ACIZI NUCLEU AND -CONTINUARE

Sa ne reamintim – structura de Dublu Helix

C. Structura “tertiara” = Configuratia spatiala a ADN

ADN-ul este un lant polinucleotidic liniar (neramificat) format dintr-un numar foarte mare de
nucleotide. Pentru a fi depozitat intr-o forma ordonata, care sa permita accesul rapid la
informatia genetica cat si pentru a se incadra in spatiul restrans al celulei, el este impacheat intr-o
structura stransa compactata. Flexibilitatea structurala a lantului ii permite moleculei de ADN sa
adopte o structura mult mai compactata decat forma dublu helicata.

a. La virusuri ADN-ul poate fi atat liniar cat si circular mono sau bicatenar.

b. La procariote (organisme inferioare care nu au nucleu) materialul genetic este inglobat

intr-o singura molecula de ADN de mari dimensiuni, de forma circulara, numita cromozom.
Forma circulara este realizata prin unirea capetelor libere 3’ si 5’ in scopul protejarii acestuia de
actiunea exonucleazelor (enzime ce hidrolizeaza leagatura fosfodiesterica situata la marginea
lantului). ADN-ul bacterian formeaza alte suprarasuciri (suprahelicari) pentru a avea o forma cat
mai compacta. In plus pe langa ADN-ul cromozomial bacteriile contin un ADN mic
extracromozomial (circular) format din cateva zeci de perechi de baze (Kb) care este denumit
plasmid. Acesta contine putina informatie genetica si se replica independent sau concomitent cu
diviziunea cromozomiala. Dupa distrugerea (moartea) celulei plasmidul difuzeaza si poate intra
in alte celule, transmitandu-le acestora informatia genetica detinuta. Astfel se explica rezistenta
la antibiotice a unor bacterii.-

c. La eucariote (celule care au depozitata informatia genetica in nucleu) ADN-ul este liniar
si asociat cu complexe proteice formand cromatina. In perioadele de repaos (in afara perioadei de
diviziune) materialul genetic se gaseste sub forma amorfa dispersat in tot nucleul. In timpul
diviziunii cromatina condenseaza, se organizeaza in 46 cromozomi asociati cate 2 in 23 perechi
(cromozomi bicromatidici). Fiecare cromozom contine o singura molecula de ADN liniar cu
lungimi diferite de la un cromozom la altul, care este aranjata ordonat, impachetata, cu ajutorul
proteinelor. Acestea indeplinesc pe langa rolul structural in aranjarea spatiala si roluluri de
reglare in precesul de replicare, transcriptie.

Proteinele ce servesc la impachetarea ADN-ului poarta denumirea de histone.

Histonele prezinta urmatoarele caracteristici:

- sunt proteine bazice ce prezinta numeroase resturi de Lys si Arg care la pH fiziologic se
prezinta sub forma ionizata avand sarcina +. Sarcina + formeaza legaturi ionice cu sarcinile –
prezente la gruparea fosfat din scheletul exterior al dublului helix, fixand astfel dublul helix
al ADN-ului pe suprafata lor.
- exista 5 tipuri de histone notate H1, H2a, H2b, H3 si H4
- histonele H2a, H2b, H4 si H5 se asociaza cate doua de acelasi fel rezuland un octamer
asemanator unui mosor (cilindru) in jurul caruia, sau pe suprafata caruia, se infasoara
molecula de ADN de doua ori in mod asemanator felului in care se infasoara ata pe mosor.
Acest complex format din octamer si ADN-ul fixat poarta numele de nucleosom si are un
diametru de 10 nm
 - intre doi nucleozomi portiunea de ADN libera este asociata cu histona H1 care se pare ca
are rolul de a proteja dublul helix de actiunea endonucleazelor (enzime ce rupe legatura
fosfodiesterica situata in interiorul lantului polinucleotidic). Se formeaza o structura
asemanatoare unui lant de margele pe care se infasoara un fir de ata.
- lantul de nucleozomi este la randul lui spiralat rezultand o structura numita polinucleozom
sau nucleofilament cu diametrul de 30nm. Aceste nucleofilamente formeaza la randul lor
bucle care sunt fixate (pentru a nu se incurca) de proteine nehistonice mari, care formeaza
axul unui cromozom (ca o perie de spalat eprubete).

