Curs de Biofizică

Vă rugăm: gândiţi!

9
Disciplina de Biofizică
şi Fizică medicală
Prof. dr. Cipriana Stefănescu
Sef lucr. dr. Irena Grierosu
MICROSCOPIA
ELECTRONICA
?
?
?
!
 Subiecte principale:

 Principiul fizic al microscopiei electronice

 Interacţiunea dintre un fascicul de electroni şi
preparat
 Partile principale ale unui microscop
electronic
- Microscopul electronic de transmisie - TEM
- Microscopul electronic de baleiaj – SEM

 Tehnici în relaţie cu microscopia electronică

 Istoria microscopiei electronice
DATA NUME EVENIMENT
1897 J. J. Thompson Descoperirea electronului
1924 Louis de Broglie Identificarea lungimii de unda a electronilor in miscare

=h/mv
unde:
 = lungimea de unda
h = constanta lui Planck
m = masa
v = viteza

(Pentru un electron la 60 kV,  = 0.005 nm)

1926 H. Busch Efectul de lentila (asupra electronilor) al câmpurilor
magnetice sau electrice
1929 E. Ruska (Teza de doctorat) cu privire la lentilele magnetice
1931 Knoll & Ruska Construirea primului microscop electronic
1931 Davisson & Proprietatile lentilelor electrostatice
Calbrick
1934 Driest & Muller Depăşirea rezoluţiei MO
1938 von Borries & Primul EM (Siemens) - 10 nm rezolutie
Ruska
1940 RCA EM comercial cu rezolutie 2.4 nm
Scala lucrurilor vizibile macro si
microscopic:
Rezoluţia
 Microscopia optica: detalii care nu sunt vizibile cu ochiul liber.
Microscopia electronica putem vedea detalii care nu sunt vizibile
nici cu ochiul liber si nici in microscopia optica.
a) Drosophila melanogaster, o musculiţă des folosita ca model
animal
b) detalii din zona capului (microscopie optica)
c) detalii ale ochiului (SEM) (Tobin, Morell)
Principiul fizic al microscopiei
electronice
Ipoteza: orice particulă în mişcare asociază o
undă cu lungimea de undă 

Ecuaţia lui Louis de Broglie, 1923:

 = h/p = h/mv Premiul Nobel,

Fizica, 1929

unde:
h = constanta lui Planck
p = impulsul particulei
m = masa particulei
v = viteza particulei
 Dacă viteza creşte,  scade,
puterea de rezoluţie creşte:
 = h/p = h / m v
dar
d = /2n sin u
pr = 1/d = 2n sinu / 
unde:
pr = puterea de rezoluţie
d = distanţa minimă dintre 2 puncte care pot fi văzute separat
n = indicele de refracţie
u = unghiul de deschidere al microscopului

Ex: pt. 10 kV,  = 130 nm (13 Å)

pt. 100 kV,  = 30 nm (3 Å)
 Interactiunea dintre
fasciculul de electroni si
preparat
 Tipuri de semnal dupa interactiunea
fascicului de electroni cu preparatul
Fascicul incident de electroni
(5 - 40 kV)
Electroni
retrodifuzaţi
Raze X:
Microanaliza
Semnal în vizibil, U.V., I.R. nucleara - semnalele
Fenomen de catodo- sunt de naturi
luminescenţa = informatii
diferite
asupra moleculelor Electroni
secundari: SEM - unele sunt
electroni Auger caracteristice
preparat atomilor sau
Electroni moleculelor
transmişi: din material
TEM - ele stau la
(fasc. de e-
accelerati Electroni
baza
la transmişi diferitelor
Electroni Electroni
30 - 100 kV împrăştiaţi
nedeviaţi
împrăştiaţi tipuri de ME
(difuzati) (difuzati)
inelastic elastic
 Producerea diferitelor tipuri de particule la
interactiunea electronilor incidenti cu atomii:

b
1
2
Imagini TEM
 Părtile principale ale unui
microscop electronic:
- Microscopia electronica de
transmisie = TEM
- Microscopia electronica de
baleiaj = SEM
Comparatie intre principiul microscopului optic si
cel al microscopului electronic:
Partile principale ale unui microscop electronic:

