LUCRARE PRACTICĂ 1

MICROSCOPUL ȘI
UTILIZAREA LUI

TIPURI DE
MICROSCOAPE OPTICE
Microscopul optic
A.Componenta Mecanica
B. Componenta Optica
 Întreținerea și păstrarea microscopului:

- pentru buna funcționare a microscopului este necesară păstrarea lui

în husă de plastic;
- părțile metalice se curăță periodic cu o bucată de pânză moale, iar
obiectivele cu tifon înmuiat în solvenți organici.
După terminarea folosirii microscopului se fac următoarele
operațiuni:
- se ridică tubul microscopului;
- se scoate lama de pe platină;
- se aduce obiectivul de l0x în axul optic;
- se coboară condensatorul;
- se decuplează sursa de lumină a microscopului de la transformator
iar acesta de la rețeaua de 220 V;
- microscopul se acoperă cu husă.
Se recomandă să nu se atingă cu mâna nici una dintre părțile optice
ale aparatului.
 Alte tipuri de microscoape utilizate pentru studiul
țesuturilor
I. Microscopul cu fluorescență
Microscopia prin fluorescență pune în evidență fenomene luminoase
care iau naștere în structuri biologice primare (naturale), sau a celor
secundare, provocate cu ajutorul substanțelor numite fluorocromi.
Metoda se bazează pe proprietatea unor substanțe care, iradiate cu un
fascicul de lumină cu o lungime de undă mică și cu frecvență înaltă emit
radiații cu o lungime de undă mare și o frecvență mai joasă, deci de
culoare diferită. Aceste substanțe se numesc fluorescente.
Fluorescența este condiționată (Mayer) de prezența unor grupări
fluorocrome cum ar fi: azin, oxazin etc.
În practica curentă, prin fluorescență se înțelege emiterea de radiații
luminoase de către o substanță supusă acțiunii razelor ultraviolete (300 -
400 milimicroni). Se formează o imagine vizibilă, colorată, care poate fi
observată cu ochiul protejat de un filtru pentru radiațiile ultraviolete sau
care impresionează placa fotografică.
 Emisia spectrului de fluorescență se prezintă sub formă de benzi
(linii Stokes) și nu este un spectru continuu, fiind în funcție de
mărimea moleculei. Fenomenul poate fi observat în orice stare de
agregare a substanței, fiind mai intens la lichide și solide.

Fluorescența unui preparat microscopic poate fi clasificată în două

categorii:
l. Fluorescență primară, naturală sau autofluorescență – produsă
de substanțe care se găsesc în mod natural în celule sau țesuturi
(lipofuscină, cromolipidele, fenilalanina, tirozina, adrenalina,
noradrenalina etc.).
2.Fluorescența secundară sau provocată - indusă prin tratarea
secțiunilor de țesut cu fluorocromi (exemplu, acridin-orange); prin
această metodă se pot detecta acizii nucleici, fibrele de colagen,
reticulina și elastice, mucinele etc.
Tehnica de lucru

l. După montarea dispozitivelor menționate, se pornește lampa

H.B.O. și se așează pe platina microscopului preparatul de examinat,
aplicat pe o lamă portobiect nefluorescentă;
2. Pentru găsirea câmpului microscopic și punerea la punct a
imaginii se procedează la fel ca în tehnica de lucru în microscopia
fotonică.
3. După examinare se întrerupe alimentarea de la rețea a lămpii
H.B.O.

ATENȚIE - este interzis a privi radiațiile produse de lampa H.B.O.

fără ochelari de protecție U.V.;
-este interzisă manipularea carcasei în timpul funcționării lămpii sau
imediat după stingerea ei înainte de răcire, deoarece există pericol de
implozie.
 Aplicații practice

Microscopia în lumină fluorescentă reprezintă o metodă cu o largă

aplicabilitate în biologia celulară.

Cu ajutorul fluorescenței primare pot fi identificați:

a. pigmenții: porfirinele (fluorescența roșie), lipocromii sau
pigmenții carotenoizi (fluorescența verde), cromolipidele (fluorescența
galben-verde), lipofuscina (fluorescență roșu-brun);
b. acizii aminați: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescența
albastră);
c. unele virusuri și bacilul Koch emit o fluorescență verde
strălucitor
d. dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se
deosebește de cel artificial;
e. aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina
(fluorescență verde)
 Cu ajutorul fluorocromării (fluorescență secundară) cu acridin-
orange se pot identifica:
a. acizii nucleici: ARN-ul (fluorescență roșie), AND-ul
(fluorescență verde-galben);
b. fibrele de colagen, elastice și reticulină – fluorescență verde;
c. nucleii leucocitelor au o fluorescență verde, iar citoplasma lor
și eritrocitele rămân opace;
d. mucinele – fluorescență verde.

