LP2

Tehnica de lucru la microscopul fotonic

Alte tipuri de microscoape
 Tehnica de lucru la microscopul fotonic

1. Transformatorul se conectează la reţeaua de 220V şi apoi se conectează sursa de lumină (becul) a microscopului
la priza proprie a transformatorului.
2. Prin rotirea revolverului se aduce obiectivul de 10× în axul optic al microscopului.
3. Se stabileşte distanţa între oculare în funcţie de distanţa interpupilară a examinatorului.
4. Privind prin oculare, se controlează iluminarea câmpului microscopic. Intensitatea luminii se corectează prin
ridicarea sau coborârea condensatorului, în funcţie de puterea de mărire a obiectivului.
5. Se aşează lama portobiect cu lamela în sus pe faţa superioară a platinei, fixând-o cu ajutorul valeţilor. Se
centrează apoi preparatul în axul optic al microscopului.
6. Privind lateral, se coboară tubul cu ajutorul vizei macrometrice până la o distanţă mai mică decât Di pentru
obiectivul cu care examinăm preparatul (Di pentru obiectivul de 10× este de 10mm).
 Tehnica de lucru la microscopul fotonic

1. Punerea la punct a imaginii: privind prin oculare se ridică încet tubul cu ajutorul vizei macrometrice până apare imaginea
clară în câmpul microscopic. Apoi se corectează claritatea imaginii cu ajutorul vizei micrometrice.
•Dacă nu apare nici o imagine înseamnă că:
– obiectivul nu se afla în axul optic
– preparatul nu se află în câmpul microscopic
– s-a ridicat prea repede tubul microscopului.
8. Cu ajutorul celor două vize laterale ale platinei se va mişca lama cu preparatul în direcţie antero-posterioară şi de
lateralitate, în vederea examinării lui în totalitate. Tot timpul studiului la microscop se ţine mâna în permanenţă pe viza
micrometrică, cu care se fac scurte mişcări de rotire înainte şi înapoi pentru a adapta claritatea imaginii, deoarece
preparatul nu are aceeaşi grosime pe toata suprafaţa sa.
 Tehnica de lucru la microscopul fotonic

8. Trecerea la obiective cu putere de mărire crescută – se face pentru examinarea de detaliu a preparatului. Etapele
sunt următoarele:
– se ridică tubul microscopului cu 2-3 cm cu ajutorul macrovizei;
– se roteşte revolverul până se aduce în axul optic obiectivul imediat superior ca putere de mărire (20×);
– se coboară noul obiectiv cu ajutorul macrovizei până la o distanţă mai mică decât noua Di (1-2 mm deasupra preparatului);
– privind prin oculare, se ridică condensatorul până se iluminează corespunzător câmpul microscopic;
– se corectează claritatea imaginii, folosind vizele micrometrice
 Tehnica de lucru la microscopul fotonic

10. Folosirea obiectivelor cu imersie (90×):

– când este necesară trecerea la obiectivul cu imersie, se face o centrare riguroasă, precisă a zonei de studiat folosind
obiectivul 40×;
– se scoate din ax obiectivul respectiv;
– se pune o picătura de ulei de cedru pe lamă în dreptul axului optic;
– se ridică condensatorul în poziţia sa superioară maximă;
– apoi se aduce obiectivul cu imersie în ax, astfel încât lentila frontală a obiectivului intră în contact cu uleiul de cedru,
dispărând spaţiul de aer dintre obiectiv şi portobiect;
– se fixează claritatea imaginii privind prin ocular şi folosind viza micrometrică.
• Obiectivele cu imersie necesită o manipulare foarte atentă, de aceea se evită coborârea tubului cu ajutorul macrovizei,
deoarece există riscul spargerii lamei portobiect şi deteriorarea lentilei frontale.



 Tehnica de lucru la microscopul fotonic

11. Întreţinerea şi păstrarea microscopului – pentru bună funcţionare a microscopului este necesară păstrarea lui în husa de plastic, iar
părţile metalice se curăţă periodic cu o bucată de pânză moale şi obiectivele cu tifon înmuiat în solvenţi organici.
• După terminarea folosirii microscopului se fac următoarele operaţiuni:
– se ridică tubul microscopului;
– se scoate lama de pe platină;
– se aduce obiectivul de 10x în axul optic;
– se coboară condensatorul;
– se decuplează sursa de lumină a microscopului de la transformator, iar acesta de la reţeaua de 220V;
– microscopul se acoperă cu husa.
• Se recomandă să nu se atingă cu mâna nici una dintre părţile optice ale aparatului.
 2. MICROSCOPUL CU CÂMP ÎNTUNECAT
 

