LP 3.

TEHNICA OBŢINERII PREPARATELOR MICROSCOPICE

 TEHNICA OBŢINERII PREPARATELOR MICROSCOPICE

 Pentru a putea observa celulele la microscop, fragmentele de ţesut trebuie prelucrate în vederea
obţinerii preparatelor microscopice.
 Un preparat microscopic este alcătuit din de proba de studiat aşezată pe o lamă de sticlă şi acoperită,
de regulă, cu o lamelă.
– lama se mai numeşte şi „lamă port-obiect” cu laturi paralele şi dimensiuni de 76/26mm şi 1.5-2mm grosime;
– lamela este din sticlă, are formă pătrată sau dreptunghiulară, foarte subţire, cu dimensiuni variabile;
– proba de studiat este reprezentată de un fragment de ţesut sau o cantitate mică dintr-un lichid corporal, aduse
prin secţionare, respectiv etalare la o grosime de câţiva microni; la aceasta grosime, lumina străbate proba
(transiluminare) permiţând studierea celulelor la microscopul optic.
 În funcţie de starea celulelor de studiat, preparatele microscopice se clasifică în:

1. Preparate proaspete, temporare sau extemporanee

2. Preparate permanente sau durabile, care permit un studiu amănunţit al celulelor pe piese fixate şi colorate
 TEHNICA OBŢINERII PREPARATELOR MICROSCOPICE

 Preparatele proaspete, temporare sau extemporanee, se realizează atunci când se

urmăreşte studierea celulelor în stare vie.
 În acest scop se recoltează din organismul animal în timpul vieţii (biopsie) un fragment foarte
subţire de organ sau ţesut pe care-l disociem pe lamă într-un lichid natural sau artificial, favorabil
menţinerii vieţii celulelor în timpul examinării (plasmă, limfă, lichid amniotic, ser fiziologic). Acoperim
apoi preparatul cu o lamelă ale cărei margini le lipim cu parafină topită, pentru a evita uscarea
ţesutului.
 Acest tip de preparat se mai foloseşte şi în studiul culturilor de ţesuturi. Pe astfel de preparate
proaspete putem examina celulele sau elementele ţesutului respectiv necolorate sau colorate printr-
o metodă numită coloraţie vitală. În metoda coloraţiei vitale se întrebuinţează diferite substanţe
colorante puţin toxice, care nu alterează viaţa celulelor (exemple: albastru de tripan, verde Janus).
Coloraţiile vitale pot fi: intravitale, când substanţa colorantă se introduce în organism în timpul vieţii,
apoi se recoltează ţesutul şi se studiază, sau pot fi supravitale, când colorantul vital se aplică pe un
preparat cu celule in stare vie.
 TEHNICA OBŢINERII PREPARATELOR MICROSCOPICE

 Examenul în stare vie sau proaspată are marele avantaj de a permite studiul celulelor în viaţă, de a urmări
diferite aspecte funcţionale ale acestora în desfaşurarea lor, de a studia unele aspecte ale dinamicii celulare. Putem
observa :
– mişcarea cililor, miscarea ameboidă, contractilitatea;
– fagocitoza, exocitoza;
– diviziunea celulară, fecundaţia, segmentarea ovulului.
 Cu toata simplitatea acestui procedeu, examenul în stare proaspătă are aplicaţii restrânse. Marele
dezavantaj al acestei metode este alterarea relativ rapidă a ţesutului de examinat.

 Preparate permanente sau durabile, rezistă în timp deoarece în timpul prelucrării ţesuturilor celulele sunt
conservate prin fixare. Preparatele permanente se pot obţine prin două procedee:
– metoda efectuării secţiunilor fine
– metoda etalării materialului biologic în monostrat (frotiu – din fluide, amprente de organ – din ţesuturi solide).
 TEHNICA OBŢINERII PREPARATELOR MICROSCOPICE