TEM SEM
Tunul electronic:
Filament Tungsten

Catod

Fascicul de
electroni

Anod

Efect termionic
Sursa de
electroni
 Lentilele electromagnetice
• Un câmp magnetic intens
este generat prin trecerea
unui curent electric
printr-o spirală metalică.
• Acest câmp magnetic
acţionează ca o lentilă
convexă asupra
traiectoriei electronilor.
• Distanţa focală poate fi
modificată prin
modificarea intensităţii
curentului electric.
• Imaginea este rotită
dependent de puterea
lentilei.
 TEM

Microscopul electronic
prin transmisie
Microscopul electronic de transmisie
comparatie cu microscopul optic

Sursa
Lentile condensor
Lentile obiectiv
Lentile de proiecţie
Principiul TEM
Se folosesc electroni
transmişi elastic prin
probă
e- sunt focalizaţi de
2 lentile condensor,
In final e- trebuie să
iradieze toată
suprafaţa probei
Proba este aşezată pe o
grilă
electrostatică
Lentilă obiectiv
Lentilă intermediară,
reglaj fin
Lentile de proiecţie
Ecran fluorescent sau film
 Grilă electrostatică: 100 nm
grosime (cupru, molibden, aur
platina)

Grosime preparat: sute de nanometri

 Imagine TEM

Bacillus subtilus

Cross section through rat ventricular myocytes. A.

Nucleus, B. Mitochondria, C. cross section of
myosin (thick filaments) and actin (thin filaments),
D. caveolae, scale bar 500nm
Parisa Asghari, Researcher in Dr. Ed Moore's lab,
Department of Cellular and Physiological
Sciences, UBC
Microscopul electronic prin
transmisie (TEM)
 Calitatea imaginii
Mărirea: raportul dintre mărimea imaginii şi
mărimea obiectului
Rezoluţia: 0,1 - 0,2 nm
Luminozitatea: depinde de numărul de electroni
transmişi (intensitatea fasciculului incident +
caracteristicile probei)
Marcheri electrono-opaci utilizati: elemente cu
numar atomic mare (Osmiu, Plumb) care cresc
contrastul (absorb electroni)
Raportul semnal/zgomot (semnal util/perturbator)
 mitocondrie

aparat Golgi

membrana

nucleu
 SEM

Microscopul electronic
cu baleiaj
 Principiu
Un spot de electroni baleiază suprafaţa probei (punct
cu punct)
Se folosesc electronii secundari emişi din probă
Energie mică (0 - 50 eV)
Imaginea se formează pe un ecran fluorescent sau
pe o peliculă fotografică
Se obţin imagini ale suprafeţei unei celule, a unui
microorganism sau a unui ţesut, de unde impresia de
imagine tridimensională.
Mărire maximum 200 000 x, cu rezoluţie de
3,5 nm.
 Microscopul
electronic cu
baleiaj (SEM)
Alcătuire:
- tun electronic: fascicul de
e- cu diametrul de 50 nm
- 2-3 lentile condensoare:
spot e- de 2 nm
- o lentilă condensoare de
reglaj fin
- detector, cristal de
scintilaţie, amplificare
- ecranul unui tub catodic
sau al unui monitor
Pereche de cromosomi umani, X şi Y, după
Nature (2003) 423: 810-812.
?
?
 Caracteristici
Mărire: maxim x 200 000 (dependentă de
lungimea baleiajului orizontal)
Rezoluţie 3,5 nm; cu atât mai bună cu cât
diametrul spotului este mai mic
Luminozitatea fiecărui punct depinde de
numărul de e- secundari emişi şi înregistraţi
din punctul respectiv (unghiul sub care cade
spotul de e- pe preparat, prezenţa metalelor grele
– emit mai mulţi e-).
Un fascicul de e- cu energie prea mare smulge
mai mulţi e- secundari; scade contrastul.
Influenţarea emisiei de electroni secundari:
- unghiul sub care cade spotul pe preparat,
- elementele grele apar mai luminoase, deoarece
emit mai mulţi electroni secundari,
- energia electronilor incidenţi: un fascicul de
electroni de energie mare smulge mai mulţi
electroni secundari, din toate zonele
preparatului, astfel încât micşorează contrastul.
 Imagini
SEM

Diferite granule de polen

SEM – eritrocite umane imbatrinite

limfocit B
 Leptocit si
microsferocit

Transformare in
sferocit

Hematii normale

Imagini
SEM Transformare in
echinocit
 Imagini SEM

Imagine SEM a unui Virusul gripei aviare este unul dintre cel
puțin o duzină de boli potential mortale
picior de musca infectioase care pot deveni mai frecvente
din cauza schimbărilor climatice globale.
 Imagini SEM

Paianjen acoperit cu
Imaginea SEM a
atomi de aur,
unui paianjen …
preparat pentru MEB
TEM versus SEM
 TEM versus SEM

In TEM electronii traversează preparate

foarte subţiri (50-1000 nm). Fascicul de e-
care iradiază toată suprafaţa probei (“bulk”).

