Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
C CA AP PI IT TO OL LU UL L 1 1
T TE EH HN NI IC CI I D DE E S ST TU UD DI IU U N N B BI IO OL LO OG GI IA A C CE EL LU UL LA AR R
I. INTRODUCERE
Familiarizarea cu metodele i instrumentele oricrei tiine este esenial pentru o bun
nelegere a aplicaiilor. Vor fi prezentate n continuare cele mai uzuale metode folosite
pentru studiul celulelor i principiile ce le implic aceste metode: uniti de msur,
pregtirea preparatelor pentru examinare, microscopia optic, microscopia n contrast de
faz, microscopia n lumin polarizat, microscopia electronic, criofracturarea,
radioautografia, examinarea celulelor vii, izolarea i studiul in vitro a liniilor celulare pure.
Cele mai importante uniti de msur folosite n biologia celular sunt micrometrul i
nanometrul. Angstrom-ul (; 10
-10
m) nu mai este recunoscut n sistemul internaional de
uniti i n schimb se folosete nanometrul (nm; 10
-9
m) ce reprezint echivalentul a 10.
Micrometrul (m) a nlocuit termenul de micron dar are aceeai valoare de 10
-6
m.
II. PREGTIREA ESUTURILOR PENTRU EXAMINAREA MICROSCOPIC
Cel mai obinuit procedeu folosit pentru studiul celulelor este prepararea de seciuni
tisulare ce pot fi studiate cu ajutorul microscopului optic. Prin microscopie optic, celulele
sunt examinate prin transiluminare. Deoarece esuturile i organele sunt prea grosiere
pentru a permite transiluminarea lor, s-au dezvoltat o serie de tehnici pentru obinerea de
seciuni fine, translucente. n unele cazuri straturi foarte fine de esut sau membrane
transparente a unor animale vii pot fi observate la microscop fr secionare prealabil a
esutului. n aceste cazuri este posibil studiul acestor structuri pentru perioade ndelungate
i n diverse condiii fiziologice i experimentale. Dac se dorete realizarea unui preparat
permanent, fragmente mici din diverse structuri pot fi fixate, ntinse pe lame de sticl,
colorate i montate cu rezin, apoi examinate la microscop. n majoritatea cazurilor,
esuturile necesit o secionare foarte fin nainte de a fi examinate. Aceste seciuni sunt
realizate cu precizie de instrumente denumite microtoame, iar organul sau esutul trebuie
pstrat i pregtit pentru secionare.
A. Fixarea
1. Pentru a evita digestia celulelor de ctre enzime (autoliza) sau bacterii i pentru a
pstra structura, piese din organul examinat necesit un tratament prompt i adecvat
nainte sau imediat dup ndeprtarea din corp.
2
a. Acest tratament fixare const, de obicei, n scufundarea esuturilor n ageni
stabilizatori sau prin perfuzarea organelor cu aceste substane pentru a menine pe
ct posibil caracteristicile morfologice i moleculare ale esuturilor respective.
b. Substanele chimice folosite pentru pstrarea esuturilor sunt denumii fixatori.
(1) Unii fixatori (ex. clorura de mercur, acidul picric) realizeaz precipitarea i
coagularea proteinelor.
(2) Alii (ex. formalina, glutaraldehida) nu determin coagularea proteic.
(3) Toi fixatorii au att efecte favorabile dar i nefavorabile. Scopul este de a
obine amestecuri fixatoare ce combin efectele dorite i minimalizeaz efectele
nedorite.
(a) Cel mai utilizat amestecuri sunt amestecul Bouin, compus din acid picric,
formalina (o soluie saturat, 37% formaldehid n ap), acid acetic i ap; i
formalina Zenker (amestecul Hely) ce conine formalin, dicromat de potasiu,
clorur de mercur i ap.
(b) Cei mai simpli fixatori folosii sunt soluia salin de formalin 10% i soluia
de glutaral-aldehid tamponat 2-6%.
Tabel 1-1. Etapele de preparare tisular pentru examinare n microscopia optic
Etapa Scop Durata
Fixarea in fixatori simpli sau
compui (amestec Bouin)
Pentru a pstra morfologia
tisular i compoziia molecular
Aproximativ 12 h, n funcie de
fixator i mrimea piesei
Deshidratarea n concentraii
graduale de etanol (70%-100%)
Pentru a nlocui apa celular cu
solveni organici
6-24 h
Clarificare n benzen, xilen sau
toluen
Pentru a impregna esuturile cu
un solvent de parafin
1-6 h
Includere n parafin topit (58-
60C)
Parafina ptrunde n toate spaiile
intercelulare i chiar n celule
realiznd o rigiditate a esuturilor
pentru secionare
-6 h
2. Procesul de fixare este complex i nu este pe deplin cunoscut. ns se cunoate
faptul c formaldehida i glutaraldehida reacioneaz cu gruprile aminice (NH
2
) ale
proteinelor tisulare. Datorit rezoluiei nalte oferite de microscopul electronic, este
necesar n acest caz, o fixare mai bun pentru a pstra cu finee detaliile
ultrastructurale. Pentru acest lucru, o procedur de dubl fixare a devenit procedura
standard pentru studiile structurale de finee: prin folosirea unei soluii de
glutaraldehid, urmat de cea de a doua fixare cu tetraoxid de osmiu. n timp ce
3
glutaraldehida realizeaz cross-link-ul proteinelor, scopul tetraoxidului de osmiu este
de a fixa i colora lipidele i proteinele.
