UNIVERSITATEA VALAHIA

FACULTATEA DE INGINERIA MEDIULUI ȘI ȘTIINȚA ALIMENTELOR

SPECIALIZAREA: CONTROLUL ȘI EXPERTIZA ALIMENTELOR

TEMĂ DE CASĂ

Analiza chimică a alimentelor

prin fluorescenţă

Conf. Dr.ing Carmen Nicolescu Masterand, Săbiescu Diana

Anul 2018-2019, sem I

1
 CUPRINS

1. Definirea fenomenului de fluorescenţei 3

2. Principiul metodei 3
3. Avantajele metodei 5
4. Dezavantajele metodei 5
5. Aparatura utilizată 5
5
5.1. Fluorimetre
7
5.2. Sperctofluorimetre
7
5.3. Microscoape cu fluorescenţă 9
6. Etapa preparativă de pregătire a probelor 9
7. Descrierea metodei de lucru specific 9
8. Rezultate furnizate 9
9. Interpretarea rezultatelor obţinute 10
10. Aplicaţii în identificarea componentelor alimentare 10

10.1. Aplicaţiile analizei chimice prin fluorescenţă la examinarea produselor

11
lactate

10.2. Aplicaţiile analizei chimice prin fluorescenţă la examinarea ouălor 12

12
10.3. Aplicaţiile analizei chimice prin fluorescenţă la examinarea cărnii
13
10.4. Determinarea dioxidului de sulf (SO2) prin fluorimetrie în UV
Bibliografie 14

1. Definirea fenomenului de fluorescenţă

Anumite combinaţii chimice, aflate mai ales în soluţie sau în stare solidă, în urma
excitării moleculelor cu radiaţii din domeniile vizibil şi UV apropiat, reemit o parte din energia
primită sub formă de radiaţie luminoasă - adesea vizibilă. Această reemisie se numeşte
fluorescenţă.

2
 Fluorescenţa este proprietatea anumitor atomi şi molecule de a absorbi lumina la o
anumită lungime de undă şi consecutiv de a emite lumină de o lungime de undă mai mare după
un anumit interval scurt, termen denumit durată de viaţă a fluorescenţei.

2. Principiul metodei
Maximul radiaţiei de fluorescenţă este situat de obicei la o valoare a lungimii de undă
mai mare decât maximul picului radiaţiei care a provocat excitarea, diferenţa de energie
corespunzătoare transformându-se în căldură, fiind disipată în mediu.
Simplificat, acest fenomen poate fi reprezentat conform schemei din fig. 1.

Fig. 1. Fenomenul de fluorescenţă

Fluorescenţa, riguros vorbind, implică emisia de radiaţie prin tranziţia între două niveluri
care au aceeaşi multiplicitate (de exemplu singlet la singlet sau triplet la triplet).
Din punct de vedere fundamental, fluorescenţa compuşilor moleculari (de interes pentru
analiza chimică) se poate înţelege ca o absorbţie de radiaţie UV-VIS urmată de o serie de
tranziţii energetice între ultimii orbitali ocupaţi, în starea fundamentală a moleculei, şi primii
orbitali externi vacanţi. Iniţial moleculele se află în repaos, în starea fundamentală, notată S 0
(fig. 2). După absorbţia unui foton incident electronii trec în starea S 1 - prima stare de tranziţie
electronică, excitată. Apoi, foarte rapid (10-12s), are loc un proces denumit conversie internă,
prin care moleculele suferă rearanjări, fără a emite fotoni, timp în care electronii ajung în starea
caracterizată prin numărul de vibraţie V0 a stării electronice următoare, S1. Abia apoi intervin
tranziţiile de fluorescenţă (timp de 10-9-10-7s) în urma cărora moleculele revin pe unul din
nivelele notate V0, V1, ... (stări energetice de vibraţie caracterizate fiecare prin numărul de
vibraţie respectiv, Vi) - aparţinând nivelului iniţial S0.

