trebuie conservate: fixarea unui frotiu de sânge este
diferită comparativ cu cea a fixării unui organ de șoarece sau a unui organ uman, aceasta
depinzând de viteza de pătrundere a fixatorului;
 de tipul reacțiilor de culoare sau histochimice pe care le efectuăm: nu vom fixa în același fel
când vom folosi o colorație simplă „topografică” sau vom încerca decelarea lipidelor sau
enzimelor.
Un bun fixator citologic trebuie să întrunească următoarele calități:
- să pătrundă rapid în țesut;
- să producă o retracție cât mai mică a pieselor evitând modificarea taliei, formei și a raporturilor
dintre celule;
- să permită o bună includere;
- să permită o bună colorare a structurilor a căror evidențiere se dorește.
Reguli generale ale fixării:
- evitarea alterărilor autolitice – fixarea trebuie făcută cât mai repede posibil după recoltarea
materialului biologic;
- spălarea fragmentelor – cu o soluție fiziologică, nu în apă care poate provoca umflarea
țesuturilor;
- evitarea uscării țesuturilor – făcând toate manevrele ce preced fixarea într-un mediu umed
(acoperind fragmentele cu o soluție fiziologică, umectând lamele cu care se secționează sau alt
instrumentar folosit cu același tip de soluție);
- tăierea unor fragmente suficient de mici;
- facilitarea la maximum a penetrării fixatorului – se vor utiliza flacoane mari cu fundul plat și
dop rodat; nu se va lăsa sânge sau mucus la suprafeței piesei; se evită ca acestea să se lipească de
pereții recipientului în care se face fixarea, agitând din timp în timp flaconul;
- utilizarea unui volum suficient de fixator. În afara unor cazuri particulare, volumul fixatorului
trebuie să fie de aproximativ 40-50 ori mai mare decât a fragmentului fixat;
- piesele se introduc în amestecul fixator ambalate în tifon și purtând un număr de ordine pentru
identificare;
- durata fixării variază în funcție de compoziția amestecului fixator, structura și dimensiunea
pieselor, temperatură – existând o durată optimă pentru fixare;
- un fixator utilizat odată nu poate fi folosit pentru fixarea altei piese.
Factori care pot afecta fixarea
 pH-ul trebuie menținut în limite fiziologice, cu valori între 4-9. Pentru conservarea
ultrastructurii probelor, soluțile fixatoare utilizate trebuie tamponate la un pH de 7,2-7,4.
 osmolaritatea: soluțiile de fixare hipertone determină ratatinearea celulară. Soluțiile hipotone
pot determina edem celular și o slabă fixare.
 dimensiunea probei – trebuie să aibă o grosime de cca. 1-4 mm.
 volumul fixatorului – să fie de cel puțin 15-20 ori mai mare decât cel al țesutului.
 temperatura – creșterea temperaturii crește viteza de fixare. Sunt necesare precauții pentru a
evita coagularea proteinelor prin fierbere. De obicei, fixarea se face la temperatura
laboratorului.
 durata fixării: ca și regulă generală, fixarea se realizează cu viteza de 1mm pe oră. Timpul
necesar fixării variază dar nu poate fi nelimitat. Pentru formalină 10%, în funcție de volumul
tisular, avem următoarele limite:
- 12-24h (piese mici cu dimensiuni de 10X10X3mm) cu o conservare bună a
constituienților citoplasmatici și a detaliilor nucleare. Fixarea este completă la 24h dar
reacțiile de cuplare încrucișată a proteinelor continuă pentru cel puțin 2 săptămâni.
- 2-6 săptămâni pentru piesele mari, de consistență moale (ex. creier uman integral);
acestea capătă o consistență suficientă pentru a fi secționate în vederea prelevării unor
fragmente cu utilitate histologică.
* Fixarea este un proces chimic care necesită un timp anume pentru a putea fi completă. Atât
suprafixarea cât și subfixarea pot fi responsabile de eșecul realizării probelor histologice.

TIPURI DE FIXATORI
Fixarea se realizează prin:

1. Agenți fizici
2. Agenți chimici
Prin definiție, agenții fixatori au capacitatea de a modifica organizarea fizico-chimică a
componentelor celulare din țesuturi. Fixatorii acționează nu numai asupra unor componente
celulare (proteine și acizi nucleici) ci și asupra macromoleculelor de la suprafața celulelor sau din
spațiile extracelulare. În mediul extracelular, fixatorii acționează asupra glicoproteinelor și
proteoglicanilor. Celulele vii prezintă plasmaleme impermeabile pentru macromolecule hidrofile.
Fixarea în agenți organici care dizolvă sau distrug lipidele membranar, permite moleculelor mari
să pătrundă în celulă sau să scape din aceasta. Citoplasma devine și ea permeabilă pentru
anumite macrocromolecule, formând o rețea proteică suficient de poroasă pentru pătrunderea
moleculelor de mari dimensiuni. Astfel de structuri includ amestecul de parafină cu ceară,
anticorpi utilizați în imunomarcare sau coloranți cu moleculă mare. Gradul de porozitate obținut
depinde de fixator utilizat. Agenții fixatori coagulanți, precum clorura de mercur, acidul picric,
suflatul de zinc determină apariția de pori de dimensiuni mai mari decât agenții necoagulanți
(formaldehida, glioxal sau glutaraldehida). Unii fixatori au proprietăți mixte, coagulante și non-
coagulante. De exemplu acidul acetic coagulează cromatina nucleară dar nu și proteinele.

