Examenul microscopic al bacteriilor – preparate proaspete, frotiuri, coloranti,

coloratii.
Funcţionarea microscopului optic.
Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic
Există mai multe categorii de microscoape. În mod uzual examenul microscopic utilizează
microscopul optic (microscopia optică pe câmp luminos). În anumite situaţii se poate recurge
la microscopia cu fond negru, microscopia cu contrast de fază sau la microscopia cu
fluorescenţă. În cazul utilizării ultimelor trei tipuri de microscop este necesară o cameră
obscură.
Microscopul optic şi microscopia optică pe câmp luminos
Microscopul optic este un instrument care permite observarea obiectelor mai mici decât
cele care pot fi văzute cu ochiul liber (sau cu lupa). Microscopul formează imagini virtuale,
mărite şi răsturnate ale obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile obiectiv şi de lentile
ocular.
În microscopia optică pe câmp luminos lumina este transmisă de-a lungul axului optic al
instrumentului, prin preparat, în aceste condiţii obţinându-se un câmp vizual puternic luminat,
în care obiectele, pentru a putea fi văzute, se disting pe fondul luminos fie prin opacitate, fie
prin culoarea lor (în special după utilizarea unor tehnici de colorare).
Părţile componente ale microscopului optic
Microscopul optic are următoarele părţile componente:
1. Piciorul microscopului, alcătuit dintr-o masă metalică cu rol de susţinere, pe care se
sprijină platina microscopului. Pe platina microscopului se aşează preparatul. Platina prezintă
un orificiu central care permite trecerea razelor luminoase şi orificii laterale în care sunt prinşi
“cavalerii” cu ajutorul cărora preparatul este fixat pe platină. Cu ajutorul a 2 şuruburi ce se
găsesc sub platformă, aceasta se poate deplasa pe 2 direcţii perpendiculare.
2. Tubul microscopului susţine ocularul şi obiectivul. Tubul poate fi deplasat mai rapid şi
grosier cu ajutorul macrovizei şi mai lent şi fin cu ajutorul microvizei. La capătul superior al
tubului se pot pune oculare cu diverse puteri de mărire, care se pot schimba uşor. Frecvent
utilizăm în microbiologie oculare cu puterea de mărire 10x.
Obiectivul se monteaza în revolver, situat la capătul inferior al tubului. Revolverul este un
suport special care permite montarea mai multor obiective şi inter-schimbarea lor prin rotire.
Obiectivul este compus dintr-un sistem centrat de lentile aşezate într-un tub metalic care se
înşurubează la revolver. Puterea separatoare a microscopului este determinată de puterea
separatoare a obiectivului a cărui putere de mărire este cu atât mai mare cu cât distanţa focală
a acestuia este mai mică.
Există obiective uscate (ex. 10x, 20x sau 40x) şi cu imersie (ex. 90x sau 100x). Obiectivele
uscate primesc fasciculul de lumină ce trece prin preparat direct prin aer, astfel că o parte din
razele trimise de obiect către lentila concavă se pierd prin fenomenul de reflexie totală.
Pierderea razelor de lumină datorită acestui fenomen se poate înlătura prin interpunerea între
lamelă şi obiectiv a unei picături de ulei de cedru sau de alt lichid cu indice de refracţie
apropiat de cel al sticlei din care este făcută lentila frontală a obiectivului, aşa cum se petrece
în cazul obiectivelor cu imersie, foarte frecvent utilizate în microbiologie.
3. Dispozitivul de iluminare este format din oglindă şi condensator.
Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumină spre axul optic al microscopului;
prezintă o suprafaţă plană şi una concavă şi este fixată pe un suport, în aşa fel încât se poate
roti în jurul a doua axe perpendiculare
4. Condensatorul care este format din 2-3 lentile cu ajutorul cărora lumina reflectată de
oglindă este concentrată asupra obiectului; fascicululul paralel de raze de lumină care cade pe
condensator devine convergent. Pentru a obţine o imagine clară, condesatorul se poate deplasa

1
pe verticală până când obiectul se găseşte în focarul fasciculului convergent care iese din
condensator. Razele de lumină, înainte de intrarea în condensator, trec printr-un suport de
filtre şi o diafragmă iris (diafragmă de apertură). Condensatorul contribuie în mod esenţial la
luminozitatea imaginii.