•permite observarea unor obiecte de dimensiuni foarte mici, necolorate. Metoda se bazează pe
fenomenul de dispersie a luminii de către particulele aflate în suspensie (similar particulelor de praf vizibile
într-un fascicul de lumină), care astfel devin vizibile ca obiecte strălucitoare pe un fond întunecat.
• preparatul nu trebuie iluminat direct, ci din lateral. În acest scop, sub condensator se plasează un disc
opac, care va lăsa să treacă lumina doar la periferia condensatorului – fascicul de raze oblice. Nedeviate de
preparat aceste raze nu intră în obiectiv şi, deci, câmpul microscopic apare întunecat. Dacă fasciculul
întâlneşte în calea sa obiecte mici, razele vor fi dispersate şi o parte vor avea direcţia corespunzătoare pentru
a străbate sistemul optic şi a forma imaginea.
•Datorită fenomenului de dispersie a luminii, prin această metodă se pot observa particule foarte mici, de
până la 0.003 m (rezoluţie de aproximativ 100 de ori mai mare ca a microscopului fotonic obişnuit).
 2. MICROSCOPUL CU CÂMP ÎNTUNECAT

Reprezentare schematică a elementelor unui microscop cu câmp

întunecat şi parcursul razelor într-un astfel de microscop – lumina care
ajunge în obiectiv şi formează imaginea este doar cea dispersată de
preparat;
 2. MICROSCOPUL CU CÂMP ÎNTUNECAT

preparat din sânge – se observă hematiile precum şi  spirocheteTreponema pallidum responsabile

numeroase puncte strălucitoare care reprezintă colonii
de nanobacterii. pentru apariţia sifilisului.
Nanobacterii = ultamicroorganisme implicate în
formarea plăcii dentare; în sânge se pare ca au rol în
coagulare şi cresc în colonii. Dimensiunile lor extrem de
mici le fac imposibil de evidenţiat la microscopul fotonic
obişnuit.
 2. MICROSCOPUL CU CÂMP ÎNTUNECAT

•Particularităţile microscopului cu câmp întunecat

• Pe un microscop fotonic obişnuit, câmpul întunecat se poate obţine prin plasarea unui disc opac pe traiectul fasciculului
luminos sub condensator. Microscoapele destinate acestei tehnici prezintă discul opac încorporat în condensator, foarte aproape
de sistemul de lentile. Cu cât discul opac este mai aproape de lentilele condensatorului, cu atât mai bună este ocluzia
fasciculului direct şi contrastul obiectelor de observat este mai bun.
• Aplicaţiile practice ale microscopiei cu câmp întunecat:
– observarea rapidă a suspensiilor de celule – de exemplu în examinarea eritrocitelor în diferite tipuri de anemii;
– examinarea preparatelor din sânge pentru depistarea rapidă a agenţilor patogeni – de exemplu examinarea sângelui pentru
diagnosticarea bacteriemiei în sifilis.
– examinarea probelor de apă pentru detectarea contaminării bacteriene;
– observarea motilităţii la diferite tipuri de celule.
 3. MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

• permite observarea în celule a compuşilor numiţi fluorocromi sau fluorofori. Aceştia prezintă proprietatea de a absorbi o
radiaţie invizibilă, ultravioletă şi de a elibera o parte din energie sub forma emiterii unei radiaţii cu lungime de undă (λ) mai lungă, în
spectrul vizibil, proprietate numită fluorescenţă.
• Fluorescenţa unui preparat microscopic poate fi clasificată în două categorii:
– fluorescenţă primară, naturală sau autofluorescenţa – produsă de substanţe care se găsesc în mod natural în celule sau ţesuturi
(lipofuscină, cromolipidele, fenilalanina, tirozina, adrenalina, noradrenalina etc.);
– fluorescenţa secundară sau provocată – indusă prin tratarea secţiunilor de ţesut cu fluorocromi, prin această metodă putându-se
detecta acizii nucleici, fibrele de colagen, de reticulină şi elastice, mucinele, etc.
• Fluorocromii folosiţi pentru colorarea diferitelor substraturi celulare sunt substanţe din marea clasă a coloranţilor citologici.
Prezintă structură asemănătoare coloranţilor, cu deosebirea că grupările cromofore din structura lor nu absorb radiaţii în spectrul
vizibil, ci în spectrul ultraviolet şi emit în scurt timp o parte din energie sub forma unei radiaţii vizibile cu λ mai mare, radiaţia emisă
fiind în spectrul vizibil, cu o lungime de undă specifică în funcţie de fluorocrom (deci cu culoare specifică).
 MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

