Ecologia microorganismelor ce afecteaz industria farmaceutic.

Controlul
microbiologic al aerului i norme de monitorizare ale aerului. Controlul microbiologic al
apei.
1. Introducere
Calitatea microbiologic a produselor farmaceutice este influenat de mediul n care sunt
fabricate i de materialele folosite n producerea lor.
Prezena unei game variate de microorganisme saprofite n mediul nconjurtor
creeaz condiii de contaminare a produselor farmaceutice, ducnd n final la degradarea
medicamentelor. Cu excepia preparatelor care sunt sterilizate n recipientul final, microflora
produsului finit poate fi reprezentat de contaminanii materiilor prime, de flora de pe
echipamentul de producie, din atmosfer, de la operator sau din recipeintul final n care se
ambaleaz produsul.
Contaminarea produselor farmaceutice se poate realiza cu germeni patogeni sau cu
bacterii saprofite condiionat patogene. n cadrul fabricrii medicamentelor pe cale industrial
exist riscul de contaminare microbian favorizat de capacitatea metabolic a unor
microorganisme de a se adapta la variaii ale temperaturii i pH-ului i de posibilitatea de a
utiliza anumite substane din compoziia produsului.
Unele microorganisme au capacitatea de a se adapta i supravieui n condiii precare,
stafilococii i enterococii se dezvolt n condiii de hipersalinitate (20-30%), iar bacteriile
zaharolitice se pot dezvolta la concentraii mari ale zaharurilor (40-60%), tincturile alcoolice
pot s conin specii de bacili sporulai, cum ar fi Bacillus cereus; fungii se dezvolt n
condiii variate de pH, temperatur i umiditate, o mare parte din medicamente permind
dezvoltarea unei game diverse de genuri microbiene.
Sursele de contaminare a produselor farmaceutice sunt reprezentate de:
atmosfer (microaeroflor)
ap
persoana care produce medicamentul (operatorul)
materialele utilizate la obinerea preparatului (substana brut: substane sintetice,
semisintetice, substane de origine animal sau vegetal, diferii adjuvani)
echipamentul de producie
recipientul final n care a fost ambalat.
Unele microorganisme pot crete chiar n prezena conservanilor i deterioreaz
produsul farmaceutic.
Bacteriile distruse n procesul final de sterilizare a produsului pot lsa reziduuri toxice sau
pirogenice, deoarece fracia pirogen, lipidul A, prezent n peretele celular bacterian nu este
distrus.
Paralel cu mbuntirea tehnologiilor de producere a medicamentelor s-a dezvoltat i
ghidul de bune practici (Good Manufacturing Practices) pentru minimalizarea contaminrii
microbiene, care se poate realiza prin studiul ecologiei microorganismelor, a riscurilor
reprezentate de acestea i controlul contaminrii.
Obiectivul ghidului este de a mbunti sigurana microbiologic a produselor ntr-o
modalitate eficient (raport optim cost-calitate) i dezvoltarea tehnicilor rapide de detecie a
microorganismelor.
2. Atmosfera.
2.1. Coninutul microbian.
Aerul nu este un mediu natural propice pentru creterea i reproducerea
microorganismelor deoarece nu conine cantitatea necesar de umezeal i hran. Aproape