3
 Fig. 2. Diagrama energetică a fluorescenţei. Săgeţile scurte simbolizează conversii
interne fără emisie de fotoni. S = singlet; T = triplet; V1 … V4 = numere cuantice de
vibraţie şi totodată notaţii ale stărilor de vibraţie

Fosforescenţa, pe lângă faptul că însoţeşte o reacţie chimică, analog luminescenţei,

corespunde şi unui mod diferit de revenire la starea fundamentală. După faza de absorbţie o
dată cu transferul unui electron pe nivelul S 1 (prima stare electronică excitată după cea
fundamentală - o stare de singlet) are loc, dacă relaxarea vibraţională se produce suficient de
lent, modificarea spinului electronului la o stare de triplet, notat T 1 (fig. 2), ceva mai stabile
(metastabilă). Din acest motiv, revenirea la starea fundamentală este încetinită, deoarece
implică o nouă modificare de spin a acestui electron. Ca urmare, durata stării excitate în
fosforescenţă poate fi de 108 ori mai mare decât în fluorescenţă.
Se cunosc câteva reguli privind legătura dintre structura compuşilor organici şi
fluorescenţa acestora:
 Moleculele organice care nu absorb puternic lumina peste 200 nm în general nu
sunt fluorescente.
 Moleculele care au banda de absorbţie corespunzătoare tranziţiei: S0→S1 (v. fig.
1), localizată la λ = 250 nm şi pentru care absorbţia luminii se datoreşte unei tranziţii (ππ') sunt
fluorescente.
 Substituenţii - donori de electroni - grefaţi pe un sistem π-delocalizat măresc
întotdeauna absorbţia luminii, intensificând fluorescenţa. În acest sens, se pot aminti, de
exemplu, funcţiunile: OH > OR > NH2.

4
  Grupele funcţionale puternic atragătoare de electroni (grefate la sistemul ππ') tind
să reducă fluorescenţa moleculei respective. În plus prezenţa, alături de acestea, a unor grupări
donoare de electroni, tinde să diminueze fluorescenţa (şi nu să o intensifice).

3. Avantajele metodei
 Metoda rapidă;
 Cost scăzut;
 Sunt sisteme ideale atăt pentru laboratoarele din cercetare cât şi pentru cele dein
controlul calităţii;
 Sunt complet automatizate şi dispun de softuri performante;
 Prezintă limită de detecţie mică;
 Realizează măsurători nedistructive, cantitative şi calitative;
 Analizează probe de cea mai diversă natură: solide, pulberi, lichide, probe de
diferite forme.

4. Dezavantajele metodei
 Se bazează pe folosirea unei surse de radiaţii;
 Necesită autorizaţie de funcţionare.

5. Aparatura utilizată
5.1. Fluorimetre
Deoarece proba spusă analizei emite radiaţia de fluorescenţă în toate direcţiile, pe
fotodioda sau fotomultiplicatorul instrumentului folosit cad doar radiaţiile care vin în direcţia
acestuia, în timp ce restul se pierd. De aceea suprafaţa senzorului care preia radiaţia trebuie să
fie cât mai mare.
În general se măsoară radiaţia care părăseşte celula sub un unghi de 90° faţă de radiaţia
incidentă. Pentru soluţii cu absorbanţă ridicată studiul se poate realiza şi în prelungirea
fascicolului incident. Pentru soluţii semiopace se preconizează o observare sub un unghi
variabil între 90-180°. Geometria fluorimetrelor poate fi sintetizată prin schema din fig.6.

5
 Fig. 3. Geometria unui fluorimetru; unghiul preferat de observare a fluorescenţei este
90°; F = fanta
Sursele optice ale fluorimetrelor actuale emit un spectru luminos continuu. Au devenit
uzuale următoarele lămpi folosite în calitate de surse:
 Lămpile cu arc de deuteriu (190 - 400 nm);
 Lămpile cu arc de xenon (200 - 850 nm);
 Lămpile cu arc de wolfram (380 - 700 nm).
Se mai utilizează şi lămpile cu vapori de mercur care produc linii spectrale intense (la
254, 313 şi 365 nm). Acestea, pot fi izolate individual folosindu-se nişte simple filtre optice.
De asemenea au mai apărut surse cu laser heliu-cadmiu (325 nm, 5-10 mW) care de
asemenea necesită un filtru optic şi impun folosirea unor fotomultiplicatori.
Constructiv se pot distinge două tipuri de fluorimetre: (1) bazate pe determinarea
raportului fluorescenţelor şi (2) spectrofluorimetre.
Fluorimetrele bazate pe determinarea raportului fluorescenţelor (fig.7) după ce
selectează radiaţia excitantă optimă, găsită prin încercări preliminare, radiaţia incidentă este
despărţită, de o oglindă semitransparentă, în două raze: una care cade pe probă (aflată în celula
de măsură) iar cealtă pe o fotodiodă. Din celula de măsură iese radiaţia de fluorescenţă, care se
observă la un unghi de 90° faţă de cea incidentă. Un al doilea monocromator, denumit de
emisie, selectează radiaţia dorită, de regulă cea mai intensă. Proba poate fi înlocuită cu un
etalon metrologic pentru reglaje. Folosirea celor două fotodiode în opoziţie elimină fluctuaţiile
de intensitate inerente oricărei surse bazate pe arc electric.

