MICROSCOPIA ELECTRONIC: NOIUNI GENERALE, DESCRIEREA MICROSCOPULUI ELECTRONIC DE TRANSMISIE (TEM), MICROSCOPULUI ELECTRONIC DE TIP SCANNING, MICROSCOPUL ELECTRONIC

DE NALT VOLTAJ n microscopia electronic fasciculul de lumin este nlocuit cu un fascicul de electroni accelerai. Relaia dintre puterea (limita) de rezoluie i lungimea de und a radiaiei luminoase, stabilit pentru microscopia optic este corect i aplicabil pentru orice form de radiaie deci i pentru un fascicul de electroni. Proprietile de und ale electronului au fost descoperite de fizicianul francez L. de Broglie, n 1924 , Electronii nu au o lungime de und constant; ea crete pe msura, ce crete viteza electronilor. ntr-un microscop electronic, la o tensiune de accelerare de 100.000 V, lungimea de und a electronilor este de 0,004 nm. Rezoluia teoretic (calculat) corespunztoare acestei lungimi de und ar trebui s fie de 0,002 nm. n fapt, ea este mai mic, fiind limitat de mai multe cauze, printre care: a. aberaiile lentilelor electromagnetice sunt mai greu de corectat dect cele ale lentilelor de sticl; b. tehnicile de preparare (fixare, includere, contrastare) i c. efectele de deteriorare ale specimenului datorate fasciculului de electroni. n consecin, specimenele de natur biologic pot fi observate n microscopia electronic la o rezoluie limit de 2 nm (20 ), de aproximativ 100 de ori mai bun dect rezoluia microscopului optic. Cele mai perfecionate microscoape electronice aflate in exploatare n diferite laboratoare, au rezoluii garantate de 2-3 iar n condiii speciale se poate ajunge la 1,2-1,4 i o putere de mrire (direct, n aparat) de 800,000 de ori. Deci, rezoluia acestor aparate se apropie de dimensiunea atomului de hidrogen care este de 1 . Pentru comparaie, reamintim c rezoluia ochiului uman, la o distan de 25 cm a obiectului, este de 0,1 mm iar a microscopului optic de 0,1-0,2 m . Judecnd dup performanele de rezoluie ale microscoapelor electronice actuale (23 ) s-ar putea considera c observarea direct a aminoacizilor n moleculele proteinelor, de exemplu, nu reprezint o problem. Aminoacidul cu diametrul cel mai mic este glicina (5.1 ), iar cel mai mare este triptofanul (175.5 ). Acest lucru nu este posibil deoarece rezoluia amintit se poate obine doar pe reelele cristaline ale unor substane i nu direct pe biomolecule. Domeniul de investigaie de la celul pn la molecul sau atom, care urmrete nelegerea organizrii ansamblurilor de molecule n structuri supramoleculare, a proceselor legate de biosinteza acestora precum i a funciilor lor, constituie domeniul ultrastructural. La acest nivel nu se mai poate vorbi de zoologie, morfologie sau fiziologie (n sensurile clasice), ci de un spaiu unificat al cunoaterii viului, acela al biologiei celulare i moleculare. 1. Microscopul electronic de transmisie (TEM) ntr-o perspectiv foarte general, microscopul electronic de transmisie (fig.1,2) este similar microscopului optic. Sursa de iluminare este nlocuit cu un filament sau catod care are rolul de a emite fasciculul de electroni. Catodul este localizat n partea superioar a unei coloane cilindrice de aprox 2m. Pentru a se evita dispersia electronilor din fascicul prin

coliziunea cu moleculele aerului, n coloan se creeaz vid prin pomparea n afar a aerului. Electronii produi de filamentul supranclzit sunt accelerai fa de un anod, cruia i se aplic o tensiune negativ ce smulge electronii i i accelereaz. Fasciculul trece printr-o deschidere ngust a anodului i strbate n ntregime coloana. De-a lungul coloanei sunt plasai mai muli e1ectromagnei (lentile electromagnetice) care pot concentra sau focaliza fasciculul ndeplinind un rol similar cu acela al lentilelor de sticl din microscopia optic.

Fig. 1 Schema componenetelor unui microscop electronic de transmisie

Fig. 2 Microscopul electronic de transmisie Un sistem de diafragme cu diametrul de 30-100m opresc trecerea electronilor mrginai, mbuntindu-se claritatea i contrastul imaginilor. Specimenul este situat n coloana vidat, pe direcia fasciculului de electroni. n urma coliziunii electronilor fasciculului primar cu specimenul, rezult mai multe tipuri de electroni sau radiaii, majoritatea fiind utilizate n diverse microscoape electronice (fig. 3). Ca i n microscopia optic, specimenul este colorat (contrastat) cu substane electrocondense adic substane capabile s disperseze cea mai mare parte a electronilor incideni pe suprafaa ocupat de ele. Electronii care au strbtut preparatul (transmii) sunt focalizai pentru a forma o imagine pe un ecran fluorescent sau pentru a impresiona o plac fotografic. Deoarece regiunile dense ale preparatului vor dispersa majoritatea electronilor, aceste zone vor arta pe ecran sau n fotografie ca zone mai negre, mai nchise i se vor numi zone electron-dense.

