Termenul biomarker este acceptat n ultimii ani, dei are nc o definire inconsistent.

Biomarkerii sunt oricare din rspunsurile biologice la o substan chimic la nivel individual sau o ndeprtare a organismului de starea normal a organismului. Clasificare a rspunsurilorbiologice : biochimice, fiziologice, histologice, morfologice i comportamentale -biomarkeri. Anumite exemple de biomarkeri la nivele diferite de organizare sunt artate n tabelul 10.1. Rspunsurile biologice la nivele de organizare superioare nivelului individual (populaie, comunitate i ecosistem ) sunt considerate ca bioindicatori. Totui, din punct de vedere al importanei, unele rspunsuri sunt considerate, n general, biomarkeri specifici. Relaia dintre biomarkeri i bioindicatori privind specificacitatea i relevana ecologic este artat n figura 10.1. n general, se poate spune c este dificil de descris modificrile ecologice (chiar dac subierea cojii oulor la unele specii de psri este cauzat de p,p'-DDE ,iar imposex ul la crabi de TBT), ntruct i schimbrile fiziologice sunt legate de schimbarea masiv a populaiei.

Clasificarea biomarkerilor Au fost propuse mai multe clasificri ale biomarkerilor. Mai frecvent utilizat este mprirea n acestora n dou tipuri de biomarkeri:

substane chimice, dar nu d nicio informaie asupra nivelului efectelor adverse pe care acestea le cauzeaz. Biomarkerii de efect sau poate, mai corect, efectele toxice (din cauz c toi biomarkerii prin definiie produc un astfel de efect) -rspunsuri care induc efecte adverse demonstrate asupra organismului. Conceptul de biomarker se bazeaz pe modificrile parametrilor fiziologici artate n figura 10.2. Modificarea strii de sntate a unui individ, odat cu creterea timpului de expunere la o substan chimic este indicat printr-o curb dreapt, plecnd de la o stare de sntate complet reversibil la schimbrile ireversibile care pot conduce la moarte. Punctele de tranziie pe traseul acestei ci sunt:

de expunere; de efect. Biomarkerii de expunere -rspunsuri care indic expunerea organismului la

organismul s fie anterior stresat,

funciile sunt afectate, iar organismul, dei stresat, este capabil s compenseze acest stres,
organismul nu este capabil s compenseze un timp ndelungat, schimbrile sunt reversibile, iar ndeprtarea stresului permite nsntoirea organismului, punctul r -schimbrile sunt ireversibile i n final moartea.

Specificitatea biomarkerilor

mprirea biomarkerilor n specifici i nespecifici este necesar ntruct efectele asupra sistemului imunitar pot fi cauzate de o varietate larg de poluani. O list a biomarkerilor n funcie de gradului lor de specificitate este dat n tabelul 10.2. Biomarkerii specifici, ct i cei nespecifici au o valoare important n evaluarea hazardelor. Ex. prin probele de snge ale unei psri maritimeeste determinat activitatea ALAD (dehidrogenaza acidului aminolevulinic), astfel fr alte msurtori, se determin procentul psrilor maritime expuse intoxicaiilor cu plumb. determinarea ALAD nu aduce nicio informaie despre ali poluani care pot fi prezeni n mediu. Inhibiia AChE poate fi utilizat pentru a furniza dovezile legale ale morii provocate de pesticidele organofosforice i carbamate, o astfel de aciune inhibitorie fiind considerat specific la aceste clase de poluani chimici. Totui, n ultimii ani, evidenele au indicat c inhibiia AChE este cauzat i de alte pesticide. Payne (1996) stabilete depresia activitii AChE la peti mai mare de 50% i consider c n acest caz poate fi implicat un complex de poluani. Astfel, Guillermino i col. (1998) a artat c detergenii i metalele pot inhiba activitatea AChE i sugernd c utilizarea acestei enzime ca biomarker poate fi extins. Inducerea monooxigenazelor - o mare varietate de substane chimice -constituie un
indicator sensibil al prezenei poluanilor. Aceasta este o indicaie obinuit prin care organismele afectate de poluani dau slabe informaii asupra cauzei specifice. n acest caz, biomarkerul are valoare de studiu secundar din cauz c poluanii trebuie s fie prezeni la un nivel destul de ridicat pentru a provoca un efect detectabil.