Fixarea prin agenți fizici

Aici se încadrează metodele ce folosesc căldura, desicarea la temperaturi scăzute
(congelare-desicare sau criodesicare), desicarea la temperatura laboratorului, metodele ce
presupun răcirea preparatului urmată de acțiunea unui fixator lichid (congelare-substituție),
răcirea nereprezentând un procedeu de fixare, ea având ca efect oprirea proceselor de autoliză;
această oprire a modificărilor postmortem încetează însă odată cu revenirea la temperatura
laboratorului, ceea ce face imperios necesară completarea cu o fixare în adevăratul sens al
cuvântului.
Fixarea prin desicare la temperatura laboratorului
Desicarea rapidă la temperatura laboratorului este folosită pentru pregătirea frotiului de
sânge destinat colorării cu metodele hematologiei morfologice. Ea poate fi aplicată și pentru
frotiuri de măduvă osoasă și amprente de organe. În afara acestor situații particulare, indicațiile
sale sunt destul de limitate, nefiind vorba de o veritabilă fixare. Denaturarea proteinelor obținută
astfel nu merge până la pierderea solubilității lor în apă, astfel că desicarea trebuie totdeauna
completată în momentul colorării frotiurilor prin acțiunea unui alt fixator (ex. alcool metilic ce se
folosește ca solvent pentru eozinatul de albastru de metilen din compoziția colorantului May-
Grumwald).
Fixarea prin desicare la temperatură scăzută
Congelarea-desicarea sau criodesicarea nu este o fixare în sensul propriu al termenului
pentru că ea nu determină denaturarea proteinelor tisulare. Principiul ei este foarte simplu,
bazându-se pe eliminarea prin sublimare a apei conținute în piese, răcire la o temperatură
inferioară de 0° și plasarea într-o incintă unde presiunea este inferioară valorii de 4,6mmHg. Din
punct de vedere tehnic această metodă are 3 etape:
- congelarea piesei care are drept scop principal oprirea rapidă a tuturor reacțiilor vitale,
ceea ce se poate obține prin folosirea unei temperaturi de -50°-70°; la această temperatură se
obține oprirea reală a tuturor reacțiilor enzimatice ce s-ar putea derula în interiorul țesuturilor.
Este etapa crucială a acestei metode; eventuale defecțiuni pot duce la artefacte grosiere ce ar face
piesa recoltată inutilizabilă.
- desicarea sub vid – sublimarea apei ce are drept scop eliminarea apei, prezentă în mare
parte sub formă de cristale de gheață conținue în interstițiile țesuturilor.
- tratamentul ulterior al piesei – o dată deshidratat, țesutul nu prezintă la examenul
microscopic nicio retracție comparativ cu starea proaspătă, proteinele tisulare sunt deci dar nu
denaturate. Urmează apoi impregnarea și includerea la parafină.
Indicații și contraindicații: În cazul utilizării acestei tehnici, este nevoie de utilizarea unor
fragmente foarte mici de țesut. Există riscul compromiterii structurilor datorită formării în
momentul congelării a unor cristale de gheață de talie superioară puterii de separare a
microscopului fotonic. De asemeni, anumite țesuturi (ficat, pancreas, tegument) sunt bine
conservate prin această metodă, în timp ce altele (rinichi, intestin) se conservă satisfăcător,
conservarea devine necorespunzătoare în cazul testicolului, țesutul nervos, măduvei osoase și
ganglionilor limfatici. Deși din punct de vedere morfologic rezultatele criodesicării pot rivaliza
uneori cu cele obținute folosind fixarea prin agenți chimici, exigențele sale materiale sunt prea
mari, costurile fiind mult mai mari decât cele ale fixării pe cale chimică. Această metodă trebuie
rezervată numai unor cazuri bine definite, în afara cărăra ea nu prezintă nicio superioaritate
raportat la alte procedee mai rapide, mai puțin minuțioase și mai ieftine.

Fixarea prin congelare-substituție

Principiul acestei metode este apropiat de cel al criodesicării și avantajele sunt
asemănătoare. Primul timp al aceste metode este similar criodesicării: piesele foarte mici sunt
congelate cu aceleași precauții dar deshidratarea se face transferând fragmentele în etanol, eter
sau glicol răcit la o temperatură cuprinsă între -20° și -50°. Din punct de vedere practic, această
metodă este mult mai simplă în raport cu criodesicarea. Fără a oferi garanțiile teoretice ale
criodesicării, metoda congelării-substituție permite obținerea unor preparate bune din punct de
vedere morfologic.
Fixarea prin agenți chimici
Clasificarea fixatorilor chimici în funcție de mecanismul de acțiune:
1. Fixatori coagulanți (alcooli, acid clorhidric, acid cromic) utilizați mai ales pentru
preparatele care vor fi examinate în microscopia foronică, deoarece precipită (coagulează)
și denaturează proteinele care nu sunt în mod natural vizibile în microscopia fotonică. Nu
sunt utilizabili pentru microscopia electronică.
Exemple: alcooli, inclusiv alool metilic și etilic, care vor denatura proteinele și nu sunt utilizați de
rutină pentru fixarea tisulară deoarece determină friabilizarea acestora. Sunt însă buni fixatori
pentru frotiuri, deoarece au o acțiune rapidă și determină p evidențiere bună a detaliilor nucleare.
2. Fixatori non-coagulanți - formează punți intra și intermoleculare determinând o tranziție
de fază a citoplasmei de la starea lichidă la starea de gel transparent și pentru electroni. Aceste
tipuri de fixatori includ formaldehida, formalina și glutaraldehida. Cel mai utilizat fixator este
reprezentat de o soluție apoasă 4% de formaldehidă, numită adesea și formalină 10%. De obicei
această soluție este neutralizată cu săruri anorganice.
Glutaraldehida induce deformarea structurii α-helicale a proteinelor și este foarte utilă
pentru preparatele de microscopie electronică. Penetrarea țesutului este destul de slabă, de aceea
piesele trebuie să fie de mici dimensiuni, dar determină o bună fixare citoplasmatică globală și
detalii nucleare de calitate. Soluția standard este cea de glutaraldehidă tamponată 2%.
Agenții oxindanți includ permanganații (parmanganat de potasiu), dicromații și
tetraoxidul de osmiu. Realizează legarea încrucișată a proteinelor dar și o denaturare extensivă a
acestora. Unii dintre acești fixatori sunt supraspecifici pe anumite aplicații (ex. tetraoxidul de
osmiu – în microscopia electronică; este cel mai bun fixator chimic simplu, însă este scump și
foarte toxic).