2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE



Secţiunea este un preparat permanent prin care se studiază ţesuturile solide. Datorită detaliilor structurale tisulare şi celulare pe care le
evidenţiază, secţiunile fine sunt preparatele cel mai frecvent utilizate în studiul ţesuturilor solide.
Efectuarea preparatelor microscopice din secţiuni fine este o metoda laborioasă, care se desfăşoară în laboratoare specializate.
Etapele obţinerii preparatelor din secţiuni fine sunt următoarele (figura 3.1):
o recoltarea
o fixarea şi spălarea
o deshidratarea
o includerea
o secţionarea şi aplicarea secţiunilor pe port-obiect
o colorarea şi montarea lamelei
2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Figura 3.1 Reprezentare schematică a principalelor etape în obţinerea

preparatelor microscopice prin secţiuni fine
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Recoltarea şi fasonarea pieselor

Fragmentele de organe sau ţesuturi pot fi recoltate în timpul vieţii, (printr-o intervenţie
chirurgicală, când se obţine o piesă operatorie, fie printr-un act operator mai redus, biopsie, când
se obţine un mic fragment de ţesut, fragment bioptic) sau imediat după moartea animalului,
pentru a evita liza ţesuturilor.
Fasonarea pieselor: fără a le deforma sau strivi, fragmentele mari sunt tăiate la o grosime
de 2-3 mm şi orientate astfel încât să permită un studiu cât mai complet – în acest scop peretele
organelor cavitare va fi secţionat şi acestea se întind şi se prind pe un suport plan prin fixare cu
bolduri sau spini de copac şi aşa se introduc în fixator.
Piesa de material biologic trebuie să aibă feţe plane şi paralele, să nu aibă grosime mai
mare de 1-4 mm, pentru a facilita pătrunderea rapidă a fixatorului şi a evita apariţia alterărilor
autolitice.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Fixarea şi spălarea
Fixarea reprezintă un timp obligatoriu în realizarea preparatelor permanente. Are ca scop
oprirea proceselor celulare şi conservarea constituenţilor celulari într-o stare cât mai apropiată de
cea din timpul vieţii, cu păstrarea formei, structurii şi compoziţiei chimice precum şi a raporturilor
reciproce existente în stare vie, şi pregătirea ţesuturilor în vederea manevrelor ulterioare
(includere, colorare). Fixarea omoară şi imobilizează celulele într-un anume moment al activităţii
lor.
La nivel molecular, fixarea realizează denaturarea şi/sau polimerizarea constituenţilor
celulari şi în special a proteinelor. În consecinţă (1) se realizează blocajul reacţiilor enzimatice,
împiedicând astfel digestia autolitică a ţesuturilor şi (2) se imobilizează constituenţii celulari,
păstrându-se raporturile existente în timpul vieţii.
Fixarea se poate face folosind agenţi fizici sau chimici:
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Agenţii fizici utilizaţi sunt: căldura, desicarea (uscarea) sau congelarea. Sunt utilizaţi
numai în aplicaţii speciale, având ca principal dezavantaj un grad redus de păstrare a raporturilor
celulare.
Agenţii chimici sunt cel mai frecvent utilizaţi, fie ca fixatori simpli, fie sub formă de
amestecuri fixatoare. Fixatorii chimici au ca mecanism general de acţiune combinarea cu
grupările funcţionale ale moleculelor proteice, pe care le fac insolubile în lichidele utilizate în
tehnică şi blochează reacţiile enzimatice (digestia autolitică). Un fixator simplu este greu să
îndeplinească toate calităţile necesare unei bune fixări (să aibă putere mare de pătrundere, să
producă o cât mai mică retracţie a pieselor, să nu determine apariţia de artefacte, să confere o
anumită consistenţă piesei), motiv pentru care se recurge uneori la amestecuri fixatoare în care
diverşii constituenţi îşi completează reciproc acţiunea.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

 Exemple de fixatori utilizaţi în practică:

