Curs de Biofizică

Vă rugăm: gânditi!

Disciplina de Biofizică
şi Fizică medicală
Şef lucr. dr. Irena Grierosu
Prof. dr. Cipriana Stefănescu
Examen de Biofizica : MCQ Joi, 31 ianuarie 2019 !
Examen practic scris : joi, 10 ianuarie 2019 ora 13,30
Examen practic oral : la ultimul lp din ultima sapt.
Microscopia optică
► Istoric

► Microscopia optică:
- părţi componente ale microscopului optic,
- formarea imaginii,
- caracteristici fizice ale microscopului

► Tipuri de microscopie optică

Rezoluţie minimă a unui
microscop optic este de
aproximativ 0,2 m,
dimensiunea unei
bacterii mici.
Microscopul optic poate
mări în mod eficient de
aproximativ 103 ori
dimensiunea unui
obiect.
Microscopul electronic
poate mari de 104 ori
imaginea unui
microscop optic, deci de
106 ori imaginea reala.
Istoric - Primele microscoape optice
Exemplu de evoluţie a microscopului
(firma Nikon)

100 ani
 1

► Microscopul optic:

Lumina traversează preparatul

Imaginea este mărită prin intermediul lentilelor

(lentile convergente, din sticlă)
 Oc

Ob
Pl

Mv
mv
c, d

Parti importante ale microscopului optic

(Oc = lentila ocular; Ob = lentila obiectiv; R = sistem
revolver; Mv = macroviza; mv = microviza; c = condensor;
d = diafragma; l = lampa)
Formarea imaginii la microscopul optic

OCULAR
OBIECTIV
Condensorul
Ocularul si sistemul de obiective
Caracteristici fizice ale microscopului:

REZOLUTIA 2
P = 1/d
d = /2n sin u = /2a

Apertura numerică:
a = n sin u
Pentru a creste P (descreste d):
- descreste  (390 - 720 nm)
- creste n

MĂRIREA
Microscopia cu contrast de fază
Prezinta o lama
sfert de unda
(disc de faza)
care transforma
defazajul luminii
imperceptibil
ochiului uman
intr-o variatie de
intensitate
perceptibila
vizual
Diviziunea celulară. (transforma deci
Creşterea contrastului prin un contrast de
împerecherea undelor (întârziate faza, in contrast
la ieşirea din preparat); de amplitudine).
se foloseste un disc de faza. Premiul Nobel in Permite
Fizica in 1953 observarea
3 Frederik Zernike celulelor
necolorate.
4 Microscopia polarizantă

- lumina polarizata
- 2 nicoli (analizor, polarizor)

Pune in evidenta fenomenul de

birefringenta al structurilor, expresie
a anizotropiei acestora.
Microscopia de contrast prin interferenţă
(DIC sau microscopul Nomarski)

- Utilizeaza lumina polarizata

pentru cresterea contrastului

5
6 Microscopia de fluorescenţă
- utilizează markeri fluorescenţi -

Principiul fenomenului de
fluorescenţă:
1. Energia este absorbită de
un atom
2. Electronul sare pe un nivel
superior de energie.
3. Ulterior, electronul revine
la starea initiala si emite un
foton = fenomenul de
fluorescenţă
 Fluorescenta si fosforescenta
•Absorbtia - timp de 10-15 s
•Relaxarea (emisia de lumina -
prin reintoarecerea pe nivelul
fundamenal) - 10-13 s 10-11 s –
fluorescenta.
•Relaxarea fara emisia de fotoni
= conversie internă
• Relaxarea la nivelul
fundamental cu trecerea
succesiva prin etape
intermediare interne ce duc la
prelungirea timpului de viata in
stare excitata = fosforescenta

Diagrama Perrin- Jablonski

 Deplasarea Sokes
(diferenta dintre lungimea undei de excitare si cea fluorescenta)
► substantele pentru a fi fluorescente trebuie sa
contină niste grupari moleculare numite fluorofori
sau cromofori

► aceste grupari pot fi prezente in proba (naturale),

sau pot fi induse artificial (in urma unor reactii
chimice, electrice, etc)
 O sursa UV.
Ecran filtrant
care lasa sa
treaca doar
radiatiile UV
excitatoare ale
fluorescentei.

celule epiteliale
GFP - Green Fluorescent Protein The Nobel Prize in Chemistry 2008
238 aa, 26.9 kDa was awarded jointly to Osamu
Shimomura, Martin Chalfie and
Vezi cursul: Roger Y. Tsien "for the discovery
Nobel in Chimie 2008 and development of the green
MODELE
fluorescent protein, GFP".

