1.

Metode de fixare si fixatori utilizati in microscopia optica

Fixarea este etapa decisiva in obtinerea unui preparat microscopic permanent. Este un proces fizic sau chimic prin care sunt oprite cat mai rapid procesele vitale celulare, pastrandu-se cu alterari minime volumul , forma , relieful si raporturile spatiale si moleculare. Prin fixare urmarim : 1. Conservarea tesuturilor 2. Prevenirea pierderii de constituenti celulari 3. Cresterea diferentierii optice a structurilor celulare 4. Marirea consistentei tesuturilor in scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape ale tehnicii si mai ales pentru sectionare Clasificara fixatorilor: a. Dupa natura lor: 1. fizici 2. chimici b. Dupa reactia pe care o au cu proteinele solubile: 1. coagulanti 2. necogulanti Fixatorii chimici: 1. simpli: acetona , acid tricloracetic , formol , acid osmic , alcool metilic 2. amestecuri fixatoare: introduse in practica datorita afinitatii inegale pentru diversele elemente structurale Mecanismul fixarii: 1. insolubilizarea prin precipitare a unor constituenti celulari: proteine , glucide , saruri minerale, lipide 2. formarea de compusi de aditie intre fixator si unii constituenti celulari 3. coagularea proteinelor Calitatile unui bun fixator: 1. patrunde bine in tesuturi 2. stabilizeaza tesuturile pastrand nealterate caracterul si distributia constituentilor celulari 3. nu provoaca artefacte 4. nu deformeaza tesutul 5. nu dizolva constituenti 6. distruge microorganismele 7. extrage enzimele autolitice inactivate 8. confera consistenta 9. produce diferentiere optica 10. nu-si modifica compozitia 11. ieftin, netoxic, neinflamabil, neiritant

2. Incluzia si masele de incluziune in microscopia optica

Incluziunea este procedeul prin care se realizeaza conditii optime care sa permita taierea pieselor in sectiuni subtiri de ordinul m, transparente si cu fete plane astfel incat sa poata fi examinate la microscop. Mase de incluziune : 1. Dupa modul de realizare al includerii: a. Penetreaza celula b. Ramane in spatiul intercelular 2. Dupa solubilitatea in apa: a. anhidre: parafina , celoidina , paraplastul b. apoase: gelatina , polietilenglicol Incluziunea la parafina etape premergatoare: deshidratare alcool in concentratii crescande incepand cu 50 fiecare in 3 bai successive; clarificare indepartarea alcoolului din piesa cu ajutorul unor reactivi numiti clarificatori, miscibili cu parafina, care fac ca piesa sa devina translucida. Se efectueaza cu alcool anilic sau cu hidrocarburi benzenice (xileni); impregnarea patrundere a piesei cu parafina topita si solidificarea in bloc prin racire pentru a oferi o consistenta omogena; turnarea blocurilor blocul inglobat se monteaza pe un port-obiect.

3. Criteriile unuei bune fixari in microsopia electronic

Absena spaiilor astructurate Continuitatea membranelor Aspectul particular al unor organite Aspectul general este acelai de fiecare dat, indiferent de fixatorul sau metoda folosit

4. Puterea de rezolutie a microscopului optic

Microscopul optic este un dispozitiv cu ajutorul cruia se pot examina structuri cu dimensiuni mult sub puterea de rezolutie a ochiului uman. Performantele microscopului optic sunt puterea de marire si puterea de rezolutie. Puterea de rezolutie: cea mai mic distan dintre dou puncte la care acestea pot fi percepute distinct ; de ea depinde claritatea i bogia n detalii a imaginii; depinde de lentila obiectivului; FORMULA LUI ABB : d=/ n sin = lungimea de unda a radiatiei electromagnetice ( 0,55 m) 2

n= indicele de refractie al mediului dintre preparat si obiectiv = din apertura unghiulara a obiectivului Limitarile puterii de rezolutie a microscopului optic in practica: este o constanta naturala ce nu poate fi influentata (0,55) mediul dintre preparat si obiectiv este de obicei aer (n = 1) la obiectivul cu imersie intre obiectiv si preparat se interpune o picatura de lichid cu un indice de refractie supraunitar, cum este uleiul de cedru (n=1,51) apertura unghiulara maxima teoretica este 180 , deci =90, limita teoretica maxima a sin =1 Rezolutia maxima a microscopului optic = 0,2 !!!