In SEM semnalul (electroni secundari) este

emis de pe suprafaţa preparatului care are
grosime mai mare. Fasciculul de e- este
foarte fin (subţire).
 TEM versus SEM
SEM: imagini ale suprafeţei
TEHNICA REZULTATE
1 µm
Cilia
(a)
Scanning electron micro-
scopy (SEM). Micrographs taken
with a scanning electron micro-
scope show a 3D image of the
surface of a specimen. This SEM
shows the surface of a cell from a
rabbit trachea (windpipe) covered
with motile organelles called cilia.
Beating of the cilia helps move
inhaled debris upward toward
the throat.
 TEM versus SEM

Longitudinal Cross section

TEM: detalii ale section of
cilium
of cilium
1 µm
structurii interne:
(b) Transmission electron micro-
scopy (TEM). A transmission electron
microscope profiles a thin section of a
specimen. Here we see a section through
a tracheal cell, revealing its
ultrastructure.
In preparing the TEM, some cilia were cut
along their lengths, creating longitudinal
sections, while other cilia were cut
straight
across, creating cross sections.
 TEM versus SEM

Membrana glomerulara Capul unei … furnici

TEM versus SEM: limfocit infectat
de un retrovirus
 TEM
Microscopul electronic de transmisie (TEM)
1: Tunul de electroni. 2 Lentile electro-magnetice
pentru dirijarea si focalizarea fasciculului de
electroni in interiorul coloanei. 3: Sistemul
pompelor de vid. 4: Deschiderea prin care se
introduc obiectele pentru observatie in camera de
vidare. 5: Panouri de operare (stanga pentru
aliniere; dreapta pentru marire si focalizare;
sageti pentru pozitionarea obiectului in interior).
6: Ecran pentru afisarea meniului si a
imaginii. 7: Apa pentru racirea instrumentului.
SEM
Microscopul electronic de baleiaj (SEM)
1: Tunul de electroni. 2 Lentile electro-magnetice pentru
dirijarea si focalizarea fasciculului de electroni in
interiorul coloanei. 3: Sistemul pompelor de vid.
4: Deschiderea prin care se introduc obiectele pentru
observatie in camera de vidare in modul SEM normal.
5: Panoul de operare cu instrumente de focalizare,
aliniere si marire precum si un joystick pentru
pozitionarea obiectului. 6: Ecran pentru afisarea
meniului si a imaginii. 7: Unitate-Cryo pentru
prepararea materialelor inghetate inainte de
introducerea in camera de observare in modul Cryo-
SEM . 8: Partea de electronica a microscopului aflata sub
Tehnica de criofractură:
 Criofractura a permis evidenţierea
aranjării proteinelor în biomembrane
Tehnici
Tehnici în
în relaţie
relaţie cu
cu microscopia
microscopia electronică
electronică

Microanaliza nucleară - 1
1948-1950, Raymond Castaing - părintele
microanalizei nucleare = microscopiei
electronice analitice nucleare
(teza de doctorat)
kn = R(Z-)2 (n-2 - k-2) Principiu:
Legea Moseley: se referă la
radiaţia X caracteristică
emisă de atomi.
Frecventa radiatiei X emise
de un atom depinde de:
- numărul atomic Z al
elementului
- numerele cuantice
principale ale nivelelor
între care are loc tranziţia
(n,k)
- 2 constante (Riedberg - R,
o constantă de ecran - )
 Tipuri de semnal dupa interactiunea fascicului de
electroni cu preparatul
Do you
Fascicul incident de electroni remember ?
(5 - 40 kV)
Electroni
retrodifuzaţi
Raze X:
Microanaliza
Semnal în vizibil, U.V., I.R. nucleara - semnalele
Fenomen de catodo- sunt de naturi
luminescenţa = informatii
diferite
asupra moleculelor Electroni
secundari: SEM - unele sunt
electroni Auger caracteristice
preparat atomilor sau
Electroni moleculelor
transmişi: din material
TEM - ele stau la
(fasc. de e-
accelerati Electroni
baza
la transmişi diferitelor
Electroni Electroni
30 - 100 kV împrăştiaţi
nedeviaţi
împrăştiaţi tipuri de ME
(difuzati) (difuzati)
inelastic elastic
La interacţia unui fascicul îngust (sub un
micrometru) de electroni cu un eşantion,
fiecare element chimic produce radiaţii X cu
o lungime de undă caracteristică, conform
legii Moseley.