orice mostr de aer netratat conine bacterii, mucegai i drojdii. Pentru a putea supravieui,
microorganismele trebuie sa fie capabile s tolereze deshidratarea din mediu.
Numrul organismelor din atmosfer depinde de activitatea din mediu, cantitatea de
praf ce este dislocat, umiditate.
Microorganismele izolate n mod normal din aer sunt:
Bacterii sporulate : Bacillus spp i Clostridium spp.
Bacterii nesporulate: Staphyllococcus spp, Streptococcus spp, Corynebacterium spp.
Mucegaiuri: Penicillium spp, Cladosporium spp, Aspergillus spp, Mucor spp.
Levuri: Rhodotorula spp.
Numrul microorganismelor din atmosfer
Depinde de activitatea din mediu i de cantitatea de praf produs. Coninutul
microbian este mai ridicat :
n zona cu utilaje n activitate (care funcioneaz),
zona cu personal care lucreaz,
ntr-o ncpere murdar, necurat fa de o camer curat/aseptic.
Coninutul microbian este influenat de umiditate, ntr-o ncpere umed i rece
numrul microorganismelor este mai mic, deoarece contaminanii sunt adui pe sol de ctre
picturile de umezeal (aerul ntr-un depozit rece nu conine de obicei microorganisme).
Aerul este mai puin contaminat n iernile umede dect n verile clduroase i uscate.
Microorganismele sunt transportate n atmosfer prin praf, tegument, haine, n
picturile de saliv sau sput rezultate din vorbire, tuse sau strnut.
Bacteriile i mucegaiurile care nu sunt ataate de particule se vor depune cu uurin
ntr-o ncpere fr cureni de aer. Rata depozitrii depinde de curenii de aer: ventilaie,
sisteme de extracie a aerului, cureni de convecie deasupra surselor de nclzire i de
activitatea din ncpere.
Numrul microorganismelor din aer poate crete n timpul manipulrii materialelor
contaminate, n timpul preparrii, amestecrii i adaugrilor n procesul de fabricaie.
Utilizarea amidonului i a unor zaharuri n stare uscat favorizeaz dezvoltarea
mucegaiurilor (la numrtoare/ detecie).
Unele ambalaje, de exemplu cartonul, au o microflor reprezentat de mucegaiuri,
bacterii; acest fapt este reflectat prin numrul crescut de microorganisme (prin metode de
cultivare/ numrare a microorganismelor) n jurul de utilajelor de ambalare.
Metode uzuale de verificare microbiologic a calitii aerului
A. nsmnarea se poate realiza:
direct pe medii solide (metoda prin sedimentare, metodele de impact, metoda
electroprecipitrii);
indirect, prin intermediul unui lichid steril cum ar fi soluie salin izoton steril,
bulion nutritiv steril (metodele de recoltare prin aspiraie).
A.1. Metoda prin sedimentare:
Deschiderea i expunerea la aer a plcilor Petri cu mediu (geloz snge) timp de
cteva minute pn la 1 or; incubare la 370C, 24 ore.
Se las pe mas nc 24 ore la temperatura camerei (pentru pigmentogenez);
Se numr coloniile pentru a obine numrul total de germeni (NTG)
Dezavantaje:
se evideniaz mai ales bacteriile din picturile de saliv i praful bacterian;
nu se obine numrul real de germeni, ci doar fraciunile de sedimentare n
intervalul de expunere;

Pentru evaluarea pe unitatea de volum de aer se utilizeaz formula lui Omeliansky,

