Universitatea de Medicina si Farmacie Gr.T.

Popa Iasi 2012

Microscopul Electronic: tipuri in relatie cu principiul fizic, evolutie, aplicatii medicale

Schaas Bogdan Andreas, Anul I , Seria A , Grupa 2

Cuprins :
1) Scurt Istoric....pag. 3 2) Premiul Nobel........pag. 4 3)Generalitati......pag. 5 4) Principiul Fizic ..pag. 6 5) Semnalele rezultate n urma interaciei dintre fasciculul de electroni i corpul solid...........................................pag. 8 6) Tipuri:1.Microscopul Eletronic cu transmisie...... pag.10 2.Microscopul Electronic cu scanare sau cu baleiaj..pag.13

1) Scurt Istoric
Primul microscop electronic a fost construit n 1931 de ctre inginerii germani Ernst Ruska i Max Knoll. Acesta era bazat pe ideile i descoperirile fizicianului francez Louis de Broglie. Desi primitiv si nepotrivit utilizrilor practice, instrumentul era capabil s mreasc obiectele de patru sute de ori. Reinhold Rudenberg, directorul de cercetri al companiei Siemens, a patentat microscopul electronic n 1931, desi Siemens nu fcea cercetri n domeniul microscoapelor electronice la acea vreme. n 1937 Siemens a nceput s-i finanteze pe Ruska si pe Bodo von Borries pentru dezvoltarea unui microscop electronic. Siemens l-a angajat si pe fratele lui Ruska, Helmut s lucreze la aplicaii, n particular cu specimene biologice.(1)

2) Premiul Nobel

Fig 1. Microscopul electronic construit de Ernst Ruska in 1933

Ecuatia lui Louis de Broglie pentru identificarea lungimii de unde a electronilor in miscare : =h/mv unde: = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa particulei considerate v = viteza de propagare a oscilatiei particulei

Fig 2. Cei 3 laureati ai Premiului Nobel pentru Fizica din anul 1986. Premiul Nobel in Fizica din anul 1986 a fost impartit astfel: jumatate pentru Ernst Ruska atat pentru cercetarile sale in optica electronica, cat si pentru proiectarea designului primului microscop electronic iar cealalta jumatate a fost acordata echipei formate din Gerd Binnig si Heinrich Rohrer pentru realizarea designului microscopului electronic prin efect tunel.(2)

Fig 3. Schita primului microscop, proiectat de Ernst Ruska

3)Generalitati

Un microscop electronic este un tip de microscop care utilizeaza un fascicul de electroni pentru a ilumina specimenul si produce o imagine marita.Microscoapele electronice au o putere mai mare decat un microscop optic, deoarece electronii au o lungime de unda in jur de 100.000 de ori mai mica decat lumina vizibila ( fotoni ) si pot realiza mai mult de 50 pm rezolutie si o marire de pana la aproximatic 10.000.000x, pe cand un microscop optic este limitat la o rezolutie de aproximativ 200nm si o putere de 2000x. Microscopul electronic foloseste lentile electrostatice si electromagnetice pentru a controla fasciculul de electroni pe care il concentreaza pentru a forma o imagine.Aceste lentile sunt analoage, dar diferite de lentilele de sticla a unui microscop optic care formeaza o imagine marita, concentrandu-se pe lumina sau prin specimen.Microscoapele electronice sunt folosite pentru a observa o gama larga de probe biologice si anorganice, inclusive microorganisme, celule, molecule mari, probe de biopsie, metale si cristale.Industrial, microscopul electronic este adesea folosit pentru controlul calitatii si analizarea defectelor de fabricatie de marimi foarte mici/microscopice. (3)

Fig 4. Stanga ( schema de principiu a microscopului optic). Dreapta schema de principiu a microscopului electronic.

4) Principiul Fizic

Fig 5. Stanga in dreptul sagetilor orificiu de observare. Dreapta : de sus in jos : sursa emitatoare de fascicul de electroni (tunul de electroni), magneti cu rol echivalent lentilei condensor din microscopul optic, traiectul fasciculului de electroni, proba, lentila obiectiv, lentila ocular, ecran. O seciune transversal printr-un microscop electronic modern relev urmtoarele elemente constructive: coloana electrono-optic, sistemul de vidare, sistemele de detecie (prelucrarea procesarea i redarea informaiei) i blocul de alimentare cu energie a tuturor componentelor.