 1. Aldehidele – sunt reprezentate de formaldehida (formolul) şi glutaraldehida. Ţesuturile sunt fixate prin
polimerizarea proteinelor. Acest tip de fixare nu modifică mult structura proteinelor acestea păstrându-şi
antigenicitatea, deci piesele fixate astfel pot fi studiate prin tehnici imunologice.
 Formaldehida: - are putere de penetrare bună, dar acţiune lentă;
 - soluţia standard este 10% formalină tamponată (tamponarea previne aciditatea care favorizează autoliza);
această soluţie se mai numeşte formol şi reprezintă fixatorul cel mai frecvent utilizat în efectuarea
preparatelor pentru microscopia optică.
 - conservă proteinele fără a le precipita, fixează bine lipidele complexe dar nu are efect pe lipidele neutre şi
deşi nu este fixatorul de elecţie pentru glucide, acestea sunt imobilizate în matricea proteică.
 Glutaraldehida - are penetrare slabă, dar acţiune rapidă, piesele trebuie tăiate la cel mult 1 mm grosime pentru
a asigura pătrunderea fixatorului;
 - dă cele mai bune detalii citoplasmatice globale şi nucleare;
 - este folosită, de aceea, în microscopia electronică.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

 . Fixatorii mercuriali - reprezentaţi, în principal, de clorura de mercur al cărei mecanism de acţiune este
necunoscut; intră în compoziţia amestecului fixator Zenker. Dau detalii nucleare excelente, şi acţionează rapid,
dar au penetrare slabă şi produc rigiditate.
 3. Alcoolii – reprezentaţi de metanol şi etanol, sunt printre primii fixatori folosiţi. Etanolul conservă glicogenul.
Acţionează prin denaturarea proteinelor şi produc rigiditate şi fragilitate. De aceea folosirea lor este recomandată
mai mult pentru frotiuri. Acţionează rapid şi dau detalii nucleare bune. Sunt folosiţi şi în amestecuri: alcool-formol,
amestecul Carnoy etc.
 4. Agenţii oxidanţi – sunt pemanganaţi (permanganatul de potasiu), dicromaţi (dicromatul de potasiu) şi
tetraoxidul de osmiu. Au ca mecanism polimerizarea proteinelor, dar produc denaturare severă. Au aplicaţii
specializate şi se folosesc mai rar. Există numeroase amestecuri (Fleming, Benda, Benoit etc). Tetraoxidul de
osmiu (acidul osmic) reacţionează cu lipidele nesaturate pe care le face vizibile datorită formării unui precipitat
negru de osmiu hexavalent.
 5. Picraţii – sunt fixatori ce conţin acidul picric; cel mai cunoscut, frecvent utilizat este soluţia Bouin. Mecanismul
de acţiune este necunoscut. Dau detalii nucleare aproape la fel de bune ca fixatorii mercuriali, fără să producă
rigiditate marcată.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Exemple de amestecuri fixatoare folosite în practică:

Fixatorul Carnoy Alcool-formol

Etanol absolut 60 ml Etanol 96% 90 ml

Cloroform 30 ml Formalină 10 ml

Acid acetic galcial 10 ml Acetat de calciu 0.5 g

Fixatorul Zenker
Soluţia Bouin
Apă distilată 95 ml Soluţie saturată apoasă de
acid picric 75 ml
Bicromat de potasiu 2.5 g

Clorură de mercur 5g Formalină 25 ml

Acid acetic glacial 5 ml Acid acetic glacial 5 ml

 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

 Alegerea fixatorului se face ţinând cont de următoarele aspecte:

– gradul conservării morfologice pe care dorim să-l obţinem: fixarea se realizează în mod diferit
pentru microscopia electronică faţă de cea fotonică; în primul caz trebuiesc păstrate relaţiile între
constituenţii celulei la scară moleculară.
– natura constituenţilor chimici ce trebuie conservaţi: anumite structuri macromoleculare sunt mai
uşor de conservat (de exemplu proteinele), în timp ce alţii sunt foarte labili şi dificil de fixat,
(oligozaharidele).
– volumul fragmentelor tisulare ce trebuiesc conservate: fixarea unui frotiu celular este diferită de
cea a unui organ (de exemplu encefalul) unde pătrunderea fixatorului devine elementul esenţial al
fixării.
– tipul reacţiilor histochimice sau de culoare pe care dorim să le efectuăm: fixarea este diferită când
folosim o coloraţie simplă, topografică sau când încercăm decelarea lipidelor sau enzimelor.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Pentru a facilita difuziunea cât mai rapidă a fixatorului în piesă, volumul de fixator trebuie
sa fie cel puţin de 10 ori mai mare decât volumul piesei. Rata de difuziune, care depinde atât de
natura fixatorului cât şi de tipul de ţesut, este factorul limitant în obţinerea conservării optime. De
asemenea, durata fixării depinde de natura fixatorului, precum şi de structura şi dimensiunile
piesei şi poate fi de câteva ore (fixatorul Carnoy) până la câteva zile (soluţia Bouin). Formolul dă
rezultate bune după cel puţin 24 de ore.
Spălarea este operaţiunea prin care se opreşte fixarea şi se îndepărtează excesul de
fixator şi a unor eventuale structuri false ce pot apare în preparat datorită unor defecte de fixare.
În funcţie de fixatorul folosit se poate face cu diferite substanţe: apa curgătoare pentru
formaldehidă, alcool pentru fixatori cu dicromat de potasiu sau alcool absolut pentru fixatorii pe
bază de alcool (amestecul Carnoy).

