Analiza microscopic Microscopia (analiza microscopic) este una din cele mai utilizate tehnici pentru analiza (observarea

i msurarea) unor obiecte foarte mici, care permite mrirea puterii separatoare a ochiului pentru a putea observa obiecte ce nu pot fi vzute cu ochiul liber sau cu lupele. n domeniul tiinelor biomedicale, microscopia este folosit pentru cercetarea ultrastructurilor biologice. Pentru efectuarea acestor observaii se folosesc diferite tipuri de microscoape, al cror principiu de funcionare este foarte divers (observare n lumin transmis, reflectat, difuzat, polarizat, fluorescent i altele), de la legile opticii geometrice la legile mecanicii cuantice. Ele au rolul de a mri puterea de separaie a ochiului. Puterea de rezoluie (puterea de separaie) a unui instrument optic este capacitatea acestuia de a permite observarea unor detalii structurale ale obiectului de cercetat. La un microscop acest parametru se definete ca inversul distanei minime de vedere distinct a dou puncte (obiecte) nvecinate (minimul de separaie), avnd expresia: (1) unde este lungimea de und a radiaiei folosite, n - indicele de refracie al mediului dintre preparat i lentila frontal a obiectivului microscopului, u - unghiul de apertur (unghiul dintre axa optic a microscopului i raza limit a fasciculului care ptrunde n lentila frontal). Dac observarea preparatului se face n aer (n = 1), pentru obiectivele microscopului, de obicei, u /2, iar pentru observaii vizuale se consider 500 nm, atunci rezult d 3. 10 -5 cm. Aceasta nseamn c, prin intermediul microscopului optic, se pot observa esuturi, celule i chiar unele detalii subcelulare. n afar de microscoapele optice obinuite (cu aer sau cu imersie), n practica biologic se folosesc i alte tipuri de microscoape (microscoape cu contrast de faz, microscoape interfereniale i altele, prevzute cu faciliti de spectrograf sau care permit nregistrri fotografice sau video), precum i microscoape electronice. Descrierea microscopului optic. Microscopul optic (monocular sau binocular), n lumin transmis, este un instrument optic la care se disting trei pri principale: mecanic, optic i de iluminare al preparatului microscopic. 1. Partea mecanic se compune din: stativul (suportul), msua i tubul microscopului (fig. 1). - Stativul (piciorul, talpa) microscopului (a) asigur stabilitatea aparatului i servete drept suport a tuturor sistemelor (optic i a sursei de iluminare) necesare observrii preparatului. - Msua (platina) microscopului are rolul de a susine i imobiliza preparatul, dar i de a permite deplasarea sa n cmpul vizual al observatorului. Preparatul (lamela) se poate fixa i imobiliza cu ajutorul cavalerilor (c), reprezentai, fie de lamele elastice, fie de prghii prevzute cu arcuri elastice. Preparatul de pe msu se poate deplasa n plan orizontal pe dou direcii ortogonale ntre ele cu ajutorul aa-numitului car mobil acionat cu ajutorul a dou uruburi (k) plasate sub platin. Mrimea deplasrii se poate aprecia cu o scal gradat fixat pe msu i prevzut cu vernier. - Tubul microscopului (d) are rolul de a susine sistemul optic al microscopului i se poate deplasa pe vertical cu ajutorul a dou uruburi cu cremalier. Un urub macrometric (h) permite