B. Includerea
1. Pentru a obine seciuni folosind microtomul, esuturile trebuie infiltrate, dup fixare,
cu substane de includere ce induc esutului respectiv o consisten rigid.
a. Aceste substane sunt gelatina, celoidina, parafina, i cele mai recente, rezinele
plastice.
b. Parafina este folosit de rutin pentru microscopia optic; rezinele de tip epoxy
(Epon sau Araldite) sunt folosite pentru microscopia electronic.
2. Procesul de includere sau de impregnare tisular este de obicei precedat de 2
etape: dehidratare i splare.
a. n prealabil, apa existent n fragmente este extras prin tratri succesive n
amestecuri de concentraii diferite de etanol i ap (de obicei de la etanol 70% la
etanol 100%).
b. Etanolul este apoi nlocuit de un solvent dizolvabil n mediul de includere. n cazul
includerii cu parafin, solventul este xilena.
(1) n timp ce esuturile sunt infiltrate cu solvent, de obicei acestea devin
transparente. Odat impregnat cu solvent, esutul este plasat n parafin topit de
obicei la 58-60C. Cldura determin evaporarea solventului, i spaiile sunt
umplute de parafin.
(2) esuturile incluse pentru microscopia electronic sunt de asemenea
deshidratate in soluii de etanol i ulterior infiltrate cu solveni plastici cum este
oxidul de propilen. Aceti solveni sunt miscibili cu i apoi nlocuii de soluii
plastice (Epon, Araldite).
3. Blocurile de parafin ce conin esuturile sunt secionate de lama de oel a
microtomului la grosimea de 1-20 m. Seciunile sunt apoi plasate pe lame de sticl.
a. Pentru microscopia electronic, sunt necesare seciuni mult mai fine (0,02-0,1 m)
i includerea se realizeaz printr-un plastic dur de tip epoxy. Blocurile obinute sunt
att de dure, nct pentru secionarea lor sunt necesare lame de sticl sau diamant.
b. Deoarece fasciculul de electroni nu poate penetra sticla, seciunile extrem de fine
sunt plasate pe un cadru de metal (de obicei de cupru). Acele poriuni ale seciunii ce
se evideniaz printre ochiurile cadrului pot fi examinate la microscopul electronic.
4. Imersia esuturilor n solveni, cum este xilena, dizolv lipidele celulare, ceea ce este
un efect nedorit, atunci cnd dorim studierea acestor componente.
4
a. Pentru a preveni pierderea de lipide, se folosete criomicrotomul cu ajutorul
cruia, esuturile devin consistente la temperaturi sczute pentru a determina
rigiditatea necesar secionrii.
b. Criomicrotomul i succesorul su, mai eficient, criostatul permit ca seciunile
s fie obinute rapid fr a necesita procedura de includere descris anterior.
c. Acestea sunt adesea utilizate n clinic, deoarece permit studiul rapid a
specimenelor patologice n timpul procedurilor chirurgicale. Sunt de asemenea
eficiente n studiile de histochimie a unor enzime foarte sensibile sau a unor molecule
mici, deoarece nghearea nu inactiveaz enzimele i previne difuziunea
micromoleculelor.
B. Colorarea
1. Cu cteva excepii, majoritatea esuturilor sunt incolore, astfel c observarea lor la
microscopul optic este dificil. Astfel au fost elaborate diverse metode de colorare ce
nu doar realizeaz evidenierea diverselor componente tisulare, dar permit i
diferenieri ntre diversele esuturi.
a. Colorarea se realizeaz prin folosirea de amestecuri ce coloreaz selectiv
componentele tisulare.
b. Majoritatea coloranilor se comport ca i compui acizi sau bazici i au tendina
de a forma legturi electrostatice cu radicalii ionizabili ai esuturilor.
c. Componentele tisulare ce se coloreaz cu colorani bazici sunt denumite bazofile,
iar cele cu afinitate fa de coloranii acizi sunt denumite acidofile.
(1) Exemple de colorani bazici sunt albastru de toluidin i albastru de metilen.
Hematoxilina se comport ca i un colorant bazic, adic coloreaz componentele
celulare bazofile. Principalele compomente celulare realizeaz legturi ionice i
reacioneaz cu coloranii bazici datorit compoziiei n acizi a acestora
(nucleoproteine i glicozaminoglicani).
(2) Coloranii acizi (ex. orange G, eozina, fucsina) coloreaz componentele bazice
prezente n proteinele citoplasmatice.
(3) Dintre toi colorani, combinaia hematoxilinei cu eozina (HE) este cea mai
utilizat.