 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Deshidratarea

Este operaţiunea prin care se îndepărtează apa care există în piesă la sfârşitul
fixării/spălării. Acest pas este necesar deoarece majoritatea mediilor de includere nu sunt solubile
în apă. Se desfăşoară în două etape: deshidratarea propriu-zisă şi clarificarea.
Deshidratarea propriu-zisă se face cu etanol în băi de concentraţii succesiv crescute
(70%, 95% şi 100%). Prin difuziune alcoolul înlocuieşte treptat apa din ţesuturi. Durata depinde
mărimea fragmentelor, în medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool.
Clarificarea, este operaţiunea prin care alcoolul din piesă este înlocuit cu o substanţă care
este miscibilă atât cu alcoolul cât şi cu parafina (solvenţi organici, de exemplu: xilenul, benzenul,
toluenul, cloroformul). Clarificarea constă , de asemenea în băi succesive de solvent organic, de
obicei 3 băi de xilen cu durată de 3-6 ore în funcţie de mărimea fragmentului. La sfârşitul
operaţiunii de clarificare, piesa devine translucidă (de aici şi denumirea acestei etape).
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

 Includerea
 Este etapa în care piesa este procesată într-o formă care să permită efectuarea de secţiuni subţiri. Majoritatea
ţesuturilor au o consistenţă moale, chiar şi după fixare, care nu permite tăierea unor secţiuni destul de subţiri. De aceea este
necesară includerea care constă în impregnarea şi înglobarea piesei într-o substanţă solidificabilă, rezultând un bloc cu
consistenţă solidă, omogenă.
 Cel mai frecvent utilizat mediu de includere este parafina, cu o densitate asemănătoare ţesuturilor, ce permite
obţinerea de secţiuni cu grosimi de 3-10 m. Alte substanţe folosite sunt celoidina, gelatina, iar pentru microscopia
electronică răşinile sintetice.
Impregnarea la parafină: se utilizează parafina topită la, care e menţinută la aceasta temperatură într-un termostat.
Se trec piesele prin cel puţin 3 băi de parafină pentru a se îndepărta orice urmă de solvent din piese.
 Includerea propriu-zisă, sau turnarea blocului, constă în înglobarea pieselor în parafină neutilizată, amestecată cu
ceară 6-10 %, topită la 56°C. Amestecul este turnat într-o formă realizată prin unirea a două bare metalice în formă de „L”
(bare Leuckardt) care se asamblează realizând „matriţe” de diferite mărimi in funcţie de dimensiunea pieselor ce urmează a fi
incluse.
 Piesa se introduce în parafină cu faţa care va fi secţionată spre fundul formei. Prin răcire la temperatura camerei
blocul se solidifică şi va putea fi secţionat.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Secţionarea şi aplicarea secţiunilor pe lamă