o deplasare grosier, iar un urub micrometric (i), prevzut cu o circumferin gradat n 50 de diviziuni, asigur o deplasare fin a tubului. De obicei, la captul inferior al tubului se afl piese numit revolver (j) ce servete drept suport pentru obiectivele microscopului, existnd posibilitatea schimbrii lor rapide prin rotirea acestei piese. 2. Partea optic se compune din obiectiv i ocular. Obiectivul, dispus la captul inferior al tubului microscopului, este format dintr-un sistem de lentile (sistem optic convergent) a crui lentil frontal este singura care produce mrirea celelalte lentile servind doar la corijarea defectelor imaginii date de aceasta (lentile de corecie). Obiectivele se pot clasifica dup mai multe criterii. Dup puterea de mrire exist obiective: slabe i puternice. Puterile de mrire sunt notate numeric, dup caracteristicile diferiilor productori, cu: 8, 10, 20, 40, 60, 90, 100, 120, 125 de ori (). Drept obiective puternice se consider cele de 40, 60, 90, 100, 120 i 125 . Dup natura mediului dintre lentila frontal i obiectul de cercetat , exist obiective uscate i de imersie. Obiectivele uscate sunt acelea pentru care mediul dintre lentila frontal i preparat este aerul. n comparaie cu sticla care acoper preparatul (n = 1,52) i cu sticla lentilelor (n = 1,54), aerul (n = 1) este foarte puin refringent. Obiectivele puternice, avnd o distan focal mic, trebuie ns amplasate foarte aproape de preparat. n aceast situaie, razele luminoase refractate (deviate) puternic datorit diferenei mari dintre indicii de refracie ai lamei care acoper preparatul i aerului nu vor mai putea fi prinse de lentila frontal, fiind pierdute pentru observator. Pentru a nltura acest neajuns, se folosesc obiective de imersie (ntlnite frecvent n microbiologie la studiul celulelor, esuturilor, elementelor figurate ale sngelui, paraziii sngelui i altele). La acestea se umple spaiul corespunztor distanei frontale cu un mediu transparent (lichid de imersie: ap (n = 1,3330), ulei de cedru (n = 1,515), ulei de parafin, glicerin amestecat cu ap n proporie de 2/1 i altele. n acest fel, toate razele provenite de la preparat se vor ndrepta spre obiectiv (obiective de imersie: 90, 100, 120, 125 ), iar lentila frontal va putea fi apropiat ct mai mult de preparat. Ocularul, dispus la captul superior al tubului microscopului, este un sistem optic convergent (lup compus), format din dou lentile deprtate ntre ele. Puterea de mrire a ocularelor poate fi: 5, 7, 10, 20 . n mod obinuit, pentru observaiile curente la microscop, se folosete combinaia dintre un obiectiv mai slab i un ocular mai puternic. Cele mai puternice combinaii ale microscopului optic obinuit pot s conduc la mriri de pn la 2500 3000 . 3. Dispozitivul de iluminare este alctuit din surs de lumin (k), port-filtru, condensor (l) i diafragm. Sursa de lumin este reprezentat de o oglind sau de un bec electric. La microscoapele cu oglind aceasta are dou fee, una plan i cealalt concav, avnd rolul de a colecta razele de lumin fie cele naturale, fie provenind de la o surs artificial (bec electric). Datorit unui sistem cardanic, oglinda poate fi orientat n toate direciile nct s permit iluminarea n funcie de poziia sursei de lumin. Dac microscopul prezint ca surs de lumin doar un bec electric, atunci lumina este dirijat mai departe printr-un sistem de lentile i de oglinzi plane reglabile care asigur o iluminare uniform a preparatului. Port-filtrul este plasat deasupra oglinzii i are rolul de a permite adaptarea de filtre de culori i grosimi diferite pentru a permite gradarea intensitii luminii i observarea selectiv a anumitor structuri ale preparatului.

Condensorul este un sistem de 2 3 lentile convergente care are rolul de a focaliza lumina sub forma unui fascicul puternic convergent asupra obiectului de cercetat, fixat pe platina microscopului i dispus chiar n focarul fasciculului. n acest scop, condensorul se poate deplasa pe vertical cu ajutorul unui urub cu cremalier. Diafragma, cu diametru variabil (dup principiul irisului), este plasat ntre port-filtru i condensor i are rolul de a regla diametrul fasciculului luminos. Pentru observarea preparatelor proaspete i a detaliilor de structur ale acestora este neaprat necesar micorarea diafragmei. Formarea imaginii n microscop (fig. 2). Scopul principal al activitilor din cadrul analizei microscopice este observarea unor imagini ct mai mult mrite ale obiectului de cercetat. n acest scop, att obiectul de investigat, ct i sistemul optic al microscopului sunt astfel plasate nct s conduc la o imagine mult mrit a obiectului. De aceea obiectul este plasat ntre focar i dublul distanei focale, iar ocularul ndeplinete rol de lup pentru imaginea dat de obiectiv. Pentru obinerea imaginii se consider un obiect liniar (AB) plasat n vecintatea axei optice a microscopului aflata aproape de focarul obiectivului. Obiectivul d o imagine real, rsturnat i mrit (A1B1) a obiectului, care servete drept obiect pentru ocular. Ocularul d o imagine virtual, dreapt i mrit (A2B2) observabil dac se privete prin ocular. Grosismentul (mrirea unghiular) unui instrument optic este un parametru care caracterizeaz instrumentele optice ce dau imagini virtuale i se definete, n general, ca raport dintre tangenta unghiului sub care se vede imaginea obiectului prin instrument ( 2) i tangenta unghiului sub care obiectul se vede cu ochiul liber (1) aezat la distana de vedere optim (25 cm), adic: (2) Grosismentul (G) unui microscop arat de cte ori acest instrument mrete un obiect dat. Uneori, n tehnic, el se mai exprim prin raportul dintre diametrul aparent al imaginii i diametrul aparent al obiectului (diametrul aparent este raportul dintre nlimea obiectului i distana obiect-pupila ochiului), la distana minim de vedere (25 cm), adic: (3) Dac se amplific i se mparte fracia cu A1B1 se obine: (4) Conform definiiei grosismentului, primul raport reprezint grosismentul ocularului ( ) iar al doilea raport reprezint grosismentul obiectivului ( ). Deci: G = Goc Gob (5) adic, grosismentul microscopului este egal cu produsul dintre grosismentul ocularului i grosismentul obiectivului. Msurarea dimensiunilor celulare cu microscopul cu micrometru obiectiv i ocular. Citometria este capitolul din biofizic ce se ocup cu msurarea dimensiunilor, formei, suprafeelor, aspectului i a altor detalii structurale ale elementelor microscopice (celule, esuturi etc.). Msurrile citometrice, ntlnite iniial n completarea diagnosticului morfologic al diverselor hemopatii, sunt indispensabile acum n diagnosticul unor afeciuni. Pentru diagnostic,