3. SPĂLAREA
- De obiceo se realizează în apă curentă
- Nu se aplică pentru țesuturi fixate care rămân deshidratate și nici pentru frotiuri

4. INCLUDEREA ÎN PARAFINĂ

Scopul acestei etape este de a îndepărta apa din țesutul fixat și spălat și de a o înlocui cu
un mediu care se solidifică la temperatura camerei și care permite realizarea unor secțiuni fine, cu
grosimea de 3-15µm. Cel mai folosit mediu pentru procesarea tisulară este parafina, un amestec
de hidrocarburi alifatice, nemiscibil cu apa dar solubil în solvenți organici.
Țesuturile biologice trebuie incluse într-o matrice dură care permite realizarea unor
secțiuni destul de fine:
- 3-5µm grosime pentru microscopia fotonică
- 80-100nm grosime pentru microscopia electronică
Pentru microscopia fotonică, mediul uzual este parafina îmbunătățită cu ceară de albie.
Deoarece parafina este nemiscibilă cu apa, aceasta din urmă trebuie extrasă în cadrul unui proces
de deshidratare. Probele sunt transferate ulterior prin băi succesive de solvent organic (de
exemplu xilol) în scopul îndepărtării alcoolului și apoi prin băi succesive de parafină topită
(agentul uzual de includere), care va înlocui xilenul în structura intimă a țesutului.
Includerea în parafină cuprinde 4 etapte: deshidratarea, îndepărtarea alcoolului,
clarificarea, impregnarea și includerea.
Deshidratarea: se face utilizând băi succesive de alcool, în concetrații crescătoare de la
50%,70%,90% și 3 băi în alcool absolut, toate a câte 15 minute.
Îndepărtarea alcoolului – se face prin 3 băi de acetonă, a câte 5 minute fiecare.
Clarificarea – 3 băi de xilol, a câte 15 minute fiecare.
Impregnarea și includerea – se utilizează 3 băi de parafină topită, a câte 15 minute fiecare.
Ulterior pentru includere, fragmentele de țesut sunt amplasate în forme în care se toarnă și
parafina topită, care apoi se solidifică la temperatura camerei. La parafina topită se adaugă ceară
de albine care crește densitatea amestecului de includere. Dacă se lucrează pe un sistem de
distribuție a parafinei, aceasta posedă o placă de răcire pe care parafina din formă se poate întări
mult mai repede. Odată incluse, fragmentele de țesut pot fi conservate în blocuri de parafină pe
termen nedefinit.
Parafina este mediul de includere cel mai frecvent utilizat dar, există și alte medii și
tehnici de includere: în paraplast, celoidină, dublă includere în celoidină și parafină, în dietilen
sau polietilenglicol sau în gelatină.
5. SECȚIONAREA LA MICROTOM
Microtomul este un instrument de secționare care este utilizat pentru realizarea secțiunilor
fine din blocurile de țesut incluse în parafină. Înainte secționării propriu-zise, blocul de parafină
ce conține preparatul, se va modela în formă de trunchi de piramidă patru unghiulară astfel încât
în jurul piesei să rămână o bandă de parafină de 1-2mm grosime. Astfel finisat el se fixează,
indiferent de mediul de includere folosit, cu baza mare pe un port-obiect care se montează la
microtom.

6. ETALAREA ȘI LIPIREA SECȚIUNILOR PE LAMĂ

În vederea prelucrării lor ulterioare (colorate), secțiunile trebuie aplicate pe un port-obiect
(lama de sticlă) bine degresat. Pentru secțiunile la parafină, panglicile de parafină obținute prin
secționarea la microtom sunt plisate și trebuie etalate pe un mediu lichid, slab încălzit, pentru ca
pliurile să dispară.
Pentru aceasta se pot utiliza 2 procedee: etalarea la bain-marie și etalarea pe lamă (cel
mai utilizat, motiv pentru care o vom și descrie). Lama de sticlă este acoperită cu o picătură de
soluție apoasă de gelatină sau albumină Mayer, din panglica de parafină se taie fragmente ce
conțin 3-4 secțiuni și se aplică (cu fața lucioasă) în jos, pe suprafața unsă cu albumină Mayer a
lamei; se picură apă distilată la una din extremitățile panglicii de parafină pentru ca secțiunile să
plutească și se așează orizontal pe o placă încălzită la o temperatură inferioară celei punctului de
topire al parafinei folosite la includere. După întinderea completă a secțiunilor, apa în exces se
îndepărtează iar lamele puse înclinat într-un stativ, se introduc în termostat la 37° timp de 24h.