Se compune din : tunul de electroni, lentilele condensoare i lentila obiectiv.

Fig 6. Principial, construcia unui microscop electronic este ntr-o oarecare msur analog construciei microscopului optic obinuit. Prile principale, comune celor dou instrumente, sunt urmtoarele: sursa (de iluminare la microscopul optic, de electroni la microscopul electronic), lentila condensoare (sau condensorul), obiectul de studiat, lentila proiectoare i sistemul de vizualizare i nregistrare a informaiei.

Mod de functionare :
1. Condensorul are rolul de a focaliza fasciculul de electroni pe prob, asigurnd un paralelism ct mai bun al radiaiilor cu axa optic. Obiectivul formeaz imaginea primar, mrit, a obiectului; aceasta este preluat de lentila proiector care o mrete mai mult, pentru observarea pe ecranul instrumentului. 2. Tunul de electroni are rolul de a genera fasciculul de electroni. n interiorul tunului de electroni un cmp electrostatic dirijeaz electronii emii de o poriune foarte mic a suprafeei unui filament, printr-o apertur foarte ngust. Dup aceea, tunul accelereaz electronii prin coloan spre prob, cu energii cuprinse ntre cteva zeci i zeci de mii de electronvoli. 3. Fasciculul de electroni, emis de tunul electronic, care bombardeaz suprafaa probei, este compus din electroni monocinetici i poart numele de fascicul incident sau primar. El poate fi supus unei tensiuni de accelerare de la 100V pn la 40.000V, n funcie de tipul de microscop folosit. *** n momentul de fa sunt utilizate cteva tipuri de tunuri de electroni: cu wolfram (W), cu hexaborur de lantan (LaB6) i cu emisie de cmp. Constructiv, sunt utilizate materiale i principii fizice diferite pentru obinerea tunurilor de electroni, dar au ca scop comun generarea unui fascicul de electroni direcionat, avnd curent stabil i diametru ct mai mic posibil. *** 7

4. Electronii parcurg tunul ca un fascicul divergent. O serie de lentile electromagnetice i de diafragme din coloan reconverg i focalizeaz fasciculul ntr-o imagine micorat. Aproape de zona de jos a coloanei exist cteva bobine de scanare n rastere, care deflecteaz fasciculul de electroni ntr-o gril de baleiere pe suprafaa probei. Lentila final focalizeaz fasciculul ntr-o arie cu o dimensiune ct mai mic pe suprafaa probei. 5. Dup parcurgerea coloanei de electroni, fasciculul ajunge n camera probei. Aceasta ncorporeaz dispozitivul de manevrare a probei, o u pentru introducerea sau extragerea eantionului analizat i cteva dispozitive pentru montarea detectorilor de semnale sau a altor accesorii. n momentul interaciei fasciculului de electroni cu suprafaa probei rezult o serie de semnale, care dup ce sunt detectate, amplificate i procesate permit obinerea unor informaii privind morfologia, structura i compoziia probelor. (4)

5) Semnalele rezultate n urma interaciei dintre fasciculul de electroni i corpul solid

Electroni retroimparstiati (reflectati elastic) Electroni secundari (emisi) PROBA Microscopie electronica prin transmisie, microsopie electronica cu baleiaj prin transmisie, analiza dispersiva in energie Fascicul electronic incident Radiatii X Radiatii infrarosii Radiatii luminoase (fotoni optici) Microscopie electronica cu baleiaj sau de tip analitic

Curent indus

Electroni absorbiti

Imprastiere elastica necoerenta Imprastiere neelastica

Imprastiere elastica coerenta Fascicul nedeviat de electroni transmisi

Fig 7. Interactiunile la nivelul probei, semnalele corespunzatoare si tipuri de microscopie electronica in functie de semnalul utilizat in crearea de imagini.