Electroni transmii

Fig. 3 Prezenterea schematic a interaciunii dintre fasciculul primar de electroni i specimen 2. Microscopia electronic de baleiaj (SEM) Microscopul electronic de baleiaj (termen derivat din lb. francez) sau microscopul electronic scanning (termen derivat din lb. englez) (fig. 4) permite obinerea unor imagini tridimensionale ale specimenului. Prin intermediul unui astfel de aparat se pot studia suprafeele obiectelor biologice, fr a se obine ns informaii despre modul de organizare n profunzime (referitoare la structurile lor interne). n timp ce n microscopia electronic de transmisie (TEM) imaginea se formeaz datorit electronilor transmii (care pot trece prin preparat), n microscopia electronic scanning (SEM) imaginea se obine prin detectarea i msurarea fluxurilor electronice dispersate sau emise (electroni secundari) de pe suprafaa specimenului. Deci, cu ct suprafaa specimenului va dispersa (reflecta) n mai mare msur electronii fasciculului cu att imaginea obinut va fi mai bun. Proprietile reflectorizante ale suprafeelor specimenelor sunt amplificate prin acoperirea lor cu un strat subire de metal greu (aur, platin, aliaj aur-platina etc.). Pe suprafaa specimenului este proiectat un fasicicul foarte ngust de electroni care parcurge ntr-un mod ordonat ntreaga sa suprafa (baleiere, scanare). Detectorul de electroni dispersai (reflectai) sau secundari (emii din specimen n

urma coliziunii cu electronii fasciculului primar) msoar punctiform proprietile acestora traducndu-le ntr-un semnal luminos pe ecranul unui monitor. Imaginea specimenului pe ecran se reconstituie pe baza semnalelor ( imaginilor) punctiforme datorate electronilor dispersai sau secundari detectai. Microscoapele de baleiaj permit diferene mari ntre planurile de focalizare, deci faciliteaz examinarea suprafeelor unor obiecte relativ mari. Deoarece cantitatea electronilor dispersai este dependent i de unghiul dintre suprafaa specimenului i fasciculul de electroni, imaginea obinut va fi mai luminat sau mai umbrit. Se amplific astfel aparena de tridimensionalitate spaialitate. Microscoapele electronice de baleiaj sunt mai mici i mai puin costisitoare n comparaie cu microscoapele electronice de transmisie. Microscoapele de baleiaj (cele uzuale) nu au o rezoluie foarte mare ci doar de aproximativ 10nm; mrirea efectiv ( obinut n aparat) este de pan la 20.000 de ori. n concluzie, microscopia electronic de baleiaj poate fi utilizat n mod curent pentru ivestigarea celulelor ntregi, a esuturilor, a fragmentelor de organe ( de exemplu, a fragmentelor de frunze, rdcini etc.) sau chiar a unor organisme de dimensiuni adecvate (unele insecte, de exemplu). n ultimul timp, s-a reuit o mbuntire substanial a rezoluiei n microscopia electronic de baleiaj reducndu-se mult diferena fa de TEM. Au fost produse instrumente care permit o rezoluie de 0,5-1 nm, deci, o vizualizare direct, tridimensional, a unor detalii de nivel molecular. Acest nou domeniu al SEM poart, numele de microscopie electronic scanning de nalt rezoluie (HRSEM - engl. High-Resolution Scanning Electron Microscopy ) . Aceste performane au fost obinute prin utilizarea electronilor slab accelarai, care reduc producerea de sarcini electrice n specimen precum i capacitatea de penetrare a specimenului, chiar dac. acesta este foarte subire.

Fig. 4 Microscopul electronic de baleiaj (SEM)

3. Microscopul electronic de voltaj supranalt Este o variant a TEM cu o coloan cu lungime total de 10m. Deoarece tubul de accelerare este de dimensiuni mari, accelerarea electronilor este de aproximativ 1.000.000 V. Acest voltaj confer electronilor suficient enargie cinetic pentru a penetra prin preparate cu grosime de microni sau chiar prin ntreaga celul. Imaginea rezultat este o radioscopie celular care evideniaz ultrastructura ntregii celule, fr a fi nevoie de sseciuni ultrafine. Principalul avantaj al microscopului electronic de voltaj supranalt este acela c permite observarea n profunzime i d o imagine tridimensionsl asupra celulei. Rezoluia i adncimea cmpului sunt extrem de performante pe toat grosimea preparatului.