spre deosebire de citologie, citometria este mai avantajoas, permind analiza rapid i sensibil a unui numr mare de celule. Ea se folosete, de asemenea, la evaluarea pronosticului pacienilor i a bolii minime reziduale. Msurrile citometrice se ntlnesc frecvent n hematologie, imunologie, oncologie, n explorarea fenomenului de apoptoz (moartea celular programat), microbiologia i biologia vegetal, n studierea efectelor produse de unii factori externi asupra anumitor celule, dar i n controlul mediului nconjurtor. Pentru determinarea detaliilor dimensionale ale diferitelor structuri ale preparatelor microscopul este prevzut cu dou micrometre: obiectiv i ocular. Aceste micrometre permit aprecierea structurilor cercetate prin compararea lor cu diviziunile scrii gradate a micrometrului ocular. Micrometrul obiectiv (fig. 3) este, de obicei, o lam de sticl (sau din metal ce prezint n centru o parte din sticl) pe care sunt gravate diviziuni a cror distan dintre ele este cunoscut (cel mai adesea 0,01 mm, adic 100 diviziuni/mm). Aceste diviziuni sunt fixe i nscrise pe lama respectiv. Pentru reperarea mai uoar a diviziunilor micrometrului obiectiv, ele sunt dispuse n centrul comun a dou cercuri concentrice. Micrometrul obiectiv servete la stabilirea valorii diviziunilor micrometrului ocular. Micrometrul ocular (fig. 4) este un disc de sticl cu un diametru puin mai mic dect diametrul interior al tubului ocularului i care se plaseaz pe diafragma interioar a ocularului. Pe suprafaa micrometrului ocular este trasat o scal (sau o gril micrometru ocular n reea) arbitrar. Valorile micrometrului ocular sunt relative ntruct ele depind de combinaia de lentile obiectiv-ocular folosite i de valoarea diviziunii micrometrului obiectiv cu care se compar. naintea unei determinri citometrice se impune determinarea coeficientului micrometric, adic valoarea unei diviziuni a micrometrului ocular. Aceast operaiune se face n cadrul etalonrii microscopului. Modul de lucru pentru determinarea dimensiunilor celulare El se desfoar n dou etape: etalonarea microscopului i msurarea dimensiunilor celulare. a. Etalonarea microscopului urmrete stabilirea valorii unei diviziuni a micrometrului ocular (coeficientul micrometric - C). Se procedeaz dup cum este descris n continuare. - Se conecteaz microscopul la sursa de iluminare i se verific prezena micrometrului ocular n tubul ocularului. - Se aeaz micrometrul obiectiv pe platina microscopului i se pune la punct imaginea acestuia, prin acionarea uruburilor situate sub platin. Imaginea se consider pus la punct atunci cnd se pot observa clar celor dou micrometre, iar diviziunile acestora sunt paralele ntre ele (n acest scop se rotete ocularul microscopului). - Se caut dou diviziuni ale micrometrului ocular care sunt n prelungirea a dou diviziuni ale micrometrului obiectiv i se numr diviziunile (n ob) de pe micrometrul obiectiv care corespund cu diviziunile (noc) de pe micrometrul ocular. - Se determin valoarea unei diviziuni a micrometrului ocular (coeficientului micrometric), y, printr-o regul de trei simpl. De exemplu: Ndiv.oc. . . . . . . . Ndiv.ob.xval.1 div.ob. 1div.oc. . . . . . . . . b. Msurarea dimensiunilor celulare (lungimi, suprafee)

- Se nlocuiete micrometrul obiectiv cu preparatul n cmpul optic al microscopului apar suprapuse att imaginea preparatului, ct i diviziunile (scala, reeaua) micrometrului ocular. - Se apreciaz cte diviziuni i/sau fraciuni de diviziuni ale micrometrului ocular sunt cuprinse n dimensiunea structurii de msurat. De exemplu, dac dimensiunea de msurat (lungimea, limea, diametrul unei celule) corespunde cu 4 diviziuni i jumtate ale micrometrului ocular, atunci dimensiunea respectiv (D) se va obine prin relaia: D = 4,5C (n mm, m). Dac elementul microscopic de exemplu, celula, canalul biologic etc. are form geometric regulat, prin msurarea dimensiunilor sale se poate determina, prin calcul, suprafaa respectiv. Pentru msurarea mai uoar a suprafeelor se utilizeaz, de preferin, micrometrele oculare n reea. Modul de msurare este analog cu cel folosit n cazul micrometrului ocular liniar. Rezultatele obinute se trec n tabelul 1. Tabelul 1 Determinarea dimensiunilor celulare Preparatul microscopic noc div nob div Val. diviz. microm. obiectiv mm C mm mm D m Suprafaa mm2 m2 Obs.