Biomarkeri specifici
Inhibiia esterazelor Monoxigenazele Studiile asupra materialului genetic Porfirinele i sintezele hemului Inducerea vitelogenului Inhibiia esterazelor
AChE este utilizata ecotoxicologic a-special -indic locul lor de aciune al ST- nivelul lor indic inhibarea corelat cu efectele toxice. Butiratcolinesteraza (BuChE) -studiat n anumite situaii n paralel cu AChE-rolul su este necunoscut i nivelul de inhibare nu este att de uor de corelat cu efectul toxic. Studiul neuropatiilor provocate de esteraze , a cror interaciune cu compuii organofosforici (OP) poate conduce la ntrzierea influxului nervos, a fost limitat la studiile de laborator. Modul lor de aciune este binecunoscut i a fost artat anterior. La vertebrate-inhibiia AChE cerebrale -utilizat la stabilirea cauzelor morii produse de ctre pesticide carbamate (Mineau, 1991). n condiii ideale, inhibiia n procent de 5080% poate fi luat drept dovad a mortalitii provocate de pesticide. n practic, nivelul poluarii este adesea necunoscut, i de aceea un control adecvat este greu de obinut. De asemenea, inhibiia carbamailor este foarte uor reversibil i se poate pierde cu uurin dup moarte. determinarea OP-urilor i a carbamailor este mai dificil rapid metabolizai i eliminai; de fapt, analizele chimice ale nivelelor reziduale nu au fost larg utilizate n diagnosticul intoxicaiilor produse de aceti compui.

esCreierul - organul cel mai des folosit ca prob la vertebratele slbatice, ntruct acesta este principalul loc de aciune al OP-urilor i carbamailor. Cu toate c folosirea inhibrii AChE i BuChE serice sunt mult mai

 Creierul - organul cel mai des folosit ca prob la vertebratele slbatice, ntruct acesta este principalul loc de aciune al OP-urilor i carbamailor. Cu toate c folosirea inhibrii AChE i BuChE serice - mult mai acceptabil, ntruct inhibarea AChE cerebrale este mult mai complex. Studiile variabilitatea activitii esterazei este mult mai mare n plasm dect n creier i de aceea refacerea activitii AChE serice este mult mai rapid dect a celei din sistemul nervos i, astfel, diagnosticul bazat pe activitatea seric a AChE este dificil de pronunat.

Monoxigenazele Sistemul monooxigenazelor este cuplat la sistemul de transport ionic compus din dou enzime, citocromul i flavoproteina (NADPH-citocrom reductaza). Sistemul este elaborat de reticulul endoplasmatic al multor organe, dar activitatea este mult mai ridicat n ficat dect n multe alte esuturi Reaciile citocrom P450 I-dependente, includ N-oxidarea i S-oxidarea; activitile enzimatice frecvent studiate includ monooxigenazele: etoxiresorufin O-deetilaza (EROD), hidroxilaza benzopirenic (BePH) i hidroxilaza aril hidrocarbonic (AAH). Oxidrile dependente de citocromul P450, includ hidroxilarea aromatic, hidroxilarea aciclic, dezalchilarea i dezaminarea. Cea mai larg studiat activitate enzimatic este cea a N-demetilazei benzfetaminic i a epoxilazei aldrinic. Prima demonstraie a efectului pesticidelor organoclorurate asupra metabolismului hepatic microzomal fost fcut acum peste 30 de ani-rezultate neateptate la obolani crora n perioada de somn li s-a administrat fenobarbital dup ce ascunztorile lor au fost pulverizat cu clordan -a dus la stimularea activitii microzomale hepatice, medicamentul fiind metabolizat enzimatic -constatare rapid extins i la organoclorurate , PCB-urile, PCDT-urile i PCAD-urile+larg varietate de compui de interes pentru mediu, organofosforicele, piretroidele i hidrocarburile policiclice aromate (PAH).

Conceptul inducerii activitii monooxigenazelor la pete, cu scopul

monitorizrii polurii mediului maritim prin uleiuri (petrol), a nceput a fi aplicat pe la mijlocul anilor '70. Aa s-au obinut date despre inducerea activitii aril hidrocarbon hidroxilazei (AAH) la ieirile apei menajere n Los Angeles la peti sau inducerea activitii etoxiresorufin O-deetilazei (EROD) la petii din apele efluenilor fabricilor de hrtie din Suedia. Inducerea monooxigenazelor de ctre afluenii fabricilor amintite a constituit unul din cei mai sensibili biomarkeri pentru tratarea acestui tip particular de poluare. Utilitatea monooxigenazelor n monitorizarea biologiei mediului a fost clar demonstrat n cazurile polurii cu substanele amintite, rspunsul acestora fiind cauzat de o mare varietate de substane chimice i, de aceea, se poate spune c sistemul este menit s detecteze o expunere suficient de mare pentru a produce un rspuns biologic la foarte multe xenobiotice. Chiar dac despre agentul cauzal se afl puine lucruri, poate fi folosit pentru delimitarea ariei de aciune a acestuia, ceea ce este folositor n timp i prin nceperea altor investigaii detaliate.