Aequorea victoria
 Premiul Nobel in
Chimie 2014
Eric Betzig,
Stefan W. Hell si
William E. Moerner
 Premiul Nobel in
Chimie 2014
Eric Betzig,
Stefan W. Hell si
William E. Moerner
7 Ultramicroscopia (microscopia
cu fond intunecat)

Iluminarea este din lateral.

Condensorul este de tip cardioid sau
paraboloid.
Se bazeaza pe fenomenul Tyndall
(de difuzie a luminii).
Fenomenul Tyndall
RECAPITULARE
Tipuri de microscopie şi imaginea

TEHNICĂ REZULTAT

(a) Microscopie optică (preparat nefixat, necolorat).

Lumina trece prin preparat.
Dacă celula nu este colorată natural sau artificial,
imaginea are contrast slab.
[Punctele (a)–(d) reprezintă o celulă epitelială jugală.]
50 µm

(b) Microscopie optică (preparat colorat).

Colorarea măreşte contrastul, dar necesită fixarea
preparatului.

(c) Microscopie optică cu contrast de fază. Creşte

contrastul în celule nefixate, amplificând diferenţele
în densitatea structurii de vizualizat; permite
vizualizarea unor structuri fără fixare, colorare.
(d) Microscopie de contrast prin interferenţă
Ca şi microscopia optică cu contrast de fază dar utilizează
lumina polarizată; imaginea apare în relief, 3D.

(e) Microscopia de fluorescenţă. Utilizează markeri

fluorescenţi pentru vizualizarea unor structuri
intracelulare. Ex.: celulă din peretele arterial.

50 µm
(f) Microscopie confocală. Utilizează lumina LASER şi
markeri fluorescenţi, pe o secţiune care apare cu
un contrast mult mai bun decât în microscopia de
fluorescenţă. Celule nervoase (verde), celule de
susţinere (roşu), suprapunerea acestora (galben).
Jos, microscopie de fluorescenţă (imagine
neclară, preparat mai gros).
8

50 µm
?
Bibliografie selectivă

► Aurengo A., Grémy F., Petitclerc T. - Biophysique, Médecine-Sciences Flammarion, Paris, 1998.
► Dimoftache C., Herman S. – Principii de Biofizică umană, Ed. Universitară “Carol Davila”,
Bucureşti, 2003.
► Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific Publications, The Alden Press,
Oxford, 1990.
► Durand A., Escanyé J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed. Ellipses, 2004.
► Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.
► Herman S. Aparatura medicală. Principiile fizice ale aparaturii medicale
moderne,Ed.Teora,Bucureşti, 2000.
► Nölting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.
► Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si farmacie, Editura BIT, 2003.
► Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universităţii „Al. I. Cuza”, Iaşi, 1988.
► Rusu V., Baran T., Brănişteanu D. D. - Biomembrane şi patologie, vol. I, Ed. Medicală, Bucureşti,
1988, 63-92, 286-292.
► Rusu V. Note de curs. 2010.
► Rusu V. – Nobel – Retrospectivă 1905 – 1995 – Laureaţii premiului pentru fiziologie şi medicină,
Ed. Omnia, Iaşi, 1996.
► Rusu V si colab. Lucrări practice şi demonstraţii de Biofizică şi Fizică Medicală, Ed. „Gr. T.
Popa” Iaşi, 2003.
► Rusu V. – Dicţionar medical, Ed. Medicală, Bucureşti, ed. IV, 2011.
► Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes d’analyse instrumentale, De Boeck Université,
Paris, 2003.
► Ştefănescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An Introduction, Ed. Tehnopress, 2008.