PRELUCRAREA PROBELOR PENTRU EXAMINAREA ÎN MICROSCOPIA

ELECTRONICĂ
Tipuri de informații care se pot obține prin microscopia elecronică
- ultrastructura diferitelor tipuri de celule şi a componentelor acestora în stare
normală şi patologică

1. PRELEVAREA PROBELOR
Pentru a preveni schimbările de orice natură care pot apare la nivel tisular sau celular
chiar din momentul prelevării, recoltarea trebuie să se facă rapid. Deoarece piesele trebuie să
fie de mici dimensiuni 0,5x0,5x0,5 mm, tăierea acestora se realizează sub o lupă binoculară.
Fragmentele sunt preluate cu o pensă și introduse în fixator răcit la 4°C.
Alternativ, fragmentele de material biologic obţinute prin puncţii sau biopsii, sau
fragmentele mici din ţesuturile şi organele recoltate imediat după sacrificarea animalului de
experienţă sunt puse pe faţa fără emulsie de azotat de argint a unei hârtii fotografice. Peste
aceste fragmente se pun 2-3 picături din lichidul fixator (4°C) pentru a opri pe cât posibil
acţiunea distructivă a enzimelor celulare.
Cu ajutorul a două lame de ras noi, bine degresate, prin mişcări de translaţie se
confecţionează cubuleţe cu latura de maxim 1mm.

Cu o scobitoare se ridică fragmentele şi se introduc într-un flacon cu fixator răcit la +4°C.

 2. FIXAREA
Metode fizice - au la bază folosirea temperaturilor foarte scăzute, deshidratarea inertă şi
metoda de substituţie prin îngheţare.
Metode chimice: o soluţie fixatoare este formată din: a) soluţia tampon; b) agentul fixator
a). Soluția tampon se alege în funcție de compatibilitatea cu agenții fixatori
tampon cacodilat (compatibil cu toţi agenţii fixatori)
tampon fosfat (compatibil cu toţi agenţii fixatori, incompatibil cu ionii de calciu şi uranil)
tampon veronal (este incompatibil cu aldehide fixatoare)
b). Agenţii fixatori:
anorganici (oxizi - OsO4, săruri-permanganat de potasiu şi bicromatul de potasiu);
organici (aldehidele-formaldehidele, glutaraldehida, acroleina, acizi-acidul tanic şi unele
catechine). În practica curentă se foloseşte o dublă fixare:
- prefixare cu glutaraldehida tamponată;
postfixare cu tetraoxid de osmiu tamponat;
Tehnica de lucru.
Fragmentele prelevate şi fasonate sunt introduse cu ajutorul unei scobitori într-un
flaconaş în care se găseşte glutaraldehidă tamponată (+4°C) în care vor sta 1 oră la frigider;
flaconul se acoperă cu un dop (glutaraldehida este toxică) pe care se notează numărul de
ordine.
 Fixatorul se varsă într-o sticlă cu dop rodat iar fragmentele rămase pe pereţii
flaconului se spală de trei ori a câte 1 oră cu tampon fosfat 0,15 M la temperatura de 4°C.
După a treia spălare fragmentele sunt post-fixate în acelaşi flacon cu fixatorul Milloning
timp de 1 oră şi la +4°C.
Fixatorul Milloning conține:
- tetraoxidul de osmiu...................................1g
- tampon fosfat, 0,15 M.................................100ml

3. SPĂLAREA PIESELOR
După fixare, urmează obligatoriu spălarea pieselor. Piesele se spală timp de 5-20 min
sau chiar peste noapte cu aceeaşi soluţie tampon care a intrat în compoziția fixatorului.

4. DESHIDRATAREA PREPARATELOR
Prin deshidratarea preparatelor se urmăreşte eliminarea apei din ţesuturile fixate pe
cale chimică sau fizică fără a produce modificări in structura moleculară nativă a celulelor
din ţesuturi.
Alegerea solventului pentru deshidratare este în funcţie de materialul de includere, acesta
trebuie să fie miscibil cu agentul de deshidratare. În cazul folosirii vestopalului ca material
de includere se foloseşte acetona iar în cazul eponului, alcoolul etilic şi propilenoxidul.
 5. INCLUDEREA
Cele mai utilizate medii de includere fac parte din grupa răşinilor poliesterice
(vestopal) a răşinilor epoxidice (epon 812, epon 562, araldita) şi mediile de includere
hidrofile (durcopanul, hidroxipropilmetacrilatul) care prezintă avantajul că evită
deshidratarea şi conservă lichidele şi enzimele din celulă. Includerea se face în capsule de
gelatină sau polietilenă.

Tehnica includerii în Epon 812:

În compoziţia mediului de includere intră următoarele substanţe:

Amestecul A + Amestecul B + Accelerator DMP - 2
Epon 812 + DDSA Epon 812+MNA
5 ml 5 ml 0,15 ml
unde DDSA = anhidrida dodecil–succinică; MNA = anhidrida metilanadică
Piesele din materialul biologic se introduc în capsule de gelatină, în eponul de lucru,
în nişă, la temperatura laboratorului.
Adăugarea eponului de lucru, pentru includere, în capsulele de gelatină

Se adaugă inițial numai 1 picatură de epon

Piesele sunt preluate din mediul de impregnare, tot cu o scobitoare, apoi sunt trecute în capsulele
de gelatină care conțin deja 1 picătură epon.