care se bazeaz pe observaia c n 5 minute se depun pe o suprafa de 100 cm2
microorganismele din 10 litri aer.
Formula de calcul este:
Nr. germeni/m3 aer = n x 10000/ (SxT/5)
n=nr colonii aprute pe suprafata mediului;
S= suprafaa cutiei Petri (cm2),
T= timpul de expunere (min).
A.2. Metode de recoltare prin aspiraie:
A.2 a) Metodele de filtrare:
Se utilizeaz un filtru de sticl care conine material filtrant (nisip de cuar steril
sau zaharuri zaharoz, lactoz) sau membrane filtrante.
o pomp de aspirare i un debitmetru.
Aerul este aspirat prin materialul filtrant care va reine microorganismele;
Dac s-a folosit nisip de cuar sau mas filtrant din zaharuri, acestea se spal cu
soluie salin izoton steril i se fac diluii care se vor nsmna pe medii solide.
Dac s-au folosit membrane filtrante (filtrul Milipore), dup trecerea unui curent de
aer peste ele, se aplic pe suprafaa mediului. Se incubeaz n termostat la 370C, 24 ore.
Se numr coloniile aprute i se raporteaz la m3 de aer, cunoscnd volumul de aer
filtrat.
A.2 b) Metoda de barbotare:
Aerul filtrat este trecut prin vase de barbotare care conin soluie salin izoton steril
i care rein microorganismele. Din suspensie se fac diluii i se nsmneaz pe mediu.
A.2 c) Metoda de impact:
n industria farmaceutic se folosete detectorul Merck pentru probe de aer.
Aerul aspirat este proiectat pe suprafaa mediului, impactul realizndu-se printr-un
curent de aer turbionar sau prin trecerea aerului printr-o fant ngust. Se incubeaz la 370C,
24 ore.Cunoscnd volumul de aer recoltat, evalum numrul de microorganisme folosind
formula: Nr. microrganisme/m3= n x 1000/V
n= numrul de colonii crescute pe o plac;
V= volumul de aer aspirat.
A.2 d) Metoda electroprecipitrii:
Se bazeaz pe principiul ionizrii particulelor de aer; acestea se depun pe electrozii
care se gsesc pe mediu
B. Determinarea indicatorilor biologici:
determinarea florei mezofile: coloniile care apar pe plci dup incubare la 370C, 24
ore. Flora mezofil este un indicator orientativ al gradului de contaminare a aerului. Se
interpreteaz ca numr de microorganisme dezvoltate la 370C/m3.
determinarea streptococilor hemolitici: pentru nsmnare se folosete geloz snge
5%. Coloniile de streptococ se identific dup hemoliz (alfa/beta), dup morfologie,
se numr coloniile i se raporteaz la m3 aer;
determinarea stafilococilor: se folosete geloz snge 5%; coloniile de stafilococ se
identific, se observ prezena sau absena hemolizei; se raporteaz numrul total de
stafilococi sau stafilococi hemolitici;
determinarea coliformilor: se face pe geloz snge. Coloniile care se consider a fi de
enterobacterii sunt trecute pe medii difereniale.
determinarea fungilor: prin metoda sedimentrii, folosind mediu Sabouraud. Se
incubeaz la 370C, timp de 24-48-72 ore urmrind apariia coloniilor caracteristice
(cremoase, alb glbui n cazul fungilor din genul Candida).

Numrul total de fungi/ m3 n aer se obine folosind folosind formula lui

Omelianski.Valori normale: sunt cele sub 550 UFC/m3 aer, (UFC= uniti formatoare de
colonii)
Contaminare medie: 550-700 colonii/m3 aer.
Contaminare maxim: peste 700 colonii/m3 aer.
Aceast metod asigur informaii asupra ncrcturii microbiene de la locul
produciei. Standardul microbiologic a sursei de aer i riscul acceptat este determinat de tipul
(forma) de prezentare a medicamentului: orale, injectabile, etc.
Produsele injectabile sau de uz oftalmic ce nu pot fi sterilizate la finalul produciei prin
caldur umed, trebuie produse n zone unde numrtoarea microorganismelor n mediu este
foarte sczut. Microaeroflora este un punct critic al fabricrii medicamentelor de acest tip.
Cu toate ca aceste produse trebuie sa treac un test de sterilitate, testul n sine este
distructiv i prin urmare doar cteva mostre sunt testate (aleator).
Numrtoarea microorganismelor din atmosfer este important pentru a detecta
ncrctura microbian real, pentru prevenirea contaminrii sporadice a unor recipiente care
ocazional pot trece nedetectate la testele de sterilitate.

