UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE “GR. T.

POPA”
FACULTATEA DE BIOINGINERIE MEDICALA
DISCIPLINA INGINERIE CITOTISULARA

OBȚINEREA ȘI EVALUAREA UNUI BIOMATERIAL COMPOZIT PE BAZĂ

DE COLAGEN ȘI HIDROXIAPATITĂ CU POTENȚIALE APLICAȚII ÎN
INGINERIA TISULARĂ A OSULUI

Scopul lucrării

Scopul lucrării constă în însușirea metodologiei de realizare a unui biomaterial

compozit pe bază de polimeri naturali (colagen) și materiale anorganice (hidroxiapatită) și
evaluarea caracteristicilor acestuia în vederea utilizării ulterioare ca substituent osos.
În cadrul lucrării de laborator se va obține un biomaterial compozit în condiții
biomimetice, prin generarea hidroxiapatitei pe fibra de colagen reconstituită și se vor evalua
caracteristicile acestui biomaterial: capacitatea de retenție a lichidelor biologice și
proprietățile mecanice, respectiv rezistența la compresiune și modulul de elasticitate.

Considerații teoretice

Medicina actuală utilizează diferite metode și tehnici pentru reconstrucţia defectelor

osoase apelând la grefele biologice care includ: autogrefele (grefe prelevate de la același
individ), alogrefele (grefe provenind de la un donator din aceeași specie cu beneficiarul) și

1
xenogrefe (grefe prelevate de la un donator dintr-o specie diferită de cea a beneficiarului).
Utilizarea acestor grefe biologice ridică însă o serie de probleme legate de:
- riscul transmiterii unor maladii infecțioase și de natură virală (HIV, hepatită, etc);
- conservarea grefelor;
- probleme de etică privind donațiile de organe, etc.
Rezolvarea acestor neajunsuri a presupus folosirea unor materiale de substituție a
osului sau care să ajute la regenerarea acestuia, luând în considerare funcția pe care o
îndeplinește grefa osoasă: un suport capabil să restabilească volumul osos, prin intermediul
elementelor vasculare și a celulelor, astfel încât să aibă loc remodelarea osoasă completă,
după care acesta să fie resorbit sau îndepărtat. Astfel, s-a propus o gamă variată de materiale
naturale și/sau sintetice care pot fi utilizate ca substituenți osoși: colagen, chitosan, acid
hialuronic, poli (acid lactic), poli (acid glicolic), hidroxiapatită, sticle bioactive, fosfați de
calciu, magneziu, fier, tantal [1-4]. Dintre aceste materiale, s-au remarcat ceramicile de
hidroxiapatită, combinate cu materiale colagenice. În Fig.1 sunt prezentate câteva exemple de
grefe osoase.

Fig.1. Tipuri de grefe osoase: A. Alogrefă Straumann; B. Substituent osos pe bază de β-fosfat
tricalcic (β-TCP); C. Substituent osos compozit pe bază de polimeri și fosfat octocalcic

2
 Materialele colagenice prezintă avantajul unei foarte bune biocompatibilitați dar sunt
puțin osteoconductoare. Din acest motiv, realizarea unui biomaterial în care hidroxiapatita
(Ca5(OH)(PO4)3) să se genereze "in situ" constituie o variantă viabilă de obținere a unui
suport cu proprietați superioare. Modul în care se distribuie hidroxiapatita în cadrul
procesului continuu de osificare este un subiect intens studiat, cercetările efectuate arătând că
sărurile minerale, organizate în structuri cristaline (Fig. 2) intră în relație cu elementele
organice.

Fig. 2. Dispoziția atomilor din hidroxiapatită

Mecanismul și natura relațiilor dintre elementele anorganice și cele organice nu sunt

încă bine precizate. S-a putut stabili însă, faptul că microcristalitele se orientează preferențial
în jurul fibrelor de colagen și se dispun paralel cu axa lungă a acestora (Fig. 3).

Fig. 3. Reprezentare schematică a relației de autoorganizare (depunerea direcțională a

hidroxiapatitei pe colagen) și interacțiunea interfacială în compozitul pe bază de colagen și
hidroxiapatită [5]

3
 Simularea acestui proces "in vitro" este posibilă prin sinteza hidroxiapatitei pe fibra
de colagen reconstituită în timpul formării biomaterialului compozit mineralo-proteic.
Utilizarea acestui produs în ingineria tisulară a osului presupune evaluarea lui fizico-
chimică, respectiv biologică, conform schemei din figura 4.