Cu ajutorul unui spectrograf de radiaţii X se

obţine reprezentarea grafică a lungimilor de
undă a radiaţiilor X emise şi se poate afla,
deci, natura chimică a elementelor prezente.
 Do you
2 posibilitati de obtinere a razelor X: remember ?

1 2
Se asociaza:
- TEM
- microsonda electronica
- spectrograf de radiatii X

1 - tun electronic,
2 - anod,
3 - lentila condensor,
4 - spectrometru cu raze X,
5 - lentila objectiv,
6 - preparat,

10 - sistem vacuum (vid).

Tehnici
Tehnici în
în relaţie
relaţie cu
cu microscopia
microscopia electronică
electronică

Microscopia ionica - 2
 Microscopia ionica
analitica

Imaginea unor atomi

de tungsten – prima
imagine in microscopia
ionica
 Principiu asemanator cu al SEM, dar se
utilizeaza un fascicul de ioni (rezultat din
trecerea unui curent printr-un mediu intens
ionizat) care interactioneaza cu suprafata
probei, determinand producerea de alti ioni

(ioni secundari), in relatie cu natura

atomilor de suprafata.

Acestia sunt colectati de un

spectrometru de masa si
determina
formarea imaginii.
Tehnici
Tehnici în
în relaţie
relaţie cu
cu microscopia
microscopia electronică
electronică

MET

Microscopul prin efect tunel

 Microscopul prin efect tunel
(MET)
Imaginea unui
fragment de Schema de principiu
ADN văzut
pentru prima
oară cu
ajutorul MET.

Atom de aur - imagine obţinută

cu MET
Imaginea obţinută cu
ajutorul unui MET -
se poate distinge
poziţia atomilor
 Microscopul electronic cu baleiaj
prin efect tunel (MET)
A fost proiectat (inventat) de Gerd BINNING (Germania) şi Heinrich ROHRER
(Elveţia) în anul 1982. În 1986 cei doi fizicieni au fost distinşi cu premiul Nobel pentru
Fizică, împreună cu Ernst RUSKA (Germania, pentru proiectarea şi construirea în
1933 a primului microscop electronic prin transmisie).
În cazul microscopului cu efect tunel (MET) nu este necesară o sursă externă de
radiaţii, energia fiind furnizată de înşişi electronii din stratul superficial al preparatului.
În conformitate cu fizica clasică, un electron poate părăsi atomul numai dacă
primeşte o energie mai mare decât energia sa de legătură. Adică, trebuie să treacă
„peste” bariera de potenţial. În mecanica cuantică, dat fiind caracterul dual al
electronilor, corpuscul şi undă, şi datorită incertitudinii poziţiei lor (principiul lui
Heisenberg) electronii pot trece „prin” bariera de potenţial, cu o probabilitate cu atât
mai mare cu cât bariera de potenţial este mai îngustă.
Acest efect poartă numele de EFECT TUNEL.
Conform mecanicii cuantice, ei formează, prin efect tunel, un nor de electroni
deasupra suprafeţei. Densitatea norului de electroni variază exponenţial cu distanţa:
scade de 10 ori la o distanţă de 1Å (10-10 m sau 0,1 nm). Acest fapt este folosit în
microscopul cu efect tunel.
 În principiu, MET este alcătuit dintr-un electrod (ac extrem de fin, cu
vârful format dintr-un singur atom), o parte electronică şi un calculator. Electrodul
se apropie de suprafaţa probei de examinat la o distanţă de circa 10 Å pentru a
pătrunde în norul electronic al atomilor probei. Se aplică o diferenţă de potenţial
de câţiva zeci de milivolţi între electrod (+) şi suprafaţă. Între electrod şi suprafaţa
preparatului apare un curent electric datorită efectului tunel care, după cum am
menţionat, constă în trecerea unor electroni prin bariera de potenţial. Acest curent
are o intensitate foarte slabă, de câţiva nA sau chiar pA. Ca urmare, este
indispensabil un sistem de amplificare. Electrodul baleiază o parte din suprafaţa
de câţiva micrometri pătraţi. În timpul acestui baleiaj un sistem electronic forţează
electrodul să îşi modifice distanţa (faţă de poziţie medie) astfel încât intensitatea
curentului tunel să fie păstrată constantă. Prin înregistrarea acestor variaţii de
distanţă se obţine un fel de hartă în relief şi în perspectivă a suprafeţei. Cea mai
mare dificultate constă în eliminarea oricărei vibraţii mecanice, care ar falsifica
rezultatele. De asemenea, este necesară prepararea suprafeţei în ultravid, pentru
prevenirea contaminării acesteia. Totodată, se impune controlul manevrelor de
apropiere a electrodului şi baleierea unor distanţe foarte mici ale suprafeţei. Dacă
se baleiază o lungime de 1 nm, care se afişează pe un ecran de 10 cm, rezultă o
mărire de 100 000 000 (108). Se poate obţine o rezoluţie laterală de 2Å. Cu
microscopul cu efect tunel pot fi identificate elementele chimice, deoarece norul
electronic are o configuraţie specifică fiecărui element.
 MET - elemente esentiale