n cazul identificrii unei caliti microbiologice necorespunztoare a aerului (se

depete pragul critic) se emite un avertisment cu privire la posibila contaminare i se iau
msuri de remediere rapid a situaiei.
Producerea preparatelor lichide sau semi-solide pentru uz oral sau pentru uz topic
necesit un mediu nconjurtor curat, atat n etapa de producere cat i n cea de umplere.
Multe forme de prezentare a medicamentelor sunt protejate prin conservani chimici
sau prin pH mpotriva dezvoltrii bacteriilor care le pot contamina. Protejarea mpotriva
sporilor de mucegai este mult mai greu de realizat.
2.2. Reducerea numrului de microorganisme
Numrul microorganismelor din atmosfer poate fi redus prin filtrare, dezinfecie
chimic, raze ultraviolete.
1. Filtrarea este cea mai utilizat metod, filtrele pot fi fabricate dintr-o gam larg de
materiale: celuloz, vat de sticl, amestec de fibre de sticl sau politetrafluoretilen
(PTFE) cu rini sau liani acrilici etc. Standardele pentru calitatea aerului filtrat sunt

notate n Marea Britanie ntr-un sistem notat de la A la D, iar n USA exist 6 clase de
la clasa 1 la clasa 100.000.
Pentru condiii asepsie strict este necesar s sa ndeprteze toate particulele peste 0,1
microni, folosind un filtru eficient HEPA.
Pentru operaii standard aerul trebuie s conin <100 particule/ 3,5 litri, diametrul
porilor este de 0,5 microni sau mai mare (gradul A n UK sau 100 n USA). Aceasta
filtrare este precedat de o etap de filtrare grosier.
Filtrele trebuie meninute n stare uscat pentru a fi eficiente, deoarece
microorganismele se pot deplasa de-a lungul filtrelor umede.
Aerul filtrat poate fi folosit pentru a cura o ncpere sau o anumit zon. Se bazeaz
pe principiul curgerii laminare, care permite ca etapele procesului de fabricaie s fie
desfurate ntr-un mediu steril. Direcia fluxului de aer poate fi orizontal sau vertical n
funcie de tipul de echipament utilizat, de tipul operaiei, de tipul materialului. Este important
ca s nu existe nici o obstrucie ntre sursa de aer i produsul expus, pentru a nu aprea
contaminarea cu microorganisme sau alte particule deviate de pe suprafee nesterile. Pentru
monitorizarea fluxului de aer sunt necesare dispozitive care s asigure meninerea permanent
a presiunii pozitive ntre zona curat ctre cea mai puin curat. Integritatea i funcionarea
corect a sistemului de filtrare a aerului trebuie verificat cu regularitate.
Cea mai utilizat metod este aceea de numrare a particulelor n zona de lucru i pe
suprafaa filtrului.

2. Dezinfectanii chimici
Utilizarea dezinfectanilor este limitat din cauza proprietilor iritante a aerosolilor..
Se pot obine rezultate bune cu propilen glicol pulverizat la o concentraie de 0,050,5mg/l sau cu compuii cuartenari ai amoniului la 0,075 %. Pentru zonele ce pot fi
sigilate pentru dezinfectare este eficient formaldehida n concentraie 1-2 mg/l de aer,
la o umiditate relativ de 80-90%.
3. Iradierea cu UV cu lungime de und ntre 240-280 nm pentru reducerea contaminrii
aerului.
Iradierea UV este activ doar la o distan mic de surs. Bacteriile n form sporulat i
fungii (n special cei cu nveli puternic pigmentat) sunt adesea rezisteni. Eficiena
metodei crete n combinaie cu filtrarea aerului.
2.3. Aerul comprimat
Aerul comprimat are numeroase aplicaii n fabricarea produselor farmaceutice, de
exemplu transportul pudrelor, al suspensiilor; utilizat n aerarea dn procesul de fermentare.