5. Etapele de obtinere a preparatului microscopic permanent in microscopia optica

1. Recoltare: operatia prin care obiectul de examinat este prelevat de la omul sau animalul viu (bioptica) sau dupa sacrificarea animalului sau de la cadavru (necroptica). Conditii: cat mai aproape de momentul decesului pentru a evita procesele de autoliza. dimensiunea pieselor sa nu depaseasca 5 mm calitatea instrumentelor bine ascutite pentru a evita zdrentuirea si pierderea paralelismului dintre planuri adecvata in functie de tipul organului ; se vor evita modificarile de volum, forma si relief. 2. Fixare: etapa decisiva in obtinerea unui preparat microscopic permanent; un proces fizic sau chimic prin care sunt oprite cat mai rapid procesele vitale celulare, pastrandu-se cu alterari minime volumul , forma , relieful si raporturile spatiale si molecular. 3. Tratamente postfixare: decalcifierea, disocierea pieselor, mordansarea . 4. Spalare 5. Includere: procedeul prin care se realizeaza conditii optime care sa permita taierea pieselor in sectiuni subtiri de ordinul m , transparente si cu fete plane astfel incat sa poata fi examinate la microscop. 6. Sectionare: mecanismul prin care piesa inclusa sau inghetata se taie in felii subtiri de ordinul micronilor cu ajutorul unui aparat numit microtom. 7. Colorare sau impregnare: prin acest proces se urmareste cresterea contrastului intre elementele tisulare sau celulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor; tehnica de colorare depinde de natura fixatorului si de tesutul pe care se aplica. 8. Montare: pentru protejarea sectiunilor fragile de eventualele deteriorari, conservarea coloratiei si asigurarea unui mediu optic omogen si transparent necesar examinarii microscopice; mediile de montare pot fi apoase (glicerina, sirop Apathy) sau anhidre (balsam de Canada, colofoniu) 9. Etichetare: pe fiecare lama se noteaza tipul cellular, sursa de recoltare, fixatorul, metoda de colorare, data efectuarii.

6. Etapele de obtinere a preparatului microscopic permanent in microscopia electronica

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Recoltare Fixare Deshidratare Clarificare Impregnare Incluzie Sectionare Diferentierea structurilor prin contrastare Montare pe grila

7. Principiul si rolul fixarii in obtinerea preparatului microscopic permanent

Mecanismul fixarii: 1. insolubilizarea prin precipitare a unor constituenti celulari: proteine , glucide , saruri minerale, lipide 2. formarea de compusi de aditie intre fixator si unii constituenti celulari 3. coagularea proteinelor Prin fixare urmarim : 1. Conservarea tesuturilor 2. Prevenirea pierderii de constituenti celulari 3. Cresterea diferentierii optice a structurilor celulare 4. Marirea consistentei tesuturilor in scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape ale tehnicii si mai ales pentru sectionare

8. Principiul imunofluorescentei
Imunofluorescenta se refera la punerea n eviden a diferiilor antigeni cu ajutorul unor anticorpi specifici marcai cu un compus fluorescent IZOTIOCIANAT DE FLUORESCEINA (FITC). Aceasta este de 2 tipuri: directa (Ag + Ac specific marcat) si indirecta (Ag + Ac specific + Ac sec. marcat; are sensibilitate mai mare; se foloseste in cazul in care antigenele se gasesc in cantitate mica in tesut).

9. Principul de functionare al microscopului cu contrast de faza

Lumina care trece prin medii cu indici de refracie diferii i modific direcia i viteza. Astfel, microscopul cu contrast de faza transform aceste diferene n diferene de intensitate luminoas.