densitatea norului de electroni variază

exponenţial cu distanţa.
EFECT TUNEL
rezoluţie de 2 Å
cu microscopul cu efect tunel pot fi
identificate elementele chimice, deoarece
norul electronic are o configuraţie specifică
fiecărui element.
Tehnici
Tehnici în
în relaţie
relaţie cu
cu microscopia
microscopia electronică
electronică

AFM

Microscopul de forta
atomica
 Microscopia de
forta atomica
BINNING a inventat în 1986
microscopul de forţă
atomică.
În acest caz se foloseşte
pentru explorarea
suprafeţei, în locul
curentului tunel, deplasarea
acului datorită forţei
exercitate între probă şi ac.
 Comparatie intre rezolutia
diferitelor tipuri de microscoape
STM: shaded area.
HM: high-resolution
optical microscope.
PCM: phase-contrast
microscope
(S)TEM: (scanning)
transmission electron
microscope
SEM: scanning electron
microscope
REM: reflection
electron microscope
FIM: field ion
microscope.
Binnig and Rohrer, 1982
 MO
Limfocite - SEM

Exemple de
limfocite
observate prin
diverse tehnici de
microscopie

TEM
 MO Exemple de
eritrocite
observate
prin diverse
tehnici de
microscopie
AFM

SEM

TEM
Bibliografie selectivă

Aurengo A., Grémy F., Petitclerc T. - Biophysique, Médecine-Sciences

Flammarion, Paris, 1998.
Dimoftache C., Herman S. – Principii de Biofizică umană, Ed.
Universitară “Carol Davila”, Bucureşti, 2003.
Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific
Publications, The Alden Press, Oxford, 1990.
Durand A., Escanyé J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed.
Ellipses, 2004.
Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.
Herman S. Aparatura medicală. Principiile fizice ale aparaturii medicale
moderne,Ed.Teora,Bucureşti, 2000.
Nölting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.
Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si
farmacie, Editura BIT, 2003.
Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universităţii „Al. I. Cuza”, Iaşi, 1988.
Rusu V., Baran T., Brănişteanu D. D. - Biomembrane şi patologie, vol. I,
Ed. Medicală, Bucureşti, 1988, 63-92, 286-292.
Rusu V. Note de curs. 2010.
Rusu V. – Nobel – Retrospectivă 1905 – 1995 – Laureaţii premiului
pentru fiziologie şi medicină, Ed. Omnia, Iaşi, 1996.
Rusu V si colab. Lucrări practice şi demonstraţii de Biofizică şi Fizică
Medicală, Ed. „Gr. T. Popa” Iaşi, 2003.
Rusu V. – Dicţionar medical, Ed. Medicală, Bucureşti, ed. IV, 2011.
Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes d’analyse
instrumentale, De Boeck Université, Paris, 2003.
Ştefănescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An
Introduction, Ed. Tehnopress, 2008.