Replicare = Sinteza ADN

Sinteza ADN se mai numeste si replicare si inseamna copierea integrala a ambelor catene ale
ADN-ului

REPLICAREA:

Replicarea este un proces amplu desfasurat pe mai multe etape succesive, fiecare etapa
necesitand “reactanti” si sisteme enzimatice specifice:
 ETAPE:

A. initierea replicarii cu separarea celor doua catene si formarea furcii de replicare

B. elongarea – sinteza propriu-zisa a noilor catene ADN

C. incheiere procesului

ELEMENTE NECESARE REPLICARII:

1. modelul dupa care se va sintetiza noua catena ADN si care este reprezentat de fiecare din cele
doua catene. Catena copiata se mai numeste matrita
2. “materialele” necesare sunt reprezentate de deoxinucleotidele ce urmeaza a fi aduse, pentru
asamblarea in noul lant, conform informatiei din “matrita”. Ele sunt in forma macroergica de
nucleotid trifostat, sunt notate dNTP si sunt reprezentate de dATP, dGTP, dCTP,
dTTP
3. prezenta unei “amorse”, numita si primer, adica prezenta unui capat de care sa se lege primul
nucleotid (asemanatoare capului de fermoar). Primerul este o secventa scurta de ARN
( formata din ribonucleotide nu deoxiribinucleotide) care are rolul de a furniza o grupare 3’ OH
libera la care sa poata fi atasat primul nucleotid.
4. enzimele specifice care vor sintetiza noua catena. Ele porta numele de ADN polimeraze
deoarece functia principala este aceea de polimerizare adica de atasare succesiva a cate un
deoxiribonucleotid, printr-o legatura fosfodiesterica. ADN polimerazele utilizeaza drept
“cosubstrat” catena matrita. Atasarea nucleotidelor nu necesita energie, acestea fiind activate
sub forma de dNTP.

Pe langa functia de sinteza aceste enzime prezinta o functie suplimentara exonucleazica. Prin
aceasta functie ele sunt capabile sa hidrolizeze legatura nou formata. In urma actiunii
exonucleazice nucleotidul marginal poate fi indepartat. Aceasta actiune suplimentara serveste
functiei de corectare in cazul adaugarii unui nucleotid gresit “necomplementar” (C atasat gresit
adica CA in loc de TA).

5. Exista mai multe tipuri de ADN polimeraze:

a. La procariote : ADN polimeraza I, II, III
 b. La eucariote: functii corespunzatoare ADN polimarazele , , , , 
ADN polimerazele difera intre ele prin: structura, viteza de sinteza si procesivitatea lor.

Prin procesivitate se intelege numarul de deoxinucleotide adaugate inainte de detasarea

polimerazei de pe matrita. Exp: ADN P I are o viteza mai mica de sinteza decat ADN P III
deoarece prima adauga 20 deoxiribonucleotide/sec, pana la desprinderea de pe matrita, fata de
1000 deoxiribonucleotide/sec cat ataseaza cea de a doua. In consecinta ADN P I are o
procesivitate mai mica fata de ADN P III.

A. Initierea.
Este un proces ce are loc in doua etape: a) desfacerea dublului helix si b) construirea primerului.

a) Desfacerea dublului helix.

Pentru ca replicarea sa aiba loc este necesara derasucirea dublului helix si separarea celor 2 catene
ale ADN –ului parental

Desfacerea dublului helix este realizata prin ruperea legaturilor de H, dintre bazele complementare,
cu consum de ATP, in prezenta unei enzime numita helicaza, in anumite regiuni numite ori (origin of
replication). La procariote exista o singura regiune ori, la eucariote insa, replicarea incepe simultan in
mai multe puncte ori ale helixului.

Regiunile in forma de “V” formate prin desfacerea dublului helix poarta denumirea de furci de replicare.
Aceasta avanseaza in directii opuse, motiv pentru care se spune ca replicarea este bidirectionala. In
spatele furcii de replicare are loc sinteza ADN simultan in ambele directii.
Pentru a impiedica reunirea catenelor in spatele furcii de replicare pe fiecare catena se ataseaza o serie
de proteine numite “single strand DNA binding proteins” (SSB) care au in plus si rolul de a proteja catena
expusa fata de actiunea endonucleazelor.

b) Construirea primerului

ADN polimeraza nu poate initia sinteza lantului complementar pe o catena matrita ci are nevoie de
un primer. Prin primer se intelege un fragment de ARN scurt, oligonucleotidic, situat la inceputul
catenei matrita care sa furnizeze gruparea OH libera la capatul 3’. Acest hidroxil functioneaza ca
acceptor al primului deoxiribonucleotid “adus si atasat” de catre ADN polimeraza. Primerul este
 sintetizat de o ARN polimeraza (primaza) (la eucariote primaza este Pol ) complementar si
antiparalel cu catena matrita rezultand un hibrid in care la A de pe matrita corespunde U pe primer.

Pe masura ce cele doua catene sunt separate in vederea copierii apar supraspiralari in directia de
inaintare, aceasta fiind blocata la un moment dat.