În fiecare capsulă de gelatină se introduce un număr de identificare scris numai cu creion negru

Se completează cu epon până la umplerea capsulelor

 6. SECŢIONAREA
Preparatele biologice fixate şi incluse în diferite medii de includere sunt supuse unor
operaţii de secţionare prin tehnici speciale, cu ajutorul unor aparate speciale numite
ultramicrotoame, pentru a realiza secţiuni ultrafine, a căror grosime nu depăşeşte 1000 Â şi
care vor fi uşor traversate de fasciculul de electroni.

Fasonarea blocurilor
Înainte de a le supune procesului de secţionare, blocurile cu preparate biologice
trebuie fasonate.
Prin acesta operaţie o anumită zonă din preparat capătă aspect de piramidă. Dacă la includere
s-au folosit capsule de polietilenă, atunci blocul apare aproape gata fasonat în această formă.
Operaţia de fasonare a blocurilor se face manual după îndepărtarea capsulei de gelatină, sub
o lupă binoculară, cu ajutorul unei lame de ras noi, după fixarea blocului într-un portbloc.
 Se confecţionează un trunchi de piramidă, al cărui vârf trunchiat ce conţine piesa,
trebuie să aibă forma unui pătrat cu latura de 0,1-0,2 mm.

Fasonarea blocului se poate face cu ajutorul ultramicrotomului şi cu cuţite de sticlă.

 Secţionarea propriu-zisă şi colectarea secţiunilor
Secționarea se face cu ajutorul unui ultramicrotom

Ultramicrotomul folosește cuțite de sticlă sau de diamant

Vizual, grosimea secţiunilor se poate aprecia prin reflexia în băiţă pe suprafaţa apei, culoarea
secţiunilor în lumină reflectată fiind în funcţie de grosimea acestora (Peachey 1958, Zelander
şi Ekholm 1960).
Secţiunile semifine se fac cu ajutorul ultramicrotomului prin folosirea avansului manual (cu
o grosime de 1500-3200 Â) cu scopul de a verifica dacă blocul respectiv conţine elementele
pe care ni le-am propus să le examinăm.
După colorare se analizează la microscopul fotonic. Pentru colorarea secţiunilor semifine
există mai multe metode: colorarea cu albastru de toluidină. Colorarea se face aplicând pe
lamă 2-3 picături din soluţia de albastru de toluidină; lamele se pun în termostat la 60 grade
C timp de 10-30 min. apoi se spală în apă curgătoare apoi în acetonă 100%, se trec rapid prin
xilol, se sugativează, se montează şi se examinează la microscopul fotonic.
Secţiunile ultrafine rezultate în urma secţionării urmează să fie depuse pe un portobiect care
în microscopia electronică este o grilă metalică.

7. APLICAREA SECŢIUNILOR ULTRAFINE PE GRILE

În prezent există o gamă variată de suporturi pentru preparate (grile şi discuri),
confecţionate pe cale electrolitică din cupru, nichel, oţel inox, argint, aur, platină, molibden
sau tungsten. Grilele electrolitice sunt de mai multe feluri: a) standard; b) de identificare; c)
duble.
Pentru ca grilele să devină un bun suport pentru preparat, se acoperă cu pelicule
organice sau anorganice fine, transparente la fasciculul de electroni a căror grosime nu
trebuie să depăşească 200 Â.
Grilele cu preparatul în sus se plasează într-o cutie Petri pe fundul căreia se află hârtie
de filtru şi pe care se notează numărul preparatului din registrul de evidenţă.
Contrastarea preparatelor biologice
Pentru mărirea contrastului biomoleculelor, al virusurilor, al diferitelor
microorganisme şi al secţiunilor de ţesuturi, se recurge în practică la o serie de metode de
contrastare, cele mai utilizate fiind: colorarea pozitivă, colorarea negativă şi umbrirea sau
metalizarea.
Colorarea pozitivă are la bază interacţiunea chimică dintre structurile biologice şi un
colorant format din săruri ale unor metale grele.
Contrastarea cu acetat de uranil
Un număr de godeuri făcute pe o placă de plexiglas se umplu cu o soluţie de acetat
de uranil 13%, utilizând o pipetă cu pară de cauciuc.
Faţa cu secţiuni ale grilelor se aplică pe suprafaţa soluţiei din godeuri lăsându-le în
contact 10 min, la întuneric. Cu ajutorul unei pense foarte fine se iau grilele de pe suprafaţa
picăturilor de acetat de uranil pe care plutesc şi se spală trecându-le prin 3 băi cu alcool etilic
50%.
Contrastarea cu citrat de plumb (soluţia Reynolds) se execută în al doilea timp.
Pe o placă de parafină curată se pune un număr de picături din soluţia Reynolds (nitrat de
plumb + citrat de sodiu + apă distilată), corespunzător numărului de probe de colorat.
Peste aceste picături se aplică grilele cu preparatul în jos şi se ţin 3 min după care se spală cu
apă distilată.
Procedeu complet:
Recoltare
Fixarea în G. A.tamponată
Spălarea în tampon fosfat
Postfixare în OSO3 tamponat
Spălare în tampon fosfat
Deshidratare cu:
alcool 30% ........................................................10 min.
alcool 50% ........................................................10 min.
alcool 70% ........................................................10 min.
alcool 90% ........................................................10 min.
alcool 100% (2 băi) ................................ 20min. fiecare
acetonă 100% (2 băi) ................................20min. fiecare
(acesta ultimă etapă nu este obligatorie, dar se recomandă pentru o mai bună impregnare)
Impregnare
acetonă 100% + epon de lucru.......................1 oră
epon de lucru.....................................1 oră
Includere: piesele din materialul biologic se introduc în capsule gelatină în eponul de
lucru, în nişă, la temperatura laboratorului.
Polimerizarea eponului la termostat, la 60°C.
Ţesuturile se pun în capsule de gelatină cu amestec de Epon proaspăt preparat. Se lasă până
când piesele cad la fundul capsulelor şi apoi polimerizarea are loc la 60°C peste noapte.