Principiul fluorescenţei:
•1) energia radiaţiei ultraviolete este absorbită de atom care intră în stare de excitaţie;
•2) electronii trec pe un nivel superior de energie;
•3) în scurt timp electronii revin la starea de bază, emiţând un foton (radiaţie luminoasă). 
•Fluoresceina, folosită în prezent pe scară largă în aplicaţiile microscopiei cu fluorescenţă este o
xantină, înrudită îndeaproape cu eozina, un colorant frecvent utilizat în coloraţiile de rutină (figura 2.7). Alţi
fluorocromi utilizaţi sunt acridin-orange, quinacrina, rodamina şi derivaţii lor.
 MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

• Particularităţile microscopului cu fluorescenţă

• Microscopul cu fluorescenţă prezintă următoarele dispozitive montate în plus faţă de un microscop fotonic
obişnuit:
• a. sursa de lumină - este reprezentată de o lampă cu vapori de mercur (HBO – 200W) care emite radiaţii
U.V.; se montează în partea postero-superioară a microscopului şi comunică cu tubul microscopului;
• b. două tipuri de filtre de lumină:
– filtrul de excitaţie care are rolul de a opri toate radiaţiile în afara celor U.V.; se montează la ieşirea din sursa de
lumină;
– filtre de protecţie care protejează retina şi se montează între obiectiv şi ocular; aceste filtre nu lasă să treacă
radiaţiile ultraviolete care pot produce leziuni ale retinei.
 MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

a) Dispunerea filtrelor şi traiectul radiaţiilor în microscopul cu fluorescenţă. b) Imagine de

imunofluorescenţă a filamentelor gliale din astrocite (verde); nucleii apar coloraţi în albastru.
 
MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ
• Sursa de lumină produce radiaţii ultraviolete, iar acestea străbat filtrul de excitaţie care lasă să treacă numai
pe aceea care este capabilă să excite fluorocromul. Aceasta este focalizată pe preparat care va emite o
radiaţie în spectrul vizibil captată şi focalizată de obiectiv pentru a forma imaginea. Deoarece sursa de lumină
produce numai lumină ultravioletă – „neagră”, obiectele colorate cu fluorocrom apar strălucitoare pe un fond
negru.
 MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

•Aplicaţiile practice ale microscopiei cu fluorescenţă:

•Cu ajutorul fluorescenţei primare pot fi identificaţi:
– pigmenţii: porfirinele (fluorescenţă roşie), lipocromii sau pigmenţii carotenoizi
(fluorescenţă verde), cromolipidele (fluorescenţă galben-verde), lipofuscina (fluorescenţă
roşu-brun);
– acizii aminaţi: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenţă albastră);
– unele virusuri şi bacilul Koch emit o fluorescenţă verde strălucitor;
– dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se deosebeşte de cel artificial;
– aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenţă verde).
 • Cu ajutorul fluorescenţei secundare prin colorare cu acridin-orange se pot identifica:
– acizii nucleici: ARN-ul (fluorescenţă roşie), AND-ul (fluorescenţă verde-galben);
– fibrele de colagen, elastice şi reticulină – fluorescenţă verde;
– nucleii leucocitelor au o fluorescenţă verde, iar citoplasma lor şi eritrocitele rămân opace;
– mucinele – fluorescenţă verde.
• Coloraţia cu acridin-orange se mai utilizează în citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici în condiţiile
unui proces tumoral).
• Cea mai importantă aplicaţie este imunofluorescenţa, care se bazează pe cuplarea unui anticorp cu un fluorocrom; prin
fluorescenţa indusă poate fi identificată localizarea antigenelor în celule.
•
 4. MICROSCOPUL ÎN CONTRAST DE FAZĂ

•Microscopia în contrast de fază utilizează un tip special de microscop fotonic ce realizează contrastul
unor obiecte de examinat, permiţând astfel studiul celulelor în stare vie, nefixate şi necolorate.
•În general, distingem diferitele părţi ale unui obiect deoarece acestea afectează lumina în mod diferit.
Una din caracteristicile care stă la baza acestei diferenţe este indicele de refracţie; celulele şi organitele sunt
alcătuite, în proporţii variabile, din molecule diferite, iar regiunile cu compoziţie diferită au şi indicele de
refracţie diferit. În mod normal aceste diferenţe nu pot fi detectate de ochi, dar microscopul cu contrast de fază
converteşte diferenţele între indicii de refracţie în diferenţe de intensitate a luminii care sunt vizibile pentru ochi
sub formă de regiuni întunecate şi regiuni luminoase.
 MICROSCOPUL ÎN CONTRAST DE FAZĂ