Examinarea folosind microscopul optic în câmp luminos
1. Examinarea unui preparat proaspăt (între lamă şi lamelă)
Pe lamă se depune o picătură din suspensia care urmează a fi examinată, se acoperă cu o
lamelă, se aşează pe platina microscopului şi se fixează cu ajutorul “cavalerilor”.
Condensatorul este coborât circa 1,5 cm sub platină, diafragmul este semideschis iar
obiectivul 40X este coborât până deasupra lamelei (privind prin lateral).
Privind prin oculare, rotim foarte încet macroviza ridicând uşor tubul microscopului până
apare câmpul microscopic. Punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei şi reglând lumina
prin modificarea fantei condensatorului.
Se pot examina astfel: sedimentul urinar, materii fecale provenind de la un pacient cu
diaree, suspensii de bacterii care se presupune că sunt mobile, preparate umede realizate în
cazul suspicionării unei micoze cutanate superficiale etc.
- sediment urinar / putem vizualiza: celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc),
celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali,
granulari etc), cristale urinare, levuri (eventual înmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas
vaginalis etc.; examenul sedimentului urinar este foarte util
- preparat montat în soluţie KOH / putem vizualiza: levuri (număr, formă, dimensiuni),
blastoconidii, atroconidii, pseudohife, microorganisme asociate
- preparat colorat cu tuş de India (coloraţie „negativă”) / putem vizualiza: levuri capsulate,
înconjurate de un halou clar pe fondul întunecat al preparatului, ex. Cryptococcus neoformans
- în cazul în care se urmăreşte mobilitatea microorganismelor, trebuie să putem deosebi
mişcarea reală de mişcarea browniană (oscilaţie pe loc a particulelor); urmărim reperele aflate
în vecinătatea microorganismelor etc.
2. Examinarea unui preparat fixat şi colorat
Frotiul se aşează pe platina microscopului şi se fixează cu ajutorul “cavalerilor”.
Centrăm zona pe care dorim să o examinăm. Procedăm ca mai sus utilizând obiectivul 40x;
alegem câmpul pe care îl vom examina ulterior cu obiectivul cu imersie (de ex. un câmp în
care sesizăm prezenţa leucocitelor).
Ridicăm tubul microscopului, punem o picătură de ulei de cedru pe lamă, în zona pe care
urmează să o examinăm. Condensatorul este ridicat până sub platina microscopului şi are
diafragmul deschis.
Privind din lateral, folosim macroviza şi coborâm obiectivul cu imersie (90x sau 100x)
până atingem suprafaţa lamei realizând contactul şi cu uleiul de cedru. Manevra trebuie
realizată cu grijă pentru a nu sparge frotiul.
Privim prin oculare şi rotim foarte încet macroviza ridicând foarte încet tubul microscopic,
până prindem imaginea câmpului. Cu ajutorul microvizei punem la punct imaginea.
Se pot examina: morfologia celulelor din produsul patologic, prezenţa leucocitelor şi dacă
acestea sunt modificate, prezenţa bacteriilor şi dispunerea acestora (ex. intra sau extra-
leucocitar), morfologia bacteriilor, morfologia unor paraziţi, morfologia levurilor, aspectul
frotiurilor de sânge etc.
