1.

Factorii de care depinde rezoluția microscopului optic (formula lui Abbe) și cum poate fi acesta
imbunătățită

0,6∙𝜆
Formula lui Abbe : 𝑑𝑜 = 𝑛∙sin 𝛼

do – rezolutia=puterea de rezolutie=distanta separatoare minima

λ – lungimea de unda
n – indecele de refractie
α – unghiul de deschidere (aperture) = unghiul format de razele divergente extreme care pleaca din centrul obiectului
n*sin α – apertura numerica
Imbunatarire = d0 cat mai mic 1. λ mai mic (de exemplu raze UV – microscopia de UV, electroni – microscopie
electronica)

2. n mai mare ( de exemplu n=1,51 – ulei de cedru)

2. Părțile componente ale microscopului optic

a) Partrea mecanica (stativul)

- picior – partea de sprijin pe masa
- coloana – in continuarea piciorului
- platina=masuta microscopului – pe care se asaza lama
- tubul – ce are la extremitatile sale obiectivul si ocularul
- dispozitivul de punere la punct – surubul macrometric si surubul micrometric
- revolverul – dispotiviul pe care se adapteaza obiectivele

b) Sursa de lumina = lampa – este concentrate pe obiectul examinat prin condesnor (sistem de lentile), condensor
care prezinta o diafragma

c) Partea optica : - obiectiv (uscat sau cu imersie)

- ocular – lupa binoculara

3. Avantajele examinării în imersie

In cazul obiectivelor cu imersie, daca se introduce intre lentila frontala si lamela ulei de cedru, cu indicele de refarctie
1,51, egal cu al sticlei , sunt eliminate fenomenele de reflexie a luminii, precum si fenomenele de refractie. Toate razele
de lumina care pleaca din punctul O si ajung pe lentila frontala, indiferent de oblicitate, patrund in microscop si
contribuie la formarea imaginii. Deci obiectivele cu imersie dau o imagine mult mai luminoasa decat cele uscate fiindca
primesc toate razele conului de lumina corespunzator unghiului de deschidere. In plus puterea de marire a obiectivelor
cu imersie este superioara celei a obiectivelor uscate, de asemenea se pot observa mai bine detaliile de structura ale
obiectelor fiindca si rezolutia obiectivelor cu imersie este mai buna.
4. Aplicațiile medicale ale examinării în imersie

Examinarea in imersie are aplicatii medicale importante, printre care : studiul bacteriilor,
examinarihematologice, examinari de citogenetica.

5. Formarea imaginii în microscopul pe fond intunecat

Se bazeaza pe fenomenul Tyndall, care consta in dispersia (imprastierea) luminii de catre particule foarte
mici aflate in suspensie si care astfel devin vizibile, analog particulelor de praf aflate intr-o raza de lumina
puternica. In acest caz se foloseste o metoda de iluminare in care fascicolul care serveste la iluminarea obiectului
nu patrunde direct in microscop. Proba este iluminata cu raze oblice printr-un condensor special (cardioid sau
paraboloid) , iar in obiectiv nu patrund decat razele dispersate de particule aflate in suspensie.

Fascicolul incident este in fiecare caz limitat de o diafragma (D) cu deschideri convenabil alese. Astfel
apar niste puncte stralucitoare pe fond negru, ce corespund particulelor pana la 0,003 μm , deci de aproape 1000
ori mai mici decat limita de rezolutie a microscopului optic. Se pot astfel obseva particule in citoplasma celulelor
vii, care nu pot fi vazute in microscopia obisnuita. Imaginea preparatului apare luminoasa pe fond intunecat.
Acest procedeu are la baza efectul produs de condensor, datorat fenomenului de difractie a luminii (in preparat)
realizat printr-o iluminare laterala.

6. Aplicațiile medicale și în biologie ale microscopiei pe fond întunecat

Microscopia pe fond intunecat se foloseste si pentru examenul celulelor vii (microbi, protozoare) care pot fi
vazute si la microscopul obisnuit, dar ale caror particularitati apar cu mult mai clar pe fond intunecat. De
exemplu studiul spirochetelor permite diagnosticul unor boli printre care si sifilisul.

7. Aplicațiile medicale și în biologie ale microscopiei în contrast de fază

Microscopia in contrast de faza este folosita pentru studiul celulei vii, permitand observarea structurii
nucleului, distributia organitelor in citoplasma, modificarile din diviziunea celulei, miscarile celulare.