5.2. Spectrofluorimetre

6
 Spectrofluorimetrele permit, pe lângă cele amintite anterior la fluorimetre, obţinerea unor
spectre de fluorescenţă. Fiecare din cele două monocromatoare baleiază întreg domeniul
spectral. Pentru fiecare valoare a radiaţiei excitante există un spectru de fluorescenţă separat.
Pentru tot domeniul se obţine o familie de spectre care caracterizează în mod unic o
combinaţie chimică sau un material fluorescent. Cu ajutorul acestora se pot selection condiţiile
optime de lucru pentru o determinare de rutină.

Fig. 4. Schema unui spectrofluorimetru cu doi detetectori care elimină

deriva sursei

Foto. 1. Spectrofluorimetru

5.3. Microscoape cu fluorescenţă

Componentele unui microscop cu fluorescenţă sunt: lampa cu arc xenon sau lampa cu
vapori de mercur, filtrul de excitaţie care este constituit din sticlă cu calităţi optice ridicate, care
selectează din fasciculul luminos emis de sursă, lumina cu lungimi de undă scurte care au cea

7
mai mare energie, oglinda dicroică sau dicromatică (termen care provine din grecescul
“dikhroos” care înseamnă bicolor) care se caracterizează prin reflexia luminii cu două lungimi
de undă şi filtrul de emisie. Filtrul şi oglinda dicroică sunt alese astfel încât să se potrivească
excitaţiei spectrale şi emisiei caracteristice etichetei fluorescente alese pentru structura studiată.

Foto. 2. Microscop cu fluorescenţă

Fig. 5. Geometria unui microscop cu fluorescenţă

6. Etapa preparativă de pregătire a probelor

8
 Proba de analiză trebuie prelevată ţinându-se cont de anumite cerinţe şi reguli pentru ca
rezultatele obţinute să fie relevante. Astfel, proba trebuie să fie reprezentativă pentru întreg
materialul şi deaceea trebuie prelevată cu atenţie.
Sensibilitatea spectrofluorimetrelor moderne este atât de mare încât se pot detecta chiar şi
amprentele digitale ale persoanei ce efectuează prelevarea, fapt ce conduce la perturbarea
analizelor.
O altă cerinţă de bază este aceea potrivit căreia mostrele trebuie să fie omogene.
Spectrometrele de fluorescenţă analizează numai straturile de suprafaţă ale probei, şi tocmai
deaceea proba trebuie să fie reprezentativă pentru materialul supus analizei.
Probele prea mici sau prea subţiri pot încălca condiţiile minime de grosime şi masă pe
care trebuie să le îndeplinească astfel încât rezultatele să poată fi considerate valide.

7. Descrierea metodei de lucru specifice

Metoda de lucru ce urmează a fi descrisă este spectroscopia de fluorescenţă cu radiaţii X.
Majoritatea probelor analizate prin această metodă necesită minimul de pregătire. Se
alege o probă reprezentativă iar aceasta este iradiată cu radiaţii X pentru a se măsura
intensitatea radiaţiilor de fluorescenţă pe baza căreia se face identificarea elementelor prezente
în probă şi analiza cantitativă a acestora. Analiza cantitativă prin scpctroscopie de fluorescenţă
cu radiaţii X necesită o metodă analitică bazate pe material de referinţă având compoziţii
asemănătoare.
Primul pas în analiză este determinarea poziţiilor de maxim şi a ariei de profil a liniei
spectrale. Poziţia picurilor redă prezenţa unui anumit element în probă, iar aria reprezintă
intensitatea liniei energetice a elementului respectiv.

8. Rezultate furnizate
În spectroscopia de fluorescenţă cu radiaţii X, întreg spectrul este analizat simultan iar
concentraţia unui element este data de aria de profil a picului.
Prin spectrometrie de fluoresenţă cu radiaţii X se obţin grafice de forma celui prezentat în
figura 6.

9
 Fig. 6. Spectru cu două picuri şi un background
În analiza cantitativă, intensităţile nete ale liniilor energetice sunt converite în
concentraţii. Calibrarea determină relaţia dintre concentraţiile elementelor şi fluorescent liniilor
energetice ale acestor elemente. De îndată ce această relaţie este obţinută se pot determina
concentraţiile necunoscute prin asocierea concencentaţiilor obţinute la calibrare.
Spectroscopia de fluorescenţă cu radiaţii X este în general o metodăp analitică
comparative, rezultatele obţinute sunt bazate întotdeauna pe procesul de calibrare analitică.