Exista enzime specifice care desfac aceste supraspiralari (rezultate prin “inghesuirea” numarului de
spire) si indeparteaza tensiunea creata de acest fenomen, numite topoizomeraze. Acestea au actiune
dubla:

- endonucleazica adica rup legatura fosfodiesterica de pe una sau pe ambele catene pentru a
permite derasucirea acestora
- ligazica de resigilare adica refac legaturile rupte dupa indepartarea supraspiralarii
Sunt cunoscute doua topoizomeraze;

- Topoizomera I – care rupe o singura catena permitand trecerea celeilalte prin bresa facuta,
nu necesita ATP pentru actiunea lor si la eucarite indeparteaza atat suprahelicarile + cat si
pe cele -.
- Topoizomeraza II – care rupe ambele catene permitand rotirea capetelor libere si
derasucirea acestora, ca ulterior acestea sa fie resigilate cu consum de ATP(la eucariote).

B. ELONGAREA - Prin elongare se intelege adaugarea de deoxiribonucleotide, cate una pe

rand, la capatul 3’OH a catenei nou sintetizate, actiune realizata de enzime numite ADN
polimeraze. Secventa de deoxiribonucleotide adaugate este dictata de secventa din matrita si
complementara cu aceasta.
 Caracteristici ale elongarii:

- necesita primer furnizor de 3’OH

- se sintetizeaza doua catene
o una care se deplaseaza in directia furcii de replicare si care este sintetizata in mod
continuu, numita catena conducatoare (leading)
o cea de a doua care se deplaseaza in directia opusa deplasarii furcii, numita catena
“intirziata” (lagging), este sintetizata in mod discontinuu. Pe aceasta catena sunt
sintetizati mai multi primeri din loc in loc (discontinuu).
- sinteza are loc intotdeauna in directia 5’->3’, antiparalel si complemetar cu matrita si este
realizata de ADN PIII la procariote La eucariote se pare ca Pol  sintetizeaza lantul leading
in timp de Pol  sintetizeaza lantul lagging. Pol  are actiune asemanatoare ADN P I iar Pol 
are rol in sinteza ADN mitocondrial [pamela].
- ADN P III si ADN P I sunt enzime multifunctionale

ADN polimeraza III indeplineste mai multe functii:

- citire a catenei matrita in directia 3’->5’ (adica recunoste nucleotidele)

- sintetiza intotdeauna in directia 5’->3’ adica adauga nucleotide la capatul 3’ pe principiul
complementaritatii. Nucleotidele aduse sunt prezente in forma macroergica de trifosfat,
energie utilizata pentru realizarea legaturii fosfodiesterice cu eliberarea unui mol de PPa.
Toate cele patru nucleotide trebuie sa fie prezente pentru ca sinteza sa aiba loc, lipsa unui
singur nucleotid ducand la blocarea sintezei.
- corectare exercitata in directia 3’->5’ care are ca scop asigurarea fidelitatii replicarii. Pe
masura ce adauga fiecare nucleotid P III verifica ca acesta sa fie cel corespunzator adica cel
complementar (ex lui A sa ii corespunda T si nu G). In cazul unei erori ( cand in locul lui T a
fost adaugat G) P III “se intoarece”, rupe legatura fosfodiesterica, indeparteaza nucleotidul
necorespunzator si il inlocuieste cu cel corespunzator. Aceasta actiune de excizie este una
exonucleazica ce are loc in directia inversa sintezei adica in directia 3’->5’
Acesta este modul de actiune al PIII pe catena leading . Pe catena lagging P III se comporta asemantor
dar se opreste atunci cand intilneste restul de primer, fiind blocata de acesta. ADN P III se desprinde de
pe catena matrita si locul ei este luat de ADN P I care este si ea o enzima multifunctionala.

ADN P I indeplineste mai multe functii:

- excizie in directia in care are loc sinteza adica 5’->3’. Dupa detasarea ADN PIII , ADN P I se
fixeaza pe catena matrita (lagging) si indeparteaza pe rand fiecare nucleotid apartinand
primerului situat in fata ei in directia de inaintare 5’->3’.
- sinteza in directia 5’->3’ pe masura ce indeparteaza ribonucleotidele primerului, adauga
deoxiribonucleoidele corespunzatoare. Portiunea de catena astfel sintetizata poarta
denumirea de fragment Okazaki. ADN P I se opreste cand intilneste capatul urmatorului
fragment Okazaki lasand un mic gol.
- corectare in directia 3’->5’ identica cu cea realizata de ADN P III.
In final catena lagging va fi sintetizata discontinuu fiind alcatuita din mai multe fragmente Okazaki.
Acestea vor fi unite de catre ADN ligaza pentru a se constitui catena continua.
La eucariote s-a constatat ca marimea fragmentelor Okazaki este echivalenta cu marimea ADN din
nucleozomi; s-a concluzionat ca succsesiv cate un nucleozom relaxeaza structura ADN permitand
replicarea.