Colorația cu acridin-orange se mai utilizează în citodiagnosticul

precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici în condițiile unui
proces tumoral).
Cea mai importantă aplicație este imunoflorescența, care se
bazează pe cuplarea unui anticorp cu un fluorocrom; prin
infloescența indusă poate fi identificată localizarea antigenelor în
celule.
 Microscopia prin fluorescență se deosebește de microscopia cu
raze ultraviolete a cărui principiu de funcționare se bazează pe
absorbția luminii ultraviolete de către moleculele preparatului.
Microscopia în ultraviolet este asemănătoare
spectrofotometriei, dar rezultatele sunt înregistrate fotografic.
Razele ultraviolete trec prin lentile speciale și prin secțiunea
preparalului de examinat dând, datorită unui fond diferit de
absorbție, o imagine invisibilă pentru ochi, dar care este înregistrată
pe placa fotografică.
Metoda este utilizată pentru detectarea acizilor nucleici, a
bazelor purinice și pirimidinice ale nucleotidelor ca și la detectarea
proteinelor ce conțin anumiți amino-acizi.
Prin metodele de preparare a secțiunilor se pot elimina astfel de
incoveniențe, lărgind astfel posibilitatea de utilizare a microscopiei
prin fluorescență.
 II. Microscopul în contrast de fază

Microscopia în contrast de fază utilizează un tip special de

microscop fotonic ce realizează contrastul unor obiecte de examinat,
permitând astfel studiul celulelor în stare vie, nefixate și necolorate.
Aparatul pentru contrast de fază este un microscop obișnuit, cu
următoarele particularități:
1. condensatorul are o diafragmă inelară (un inel transparent într-
un disc opac);
2. în obiectiv se găsește o placă sau inel de fază care are rolul de a
modifica transmisia unei părți din razele luminoase care formează
imaginea câmpului microscopic (este un proces de defazare între
razele luminoase care sunt transmise direct și cele care sunt difractate
de preparat).
Aceste două particularități permit modificarea sistemului optic,
adică transformă diferențele de fază invizibile pentru ochi în diferențe
de amplititudine, care măresc constrastul elementelor preparatului.
Aplicații practice

Microscopia în contrast de fază permite:

1. studiul celulelor în stare vie (celule nefixate și necolorate);

2. scoate în evidență unele detalii de structuri care nu se pot
observa la microscopul fotonic obișnuit ca endocitoza, mișcarea
cililor și flagelilor, diviziunea celulară etc
3. studiază reacțiile celulare la diferiți agenți fizici sau chimici;
4. studiază benzile cromozomilor
 III. Microscopul cu lumină polarizată

Prin această tehnică se obțin

imagini ale unor constituenți în
care structurile examinate sunt
anizotrope, acestea făcând ca
viteza de propagare a luminii
polarizate să varieze cu direcția de
propagare; mediile respective se
numesc birefringente.
Birefringența se poate clasifica:

a. în structurile fibrilare (colagen, mielină, fibrele musculare striate

etc.) poate exista o birefrigentă pozitivă, când indicele de refracție
este mai ridicat în lungime decât în plan perpendicular și refrigență
negativă în caz contrar (fibrele nucleoproteice);

b. birefrigenta cristalină sau intrinsecă observată în sistemele sau

moleculele în care ionii prezintă un aranjament asimetric regulat și
este independentă de indicele de refracție a mediului de montare; se
observă în structuri constituite din proteine sau lipide;

c. birefrigenta de formă sau structură apare atunci când particulele

submicroscopice sunt orientate regulat într-un mediu cu indice de
refracție diferit;
d. birefrigenta de tensiune se observă la strucrurile izotope care sunt
supuse unei constrângeri mecanice și se întâlnește la nivelul
mușchilor și în țesuturile embrionare;

e. dicroismul apare în momentul în care absorbția unei lungimi de

undă dată de lumina polarizată variază în funcție de orientarea
obiectului examinat. Aceste variații apar datorită diferențelor de
intensitate (amplitudinea luminii transmise de obiect). Unii coloranți
organici ca roșul de Congo, pot induce dicroismul în unele structuri
biologice, datorită unei orientări preferențiale a moleculelor.