10. Clasificarea colorantilor

Dupa natura lor: Naturali - vegetali : hematoxilina ,safranina , orceina , turnesolul - animali : carminul Sintetici : albastru de metil Dupa caracterele chimice: Acizi: sunt de obicei sruri de acizi organici , gruparea auxocrom principal fiind ncrcat electric negativ (se ataeaz pe un substrat morfologic ncrcat electric pozitiv). Bazici: gruparea auxocroma principal ncrcat electric pozitiv , deci se va ataa pe un substrat ncrcat negativ. Neutri: grupri auxocrome principale ncrcate electric pozitiv i negativ, fiind soluii apoase de colorani bazici i acizi ntr-o anumit proporie.

11. Coloratia hemalaun eozina

Implica 2 colorani: hemalaunul colorant bazic eozina colorant acid REZULTATE - nuclei albastru violet - citoplasma roz rosu

12. Principiile colorarii

Substratul molecular la nivelul crora se fixeaz coloranii prin legturi electrochimice i de hidrogen este reprezentat de proteine. In funcie de tipul gruprilor ionizabile din structur , proteinele sunt 1. acide 2. bazice 3 . neutre Colorant bazic substrat (=proteina) acid (ex: hemalaunul) Nucleul - caracter bazofil: albastru-nchis / violet Colorant acid substrat bazic (ex: eozina) Citoplasma caracter acidofil: roz/rou

13. Coloratia topografica: definitie, exemple, rezultate

COLORAIA HEMALAUN EOZIN

hemalaunul colorant bazic eozina colorant acid nuclei albastru - violet citoplasma roz- rosu

REZULTATE

COLORAIA HEMALAUN EOZINA CU ALBASTRU DE METIL

hemalaun eozina albastru de metil Nuclei violet Citoplasma albastru cenusiu Fibrele de colagen albastru intens

REZULTATE

COLORATIA VAN GIESON

hematoxilina feric acidul picric fuxina acid Nuclei negri Citoplasma galben Fibre de colagen rou intens

REZULTATE

COLORATIA MASSON

hematoxilin feric soluia colorant A ce conine fuxin acid soluia colorant B ce conine albastru de anilin Nuclei negru Citoplasma rou violet deschis Fibrele de colagen albastru intens

REZULTATE

COLORATIA MALLORY

fuxin acid albastru Mallory ( contine albastru de anilina i orange G ) Nuclei - rou intens Citoplasma roie Fibre de colagen i reticulin albastru esut muscular neted - violet esut muscular striat - rou portocaliu

REZULTATE

COLORATIA AZAN

azocarmin C albastru Heidenhein , cu anilin i orange G Nuclei rou viu Citoplasma rou Fibre de colagen i reticulin albastru deschis esut muscular striat rou , orange sau galben

REZULTATE

14. Coloratiile citologica: definitie, exemple, rezultate

Coloratiile citologice sunt utilizate pentru evidenierea anumitor organite celulare. METODA CAJAL DA FANO

- evidenierea complexului Golgi

REZULTATE

Nuclei necolorai Aparatul Golgi reea perinuclear de culoare neagr Citoplasma aurie

METODA HEMATOXILINA FERICA REGAUD

- evidenierea mitocondriilor
REZULTATE

Nucleu necolorat Nucleol negru Mitocondrii puncte negre

15. Tehnici de evidentiere la microscopul optic pentru fibrele conjunctive

1. Fibrele de reticulin - se examineaz folosind o metoda electiv - IMPREGNAREA ARGENTICA - apar colorate n negru Fibrele elastice - se poate utiliza coloraia cu Rezorcin fuxina - albastre Orcein cafeniu - roscate Tesutul conjunctiv - coloratia cu albastru de toluidina - granulaiile din mastocite prin coloraie metacromatic n rou violet

2.

3.