6) Tipuri de semnale
1) Electronii secundari

Electronii secundari (SE) sunt electronii atomilor din prob care sunt ejectai n mediu datorit interaciei cu electronii primari din fascicul. n general, ei au energii foarte mici (prin convenie mai mici de 50 eV). Datorit faptului c au energii foarte mici, acest tip de electroni poate scpa din suprafaa probei doar dintr-o regiune de foarte mic adncime. Prin urmare, electronii secundari ofer imagini de cea mai bun rezoluie. Imaginile date de electronii secundari sunt oferite n principal de toporafia suprafeei probei. Cu ct volumul de interacie este mai aproape de suprafaa probei, cu att mai muli electroni secundari pot fi emii din prob, acest fenomen producndu-se att n zonele cu vrfuri, ct i n cele mai joase. Astfel se obin imagini n care vrfurile vor fi mai luminoase, iar vile mai ntunecate. Datorit acestui fapt, interpretarea imaginilor de electroni secundari devine foarte intuitiv.

2) Electronii retrodifuzai Electronii retrodifuzai (BSE backscattered electrons), sunt electronii primari care au fost mprtiai n afara suprafeei probei, datorit ciocnirilor elastice cu nucleele din atomii probei. Aceti electroni posed energii mari, cuprinse (prin convenie ntre 50eV i tensiunea de accelerare a fasciculului). Acest tip de electroni provin dintr-un volum mai mare de interacie cu substana, ceea ce contribuie la pierderea rezoluiei n imaginile de electroni retrodifuzai. n aceste imagini, contrastul este determinat de diferena numerelor atomice din fiecare punct bombardat cu fasciculul de electroni, de media numerelor atomice ale elementelor din compoziia probei. Din zonele ce conin elementele cu numere atomice mai mari vor fi reflectai mai muli electroni, ceea ce conduce la obinerea unei arii mai luminoase n imagine. Imaginile de electroni retrodifuzai nu sunt att de uor de interpretat dar, evaluate corect, pot oferi informaii importante privind compoziia probei. n general, intensitatea curentului de electroni retromprtiai crete cu creterea unghiului de mprtiere, nu variaz sensibil cu energia fasciculului primar i crete cu numrul atomic al probei. Semnalul oferit de electronii retrodifuzai este detectat de doi detectori cu corp solid, care, lucrnd n regim de substituie-adiie permit obinerea unor imagini privind topografia sau compoziia suprafeelor analizate. 3) Recombinarea i catodoluminiscena Prin interaciunea unui fascicul incident cu o prob, muli electroni secundari produi nu pot prsi proba i sunt anihilai, n urma mprtierilor, prin procese de recombinare electron-gol. Dac procesul de recombinare este nsoit de emisia de fotoni optici, apare fenomenul de catodoluminiscen. Mecanismul acestei fotoemisii este similar cu luminiscena n sensul c este stimulat de o serie de elemente active, aflate n cantiti foarte mici n aria probei bombardate cu fasciculul de electroni. Exact la fel ca n cazul luminiscenei normale, catodoluminiscena poate indica distribuia n prob a acestor elemente cu concentraii mici, completnd astfel informaia privind compoziia chimic a ariei bombardate, obinute prin emisie de radiaii X sau electroni Auger.

Catodoluminiscena n probele semiconductoare este dependent de tensiunea electric aplicat i, n consecin, strile de suprafa n unele materiale semiconductoare pot fi studiate prin acest efect care furnizeaz date privind timpul de via al purttorilor de sarcin majoritari, lungimi de difuzie, etc. Fenomenul de catodoluminiscen este afectat de asemenea de topografia superficial i de prezena unor defecte interne (dislocaii, precipitate, limite intercristaline). Acest fenomen de excitare a luminiscenei prin bombardament electronic a fost observat i n unele materiale plastice, organice i n unele probe minerale. 4) Emisia de radiaii X i electroni Auger Emisia de radiaii X se produce dac un electron de pe un nivel energetic inferior este excitat de fasciculul primar de electroni i trece pe un nivel energetic superior, sau prsete complet atomul (fotoelectron). Locul vacant este ulterior ocupat de un alt electron care cade de pe un nivel energetic superior i emite un foton de radiaie X, de energie h egal cu diferena dintre energiile corespunztoare celor dou niveluri energetice ntre care a avut loc tranziia. Este posibil ca anumii electroni s fie reflectai din prob, dup ce n prealabil au interacionat neelastic cu atomii din prob. Ceilali electroni, care sunt mprtiai la unghiuri mai mici spre interiorul probei, i pierd din ce n ce mai mult din energie, dup fiecare coliziune, pn cnd nu mai pot participa la un proces de ionizare prin impact (de obicei energia de ionizare este cuprins ntre 3 i 8 eV). Energia rezultat n urma frnrii acestor electroni este emis sub forma unor fotoni de radiaii X ce alctuiesc spectrul continuu de emisie a probei. Intensitatea maxim a spectrului continuu crete cu tensiunea de accelerare, cu intensitatea fasciculului i cu numrul atomic al probei.(4)