Microscopia crioelectronică (Cryo-EM)

În anii 1960, oamenii de știință s-au confruntat cu problema metodelor de determinare a
structurii folosind microscopia electronică care dăunează probei din cauza fasciculelor de
electroni cu energie mare, astfel încât microscopia electronică criogenică a fost considerată să
depășească această problemă, deoarece era de așteptat ca temperaturile scăzute să reducă
deteriorarea fasciculului.
Secțiunile subțiri montate pe film de carbon s-au dovedit a fi de la 30 la 300 de ori mai
rezistente la fasciculul de electroni la 4 K decât la temperatura camerei.
Eșantionul trebuie congelat extrem de rapid, obținându-se fixarea într-o stare vitroasă
( starea vitoasă a apei înghetate nu prezintă structura cristalină). Dacă înghețarea se produce prea
încet sau la temperaturi de peste -137 ° C, temperatura la care apa se devitrifiază, se formează
gheață cristalină. De asemeni, încălzirea eșantionului mai mult de ~ - 160 ° C va produce o
gheață de o calitate scăzuta cu risc mare de a se forma cristale de gheață care ar compromite
integritatea structurală și degradează, de asemenea, calitatea imaginii . În acest caz electronii
suferind fenomenul de difractie.
Secționarea poate fi efectuată în condiții criogenice, ceea ce oferă cea mai bună
conservare a probei. Această tehnică, cunoscută sub denumirea de microscopie crio-electronică a
secțiunilor vitroase , folosește un crio-ultramicrotom cu un cuțit de diamant pentru a produce
secțiuni de 40–100 nm grosime.
Cryo- EM permite studierea directă a probelor rapid conservate la temperaturi criogenice (
temperaturi corespunzătoare azotului lichid, mai mici de -160°C), fără a fi fixate sau colorate
anterior.
 SECȚIONAREA LA GHEAȚĂ

Tehnica secționării pieselor biologice congelate permite analiza microscopică rapidă a

unui preparat. Recoltarea, fixarea, secționarea, etalarea, colorarea, montarea și etichetarea se
desfășoară într-un timp foarte scurt (cca. 10 minute) față de tehnica secțiunilor fine la parafină
(cca. 16h). La această metodă, etapele de fixare și includere se realizează în același timp, practic
se suprapun.
Utilitate medicală practică și în cercetare:
- efectuarea unui examen anatomopatologic rapid
 pentru examinarea în timpul operator a unei tumori cu presupuse metastaze; proba
suspecta de a fi o metastază este prelucrată prin congelare și secționare la criotom, iar
rezultatul decide continuarea procedurii operatorii în sens radical sau conservator;
 tot în timp operator, pentru a verifica marginile negative ale rezecției unei tumori;
- evidențierea unor componente tisulare care se pierd la prelucrarea prin tehnici histologice
uzuale (în care, de exemplu, folosirea formolului ca fixator dizolvă lipidele); se pot detecta
lipidele, enzimele, mucopolizaharidele;
- efectuarea unor preparate care să permită detecția unor antigene, prin tehnici complementare de
imunofluorescență sau imunohistochimie; aceste antigene pot fi mascate de fixarea cu
formaldehidă, motiv pentru care se poate opta pentru secționarea la criotom.
Materiale și echipamente necesare
- țesut proaspăt recoltat; metodele de recoltare sunt similare celor utilizate pentru țesuturile
incluse în parafină.
- criotom – un microtom pentru secțiuni congelate, amplasat într-o incintă frigorifică; grosimea
secțiunilor este de 5-60µm;
- gel crioprotector OCT – un amestec de glicerol și rășini care împiedică formarea cristalelor de
gheață în interiorul țesutului (fapt care ar putea afecta structura tisulară).
1. Recoltarea – se poate realiza prin metodele cunoscute;
2. Fixarea și includerea – fixarea se realizează prin congelarea probei (implicit – metodă fizică).
Congelarea probei se realizează într-un container special. Piesa este acoperită cu soluție
crioprotectoare și sigilată cu o membrană PET. Congelarea se poate realiza și în sistemul de
răcire al criotomului, pe o placă răcită la -58°C. Pentru congelearea probelor, piesa de țesut se
amplasează pe suportul răcit în incinta criotomului, pe placa de răcire, la -58° C. Inițial se adaugă
o picătură de crioprotector. Peste piesă se cobară aplicatorul răcit și el la -58° C. Piesa este
congelată simultan din partea superioară și inferioară. Se lasă la răcit (congelare = fixare +
includere) câteva minute.
Reducerea artefactelor rezultate din congelare se realizează prin următoarele artificii
tehnice:
Răcirea agentului crioprotector
Congelarea și formarea cristalelor de gheață începe imediat după ce țesutul atinge placa de
răcire. Țesuturile care conțin multă apă sau care sunt edemațiate pot forma cristale de gheață care
să le afecteze structura. Acest fenomen poate fi redus prin răcirea gelului OCT la frigider. Gelul
crioprotector este folosit de obicei pentru biopsiile cerebrale, tiroidiene, pulmonare sau renale.
Viteza de congelare este crescută prin această metodă.

