METODE OPTICE PENTRU

INVESTIGAȚII ȘI TERAPIE
-Proiect-
Oftalmoscopia cu fluorescență

Piperea Corina-Andreea
Facultatea de Inginerie Medicală
TMIM1
 Descrierea metodei
Oftalmoscopia cu fluorescență (FLIO) este o tehnologie în curs de dezvoltare, care
permite măsurarea in vivo, pe o perioadă de timp, a fluorescenței emise de fluoroforii
endogeni din retină. Timpul de degradare al fluorescenței este un parametru caracteristic
pentru moleculele fluorescente și mediul lor și, prin urmare, FLIO este un instrument
promițător pentru detectarea și evaluarea diferitelor stări metabolice ale diferitelor zone ale
retinei.
Deși măsurarea duratei de viață a fluorescenței este considerată o tehnică relativ nouă
în imagistica biomedicală, ea a fost descoperită în secolul al XIX-lea, ca urmare a cercetărilor
bazate pe tehnica FLIM, ce măsoară prin metode micoscopice durata de viață a fluorescenței.
Cu FLIM, multe detalii ascunse ale arhitecturii celulare sau tisulare pot fi expuse, iar
mecanismele lor pot fi investigate în detaliu mai mare. Un sistem convențional de microscop
FLIM funcționează în vizibil și în apropiere de infraroșu (NIR) (400-900 nm), cu unele dintre
cele mai recente evoluții mergând până la ultraviolete profunde (UV, 240 nm) și infraroșu cu
lungimi de unde scurte (1700 nm). Cu un spectru atât de larg, FLIM poate excita eficient
fluoroforii endogeni găsiți în retină și în țesutul din jur, cum ar fi elastina, colagenul și
melanina, precum și multe alte structuri exogene care oferă informații structurale și
biochimice intrinseci valoroase.
Pe o scară a duratei de viață moleculară, fluorescența este un proces relativ lent. În
acest timp un fluorofor de energie mare poate provoca o varietate de transformări, de la
redistribuirea minoră a electronilor la izomerizarea structurală și reacția chimică cu
moleculele din jur. În condiții ideale, (adică un vid fără alte molecule în jur) starea excitată
are cea mai lungă durată de viață, cunoscută sub numele de durata de viață a fluorescenței
naturale Tn. Această valoare este dificil de măsurat, dar posibil de prezis folosind ecuația
StricklerBerg binecunoscută și importantă din punct de vedere istoric. Orice activitate sau
proces în jurul fluoroforului (solvatare, încălzire, ciocniri) vor absorbi energie din fluorofor în
timp ce este încă în stare excitată și conduc la o scădere a duratei de viață a fluorescenței. Prin
urmare, cartografierea duratei de viață a fluorescenței unui fluorofor într-o celulă sau un țesut
este în esență cartografierea proceselor biochimice care au loc în vecinătatea fluoroforului în
timpul descompunerii.
Fluoroforii endogeni responsabili de autofluorescența în retină și țesutul din apropiere
sunt reprezentați de amino-acizi (fenilalanină, tirozină, triptophan), FAD (Flavin adenin
dinucleotidă), melanină, lipofuscină, luteină, colagen și elastină.
 Figura 1

Principiul de funcționare al metodei

Sistemul se bazează pe un oftalmoscop laser cu scanare confocală cu un sistem
implementat de urmărire a ochilor în timp real. Fluoroforii sunt excitați de impulsuri laser de
picosecunde, iar emisia de fluorescență este detectată utilizând tehnologia de numărare a
fotonului unic corelată în timp (TCSPC).
Durata de viață a fluorescenței este o funcție fotofizică și chimică și descrie timpul
mediu în care o moleculă rămâne în starea sa excitată electronic după absorbția energiei unui
foton și înainte de a reveni la starea fundamentală prin emiterea unui foton. Acest proces
urmează o decădere exponențială, iar scara de timp este de obicei de ordinul pico- până la
nanosecunde.
n −t

I ( t )=I (0)∙ ∑ ai e
Ti

i=1

Ecuația 1 reprezintă suma fluorescenței, indicată ca intensitate a fluorescenței (I), la

momentul (t) cu durata de viață a fluorescenței (T) și amplitudinea (α) respective, în funcție
de numărul de componente de dezintegrare.
Decăderea stării excitate a fluoroforului este un proces statistic. Prin urmare, a deriva
durata de viață a fluorescenței, trebuie măsurat un număr de cicluri de dezintegrare. Pentru
fiecare fluorofor, timpul de detectare de la excitare este măsurat și sortat în diferite canale de
timp, care formează apoi o funcție exponențială.
 Figura 2

Experimental, fiecare foton fluorescent trebuie să fie înregistrat cu precizie în funcție

de timpul lui de sosire la detector din momentul în care a fost excitat și poziția
corespunzătoare pe retină. Prin urmare, sistemul FLIO constă dintr-o sursă laser pulsată și un
detector sensibil pentru înregistrarea fiecărui foton. Un oftalmoscop cu scanare laser confocal
(cSLO) este baza pentru înregistrarea imaginilor pe tot parcursul procesului de achiziție.