Imaginea unui fibroblast în cultură, necolorat (A) în microscopie optică

şi (B) în contrast de fază.
 MICROSCOPUL ÎN CONTRAST DE FAZĂ

•Particularităţile microscopului cu contrast de fază

•Microscopul pentru contrast de fază separă lumina directă de lumina difractată care trece prin probă şi
face ca aceste două radiaţii să interfere. Prezintă următoarele adaptări faţă de un microscop fotonic obişnuit:
– condensatorul are un diafragm inelar (un inel transparent într-un disc opac);
– în obiectiv se găseşte o placă sau inel de fază care are rolul de a modifica transmisia unei părţi din razele
luminoase care formează imaginea câmpului microscopic (are loc interferenţa razelor luminoase care sunt
transmise direct şi a celor care sunt difractate de preparat).
•Defazarea este proporţională cu indicele de refracţie al regiunii străbătute de radiaţia respectivă.
 MICROSCOPUL ÎN CONTRAST DE FAZĂ

•Aplicaţiile practice ale microscopiei în contrast de fază:

– studiul celulelor în stare vie (celule nefixate şi necolorate) – important mai ales în urmărirea culturilor de
celule, care sunt verificate prin transparenţa flaconului de cultură pentru observarea proliferării şi a aderării de
substrat.
– permite urmărirea mişcărilor celulare care nu se pot observa la microscopul fotonic obişnuit ca endocitoza,
mişcarea cililor şi flagelilor, diviziunea celulară etc.
– studiul reacţiile celulare la diferiţi agenţi fizici sau chimici.
 MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

•Lumina, la fel ca şi alte radiaţii electromagnetice, este alcătuită din unde care vibrează în mai multe
planuri. Microscopul cu lumină polarizată, foloseşte filtre speciale capabile să selecteze lumina care vibrează
într-un singur plan (lumină polarizată). Cu ajutorul acestor filtre, microscopul cu lumină polarizată furnizează
imagini ale unor constituenţi celulari în care structurile examinate sunt anizotrope, acestea făcând ca planul şi
viteza de propagare a luminii polarizate să varieze cu direcţia de propagare. Astfel de structuri se numesc
birefringente – deşi nu sunt vizibile în mod normal la microscopul fotonic obişnuit, pot fi evidenţiate la
microscopul cu lumină polarizată ca structuri luminoase pe un fond întunecat.
• structuri anizotrope = structuri compuse din elemente cu o anumită orientare, care prezintă diferenţe în
indicele de refracţie în funcţie de orientare.
 MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

•Particularităţile microscopului cu lumină polarizată

•Microscopul cu lumină polarizată prezintă în plus faţă de microscopul fotonic obişnuit:
– un polarizor situat între sursa de lumină şi condensator – acesta este un filtru care lasă să treacă din
fasciculul incident doar lumina care vibrează într-un plan – lumină polarizată;
– un analizor – acesta este un al doilea polarizor situat deasupra obiectivului; când analizorul şi polarizorul sunt
aşezate cu planurile de polarizare perpendiculare unul pe celălalt, lumina incidentă nu străbate sistemul optic
şi câmpul microscopic apare negru;
– o platină rotativă, care permite modificarea orientării preparatului în raport cu planul luminii polarizate.
 MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

Când pe platină se găseşte un preparat cu structuri birefringente, planul luminii polarizate este rotit
astfel încât o parte din lumină va străbate analizorul
chiar dacă acesta este orientat perpendicular
pe polarizor.
 MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

• Aplicaţiile microscopiei cu lumină polarizată constau în studierea constituenţilor celulari care prezintă proprietatea
de birefringenţă, cum ar fi:
– structurile fibrilare (colagen, mielină, fibrele musculare striate) prezintă o birefrigenţă pozitivă când indicele de refracţie
este mai ridicat în lungime decât în plan perpendicular şi negativă în caz contrar (fibrele nucleoproteice).
– birefrigenţa cristalină sau intrinsecă observată în sistemele sau moleculele în care ionii prezintă un aranjament
asimetric regulat, se observă în structuri constituite din proteine sau lipide;
– birefrigenţa de tensiune se observă la structurile izotope care sunt supuse unei constrângeri mecanice şi se întâlneşte
la nivelul muşchilor şi în ţesuturile embrionare;
– dicroismul apare în momentul în care absorbţia unei lungimi de undă dată de lumina polarizată variază în funcţie de
orientarea obiectului examinat. Unii coloranţi organici ca roşul de Congo, pot induce dicroismul în unele structuri
biologice datorită unei orientări preferenţiale a moleculelor.
Cell-fie time/coffee time!