Pre-răcirea țesutului
Țesuturile răcite rapid prezintă mai puține artefacte. Țesuturile primite din clinică au
temperatura cuprinsă între temperatura corpului și temperatura camerei. Prerăcirea țesutului
înainte de congelare (la 0°C) este utilă în accelarea etapei de fixare+includere.
3. Secționarea
Containerul special de congelare este amplasat pe sistemul portobiect al criotomului.
Blocul congelat cu țesutul trebuie să fie paralel cu lama cuțitului; acum se poate începe
secționarea. Același fenomen poate fi evitat cu ajutorul unui panou de sticlă anti-încurbare, atașat
și amplasat deasupra cuțitului.
4. Etalarea – secțiunile sunt preluate cu un penson și amplasate pe lamă.

Colorarea unui preparat microscopic în vederea examinării la microscopia fotonică:

colorarea cu hematoxilină-eozină, a secțiunilor incluse în parafină (tehnică, rezultate, utilitate
medicală practică); colorarea secțiunilor la gheață – tehnică, avantaje, rezultate

Capitolul cuprinde noțiuni fundamentale privind coloranții și mecanismele generale ale

colorării, precum și importanța acestora pentru evidențierea unor structuri celulare.
Coloranții. Generalități
Colorarea structurilor celulare și tisulare este un fenomen complex, în care intervin factori
fizici și mecanisme chimice. Toți coloranții, în sensul strict al termenului utilizat în tehnică, sunt
compuși organici, marea lor majoritate corespunzând seriei aromatice. Un colorant este un produs
ce poate colora durabil o substanță sau un ansamblu de substanțe. Pentru aceasta au nevoie de:
1. grupări atomice specifice numite cromofore ce conferă culoarea;
2. grupări ce permit o fixare permanentă pe substanța de colorat numite grupări auxocrome;
Se știe că fenomenul „culoare” este legat de absorbția selectivă de către o substanță dată a
unor anumite lungimi de undă din spectrul vizibil astfel încât lumina reflectată de această
substanță apare colorată; responsabile de această absorbție selectivă sunt grupările cromofore.
Compușii organici ce conțin grupări cromofore sunt numiți și „cromogeni”.
 Grupările auxocrome din punct de vedere chimic sunt, cel mai ades, funcții simpe, fără
duble legături, polare sau semi-polare. Grupările hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil sunt
principalii auxocromi.
Clasificarea coloranților
Coloranții utilizați în citologie pot fi clasificați după mai multe criterii:
1. După origine:
- naturali, de origine vegetală (hematoxilină, safranină) sau de origine animală (carminul)
- sintetici (albastrul de metil)
2. După natura auxocromilor ce determină și comportamentul lor în soluție:
- coloranți acizi sau anionici
- coloranți bazici sau carionici
- coloranți neutri
* Termenul de acid sau bazic nu se referă la caracterul acid sau bazic al soluțiilor colorante;
clasificarea se referă la auxocromi:
 colaranții conținând auxocrom anionic sunt coloranți acizi ce colorează componentele
subcelulare încărcate pozitiv; cel mai utilizat coloreant acid este eozina ce colorează în
roz citoplasma.
 coloranții bazici conțin auxocromi cationici și colorează componentele sucelulare
încărcate negativ, cei mai utilizați fiind tionina, violet de metil, hemalaunul.
 coloranții neutri sunt purtătorii de grupări cationice și anionice; se obțin din soluții
apoase de coloranți bazici și coloranți acizi amestecate în anumite proporții (ex. eozinatul
de albastru de metilen și eozinatul de azur de metilen)
Principalele metode de colorare
Acestea sunt clasificate în funcție de următoarele criterii:
1. Numărul coloranților utilizați:
- simple, când se folosește un singur colorant, fie nuclear (hematoxilina) fie citoplasmatic
(eozina)
- combinate, când secțiunile se colorează succesiv cu 2 sau mai mulți coloranți (dublă –
hematoxilină-eozină, triplă – hematoxilină-eozină-albastru de metilen), folosite pentru
colorarea diferențială a diverse elemente ale unui țesut și de a facilita astfel analizarea
structurii lui.
2. Utilizare unor adjuvanți:
- directă: colorantul se fixează prin simplul contact cu secțiunea (colorarea cu
hematoxilină-eozină)
- indirectă sau prin mordansare – necesită prezența unui mediator sau mordant
(alaunurile, iodul, sărurile de fier, etc.) care fixează colorantul de componentele celulare;
combinația dintre colorant și mordant se numește lac.
3. Intensitatea colorării
- progresivă – se fac încercări succesive sub control microscopic până se ajunge la tenta
de culoare optimă a structurii celulare după care se oprește colorarea prin spălare (ex.
 hemalaunul colorează nucleii tuturor tipurilor de celule în albastru în 4-6 minute; dacă
lăsăm secțiunile mai mult timp în contact cu colorantul, se colorează și alte structuri
celulare);
- regresivă – se face o supracolorare care prinde și alte structuri celulare decât cele dorite,
după care excesul de colorant, este îndepărtat prin substanțe decolorante sau
diferențiatorii (de ex. după ce am colorat secțiunea în negru intens cu hematoxilină ferică
Heindenhain, introducem lama într-o soluție de alaun de fier amoniacal până în momentul
în care a rămas colorată numai cromatina nucleară, celelalte elemente celulare-
mitocontriile, centrul celular etc. se decolorează).
4. Starea materialului
- colorația vitală se face pe celule în stare vie prin utilizarea unor coloranți vitali și care
persistă numai atâta timp cât supraviețuiește celula; se utilizează pentru evidențierea unor
organite celulare (mitocondrii – verde Janus B sau complex Golgi – roșu neutru) și a unor
activități fiziologice celulare.
- colorația permanentă – se face prin colorarea unor preparate permanente.