În cazul examinării unui frotiu colorat cu albastru de metilen (A.M.) putem vizualiza:
bacterii colorate în albastru închis, iar în cazul bacteriilor capsulate, această structură va
apărea ca un halou necolorat, celule diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule
inflamatorii pentru care nucleul apare într-o culoare albastru mai închis în timp ce citoplasma
apare cu nuanţe de albastru; coloraţia cu A.M. permite o mai bună diferenţiere a detaliilor
structurale;

2
 În cazul examinării unui frotiu colorat Giemsa putem vizualiza: hematii (roz-roşii),
polimorfonucleare neutrofile (citoplasmă roz, granulaţii brune, nucleu violaceu),
polimorfonucleare eozinofile (citoplasmă roz, granulaţii brune, nucleu violaceu), limfocite şi
macrofage (citoplasmă albastră, nucleu violaceu), bacterii colorate în violet, forme trofice de
Pneumocystis carinii (nucleu roşu, citoplasmă albastră), Histoplasma capsulatum în
citoplasma celulelor fagocitare (levuri colorate în roşu), incluziuni de Chlamydia trachomatis
(corpusculii reticulaţi apar albaştri, corpusculii elementari apar roşii) etc.
În cazul examinării unui frotiu colorat Gram:
a) în cazul în care frotiul a fost realizat din cultură pură putem vizualiza microorganisme
cu aceeaşi formă, aceleaşi dimensiuni (excepţie Proteus spp.), o anumită dispoziţie, cu
sau fără capsulă (halou necolorat), gram pozitive (colorate în violet) sau gram negative
(colorate în roşu), levurile se colorează în violet;
b) în cazul în care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule
diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi
citoplasma apar în diverse nuanţe de roşu, bacterii gram pozitive şi / sau gram negative,
fibrină şi levuri care se colorează în violet etc.
În cazul examinării unui frotiu colorat Ziehl-Neelsen sau Kinyoun putem vizualiza: bacili de
culoare roşie, relativ fini (în cazul prezenţei BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (în
funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii de culoare albastră (toate structurile ne-AAR
apar colorate albastru) etc; în cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia numai
bacili de culoare roşie.
Întreţinerea microscopului
După terminarea examenului microscopic trebuie efectuate următoarele proceduri:
 închidem sursa de lumină
 ridicăm cu ajutorul macrovizei tubul microscopului
 coborâm condensatorul
 scoatem lama (sau lama şi lamela) de pe platina microscopului
 preparatele proaspete le punem în borcanul cu amestec dezinfectant
 preparatele fixate (pe care urmează să le păstrăm) se introduc într-un container
cu xilol (1-2 minute) apoi, după evaporarea xilolului se pun într-o cutie
 ştergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hârtie moale,
specială, pentru a o curăţa de uleiul de cedru (periodic, vom şterge lentila
acestui obiectiv cu un tifon foarte curat îmbibat în xilol)
 curăţăm platina microscopului şi lentila condensatorului cu tifon curat îmbibat
în xilol
 acoperim microscopul cu o husă de plastic sau pânză, pentru a-l feri de praf
Microscopul cu fond întunecat (negru)
Pentru acest tip de examinare este utilizat un microscop optic obişnuit la care se adaptează
o sursă de lumină cu intensitate mare şi un condensator cardioid (cu oglinzi sferice
concentrice), cu posibilităţi de diafragmare a luminii. Condensatorul pentru câmp întunecat
(fond negru) opreşte accesul spre obiectiv al razelor de lumină directe iar obiectul este
iluminat oblic. Astfel o parte dintre razele difractate şi reflectate de obiectul iluminat oblic
pătrund în obiectiv care apare luminos pe fondul întunecat al câmpului.
Pentru a evita reflexia totală a razelor, înainte ca obiectul să fie luminat, acesta este imersat
într-o peliculă de lichid (lichid de imersie cu indice de refracţie mai ridicat, ex. glicerina).
Lamele trebuie să aibă grosimea de 1 milimetru (distanţa focală a condensatorului fiind 1,2
milimetri).
Tehnica de examinare
După centrarea diafragmei de câmp folosind obiectivul cu mărire 10x şi condensatorul
pentru câmp luminos, trebuie să înlocuim acest condensator cu condensatorul cardioid.

3
Condensatorul cardioid este cu diafragma închisă. Ridicăm condensatorul până la nivelul
platinei microscopului şi punem pe lentila condensatorului o picătură de glicerină.
Pregătim preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) şi îl plasăm pe platina microscopului
astfel încât să vină în contact cu glicerina de pe lentila condensatorului. Fixăm preparatul cu
ajutorul “cavalerilor”.