9. Interpretarea rezultatelor obţinute

Analiza picurilor este folosită pentru identificarea elementelor prezente în probă. Pentru
identificarea picurilor în spectru se întrebuinţează o tehnică matematică. Profilul picurilor
obţinute din analiză se compară cu profilul picurilor etaloanelor dintr-o bază de date până se
identifică un profil asemănător cu cel obţinut experimental. Acesta va fi elemental căutat.
Metoda analitică trebuie calibrate cu grijă, având în vedere interferenţele spectrale,
efectele de matrice şi alte efecte care pot influenţa determinarea intensităţii radiaţiei de
fluorescenţă din spectru.

10. Aplicaţii în identificarea componentelor alimentare

Există un număr mic de molecule care posedă o fluorescenţă naturală. Acestea pot fi
analizate cantitativ prin fluorimetrie dacă se dispune de substanţa pură (etalon). Numărul
acestora este foarte mic (5-8% din total). Pe de altă parte, aşa cum există reactivii de culoare,

10
există şi o serie de reactivi de fluorescenţă care duc, în urma unei reacţii chimice, la produşi
fluorescenţi.
Din primul grup de metode amintim analiza hidrocarburilor policiclice aromatice din ape,
în urma separării acestora prin cromatografie. Tot în categoria acestui prim grup intră şi
determinarea aflatoxinelor - agenţi cancerigeni prezenţi în alimente dar şi o serie de alte
substanţe importante cum ar fi steroizi şi vitamine. Din a doua grupă de metode amintim
determinările unor cationi metalici cum ar fi Be2+ cu reactivul morină sau unii complecşi ai
metalelor trivalente cu oxina (8-oxichinoleina).
Analiza fluorescenta este o metoda chimică utilizată pe scară tot mai largă. Astfel, în
cazul determinarilor calitative, carnea şi extractele din carne capătă proprietăţi fluorescente în
funcţie de specia de animale de la care provin (ţesutul muscular proaspăt de la bovine este roşu
închis, catifelat; la ovine, cafeniu închis; la porcine, cafeniu deschis).
Metoda fluorescenţei este folosită şi pentru determinarea gradului de prospeţime a
produselor alimentare. Astfel, pe parcursul perioadei de păstrare, peştele, ouăle, lactatele,
cerealele şi produsele cerealiere îşi schimbă fluorescenţa. O altă aplicare a metodei este
determinarea cantitativă a vitaminei E şi a proteinelor.
Aflatoxinele prezintă fluorescenţă în UV. De altfel, primii patru compuşi izolaţi au fost
denumiţi în funcţie de culoarea fluorescenţei la 254 nm şi 366 nm, albastră sau verde, respectiv
B (blue) şi G (green).

10.1. Aplicaţiile analizei chimice prin fluoresenţă pentru examinarea produsele

lactate
Aminoacizii aromatici, acizii nucleici, riboflavina, reziduurile triptofan din proteine şi
vitamina A sunt cele mai cunoscute molecule fluorescente din produsele lactate.
Spectrul fuorescenţei unei probe de brânză a înregistrat excitaţia la 290 nm - 380 nm şi
emisia între 400 – 600 nm. Reziduurile de triptofan din proteine sunt excitate la 290 nm cu
maximul emisiei de 345 nm.
Riboflavina înregistrează o emisie a fluorescenţei în jurul valorii de 525 - 531 nm la o
lungime de undă a excitaţiei de 380 nm. În ultraviolet, molecula de riboflavină se degradează
obţinându-se doi produşi fluorescenţi: lunicromul şi lumiflavinul; aceştia au emisiile maxime

11
între 444 - 479 nm, respective 516 - 522 nm. Reducerea fluorescenţei la 525 nm, poate
demonstra foto-degradarea vitaminei B2.
Spectrul de excitaţie al vitaminei A se încadrează între 250 - 350 nm, cu lungimea de
undă setată la 410 nm, lucru ce adduce informaţii privind interacţiunea dintre proteine şi lipide
în timpul coagulării laptelui. Forma spectrului de excitaţie al vitaminei A este corelată cu starea
fizică a trigliceridelor din globulele de grăsime.