Blocul de parafină care conţine piesa este montat, în vederea secţionării, într-un aparat
numit microtom. Acesta este prevăzut cu un cuţit foarte ascuţit dispus orizontal şi cu un braţ mobil
în care se prinde blocul şi care se deplasează vertical pe cuţit, tăind secţiunile. La fiecare cursă
verticală, braţul mobil avansează orizontal cu o distanţă standard – grosimea secţiunii (câţiva
microni, de regula 4 – 6 m). Prin mişcarea repetată a blocului în lungul cuţitului se obţin secţiuni
seriate, care aderă una de alta, formând o panglică.
Uneori includerea la parafină împiedică evidenţierea anumitor compuşi celulari. De
exemplu, lipidele sunt „spălate” din piese în timpul etapei de clarificare care precede includerea.
Pentru evidenţierea acestor compuşi, piesele se congelează după fixare (fără a fi incluse).
Congelarea conferă o consistenţă solidă ce permite secţionarea în secţiuni subţiri; se face rapid,
de obicei prin introducerea pieselor într-un gaz lichefiat (bioxid de carbon, azot lichid), şi apoi
piesele se secţionează la un microtom special numit criotom.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Secţiunile sunt apoi aplicate pe lama port-obiect. Pe lama de sticlă bine degresată se
aplică o picătură de albumină Mayer sau soluţie apoasă de gelatină care se întinde bine în lungul
lamei.
Din panglica de secţiuni se taie fragmente de 3-4 secţiuni care aşează pe suprafaţa unei
băi de apă încălzită la aproximativ 56°C. Secţiunile se lasă să plutească până se descreţesc şi se
întind complet, apoi sunt preluate cu lama port-obiect. În continuare, lamele se ţin 24 de ore la
termostat la 37°C, pentru ca secţiunile să se usuce şi să se lipească.
Astfel procesate, preparatele permanente pot fi păstrate necolorate, ferite de praf şi
lumina timp îndelungat. Ele vor putea fi însă observate la microscop numai după efectuarea
colorării.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Colorarea şi montarea lamelei

Este operaţiunea prin care diferitele componente tisulare şi celulare sunt evidenţiate pentru a putea fi observate la microscop.
Colorarea se face cu ajutorul unor soluţii de coloranţi care sunt în marea lor majoritate soluţii apoase, mai rar alcoolice. Montarea lamelei se
face cu ajutorul unor răşini de tipul balsamului de Canada.
Datorită utilizării în tehnica secţiunilor fine atât a substanţelor anhidre, nemiscibile cu apa, cât si a soluţiilor apoase, sunt necesare
secvenţe intermediare de deshidratare şi rehidratare care să permită accesul acestor agenţi la structurile tisulare (figura 3.2).
De aceea, înainte de colorarea propriu-zisă a secţiunilor la parafină, este necesară efectuarea unei etape de rehidratare.
Rehidratarea implică folosirea alcoolilor şi solvenţilor organici într-o secvenţă inversă deshidratării prezentată anterior; se desfăşoară în doi
timpi:
– Deparafinarea – se face prin trecerea lamelor cu secţiuni în bai de solvent organic;
– Hidratarea – se face prin trecerea secţiunilor în bai de alcool de concentraţii descrescătoare, ultima baie fiind de apă.
Deoarece secţiunile au grosime mult mai mică decât piesele de ţesut, durata acestor băi este de câteva minute pentru fiecare baie.

Se face apoi colorarea propriu-zisă cu coloranţii specifici pentru evidenţierea structurilor dorite. Alegerea coloranţilor se face în
funcţie de componentele celulare pe care dorim să le evidenţiem şi de proprietăţile lor, prezentate în secţiunea următoare.
După colorare, lamele se spală, se usucă şi se acoperă cu o lamelă.
 2. METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Montarea lamelei – are ca scop (1) protecţia mecanică a secţiunilor, (2) conservarea cât
mai mult timp posibil a coloranţilor şi (3) obţinerea unui indice de refracţie şi grad de transparenţă
avantajos din punct de vedere optic.
Pentru lipirea lamelei se foloseşte un mediu de montare cu indice de refracţie asemănător
cu al sticlei, cel mai utilizat fiind balsamul de Canada. Acesta este o răşină anhidră care nu este
miscibilă cu apa şi deci nu poate fi aplicată direct pe secţiunile colorate, ci numai după efectuarea
unei etape de deshidratare (băi de alcool de concentraţii crescătoare şi băi de solvent organic).
Montarea se realizează punând 1-2 picături din mediul de montare pe lama cu secţiunea
colorată, pe care se aplică o lamelă de sticlă. Preparatele astfel montate se pun la termostat la
37°C, 10-12 ore sau la temperatura camerei, dar ferite de praf, 1-2 zile, pentru uscarea şi
uniformizarea mediului de montare.