16. Metode de evidentiere a organitelor celulare la microscopul optic

coloratiile citologice -

17. Impregnarea argentica: principiu, rezultate

evidentierea interstiiului dintre celulele epiteliului din seroase limitele intercelulare apar net n culoarea neagr

18. Tehnici de evidentiere la microscopul optic pentru organitele specifice neuronale

- pentru evidenierea esutului nervos

- metoda Nissl - impregnare argentic - evidenierea tecii de mielin prin fixare cu tetraoxid de osmiu

19. Metode de evidentiere a miofibrilelor la microscopul optic

METODA HEIDENHEIN (cu hematoxilina ferica) evidentiaz structura periodic a miofibrilelor se remarc alternana de zone clare i ntunecate.

20. Evidentierea la microscopul optic a limitelor intercelulare

prin impregnare argentica

evidentierea interstiiului dintre celulele epiteliului din seroase limitele intercelulare apar net n culoarea neagr

21. Evidentierea la microscopul optic a acizilor nucleici

prin fluorescenta secundara dup marcare cu compui fluoresceni : o Acridin orange ADN-verde/ ARN-rosu o Quinacrina cromozomi = bandare

22. Tehnica de evidentiere la microscopul optic pentru glicoproteine

Metoda PAS ( per-iodic acid Schiff): evidenierea glicogenului, GAG, glicoproteinelor si glicolipidelor ; grupri glicol, prin oxidare cu acid per iodic, se transforma in grupri aldehidice care dau cu reactivul Schiff un precipitat rosu violaceu vizibil la M.O. (Metoda PAS - GLICOGEN : specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se consider c structurile colorate PAS care dispar n urma pretratamentului cu amilaz conin glicogen) Metoda cu carmin amoiacal BEST: evideniaz glicogenul, polimer cu solubilitate redus n ap. Daca fixarea lui nu este prompt, enzimele hidrolitice l descompun n glucoz care este foarte solubil n ap i difuzeaz (granule roii n citoplasm) Bazofilia : proprietatea substanelor glucidice de a se colora cu colorani bazici de tipul albastru alcian i albastru de metil; poate fi utilizat i pentru evidenierea lipidelor i proteinelor cu caracter acid

Metacromazia: Capacitatea unui substrat de a se colora ntr-o alt culoare dect cea a colorantului (existena unor grupri anionice aflate la o distan foarte mic una de alta formnd agregate cu proprieti de absorbie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate).

23. Metacromazia
Metacromazia: Capacitatea unui substrat de a se colora ntr-o alt culoare dect cea a colorantului (existena unor grupri anionice aflate la o distan foarte mic una de alta formnd agregate cu proprieti de absorbie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate).

24. Tehnica de fixare a frotiului sangvin

se realizeaz intinderea celulelor n monostrat pe o lamel de sticl. Pot fi examinate : o celulele sangvine o celulele epiteliale descuamate sau exfoliate o sedimentele celulare o amprente de esuturi sau organe parenchimatoase

1. recoltare 2. ntindere: se folosesc dou lame de sticl o lama portobiect cea pe care se efectueaz frotiul o lama executoare cu care se ntinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45 3.uscare

25. Coloratia panoptica May Grunwald Giemsa

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM pentru colorarea frotiului sangvin. 1. solutia May-Grunwald conine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic i glicerin neutr 2. solutia Giemsa contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra Frotiul trebuie sa fie : subire cu un singur strat de celule ntins uniform ambele margini pe lama se termin n franjuri pe lam , ocupnd cca. 2/3 din aceasta la margine se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine REZULTATE nuclei violet citoplasmele agranulocitelor albastru citoplasmele granulocitelor roz granulaii: - neutrofile rou- violet - bazofile albastru nchis spre negru - eozinofile rou portocaliu 9

26. Contrastarea in microscopia electronica 27. Citometria in flux

Citeometria in flux permite analiza i separarea celulelor pe baza unor caractere morfologice i biochimice. Ofer informaii asupra : 1. mrimii relative a celulelor 2. granularitii interne (neomogenitatea intern citoplasmatic) relativ 3. intensitatea relativ a fluorescenei. Utilitate: 1. msurarea caracteristicilor fizice ale celulei 2. identificarea si separarea populaiilor de celule sanguine (granulocite, monocite, limfocite) 3. msurarea cantitii de ADN din celul 4. msurarea cantitii intracelulare de Ca 5. masurarea pH-ului intracelular