Tehnica de colorare și montare a secțiunilor la parafină

1. Pre-colorarea
 Deparafinarea: se îndepărtează parafina din secțiuni prin 3 băi de succesive de xilol, a câte
10 minute fiecare.
 Hidratarea: se folosesc 3 băi de alcool absolut a câte 5 minute fiecare, urmate de 3 băi de
alcool în concentrații descrescătoare, de la 95%,70% și 50%, a câte 5 minute fiecare.
 Spălarea: se spală rapid (scufundări succesive a câte 10 secunde) în apă distilată.
2. Colorarea propriu-zisă
Colorarea se face cu soluție de hematoxilină timp de 10 minute, se spală în apă curentă timp
de 5 minute, se diferențiază în soluție acid-alcool 1% timp de 30 de secunde, se spală în apă
curentă timp de 1 minut și se contracolorarează cu soluție de eozină timp de 2-5 minute.
3. Post-colorarea
 Deshidratarea în băi succesive de soluție de alcool în concetrații crescătoare
 Clarificarea în 3 băi de xilol, 5 minute fiecare
 Montarea - se montează lamela cu o picătură de mediu specific (Balsam de Canada) solubil
în xilol
 Etichetarea se poate face cu etichete preformate, imprimate sau coduri de bare.

Rezultatele colorării H&E

- colagenul – roz palid
- mușchi – roz intens
- citoplasma acidofilă – roșu
- citoplasma bazofilică – violet
- nuclei – albastru
- eritrocite – roșu deschis

COLORAREA SECȚIUNILOR LA GHEAȚĂ

Colorarea secțiunilor din blocuri de țesut congelat se poate face fie pe secțiuni libere fie
pe secțiuni lipite pe lame portobiect.
Pentru secțiuni libere, bateria de colorare este formată din cutii Petri cu diametru mic prin
care secțiunile se trec cu ajutorul unor baghete de sticlă în forma de „L”. După colorare, aceste
secțiuni se pescuiesc pe lame portobiect și se montează în medii apoase (glicerină, gelatină).
Pentru secțiunile etalate pe lamă, colorarea se realizează cu diferiți coloranți și prin
metode variate; colorațiile utilizate sunt cele folosite de obicei pentru secțiuni fine (albastru de
toluidină sau hematoxilină-eozină – colorații de rutină) sau sunt adaptate rezultatelor scontante
(ex. imunofluorescență).

Tehnica de colorare și montare a secțiunilor lipite pe lamă (cu soluție 1% de albastru de

toluidină)

Secțiunile lipite pe lamă, după secționarea la criotom, sunt hidratate dar conțin încă
impurități și grăsimi. În consecință este necesară o clarificare cu xilol (solvent organic). Xilolul
nu este miscibil cu apa, așadar, înainte de clarificare este necesară deshidratarea iar după
clarificare, este necesară rehidratarea acestora, având în vedere faptul că soluția de colorare este
apoasă.

1. Pre-colorarea:
 Deshidratare: se toarnă alcool 90% ulterior alcool absolut în picături peste secțiuni, pe lama
așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde fiecare, apoi se scurge în vasul
Petri.
 Clarificare: se toarnă Xilol în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii
Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri.
 Rehidratare: se toarnă alcool absolut ulterior alcool 90% în picături peste secțiuni, pe lama
așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde fiecare, apoi se scurge în vasul
Petri.

2. Colorarea propriu-zisă
– se toarnă soluție de albastru de toluidină 1% în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe
marginile unei cutii Petri. Se lasă 30-60 secunde, apoi se scurge în vasul Petri.

3. Post-colorarea
 Această etapă se face în funcție de mediul de montare: pentru mediu de montare apos, se
adaugă direct 1-2 picături de mediu de montare și se acoperă cu o lamelă; se elimină bulele de
aer prin presarea ușoară a lamelei. Ulterior se poate examina la microscop.
Pentru un mediu de montare anhidru (Balsam de Canada) etapele sunt:
 Deshidratare cu alcool 90% urmat de alcool absolut, în picături peste secțiuni, pe lama
așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde fiecare, apoi se scurge în vasul
Petri.
 Clarificare cu Xilol în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se
lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri.
 Montarea cu Balsam de Canada: se adaugă direct o picătură de medoi de montare și se
acoperă cu o lamelă; se elimină bulele de aer prin presarea ușoară a lamelei.

Rezultatele colorării cu albastru de toluidină: nucleii apar albastru închis iar citoplasma
albastru deschis.