6.1 ) Microscopul Electronic cu Transmisie (MET) si utilizarile sale

Forma original a microscopiei electronice, microscopia electronic cu transmisie implica o raz de electroni la tensiune nalt emis de un catod, de regul filament de tungsten, i focalizat de lentile electrostatice i electromagnetice. Raza de electroni care a fost transmis printr-un specimen parial transparent pentru electroni transport informaie despre structura intern a specimenului n raza care ajunge la sistemul de formare a imaginii. Variaia spaial a acestei informaii ("imaginea") este apoi mrit de o serie de lentile electromagnetice pn cnd este nregistrat la coliziunea cu un ecran fluorescent, plac fotografic, sau senzor de lumin cum ar fi un senzor CCD. Imaginea detectat de CCD poate fi afiat n timp real pe un monitor sau transmis pe loc unui calculator.

10

Fig 8. De sus in jos in sagetile indica: sursa de inalta tensiune, tun de electroni, prima lentila condensor, dispozitiv de reglare a aperturii condensorului 1, a doua lentila condensor, dispozitiv de reglare a aperturii condensorului 2, suport pentru specimen si orificiu etans pentru aer, lentila obiectiv si dispozitiv de reglare a acesteia, fasciculul de electroni transmisi, ecran fluorescent si camera. Rezoluia unui microscop electronic cu transmisie este limitat n principal de aberaia de sfericitate, dar o nou generaie de sisteme de corecie a aberaiilor a avut ca efect depirea parial a aberaiilor sferice i creterea rezoluiilor. Coreciile din software ale aberaiei de sfericitate pentru microscoapele electronice cu transmisie de nalt rezoluie a permis producerea unor imagini cu rezoluie suficient de bun pentru a evidenia atomii de carbon n diamante, aflai la distane de doar 0.89 ngstrmi (89 picometri) unii de alii i atomi din silicon la distane de 0.78 ngstrmi (78 picometri).(5),(6) Proteinele recombinate care contin etichete tetracisteine pot fi cu usurinta distribuite in celule vii cu diferite culori a biarsenical fluorescent chromophore* astfel incat , atat proteinele tinere , cat si cele batrane sa fie observate diferit de microscopul electronic. Astfel, noua proteina sintetizata connexin43** a fost transportata predominant intre 100 si 150 de nanometri prin plasma membranei si incorporata la periferia

11

membranei unde exista gap junctions***.Aceasta metoda are rolul de a clarifica procesele de transport de proteine in situ****.(7) *Fluorescent chromophore ( fluorophore ) reprezinta un flourcrom covalent la o macromolecula care ajuta la patarea tesuturilor, celulelor sau materialelor pentru imagine fluorescenta sau spectroscopie.(8)

Fig 9. ** connexin ( sau gap junction proteins ) reprezinta o serie de proteine care formeaza aceste jonctiuni.(9) *** gap junctions ( sau nexus ) reprezinta o conexiune specializata intercelular intre o multitudine de celule animale. Acesta se conecteaza direct la citoplasma si permite moleculelor si ionilor sau treca intre celule.(10) **** in situ = in habitatul natural (11)

Fig 10. Imaginea unui virus cu o dimensiune de 30 nm prin microscopul electronic cu transmisie.

12

 Fig 11. Imaginea virusului subtilis la microscopul electronic de transmisie

6.2 ) Microscopul electronic cu scanare ( sau cu baleiaj MES) si utilizarile sale

13

Fig 11. Schema de principiu a microscopului electronic de scanare. Stanga, de sus in jos sagetile indica: tunul de electroni, magnetii condensori, fasciculul de electroni, bobina, magnetii obiectiv, electroni secundari, proba. Dreapta, de sus in jos sagetile indica: imaginea vazuta pe ecranul format din tub catodic sincronizat la bobina, detectorul de electroni. Spre deosebire de MET, unde semnalele electronilor transmisi formeaza imaginea, microscopul electronic cu scanare produce imagini prin detecia electronilor secundari, cu energie sczut, emisi de pe suprafaa specimenului datorit excitrii acestuia de ctre raza principal de electroni. n MES, raza de electroni parcurge ntreg specimenul, detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziia razei. n general, rezoluia MET este de regul cu un ordin de mrime mai mare dect cea a MES. Datorit faptului ca imaginea produs de microscoapele cu scanare se bazeaz pe procese de suprafa i nu pe transmisie, acesta este capabil s vizualizeze probe mai mari, i are o adncime de penetrare mult mai mare, producnd astfel imagini care sunt o bun reprezentare tridimensional a probei.(12)