8. Ce este fenomenul de fluorescență și ce sunt fluorocomii

Prin absorbtia energiei luminoase moleculele trec din starea fundamentala in stare excitata. Revenirea
moleculei la starea fundamentala se produce prin pierderea energiei. In cazul fluorescentei revenirea la starea
fundamentala se insoteste de emisie de radiatie luminoasa ce are o energie inferioara radiatiei absorbite,
adica lumina emisa are lungimea de unda mai mare.
Substantele ce prezinta fluorescenta puternica se numesc fluorocromi. In microscopia de fluorescenta
preparatele examinate contin fluorocromi . Prin iradierea cu lumina UV se produce excitarea fluorocromilor
si rezulta fluorescenta zonelor ce contin fluorocromii.
9. Formarea imaginii în microscopul de fluorescență
Microscopul de fluorescenta are ca sursa de lumina o lampa cu vapori de mercur ce emite radiatii
ultraviolete. In calea razelor ultraviolete se aseaza filtre de excitatie (colorate in albastru pana la violet) ce
opresc o parte din radiatiile sursei lasand sa treaca numai pe cale cu lungimea de unda care sa excite
fluorocromul. Radiatia trece apoi prin condensor, obiectiv, lama cu preparatul microscopic, toate din sticla de
cuart fiindca sticla obisnuita absoarbe razele UV. Dupa trecerea prin obiectiv lumina este filtrata prin filtre de
baraj, care opresc lumina ce vine de la sursa si permit numai trecerea luminii emise de fluorocrom. Imaginea
este observata dupa ce lumina fluorescenta trece prin ocular

10. Aplicațiile medicale și în biologie ale microscopiei de fluorescență

Microscopia de fluorescenta se foloseste pentru observarea unor preparate colorate vital, pentru observarea
lizoomilor ce au acumulat colorantii fluorescenti (cum este acridin oranjul) , in studiul cromozomilor (benzi
fluorescente sau detectarea cromozomului Y), in studii de imunologie (imunofluorescenta), de histochimie si
citochimie.

Microscopia de fluorescenta a fost folosita in biologia celulara in studiul mobilitatii proteinelor de membrana
dupa fuziunea celulelor umane si de soarece, experienta ce dovedeste fluiditatea membranei.

11. Schema de fracționare a celulei prin centrifugare diferențială – explicație pe imaginea fracțiunilor
subcelulare observate la microscopul electronic de transmisie

Centrifugarea diferentiala: se efectueaza

intr-un mediu cu densitate uniforma, pentru o
anumita perioada de timp si la o anumita viteza
de centrifugare (numar de g) in care pe fundul
tubului de centrifuga se colecteaza particulele
formand o peleta. Aceasta fractiune ce
sedimenteaza poate fi separata de restul
particulelor ce raman in supernatant. Daca
supernatantul se centrifugheaza apoi la o turatie
mai mare va sedimenta alta fractiune. Procedeul
se repeta pana cand sedimenteaza toate
organitele celulare, iar in supernatant ramane
faza solubila a citoplasmei (citosolul).
12. Definiția cromatografiei și ce este factorul Rf

Cromatografia este metoda care permite separarea substantelor dintr-un amestec pe baza capacitatii de
distributie intre o faza stationara si una mobila, avand ca urmare deplasarea cu viteza diferita a componentelor
purtate de faza mobila de-a lungul fazei stationare.

Intr-o separare cromatografica o substanta X se distribuie intre cele doua faze, mobila si stationara, aflate in
contact, trecand foarte rapid de pe faza stationara in cea mobila si invers pana cand se stabileste un echilibru de
faza stationara in cea mobila si invers pana cand se stabileste un echilibru de distributie. Cu cat o substanta
petrece mai mult timp in faza mobila cu atat se va deplasa mai mult cu aceasta faza. Viteza de deplasare a
substantei X in raport cu faza mobila (solventul) este exprimata prin parametrul Rf, care pentru un anumit
sistem este:

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎 𝑝𝑎𝑟𝑐𝑢𝑟𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑋
𝑅𝑓 =
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎 𝑝𝑎𝑟𝑐𝑢𝑟𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑟𝑜𝑛𝑡𝑢𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑢𝑙𝑢𝑖

In general substantele dintr-un amestec se distribuie in mod diferit intre cele doua faze, deci vor avea Rf-uri
diferite si de aceea se vor separa.