10.2. Aplicaţiile analizei chimice prin fluorescenţă pentru examinarea ouălor

Spectrofluoresenţa reprezintă o metodă promiţătoare de analiza şi determinare a
prospeţimii ouălor. Spectrul de emisie al diferitelor ouă arată două valori maxime la 635 şi 672
nm, la excitaţii de 405, 510, 540 şi 557 nm, specific pigmenţiolr porfirinei şi derivaţilor
acesteia florin şi oxoflorin.
Oul proaspăt prezintă fluorescenţă la 672 nm, o valore mai mica a acesteia însemnând
faptul că oul respectiv este mai puţin proaspăt.

10.3. Aplicaţiile analizei chimice prin fluorescenţă pentru examinarea cărnii

Fluoresenţa, ca metodă de analiză a calităţii cărnii şi peştelui a fost propusă pentru prima
data în 1986, bazându-se pe caracteristicile fluorescente intrinsece ale acestora.
Metoda se bazează pe excitaţia la 340 nm. Diferitele ţesuturi din care este alcătuită
carnea şi anume: muscular, osos, gras şi conjunctiv, posedă proprietăţi diferite din punct de
vedere al fluorescenţei.
Ţesutul muscular prezintă o valoare mica a fluorescenţei pe când celelalte ţesuturi au
valori mari de emisie ale fluorescenţei astfel: carnea prezintă fluorescenţă maxima la 390 nm,
oasele şi ţesutul conjunctiv la 455 nm şi ţesutul gras la 475 nm.
Primele studii ale fluorescenţei cărnii s-au bazat pe analiza colagenului din ţesuturile
conjunctiv şi adipos, însă au intervenit sugestii referitoare la influenţa compuşilor de oxidare
asupra spectrului de fluorescenţă al produsului analizat. Spectrul de emisie al fluorescenţei
produşilor de oxidare fluorescenţi a condus la corelarea procesului de oxidare lipidică al cărnii
cu procesul de râncezire. Mai mult decât atât, luorescenţa triptofanului (emisia la 290 nm) a
fost corelată cu textura cărnii (moliciunea acestei), a emulsiilor de carne şi a cârnaţilor. De
asemenea, autofluorescenţa colagenului a condus la cuantificarea conţinutului de grăsime şi de

12
ţesut conjunctiv intramuscular din carnea de vită precum şi la determinarea gradului de oxidare
lipidică a cărnii de pui.
În ceea ce priveşte carnea de peşte, moleculele ce prezintă fluorescenţă sunt aminoacizii
aromatici, acizii nucleici (excitaţia la 250 nm, emisia la 280 – 480 nm) şi reziduurile triptofan
din proteine (excitaţia la 290 nm, emisia la 305 – 400 nm). Spectrele de fluorescenţă ale acestor
molecule oferă informaţii cu privire la prospeţimea cărnii de peşte respective. Astfel, luând în
considerare spectrul de fluorescenţă al triptofanului pentru un peşte proaspăt, înregistrează
maximul la 326 nm pe când pentru un peşte congelat, maximul este de 330 nm.

10.4. Determinarea dioxidului de sulf (SO2) prin fluorimetrie în UV

Se bazează pe excitarea moleculelor de SO2 din probă cu o lampă UV pulsatorie (având o
frecvenţă de 20 kHz) cu λ < 214 nm. Moleculele de SO 2 emit prin excitare o fluorescenţă cu
lungimea de unda de 214 nm, foarte specifică. Această metodă stă la baza celor mai
performanre analizoare de SO2 permiţînd determinarea 1 ppb în aer. Mai mult, folosindu-se
cuptoare de conversie oxidative prin care H2S este convertit la SO2 se pot construi analizoare
atât pentru SO2 cât şi pentru H2S.
O schemă de principiu a analizorului pentru SO 2 prin fluorescenţă în UV este prezentată
în fig. 8.

Fig. 7. Schema de principiu a analizorului pentru dioxid de sulf bazat pe

fluorescenţă în UV

13
Bibliografie

1. Jäntschi Lorentz, Chimie fizică. Analize chimice şi instrumentale, Editura

AcademicDirect, 2004, pag. 155-163, http://ph.academicdirect.ro
2. http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/00302.pdf
3. http://www.phys.ubbcluj.ro/~dana.maniu/MTMSA/curs/MTMSA_11_2011.pdf
4. http://www.scribd.com/doc/60855099/Tehnici-de-Biol-cel
5. http://www.kstate.edu/ksuedl/publications/Ultraviolet%20fluorescence
%20identification%20of%20protein,%20DNA,%20and%20bacteria.pdf
6. http://www.scribd.com/conose_1/d/67070465-Pigmenti-luminiscenti

14