Cultivarea microorganismelor (bacterii, virusuri, fungi)

OBIECTIVE: La sfârşitul lucrării practice studenţii trebuie:

1. Să cunoască principalele tipuri de medii de cultură utilizate pentru cultivarea bacteriilor si fungilor
2. Să cunoască tehnica însămânţării în 4 cadrane în scopul obţinerii culturii pure
3. Să poată descrie caracterele de cultură
4. Să cunoască etapele izolarii virusurilor, rickettsiilor, chlamydiilor si principalele tipuri de gazde vii
utilizate

1. Scopurile cultivării microorganismelor:

 Medical - diagnosticul etiologic al unei infecţii
- testarea sensibilităţii la antibiotice, antivirale, antifungice
 Industrial - obţinerea de vaccinuri, antibiotice, vitamine, etc..

2. Microorganisme cultivabile pe medii de cultura acelulare:

- bacterii
- fungi

Microorganisme cultivabile numai in celule receptive capabile sa le replice:

- virusuri
- bacterii obligat intracelulare (rickettsiile si chlamidiile)

3. Cultivarea bacteriilor si fungilor:

Mediile de cultură = soluţii apoase ale unor substanţe nutritive (nutrienţi, factori de creştere).
Însămânţare = depunerea în mediul de cultură a materialului microbian, inoculum.
Cultură = totalitatea microorganismelor acumulate prin multiplicare
Cultură pură = cultură constituită din microorganisme de acelaşi fel
Colonie = masă de cultură, vizibilă cu ochiul liber pe suprafaţa unui mediu de cultură solid, rezultată prin
multiplicarea unei singure celule sau a unui grup de celule, numit unitate formatoare de colonii / UFC.
Colonie = clonă, DECI cultură pură

Se va discuta cu studentii de ce este necesara izolarea microorganismelor în cultură pură

Condiţiile fizico-chimice necesare cultivării:

- presiunea osmotică, pH, temperatura, atmosfera de incubare

Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură:

- să fie steril, nutritiv, transparent si să asigure presiunea osmotică şi pH optime

Clasificarea mediilor de cultură

Se vor discuta cu studentii: tipurile de medii de cultura, modul de repartizare si se vor da exemple pentru
fiecare tip de mediu de cultura.

Tehnicile uzuale de cultivare a bacteriilor si fungilor:

- se efectuează demonstrativ însămânţarea prin epuizare în 4 cadrane, pentru obţinerea culturii pure
Criterii Clasificarea mediilor de cultură

provenienţa empirice -conţin ingrediente de origine animală sau vegetală Geloza-sange

nutrienţilor
sintetice - conţin ingrediente chimic pure Simmons
- utilizate pentru studiul necesităţilor nutritive
consistenţă lichide (bulioane) - nu permit separarea microorganismelor dintr-un amestec Bulion nutritiv

solide - permit separarea microorganismelor dintr-un amestec Agar nutritiv

- obţinute prin adaos de agar sau coagularea proteinelor din ou Lowenstein-Jensen

semisolide - conţin o concentraţie mai redusă de agar Geloza moale

- utilizate pentru - studiul mobilităţii bacteriilor
- conservarea tulpinilor

valoarea simple - conţin numai ingrediente de bază Agar nutritiv

nutritivă -permit cultivarea microorganismelor nepretenţioase nutritiv

îmbogăţite - cu adaos de sânge, ser, ou, etc. Geloza sange

-asigură cultivarea microorganismelor pretenţioase nutritiv

scopul de izolare  uzuale - satisfac exigenţele nutritive pentru o gamă largă de Geloza sange
utilizării specii

 diferenţiale - conţin substratul pentru anumite enzime microbiene CLED

şi un indicator care atestă atacarea acestui substrat  un caracter
metabolic diferenţiază între ele microorganisme cu aspect al culturii
identic pe mediile simple.

 selective - medii solide Mac Conkey

-conţin ingrediente care inhibă dezvoltarea microorganismelor de Hektoen
contaminare a prelevatelor Agar Sabouraud cu
- frecvent au şi caracter diferenţial cloramfenicol
- utilizate pentru izolarea preferenţială a anumitor specii dintr-un
produs plurimicrobian (ex. materii fecale, exsudat faringian)
 de îmbogăţire - medii lichide Bulion selenit
- favorizează multiplicarea microorganismelor a căror izolare o
urmărim
- inhibă selectiv flora de asociaţie (pentru un interval de timp
limitat)
- utilizate pentru izolarea unor microorganisme patogene care se
găsesc în număr redus în produse patologice
de identificare - conţin substratul pentru anumite enzime microbiene şi indicatori ai TSI
activităţii enzimatice (schimbare de pH, produşi de metabolism, MIU
etc.)
- utilizate pentru studiul activităţii biochimice a microorganismelor
în scopul încadrării într-un gen/specie
pentru testarea Agar Mueller Hinton
sensibilitatii la Agar Mueller Hinton cu 2% Glucoza si albastru de metilen
antibiotice,
antifungice
de conservare Bulion glicerinat

de transport Cary Blair

Descrierea caracterelor de cultură:

 condiţii optime de cultivare
 aspectul culturii pe medii lichide / solide:
 Se vor descrie:
- forma de cultură S şi forma de cultură R pe mediu lichid / solid:
- aspectul coloniilor: diametru, circumferinţa, relief, suprafaţă, culoare, transparenţa, consistenţă, aderenţa
la mediu;
 modificări ale mediilor de cultură induse de cultivare:
- hemoliza pe agar-sânge: alfa / beta / gamma
- producerea de pigment difuzibil în mediu