14

 Fig 12. Imaginea unor cristale de gheata la microscopul cu scanare

- Analizarea Coloniilor Bacteriene Aceasta tehnica este utilizata pentru observarea cresterii coloniilor bacteriene. Bacillus cereus si Bacillus subtilis au fost cultivate pe fasii de membrane de dializa etichetate cu nutriment agar. Microcoloniile au fost fixate pe fasii in vapor Formalin in situ.Apoi fasiile au fost scoate de la nutriment agar si analizate cu ajutorul microscopului cu scanare fara a fi distruse aranjamentele celulare. Astfel cu ajutorul acestui microscop s-au observat atat morfologia celulelor, cat si orientarea lor in cadrul coloniei.(13)

Fig 13. Imaginea unei colonii bacteriene - Evolutia Micoscopiei cu scanare ( Reconstructia structurilor 3D ) Fig 14. Imaginea unei furnici Observarea si analizarea structurilor la nivel 3D este de o importanta majora in la nivelul microscopului cu domeniul biologic si biofizic.Exista metode de a obtine stuctura unei molecule sau a unui scanare 15

atom la nivelul microscopului optic.Dar nimic nu se compara cu analiza 3D in momentul in care trebui sa se reconstruiasca anumite structuri de ordinul micrometrilor si sa se analizeze cele mai mici procese. De asemenea, sistemul 3D este foarte util in intelegerea retelelor de celule , mai ales cand vine vorba de Sistemul Nervos.(14)

Bibliografie :
1. Ernst Ruska (1986). Autobiografia lui Ernst (versiunea in engleza). Nobel Foundation. Accesat la 2007-02-06. 2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1986/ 3. Erni R, Rossell MD, Kisielowski C, Dahmen U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50-pm Electron Probe. Phys Rev Lett 2009: 102 (9): 096101. 4. http://www.scribd.com/doc/57678478/Microscopie-electronica 5. OM: World-Record Resolution at 0.78 , (18 mai 2001) Berkeley Lab Currents. 6. Nellist PD, Chisholm MF, Dellby N, Krivanek OL, Murfitt MF, Szilagyi ZS, Lupini AR, Borisevich A, Sides WH Jr., Pennycook SJ .(17). Direct Sub-Angstrom Imaging of a Crystal Lattice (n englez). Science 305 (5691): 1741. doi:10.1126/science.1100965. 7. Gaietta G, Deerinck TJ, Adams SR, Bouwer J, Tour O, Laird DW, Sosinsky GE, Tsien RY, Ellisman MH. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 2002 Apr 19;296(5567):503-7. PubMed PMID: 11964472. 8. Tsien RY, Waggoner A (1995). Fluorophores for confocal microscopy. In Pawley JB. Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press 2008: pp. 26774. ISBN 0-306-44826-2. 9.Lodish, Harvey F.; Arnold Berk, Paul Matsudaira, Chris A. Kaiser, Monty Krieger, Mathew P. Scott, S. Lawrence Zipursky, James Darnell (2004).Molecular Cell 16

Biology (5th ed.). New York: W.H. Freeman and Company. pp. 2301. ISBN 0-71674366-3. 10. White, Thomas W.; Paul, David L. (1999). "Genetic diseases and gene knockouts reveal diverse connexin functions". Annu rev physiol 61: 283310. 11. http://dexonline.ro/definitie/in%20situ 12. Microscopia electronic cu scanare, 1928 - 1965 13. Bulla LA, St Julian G, Rhodes RA, Hesseltine CW. Scanning electron and phasecontrast microscopy of bacterial spores. Appl Microbiol. 1969: 18(3): 490-95 [PMC free article][PubMed] 14. Denk W, Horstmann H. Max Planck Institute for Medical Research, Heidelberg, Germany. PubMed )

17