28. Membrana nuclear: ultrastructura, complexul por nuclear

prezent doar n interfaz alctuit din membranele nucleare intern i extern si cisterna perinuclear membrana extern se continu cu cisterne RER i poate prezenta pe suprafa ribozomi ataai structur de bistrat fosfolipidic enzime ataate: G6Paz ambele membrane au dimensiuni sub limita de rezoluie a MO i pot fi observate doar n ME membrana intern vine n raport cu o structrur fibrilar lamina densa interna (lamina nuclear) lamina nuclear: o filamente intermediare polimeri de laminine o implicat n asamblarea i dezasamblarea nveliului nuclear ntre cele 2 membrane se delimiteaz cisterna perinuclear membranele se unesc la nivelul COMPLEXULUI POR, alctuit din: o 8 subuniti anulare o inel citoplasmatic cu prelungiri fibrilare subiri o inel nucleoplasmatic cu fibrile lungi, unite distal de inelul distal o particula central

29. Nucleol: microscopie electronic

implicat n sinteza ribozomilor nedelimitat de endomembran ME: zon electronodens, neregulat, cu structur fibrilogranular 3 componente distincte: o centrul fibrilar conine gene pt ARNr o zona dens fibrilar zona de transcripie genic o zona granular- conine ARN ribozomal 10

30. Specializari membranare de pol apical

31. Ciclul secretor celular

Circuit urmat de substanele sintetizate intracelular pn la destinaia lor final Realizat prin intermediul sistemului de endomembrane 2 destinaii finale: o intracelular ( ex: lizozomii) o extracelular (ex: proteinele de export) sintez proteic la nivelul RE transport prin microvezicule ctre ap. Golgi mpachetare, sortare i etichetare n ap. Golgi expediere ctre destinaiile finale studiat pentru prima dat de profesorul George Emil Palade, folosind autoradiografia. administrarea n perfuzie a unor aminoacizi tritiai, urmrindu-se localizarea radioactivitii la diferite intervale de timp: o dup 3 min., emisia radioactiva era localizat perinuclear (RE) o dup 20 min. radioactivitatea era maxim n zona ap. Golgi, o iar dup 90 min. - la polul apical al celulei

32. Reticul endoplasmatic: aspect si evidentiere la M.O., aspect electrono microscopic

enzima marker: G6P aza prin prezenta endomembranei are loc mrirea suprafeei la nivelul creia se desfoar procesele metabolice are loc crearea unor microcompartimente cu particularitate enzimatica (identificarea particularitilor funcionale prin determinarea enzimelor structurale specifice)

33.Mitocondria: aspect si evidentiere la M.O., aspect electrono microscopic

METODA HEMATOXILINA FERICA REGAUD

- evidenierea mitocondriilor la M.O.

REZULTATE

o Nucleu necolorat o Nucleol negru o Mitocondrii puncte negre organit delimitat de endomembrane cu rol n producerea energiei structura tipic conine ADN circular se poate divide independent forma, numrul si aspectul cristelor difer n funcie de caracteristicile celulei n care se gsesc nalt polimorfism

11

34. Lizozomul: aspect electrono microscopic

organit delimitat de endomembrana aspect electrono dens la M.E. forma sferica

35. Peroxizomul: aspect electrono microscopic

implicai n digestia proteic complexe proteice 26S, alctuite, la mamifere, din: o subunitate de 20S componenta major a proteolizei o subunitate 19 S rol adjuvant formaiuni cilindrice alctuite din 3 discuri suprapuse 15nm nime i 11 nm diametru structural aprox. 28 subuniti distincte, ce formeaz o structur cilindric riguros organizat siturile active sunt situate la interior.

12