Examinăm iniţial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 40x coborât până aproape de
suprafaţa lamelei; punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei. Când obţinem imaginea
curgerii curentului de lichid ştim că am “prins” câmpul microscopic. Utilizând mai departe
microviza punem la punct detaliile şi apoi înregistrăm ceea ce am examinat.
Examinarea la microscopul cu fond negru este indicată în mod special pentru examinarea
morfologiei şi mobilităţii pentru Treponema pallidum în serozitatea din şancrul sifilitic sau
pentru Leptospira spp. în produs patologic (ex. urină) sau din medii de cultură.
Lichidul clar recoltat şi şancrul sifilitic trebuie examinat în maxim 20 minute după recoltare;
putem vizualiza spirochete luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete efilate, cu mişcări
de înşurubare, flexie, translaţie, pe fond negru.
În preparatul proaspăt care conţine leptospire putem vizualiza filamente luminoase, spiralate,
foarte mobile, cu mişcări de înşurubare şi flexie, pe fond negru.
Microscopul cu fluorescenţă
Microscopul cu fluorescenţă trebuie să fie dotat cu următoarele piese speciale: sursa de
radiaţii (de ex. o lampă din sticlă de cuarţ cu vapori de Hg care emite radiaţii ultraviolete),
setul de filtre (caloric, de excitaţie, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat.
Filtrele au următoarele roluri. Filtrul caloric absoarbe radiaţiile calorice emise de lampă
(sursa de radiaţii emite atât radiaţii ultraviolete cât şi radiaţii luminoase şi calorice). Filtrele de
excitaţie permit numai radiaţiilor cu lungime de undă mică (ex. ultraviolete) să acceadă către
preparatul microscopic. Aceste radiaţii reprezintă radiaţii de excitaţie. Filtre de baraj sunt de
fapt filtre de protecţie pentru că nu permit trecerea radiaţiilor de excitaţie nocive să treacă spre
ocular şi respectiv spre ochiul examinatorului, în timp ce lumina emisă de fluorocromi trece şi
poate fi percepută. Filtrele de excitaţie şi de baraj sunt alese în funcţie de fluorocromul
utilizat.
Condensatorul măreşte contrastul imaginii mai bine decât un condensator obişnuit.
Pentru examinarea în fluorescenţă mai sunt necesare câteva elemente, respectiv obiectivele
acromate (cu menţiunea că obiectivul cu imersie trebuie să aibă diafragmă iris), utilizarea
unui lichid de imersie care nu se usucă uşor şi lipsit de proprietatea de fluorescenţă (ex.
glicerină tamponată neutră) şi respectiv lame cu grosimea de 1 milimetru. Este preferabilă
utilizarea unui dispozitiv monocular.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescenţă
Preparatele microscopice (care pot include bacterii) sunt tratate cu flurocromi (coloranţi
fluorescenţi). Fluorocromii sunt compuşi organici care, după “iradiere” cu radiaţii ultraviolete
absorb radiaţia excitantă, intră în stare de excitaţie iar atunci când revin în “starea normală”
pierd energia acumulată emiţând radiaţii luminoase. Dintre fluorocromi am putea aminti
auramina O, rhodamina B, acridin-oranj R sau tripaflavina. Lumina vizibilă emisă depinde de
fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galbenă pentru auramina O, galben-
portocalie pentru combinaţia de auramină O – rhodamină B etc).
Sunt de menţionat în mod special acele substanţe care se pot lega covalent de anticorpi,
marcând astfel complexele antigen-anticorp care devin fluorescente. Atunci când marcajul se
realizează cu izotiocianat de fluoresceină lumina emisă va avea culoare verde iar dacă
marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină, lumina emisă va avea culoare portocalie.
Drept exemplu privind utilizarea microscopiei cu fluorescenţă vom menţiona examinarea
frotiurilor colorate fluorescent sau imunofluorescent în diagnosticul bacteriologic al
tuberculozei sau al leprei.