Fig. 4. Schema metodologică de evaluare a biomaterialului compozit mineralo-proteic

Materiale și aparatură

Materiale Aparatură
- Soluție de colagen de conc. 1% Analizatorul de textură - Texture Analyzer
TA.XTplus.
- Soluție de poli (alcool vinilic) Balanță analitică
(PAV), de conc. 15%
- Hidroxiapatită Etuvă

- Soluție CaCl2 40% pH-metru

- Soluție NaH2PO4 25% Mojar cu pistil
- NH4OH Hârtie de filtru
- Soluție NaH2PO4 0.1M Placă de cultură cu 24 godeuri
- Soluție Na2HPO4 0.1M Hârtie de pH
- Soluție tampon fosfat 0.1M

4
 Modul de lucru

Se realizează o masă fibroasă de colagen reconstituit, de concentrație 4%, prin

modificarea pH-ului unei soluții de colagen, de concentrație 1% pînă la valoarea pH-ului
izoelectric (4,85), separarea masei fibroase de soluție apoasă prin centrifugare și diluare până
la concentrația stabilită.
Concomitent se prepară următoarele soluții în apă distilată:
- PAV 15%; CaCl2 40%; NaH2PO4 25%;
Într-un mojar se introduc 5g pastă de fibre de colagen și 1.5 ml soluție PAV. Se
omogenizează amestecul. Se adaugă 1 ml soluție apoasa CaCl2 40% și 1.2 ml soluție
NaH2PO4 25% amestecând continuu sistemul. Se modifică pH-ul până la o valoare egală cu
6, prin adaos de soluție NH4OH, pentru a genera hidroxiapatită.
Într-o placă de cultură cu 24 godeuri se introduc câte 0.5 g amestec/godeu. Ansamblul
se menține la etuvă la 60 oC timp de 45 minute. Se va obține un material poros în care
hidroxiapatita va fi orientată pe direcția fibrelor colagenice.
În același timp se realizează un amestec după metodologia descrisă anterior, cu
aceeași compoziție în fibră de colagen, același conținut de polimer sintetic (PAV) dar sărurile
de Ca și Na se înlocuiesc cu 0.5 g hidroxiapatită preparată anterior. Condițiile de formare se
păstrează aceleași.
Ulterior, biomaterialele se caracterizează din punctul de vedere al capacității de
interacțiune cu apa, respectiv cu soluție tampon fosfat, pH=7.4, 0.1M, utilizând procedeul
gravimetric. Evaluarea capacității de interacțiune cu lichide furnizează informații cu privire la
posibilitatea pătrunderii de nutrienți din mediul biologic în interiorul substituentului.
Determinarea capacității de interacțiune cu lichide
Din materialele compozite obținute se cântăresc câte 6 bucăți având fiecare masa
egală. În 3 flacoane de 50 ml se introduc câte 30 ml apă distilată, iar în alte 3 flacoane câte 30
ml soluție tampon fosfat, pH=7.4, 0.1 M, temperatura de 37oC. Se imersează filmele în cele 6
pahare. La intervale de timp prestabilite, 2 min, 5 min, 10min, 20min, 30 min, 45min, 60 min,
se scot materialele din soluții, se îndepărtează excesul de lichid prin tamponare cu hârtie de
filtru și se cântăresc.

5
 Exprimarea rezultatelor
Se determină cantitatea de soluție absorbită de 1g probă cu relația:
m i =m i’/ m 0
unde m i - masa de soluție absorbită de un gram de probă la momentul t i
m i’- masa de soluție absorbită de probă de masa mp la momentul t i
m 0 - masa probei
La t=0 : m=0
t=t 1=t 1’ m 1=m 1 ’/ m 0
t=t 2=t 2’+t 1 m 2=m 2’/ m 0
............................................
t=t i=t n’+t n-1 m i=m n’/ m 0

Dacă se notează în relația (1) m  -m i= se obține :

-d/dt=k u* (1)
-d/ =k u*dt (2)

Rezolvând ecuația (2) rezultă : -ln = k u*t - ecuația unei drepte

Dacă se reprezintă grafic ln=f(t) se obține o dreaptă având panta egală cu ku
(constanta vitezei de interacțiune cu lichide). Variația lui ku pentru cele două biomateriale
evidențiază influența condițiilor de obținere a acestora asupra procesului de retenție a
lichidelor.

Evaluarea proprietăților mecanice. Determinarea rezistenței la compresiune

În proiectarea unor substituenți osoși trebuie să se aibă în vedere faptul că aceștia