13. Interpretarea cromatografiei lipidelor extrase (ordinea fracțiunilor lipidice de la linia de strat la frontal
solventului, fără procente)

Pe linia de start raman fosfolipide ce formeaza majoritatea lipidelor membranelor. Urmeaza in ordine
spoturile de colesterol, monogliceride, digliceride, acizi grasi liberi, trigliceride.

Principalele fosfolipide din membrane sunt: dintre fosfogliceride : fosfatidilcolina(lecitina),

fosfatidiletanolamina(cefalina), fosfatidilserina, fosfatidilinozitolul ,cardiolipina (prezenta numai in membrana
interna a mitocondriilor, precum si sfingomielina dintre sfingolipide. Componente minore sunt : lizolecitina,
acidul fosfatidic. Separarea fosfolipidelor se realizeaza prin cromatografie bidimensionala.

14. Izolarea AND-ului: principiu

Fractiunea nucleara izolata din ficatul de sobolan este solubilizata prin distrugerea invelisului nuclear de
catre detergentul dodecilsulfat de sodiu (SDS) in alcool etilic . Reactivul are ca efect si denaturarea proteinelor,
astfel ca acestea precipita, pe cand acizii nucleici raman in solutie. Se indeparteaza prin centrifugare proteinele
(care sedimenteaza ) , iar din supernatant se izoleaza ADN-ul prin precipitare cu etanol.
15. Electroforeza AND-ului: definiția electroforezei

Electroforeza este o metoda analitica sau preparativa de separare a particulelor incarcate electric sub
actiunea unui camp electric uniform aplicat din exterior. Migrarea particulelor sau ansamblurilor de particule se
face spre unul dintre electrozi (anod sau catod)

Moleculele de proteine si de acizi nucleici au incarcatura electrica si de aceea vor migra in camp electric.
Forta care se exercita asupra unei astfel de molecule este determinata de campul electric si de sarcina neta a
moleculei, dar invers proportionala cu vascozitatea mediului si cu dimensiunea moleculei.

16. Deosebirea în formarea imaginii între microscopia electronica de transmisie și microscopia electronică de baleiaj

In microscopia optica formarea imaginii se bazeaza pe absorbtia luminii de catre preparatul biologic colorat
(culoarea unde apare prin absorbtia selectiva a luminii cu o anumita lungime de unda) si pe devierea luminii de
catre preparatul cu densitati diferite ( indici de refractie diferiti(. In microscopia electronica formarea imaginii
este rezultatul dispersiei electronilor de catre obiectul biologic. Contrastul se realizeaza din cauza ca fluxul de
electroni este imprastiat inafara campului vizual. Dispersia electronilor este data de grosimea si densitatea
moleculara a obiectului biologic si in special de numarul atomic al atomilor ce intra in compozitia preparatului.

Cu cat numarul atomic este mai mare cu atat este mai mare dispersia.Cu alte cuvinte cu cat o parte a
specimenului opreste mai multi electroni, cu atat va aparea mai intunecata.

Materialele biologice sunt in cea mai mare parte alcatuite din elemente usoare si au contrast foarte slab.
De aceea, pentru a creste contrastul se utilizeaza colorarea sectiunilor cu compusi cu atomi grei (electrodensi):
tatraoxid de osmiu (numit si acid osmic), acetat de uranil, acid fosfotungistic etc.

 Aparatura, tehnici de pregatire a probelor si examinare. Aplicatii in biologie si medicina

Exista doua tipuri principale de microscoape electronice : de transmisie si de baleiaj. In microscopia electronica
de transmisie electronii trec prin preparat , deci se aplica tot ce s-a expus mai sus privind formarea imaginii cu
ajutorul electronilor. In microscopia electronica de baleiaj (de „scanning”electronii sunt reflectati de preparat.

 Microscopia electronica de baleiaj („scanning electron microscopy”)

In aceasta varianta un fascicul subtire de electroni este miscat pe suprafata obiectului (balciat) la fel cum un
fascicul de electroni balciaza suprafata ecranului unui televizor. De fapt, electronii imprastiati de proba vor fi
colectati de un fotomultiplicator, apoi detectati pe ecranul unui televizor. Fasciculul ede electroni pe ecran se misca
sincron cu fasciculul de electroni ce baleiaza suprafata obiectului . Din depresiunile obiectului sunt reflectati mai
putini electroni, deci acestea apar mai intunecate; dimpotriva, proeminentele sunt mai iluminate fiindca imprastie
puternic electronii. Consecinta este obtinerea in relief a imaginii, care poate fi si fotografiata.