Rolul fundamental al ADN n procesele de reproducie este binecunoscut, acest aspect fiind utilizat la evaluarea daunelor produse ADN-ului de ctre poluanii de mediu care au efecte genotoxice specifice, n special creterea carcinogenezei i, mai puin efecte asupra proceselor reproductive exist o succesiune de evenimente care au loc ntre prima interaciune a xenobioticului cu ADN-ul i mutaia consecutiv acesteia, mprite n patru stadii. Primul stagiu este formarea adiiei prin puni de legtur. n urmtorul stadiu pot fi sesizate modificri secundare ale ADN-ului, fie o modificare de suprafa, fie o mrire a procentului de reparaie. Al treilea stadiu este atins atunci cnd perturbrile structurale ale ADN ncep s fie realizate. n acest stadiu, celulele afectate prezint alterri funcionale. Unul din cele mai largi teste utilizate pentru msurarea aberaiilor cromozomiale este schimbul de cromatide surori. La final, cnd celulele se divid, distrugerile cauzate de substanele toxice pot conduce la crearea de ADN mutant i, consecutiv, alterrii n funcionarea genelor.

Au fost utilizate dou moduri diferite de abordare la studierea adiiei de ADN dup expunerea la poluani: Marcarea radioactiv -folosind 32P conduce la separarea adiiilor i gruparea lor prin cromatografie bidimensional n strat subire. Tehnici specifice de identificare a adiiilor -incluznd spectrometria fluorescent, tehnicile de cromatografie, i testul imuno-enzimatic -ELISA; tehnici care sunt sensibile i care pot detecta o adiie la un numr de 108 nucleotide normale. Cele dou tehnici dau informaii diferite, prima contribuie la obinerea indexul numrului total de legturi covalente, pe cnd ultima d informaii despre gradul actual al relaiei cu anumii compui specifici. Monitorizarea formrii adiiilor furnizeaz cel mai bun mijloc de a detecta expunerea la hidrocarburi aromatice policiclice (PAH ). Stabilitatea ADN i adiiile formate la hemoglobin, de ctre aceast clas de compui toxici, sunt indicatori care evideniaz expunerea la ST, dup ce acestea au disprut din corp. De fapt, aceste adiii formate la hemoglobin pot fi cel mai studiat mijloc posibil de test non-invaziv. n SUA, au fost probate studii la peti i sedimente. Prin determinarea nivelelor PAH-urilor din sedimente i intestin au fost stabilite i proporiile adiiilor xenobiotice ADN din ficat msurate prin 32P marcat.

Porfirinele sunt produse pe cile biosintezei hemului, un sistem vital pentru multe sisteme animale. Au fost studiate dou tulburri majore ale biosintezei hemului:

formarea n exces a unei cantiti de porfirine dup expunerea la anumite organoclorurate (OC);

inhibarea enzimei dehidrataza acidului aminolevulinic (ALAD).

1.Biosistemele hemului sunt strns reglate n mod normal, iar nivelul porfirinelor n mod curent este foarte sczut. Porfiria hepatic este caracterizat printr-o acumulare masiv a porfirinei n ficat i eliminarea prin urin a acesteia i a acidului porfirinic heptacarboxilic. Dei mecanismul inducerii porfirinei de ctre OC-uri nu a fost complet elucidat, se consider n anumite lucrri c inhibarea enzimei uroporfirinogen decarboxilaza este cea mai veridic cauz. Cele mai implicate OC-uri n producerea maladiei sunt hexaclorobenzenul (HCB) i PCB-urile. 2. Dehidrataza acidului aminonolevulinic (ALAD) este o enzim din calea de biosintez a hemului. Inhibarea ALAD a fost studiat nc de acum 30 de ani, ca un mijloc de detectare a expunerii oamenilor la plumbul din mediu i a devenit un biotest standard din acest motiv, frecvent utilizat n investigaiile lumii slbatice. Testul este foarte specific pentru plumb, alte metale fiind de 10 ori mai puin active din cauza inhibrii. La acestea, inhibiia ALAD este rapid, dar efectul este slab exprimat, ALAD revenind la valorile normale numai dup 4 luni.