trebuie să fie stabili din punct de vedere mecanic, adică să nu se rupă sau să se deformeze
excesiv în timp. În funcţie de aplicaţia pentru care sunt folosiți, aceștia trebuie să reziste la
unele solicitări, cum ar fi: compresiune, tracţiune, încovoiere, forfecare, rupere, oboseală,
abraziune, eroziune, frecare şi să aibă un modul de elasticitate corespunzător, preferabil cât
mai apropiat de cel al osului. Solicitările mecanice la care este supus un substituent osos vor
duce la apariția unor eforturi de forfecare la interfața implant-os, eforturi a căror intensitate
va fi cu atât mai importantă, cu cât va fi mai mare diferenţa dintre modul de elasticitate al
6
ţesutului osos şi cel al materialului implantat. Aceste solicitări sunt responsabile de
producerea unui ţesut fibros, cu atât mai consistent cu cât interfaţa este mai instabilă din
punct de vedere mecanic. În plus, amplitudinea solicitării mecanice determină natura reacţiei
tisulare, în sensul că, în funcţie de intensitatea lor, solicitările la compresiune pot orienta
reacţia tisulară spre fibrogeneză (formarea unui ţesut fibros) sau osteogeneză (formarea unui
nou ţesut osos).
În cadrul lucrării de laborator se va determina rezistența la compresiune folosind
analizatorul de textură - Texture Analyzer TA.XTplus (Fig. 5).

Figura 5. Realizarea testului de compresiune

Cu ajutorul acestui dispozitiv se pot determina și alte proprietăți precum: duritate,

fragilitatea, aderența, rezistența la tracțiune, extensibilitate. În funcţie de proprietatea testată
şi tipul probei, dispozitivul are o serie de platforme şi accesorii care se ataşează de partea
superioară a dispozitivului printr-un adaptor special (Fig. 6). În primele două rânduri se
regăsesc accesoriile cilindrice cu suprafaţă de acţiune plată, cu diametrul cuprins între 2 mm
şi 50 mm realizate din diverse materiale: oţel inoxidabil, aluminiu, polioximetilenă şi poli
(metacrilat de metil).
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute se va utiliza accesoriul
cilindric din figura 6.B., fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (33.7 mm) și se va ataşa
platforma pentru greutate mare (Fig. 5).

7
 Fig. 6. Accesoriile dispozitivului Texture Analyzer TA.XTplus

Determinarea rezistenței la compresiune

Probele de forma circulară vor fi masurate (dimensiunile: diametru, înălțime), după care
vor fi supuse testului de compresiune folosind parametrii:
- viteza de pre-test de 0.1mm/sec,
- viteza de testare 0.5 mm/sec
- distanța de întoarcere – 6 mm.
Datele sunt capturate de software-ul Exponent în timpul procedurii şi redate sub formă
de grafice ce oferă detalii despre reacţia fiecărei probe la forţe specificate. Un exemplu de
curbă de solicitare este prezentat în Figura 7.

Fig 7. Curbă de solicitare pentru un material de substituție osoasă

8
 Pentru fiecare tip de material se va determina aria materialului, forța, rezistența la
compresiune și modulul de elasticitate, cunoscut în literatură sub denumirea de modulul lui
Young (Legea lui Hooke). Se vor efectua 5 determinări și se va calcula valoarea medie și
deviația standard pentru rezistența la compresiune și modulul de elasticitate, pe baza
următoarelor relații:

F= Fmax*0.0098 (N) (3)

unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv (g), iar F este forţa exprimată in
newtoni (N).

(4)

σ este rezistenţa la compresiune, iar în final se calculează modulul de elasticitate (E)

(5)

unde ε este deformarea (elongația).

Datele sunt incluse într-un tabel de forma:

Tabel. 1. Parametri testului mecanic

Grosime
Nr. Diametru Forta σ
Proba A(mm2) Forta (N) A(m2) E(N/m2)
exp. (mm) max (g) (N/m2)
(mm)

1
2
3
4
5
6

9
 BIBLIOGRAFIE

1. S. Kuttappan et al. Biomimetic composite scaffolds containing bioceramics and

collagen/gelatin for bone tissue engineering - A mini review. International Journal of
Biological Macromolecules 93 (2016) 1390–1401.
2. N. Bock et al. A novel route in bone tissue engineering: Magnetic biomimetic scaffolds.
Acta Biomaterialia 6 (2010) 786–796.
3. S. Wu et al. Biomimetic porous scaffolds for bone tissue engineering. Materials Science
and Engineering R 80 (2014) 1–36.
4. S. Kashte, A.K. Jaiswal, S. Kadam. Artificial Bone via Bone Tissue Engineering: Current
Scenario and Challenges. Tissue Eng Regen Med, 14 (2017), 1–14.
5. M. Kikuchi et al. Biomimetic synthesis of bone-like nanocomposites using the self-
organization mechanism of hydroxyapatite and collagen. Composites Science and
Technology 64 (2004) 819–825.

CHESTIONAR

1. Definiți grefa osoasă și dați exemple de materiale care pot fi folosite în ingineria
tisulară a osului.
2. Argumentați necesitatea obținerii în condiții biomimetice a unui biomaterial
compozit cu funcție de grefă osoasă.
3. Care sunt etapele unei evaluări fizico-chimice și respectiv biologice a unui
biomaterial compozit cu funcție de grefă osoasă ? Exemplificați cel puțin o etapă
de evaluare.

10