Actiunea ADN ligazei este aceea de a sigila micile golurile lasate de fragmentele Okazaki prin legarea
capatului 3’OH a unui fragment cu capatul 5’-P al fragmentului vecin, legare ce necesita consum de
energie furnizata prin hidroliza ATP la AMP si PPa.

C. Terminarea replicarii
Are loc atunci cand doua bifurcatii de replicare se intilnesc venind din directii opuse.
Repararea ADN

ADN este supus continuu unor procese ce duc la alterarea lui. Degradarea ADN poate fi provocata atat
de factori interni (greseli de imperechere a bazelor, modificari ale bazelor) cat si de factori externi
(radiatii, agenti chimici) care pot opera atat in timpul replicarii cat si in afara ei. Daca aceste leziuni nu
sunt reparate, o leziune permanenta numita mutatie va fi introdusa in ADN.

Consecintele mutatiilor pot duce la :

- boli genetice – daca leziunea a avut loc la nivelul celulelor germinale

- cancere - daca leziunea a avut loc la nivelul celulelor somatice
Dintre leziunile cele mai frecvente pot fi mentionate:

a. dezaminarea oxidativa a unor baze (pierderea gruparii NH 2 de la adenina sau citozina)

b. formarea de dimeri de timina

Dimerii de timina se pot forma in celulele umane ca urmare a expunerii la raze UV. Exista unele boli
genetice in care celula nu poate repara leziunea ADN cauzata de dimerii de timina, rezultand o
acumulare a acestora si in final aparitia cancerului de piele xeroderma pigmentosa.
 c. Formarea unor perechi incorecte de baze. Prin perechi incorecte se intelege formarea altor
perechi
de baze in afara celor 2 perechi considerate corecte si anume A si T respectiv G si C care au fost dovedite
a se gasi in ADN. De regula aceste greseli sunt reparate in procesul de replicare de catre de actiunea de
corectare a ADN polimerazelor. In situatia in care aceste greseli raman totusi dupa replicare ele sunt
inlaturate intr-un proces in care pot fi diferentiate catenele parentale fata de cele nou formate. La
bacterii catenele parentale sunt metilate in timp ce catenele nou sintetizate sunt metilate ceva mai
tarziu. Aceasta permite proteinelor implicate in procesul de reparare sa distinga intre cele doua tipuri de
catene si sa actioneze pe catena fiica indepartand fragmentul incorect si inlocuindu-l cu unul corect. Un
mecanism asemanator dar neelucidat complet functioneaza si la eucariote.

Celulele dispun de intrumente de reparare care:

a) recunosc leziunea si opresc termporar ciclul celular

b) repara leziune ADN si initiaza apoptoza in cazul in care repararea esueaza
Dupa depistarea leziunii repararea ADN presupune mai multe etape:

a. excizia leziunii

a) indepartarea bazei alterate (in cazul dezaminarilor oxidative suferite de adenina sau citozina)
b) indepartarea unui portiuni de ADN ( in cazul dimerilor de timina sau a leziunilor care duc la
distorsioarea structurii helicate a ADN-ului)
b.sinteza reparatorie realizata de ADN polimeraze neprocesive, pentru completarea golului utilizand ca
model :

- cealalta catena

- celalalt brat al cromozomului (celalta cromatida) datorite asemanarii destul de mari ale celor
doua cromatide ce un cromozom.

c. ligaturarea in vederea restabilirii continuitatii ADN cu ajutorul ADN ligazei

Leziune generata de dezaminarea oxidativa a unor baze este reparata prin procesul “baze excizion
repair” (BER). Initial este scindata legatura N-glicozidica dintre baza azotata si riboza de catre o enzima
numita ADN-glicozilaza si eliminata baza alterata (in cazul de fata U).

In urma eliminarii pe scheletul fosfo-ribozidic ramane un loc fara baza azotata denumit apirimidinic (in
cazul de fata) sau apurinic notat AP. In acest loc actioneaza o AP endonuleaza (endonucleaza
apirimidinica/apurica) care scindeaza portiunea ce contine fragmentul AP. Golul ramas este sigilat prin
actiunea a doua enzime o ADN polimeraza neprocesiva urmata de ADN ligaza.

Leziunea genarata de dimerii de timina este reparata prin procesul “nucleotid excizion repair” (NER). O
endonucleaza specifica, numita excinucleaza, scindeaza legatura fosfodiesterica in doua puncte, de o
parte si de alta a leziunii. Dupa dubla excizie un fragment de aproximativ 30 baze, care contine leziunea
este indepartat. Golul ramas este sigilat prin actiunea a doua enzime o ADN polimeraza neprocesiva
urmata de ADN ligaza.