Tabel 1-2. Exemple de tehnici de colorare
Tehnica Componente Nucelu Citoplasma Colagen Fibre
elastice
Fibre
reticulare
Hematoxilin- Hematoxilin i Albastru Roz Roz Variabil
5
eozin eozin
Colorare
elastic Weigert
Rezorcin i
fucsin, HCl,
hematoxilin,
acid picric, acid
acetic glacial
Gri Galben Rou Negru
Impregnare
argentic
Soluie salin de
argint
Maro
nchis
Negru
2. O multitudine de ali colorani sunt utilizai n diverse procedee citologice. Cu toate
c sunt folositoare pentru vizualizarea diverselor componente celulare, de obicei nu
realizeaz o analiz a compoziiei chimice a celulelor studiate. Pe lng colorare,
impregnarea cu metale, de tipul argintului sau aurului este o tehnic mult mai utilizat,
n special n studii ale sistemului nervos.
3. n microscopia electronic, imaginea format se datoreaz capacitii celulelor sau
colorantului de a absorbi sau a mprtia electronii. Sruri de metale grele cum ar fi
citratul de plumb i acetatul de uraniu, determin o absorbie ridicat a electronilor sau
o capacitate de refracie i sunt coloranii de baz folosii n microscopia electronic.
III. MICROSCOPIA OPTIC
Investigaiile citologice se bazeaz pe preparatele microscopice numite extemporanee
sau nepermanente i cele permanente, care se examineaz fie la microscopul optic sau
fotonic, fie la alte tipuri de microscoape, cum sunt: microscoape cu fluorescen,
microscoape cu lumin ultraviolet (UV), microscoape cu cmp ntunecat, microscoape de
for atomic i microscoape electronice prin transmisie (TEM) sau prin baleiaj (SEM).
A. Microscopul optic uzual
1. Printre primele instrumente folosite pentru studiul celulelor a fost microscopul optic
(Fig. I-1), oferind posibilitatea studierii detaliilor ce nu pot fi observate cu ochiul liber.
Aceste detalii pot fi observate pe baza proprietilor luminii (natura ei ondulatorie), a
proprietilor optice ale materiei (dimensiuni, indici de refracie, coeficieni de absorie)
i a proprietilor fiziologice ale ochiului.
a. Formarea imaginii este supus legilor opticii. Microscoapele optice sau fotonice
utilizeaz pentru obinerea unei imagini mrite a preparatelor, efectele optice ale
lentilelor asupra radiaiilor fotonice ale spectrului luminos.
6
b. Pe retin se formeaz imaginea redus i rsturnat a tuturor obiectelor spre care
ne ndreptm privirea. Capacitatea ochiului de a distinge detaliile obiectelor vizibile
se numete acuitate vizual.
(1) Acuitatea vizual este condiionat de structura retinei i de distana care
separ detaliile unele de altele. Detaliile unui obiect pot fi vzute distinct numai
cnd imaginea lor se formeaz pe o regiune a retinei numit pata galben.
(a) Pentru ca dou puncte, A i B, ale unui obiect s fie percepute distinct este
necesar ca imaginile lor pe retin, a i b, s se formeze la o distan de 4 m;
dac distana respectiv este sub 4 m vom avea impresia existenei unui
singur punct.
(b) Explicaia const n aceea c cele dou imagini a i b, trebuie s se formeze
pe dou celule cu conuri din retin separate printr-o alt celul neimpresionat,
diametrul unui con fiind de 4 m.
(2) La aceast distan de 4 m a proieciei pe retin corespunde o distan AB de
0,1 mm (100 m) dac obiectul se afl la distana vederii distincte a ochiului
normal (20-25 cm). Distana minim la care dou puncte se pot observa distinct se
numete distan separatoare minim sau putere de rezoluie (rezoluie) (Fig I-
2). Rezoluia ochiului uman este prin urmare de 100 m.
c. Microscopia se bazeaz pe proprietatea lentilelor convergente de a da imaginea
unui obiect luminos aezat naintea lor, la o anumit distan (Fig. I-3).
(1) Dac obiectul AB se afl n faa unei lentile convergente, la o distan mai
mare dect distana focal (f), de cealalt parte a lentilei se va forma imaginea
real, mrit i rsturnat, ab, la ntlnirea razelor refractate cu axele
secundare.
(2) Dac obiectul este ntre lentil i focar, imaginea obiectului se va forma
naintea lentilei (i napoia obiectului), imaginea fiind mrit, dreapt i virtual.
Se numete virtual fiindc nu poate fi proiectat pe un ecran sau pe o plac
fotografic, spre deosebire de cea real.
2. Microscopul este compus din dou sisteme de lentile: un sistem numit obiectiv, n
faa cruia se aeaz obiectul i un sistem numit ocular, prin care privim imaginea
proiectat de obiectiv, la fel cum am privi cu o lup un obiect (Fig. I-4, Fig. I-5).
a. Sistemele de lentile au o construcie special pentru a elimina aberaiile lentilelor.
b. n mod simplificat putem considera obiectivul i ocularul echivalente fiecare unei
lentile convergente.
7
0
0,6
sin
d
n