Este sterilizat prin filtrare sau o combinaie ntre cldur i filtrare pentru a evita
contaminarea cu microorganisme a produsele farmaceutice pentru obinerea crora este
utilizat.
Coninutul microbian al aerului comprimat poate fi estimat prin barbotarea unui volum
cunoscut de aer n bulion nutritiv apoi
a. filtrarea printr-o membran, care este apoi aplicat pe suprafaa plcii Petri cu
geloz, incubare i numrtoarea coloniilor.
b. sau se folosete o metod mai rapid prin detecia modificrilor caracteristicilor
fizice sau chimice ale bulionului nutritiv.
3. Apa
Ecologia microbian a apei are o mare importan n industria farmaceutic.
Apa este utilizat drept constituent al multor produse farmaceutice i este utilizat n
procesele de splare i rcire.
Sunt importante dou aspecte:
A.Calitatea apei brute i orice procesare a sa
B. Sistemul de distribuie
Microoorganismele specifice apei proaspete includ: Pseudomonas spp, Alcaligenes
spp., Flavobacterium spp., Chromobacter spp., Serratia spp.
Sunt bacterii nepretenioase din punct de vedere nutritiv i au o temperatur de cretere
relativ sczut.
Bacteriile ce ajung n ap din cauza eroziunii solului, aploilor abundente i putrefaciei
plantelor includ: Bacillus subtilis, B.megaterium, Enterobacter aerogenes E. cloacae.
Prin contaminarie cu deeuri (ape uzate, de canalizare): Proteus spp., E.coli i alte
enterobacterii, Streptococcus faecalis , Clostridium spp.
O examinare a rezervei de ap industrial nmagazinat a artat c 98% din
contaminare se datoreaz bacteriilor Gram-negative. Alte organisme izolate Micrococcus
spp., Cytophaga spp., levuri, fungi i actinomicete.
Apa distilat
n urma procesului de fabricare apa distilat nu conine microorganisme.
Contaminarea poate aprea din cauza unor defecte ale sistemului de rcire, de
depozitare sau ale sistemului de distribuie. Flora ce poate contamina apa distilat este de
obicei format din bacterii Gram-negative. Cnd apare contaminarea, flora microbian este
introdus dup sterilizare i astfel este o cultur pur (uneori pn la 1.000.000/ml).
Apa distilat este folosit pentru obinerea de preparate farmaceutice orale sau topice
pentru care este acceptat un numr mic de bacterii.
Este utilizat i pentru obinerea produselor de administrare parenteral dup distilare
i sterilizare prin cldur. Apa pentru astfel de preparate se pstreaz la 800C pentru a preveni
dezvoltarea bacterian i producerea de substane pirogene care nsoesc creterea bacterian.
Apa obinut prin osmoz revers
Apa este mpins de presiunea osmotic printr-o membran semipermeabil care
acioneaz ca un filtru molecular. Se mpiedic difuziunea substanelor solubile dizolvate n
ap.
Substanele solubile cu greutate molecular mare nu difuzeaz deloc. Procesul este
inversul procesului natural de osmoz. Osmoza revers ndeprteaz microorganismele i
pirogenii.
Contaminarea post-osmoz revers poate avea loc atunci cnd vasul de depozitare sau
sistemul de distribuie sunt contaminate cu microorganisme.