4. Cultivarea virusurilor, rickettsiilor si chlamydiilor

Sisteme de diagnostic
Culturi de celule Embrioni de găină în dezvoltare Animale de laborator
-Culturi primare -În cavitatea v. gripale, - de mici dimensiuni (şoarece alb,
-Linii de celule diploide amniotică v. paragripale hamsteri)
-Linii permanente -În cavitatea - gazde unice (maimuţe,
alantoidă cimpanzei)
-Pe membrana v.herpetice, Inoculare pe cale: ic, sc, im, ip.
Virusuri

corioalantoidă poxvirusuri Rar utilizate (dezavantaje)

- gazde mai putin sensibile În sacul vitelin - cobai, şoarece

- gazde mai putin sensibile - inoculare intraperitoneala
Rickettsii

- gazde mai sensibile

- Culturi de celule de maimuţă În sacul vitelin

- Linii permanente HeLa
Chlamydii

- cultivă dificil

Se vor descrie:
1. Principalele gazde de laborator:
- culturi de celule:
 Culturi primare
 Linii de celule diploide
 Linii permanente

- embrioni, în dezvoltare;
- animale de laborator.

2. Etapele izolarii pe gazde vii:

Pregătirea suspensiei microbiene → Inocularea gazdelor de laborator → Incubarea → Depistarea
microorganismului (± cuantificarea virusului replicat) → Identificarea microorganismului izolat

(metodele de identificare, care fac apel la utilizarea reactiilor Ag-Ac vor fi detaliate in cadrul lucrarilor
practice viitoare, dupa insusirea cunostintelor de baza)

3. Depistarea şi cuantificarea virusurilor replicate:

a. in culturi de celule:
o efectul citopatic – rotunjirea şi desprinderea celulelor de pe suport, apariţia de sinciţii, etc
o apariţia în supernatant a unor proteine codificate de virus
o adsorbţia eritrocitelor pe membrana modificată a celulelor care au replicat virus
 o incluziuni virale = acumulări de virioni sau componente virale în aria celulară de replicare şi
asamblare a unor virusuri (citoplasmă, nucleu) ; ex.: formaţiuni rotunde sau ovalare, bazofile
sau acidofile, IC sau/şi IN.
o interferenţa virală = replicarea virusurilor care cultivă fără efect citopatic este depistată
indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut citopatogen.
o depistarea antigenelor virale - prin reacţii Ag-Ac (care vor fi discutate in cadrul unui LP viitor)
o transformarea celulelor normale în celule canceroase sub actiunea unui virus oncogen.

b. pe ouă embrionate în dezvoltare:

o moartea embrionului
o apariţia de pustule pe membrana corioalantoidă (MCA)
o acumularea de virus sau glicoproteine virale în lichidul amniotic / alantoidian - prin reacţii
Ag-Ac
Cuantificarea virusului replicat:
- titrarea antigenului viral în lichidul alantoidian
- numărul de pustule formate pe MCA

c. pe animale de laborator:
o moartea animalului
o reproducerea bolii la animal (ex. paralizii, tremor)
o evidenţierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor ţintă;
o in esantioanele recoltate de la animal se evidenţiază prezenţa virusului prin reacţii Ag-Ac,
ME (pentru virusurile nou izolate, cercetare, etc)
Cuantificarea virusului replicat → măsurarea dozei infectante sau letale 50% pentru animale (DI50 /
DL50) = reciproca diluţiei de suspensie virală care determină efectul urmărit (infecţie/moarte) la 50% din
animalele inoculate.

Bibliografie:
Buiuc D, Microbiologie medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iasi, 2003, cap3, pag.39-42, 46-51 si
cap 4, pag 54-56.

In sala se gasesc:
Recipiente cu medii de cultura neinsamantate: geloza simpla, geloza sange, bulion nutritiv, medii selective
(Hektoen, MacConkey) si diferentiale (CLED), medii de identificare biochimica (TSI, MIU,Simmons)
Medii insamantate pentru demonstrarea:
- Producerii de pigment galben, auriu, alb (nedifuzibil)
- Producerii de pigment difuzibil in mediu – bacil piocianic
- Hemoliza alfa, beta, gamma
- Cresterea invaziva (Proteus)
- Tuburi cu geloza moale - mobilitate bacterii
- Forma de cultura S si R pe medii solide si in bulion
- Cultura de Candida albicans pe agar Sabouraud
- Colonii lactoza-neg (±H2S) si lactoza-poz pe medii selective Mac Conkey, Hektoen si pe mediul
diferential CLED. Aceleasi bacterii se insamanteaza pe mediul geloza simpla.
- Colonii mucoase (Klebsiella)
- Cultura in 4 cadrane (ex de stafilococ) pentru demonstrarea tehnicii de insamantare prin epuizare
Flacoane cu medii de cultura sub forma deshidratata
Planse cu oua embrionate si culturi de celule
Recipiente pentru culturi de celule
Anse
Spirtiere
Recipiente cu dezinfectant