Inhibarea ALAD a fost folosit ca un indicator al expunerii la plumb n probleme generale, fie n aria

urban, fie de-a lungul autostrzilor, fiind de asemenea specifice studiilor psrilor acvatice cu probleme legate de plumb. Diferene de trei ori mai mari ale ALAD, au fost gsite ntre obolanii din aria rural i cei urbani n Michigan (Mouw i col., 1975). Cei mai importani indicatori ai intoxicaiei cu plumb la obolanii din mediul urban au fost creterea n greutate a rinichiului i creterea incidenei incluziunilor intranucleare. n acelai mod, s-a difereniat activitatea ALAD la porumbeii din mediul rural, urban la nivel central i, respectiv, periferic, n zona Londrei (Hutton, 1980). Testul ALAD este unul simplu, care poate fi realizat fr un echipament costisitor sau o pregtire de durat. n concluzie, inhibiia ALAD este un biomarker sensibil,

Descoperirea unor specii de peti hermafrodii pe cursul unor ruri n apropierea scurgerilor de ape menajere a fost o int a cercetrilor, n scopul evidenierii efectului de distructiv al estrogenilor la peti, avnd n vedere c hermafroditismul natural are o inciden foarte sczut. Examinarea acestui proces la peti a artat c masculii au un nivel ridicat al vitelusului, care este n mod obinuit produs numai de ctre femele, acesta fiind o protein a glbenuului oului.

Schimbrile de comportament reprezint un nivel evoluat de organizare al biomarkeri-lor, fiind considerat de ctre unii foarte greu de demonstrat. Unii din cei mai apropiai partizani ai valorilor comportamentului toxicologic consider c acest comportament al unui organism, reprezint rezultatul final integrat al biochimiei i fiziologiei proceselor declanate de ST. Astfel, un singur parametru comportamental este, n general, mult mai cuprinztor dect unul fiziologic sau biochimic. Cu toate acestea, biomarkerii comportamentului nu fac parte din procedeele de testare formale. Exist dou dificulti fundamentale ale testelor comportamentale ale toxicitii vieuitoarelor din mediului slbatic, astfel: slaba relevan pentru mediu ntruct se obin i se cuantific foarte repede, o rezisten foarte puternic mpotriva schimbrilor la cele mai relevante dintre comportamente (Peakall, 1985). Studii recente includ multe din efectele metalelor grele. Dac cineva compar efectele slabe ale concentraiei observate (LOEC), obinute din studii comportamentale (aprare, atractivitate, ventilaia la peti, rata bolilor) cu studii cronice (de toxicitate), stabilete c anumite teste comportamentale sunt mai sensibile. Aceste teste implicnd evitarea prdrii, comportamentul alimentar, nvarea, interaciunile sociale i variate comportamente locomotorii, sunt nc insuficient studiate pentru a permite judecarea sensibilitii i utiliti acestora

Totui, testele comportamentale pot furniza date reale despre relaiile dintre prdtor i prad, ns testele trebuie s fie validate n mediu.

Biomarkerii specifici au fost identificai n plantele sensibile -este cunoscut faptul c excesul substanelor chimice specifice a adus o cretere a produciei unui metabolit care difer prin toleran i sensibilitate. n prezena unui exces al seleniului, plantele seleniu-sensibile ncorporeaz Se n aminoacizii cu sulf, conducnd la sinteza enzimelor cu activitate sczut, care pot conduce la moartea plantelor. n contrast, plantele Setolerante biosintetizeaz i acumuleaz selenoaminoacizi nonproteici, precum seleno-cistein i Se-metil-selenocistein, care nu pot cauza probleme metabolice pentru plante. Astfel, selenoproteinele din plante sunt exceleni biomarkeri pentru Se stres, chiar dac folosirea lor n mediu nu a fost frecvent reprodus. Un alt exemplu este o expunere la fluor n exces, produs printr-un minereu coninnd fluoruri plantele sintetizeaz fluoroacetil coenzima A i, apoi realizeaz convertirea, pe calea ciclului acidului tricarboxilic n fluorocitrat. Apoi , compusul blocheaz calea metabolic prin inhibiia enzimei aconitaz. Ca un rezultat al acestui proces, acumulrile de fluorocitrat constituie un biomarker demn de ncredere pentru intoxicaiile cu fluor. Exist anumite plante biomarkeri pentru metalele libere. Fitochelaii sunt sintetizai n perioada expunerii la un numr de metale i anioni, precum SeO42-, SeO42- i AsO43-. Relaiile doz-timp dependen au fost stabilite n condiii de laborator pentru Cd, Cu i Zn. Pentru aceste monitorizri, cercetrile au nevoie de producia de fitochelatai din mediu.