Sistemul de distribuie
Un recipient de depozitare contaminat acioneaz ca un rezervor microbian i
contamineaz toata apa ce trece prin el. Toate recipientele de depozitare se testeaz regulat.
Recircularea constant a apei la o presiune pozitiv, asigur un sistem optim de reducere a
creterii florei microbiene.
Se folosete un sistem de resterilizare a apei prin filtrare sau UV nainte ca apa s
reintre n rezervor.
Dezinfecia apei
Se folosesc trei metode de tratare a apei : dezinfecie chimic, filtrare, radiaii UV.
3.1. Tratarea chimic
Se aplic de obicei apei brute, apei din reea, apei dedurizate, sistemului de depozitare i
distribuie a apei distilate, deionizate, a apei produse prin osmoz revers. Se folosesc
hipocloritul de sodiu, clorul (cei mai utilizai agenti de tratare a rezervei de ap).
3.2. Filtrarea apei
Este util n situaiile n care consumul este moderat i exist un circuit continuu al apei. Apa
se rentoarce n rezervor i este refiltrat. Se instaleaz un filtru terminal cu diametru de 0,22
micrometri din cauza dimensiunii mici a bacteriilor. Filtrele trebuie dezinfectate sau, cel mai
eficient, scoase i sterilizate prin autoclavare.
3.3. Razele UV
Razele UV cu lungime de und de 254 nm sunt eficiente pentru dezinfecia apei
limpezi (claritate bun). Avantaje sunt reprezentate de lipsa mirosului sau gustului neplcut ca
la dezinfectarea chimic i nu se produce colonizare microbian (spre deosebire de filtre).
3.4. Verificarea microbian
Filtrarea prin membrane este una dintre cele mai utilizate i eficiente metode de
verificare a apei. Permite concentrarea unui numr mic de microorganisme dintr-un volum
mare de ap. Cnd se testeaz rezervele de ap clorinat se adaug un agent inactivator
(tiosulfatul de sodiu).Temperatura de incubare pentru izolarea microorganismelor este de
370C. Deoarece multe specii de contaminani fecali nu cresc la 370C, trebuie ca plcile Petri
s se incubeze la 20-260C.
Controlul bacteriologic al apelor denumite medicale, utilizate pentru pacieni,
personalul medical sau materiale:
apa steril pentru splarea minilor n chirurgie
apa pentru splarea arsurilor
apa pentru hemodializ
ap steril pentru preparate injectabile
apa purificat utilizat n farmacie i n laboratoare
Apa steril este utilizat pentru splarea minilor chirurgilor, a endoscoapelor.
Periodic, apa steril este controlat; sunt prelevate probe din flacoanele cu ap steril care
conin 5-10mg tiosulfat de sodiu pentru a neutraliza urmele de clor prezente n ap. Nu trebuie
s conin nici un microorganism la 100 ml.
Tehnici microbiologice:
tehnica plcilor cu geloz snge:
Geloza snge 5 % este nclzit la 440C+/- 20C realizndu-se nsmnarea prin
nglobare. Se incubeaz 24 ore la 30-350C, apoi 48 ore la 20-210C. Se numr dup fiecare
perioad de incubare coloniile aprute i se evalueaz numrul de colonii/ml ap, innd cont
de diluie.
tehnica filtrrii prin membran:
Se filtreaz prin membran cu dimensiunea porilor de 0,45 un eantion din ap sau
din diluiile preparate pentru a obine n final maximum 100 de colonii.

Membrana filtrant se aplic pe placa Petri cu mediu solid i se incubeaz la termostat

la temperatura de 30-350C timp de 24-72 ore.
Se numr coloniile dup fiecare perioad de incubare i rezultatul se exprim n
numr de microorganisme/ml, lund n calcul i eventuala diluie a probei.
Cercetarea microorganismelor n ap steril, ap pentru farmacie
Se folosete tehnica filtrrii prin membran care se aplic pe placa Petri. Se
termostateaz la 300C. Se numr i se identific coloniile aprute.
Pentru evidenierea stafilococului auriu se utilizeaz mediul hiperclorurat selectiv
Chapman solid,
Pentru Pseudomonas aeruginosa se utilizeaz mediul cu geloz simpl pentru
evidenierea pigmentogenezei.
Escherichia coli se dezvolt pe medii selective i selectivo-difereniale pentru
Enterobacteriaceae (CLED, AABTL, ADCL Leifson, etc,
Salmonella spp. se dezvolt optim pe medii de cultur care conin selenit.
Analiza parazitologic a apei
Recoltarea probelor se realizeaz n mod similar cu recoltarea pentru analiza
bacteriologic.
Apa potabil, apa utilizat n farmacii, nu trebuie s conin ou de helmini. Pentru
evidenierea de ou de geohelmini din ap i din instalaiile de tratare i stocare a apei se
recolteaz 10 l de ap, se las 24 ore pentru sedimentare, se centrifugheaz, se arunc
supernatantul i se realizeaz preparate proaspete din sediment. Se pot evidenia ou de
parazii dac acetia exist n proba de ap examinat. Rezultatul se exprim n numr de ou
parazii/litru.