Figura 3

Aparatul este echipat cu o cameră cu infraroșu pentru urmărirea activității ochiului

(TruTrack), care corectează mișcările și, prin urmare, asigură înregistrarea corectă și în timp
real a fiecărui foton care ajunge într-un cadru de 256x256 pixeli.
Durata de viață a fluorescenței este modificată și sincronizată cu o diodă de excitație
laser cu lungime de undă la 473 nm. Excitația prin autofluorescență apare cu un fascicul laser
confocal, scanând un unghi de 30° central al fundului de ochi, cu un frame rate de 9 Hz și o
rată de repetiție laser de 80 MHz.
Două detectoare spectrale separate sensibile, ce pot număra câte un singur foton
(HPM-100-40, Becker&Hickl) conectate la două sisteme de numărare corelate în timp
(TCSPC, Becker&Hickl) sunt responsabile pentru detectarea fiecărui fluorofor emis. În
funcție de lungimea lor de undă, fotonii sunt detectați separat în două canale: un canal spectral
scurt (lungime de undă 498 până la 560 nm,și într-un canal spectral lung (560 până la 720 nm,
LSC). Laserul și detectoarele sunt controlate
de un modul de control al detectorului
(Becker&Hickl).
Pe toată durata scanării, perioade de
măsurare repetitive, la fiecare 12 ns, sunt
efectuate pentru fiecare pixel scanat. Fotonii
detectați sunt apoi puși într-o histogramă cu
canale de timp de 12,5 ps.

Achiziția și analiza imaginilor

Funcția de dezintegrare bi-
exponențială determinată a dus la următoarea
durată de viață individuală: un timp de
dezintegrare scurt (T1) și lung (T2) cu
amplitudinile lor relative corespunzătoare (=
intensitatea relativă) α1 și α2. În fundul
ocular, T1 este mult mai scurt decât T2 iar
amplitudinea α1 este mult mai mare decât α2.
Un parametru principal rezultat, reprezentând
toată durata de viață a componentei de
fluorescență menționată mai sus, este media
tau a duratei de viață a fluorescenței (Tm).
Aceasta reprezintă amplitudinea medie
ponderată a timpului de dezintegrare a
fluorescenței per pixel și canal de lungime de undă. Tm este calculat din cele patru
componente individuale ale duratei de viață T1, T2, α1 și α2:
α 1 ∙ T 1 +α 2 ∙ T 2
T m=
α 1 +α 2

Utilizarea FLIO în diagnostic

1. Retina normală
În cazul ambelor canale spectrale, cele mai scurte durate de viață pentru fluorescență
au fost măsurate în centrul foveal cu perioade de 200 ps în canalul spectral scurt și 240 ps în
canalul spectral lung. În această zonă, intensitatea fluorescenței a fost scăzută datorită
prezenței pigmentului macular. Acest lucru este confirmat prin alte studii care arată
congruența măsurătorilor densității optice a pigmentului macular cu durate scurte de viață de
fluorescență într-o populație independentă de subiecți sănătoși.
Spre periferia retinei, au fost măsurate perioade mai lungi de florescență. Aceste zone
se corelează cu distribuția topografică a lipofuscinei retiniene.
 Cele mai lungi durate medii de fluorescență pot fi detectate în zona vaselor retiniene și
la baza nervului optic, posibil datorită unui conținut mai mare de componente cu fluorescență
din țesutul conjunctiv precum colagenul și elastina.
Când se analizează componentele individuale de dezintegrare a fluorescenței T1 și T2,
distribuția pe durata vieții poate fi afișată într-o Figura 4
histogramă 2D (Figura 4 C). Prin urmare, repere precum fovea, retina, vasele retiniene și
capul nervului optic pot fi diferenţiate.
Odată cu vârsta, durata de viață a fluorescenței retinei devine mai lungă în ambele
canale spectrale. Acesta este probabil rezultatul acumulării progresive a unor produse
secundare, cum ar fi lipofuscina, și modificarea compoziției fluoroforilor, care în cele din
urmă duce la o schimbare către perioade mai lungi.

Figura 5

2. Găuri maculare
Găurile maculare sunt defecte ale întregului strat al retinei, situate în zona foveii. Aici,
straturile retiniene neuronale care conțin pigment macular sunt perturbate și dislocate spre
partea laterală a defectului. Modelele de fluorescență pe durata de viață la ochi cu găuri
maculare diferă de modelul găsit în cazul ochilor sănătoși. Duratele de viață în interiorul
defectelor au fost semnificativ mai lungi comparativ cu regiunile maculare intacte. Au fost
găsite durate scurte de viață de fluorescență adiacent găurilor maculare, adesea în formă de
inel. Păreau să fie dislocate în același mod în care straturile retiniene au fost dislocate în
zonele din afara defectului (Sauer, Peters et al. 2016). Figura 8 A) prezintă un exemplu gaură
maculară pe toată grosimea stratului.
 Figura 6

3. Ocluzia arterei retiniene

Ocluzia arterei retiniene ramificate este o oprire a circulatiei in artera centrală a retinei
(CRAO) sau in una dintre ramurile in care ea se imparte (BRAO). Aceasta ocluzie este
provocată de cele mai multe ori de prezența, pe peretele intern a unei artere cu destinație
cefalică, a unei plăci de aterom. Un fragment de placă desprins (sau embol) este uneori
antrenat in circulație și obturează brusc artera centrală a retinei.
Aportul insuficient de oxigen rezultat al retinei duce la o umflare a straturilor
interioare ale retinei în zonele afectate în stadiul acut al bolii. Pacienții au fost investigați cu
FLIO în stadiul acut timpuriu al pierderii vederii (< 3 zile) În acest stadiu, durata de viață a
fluorescenței a fost prelungită semnificativ în zonele cu RAO (Figura 9). Hipoxia, prin
urmare, duce la scăderea contribuției fluoroforilor cu scurte durate de viață de
autofluorescență și influențează pe termen lung această perioadă.
Ischemia induce multiple modificări ale mediului celular și molecular în interiorul
retinei. Acestea includ formarea de specii reactive de oxigen (ROS), scăderea valorii pH-ului,
precum modificări în activarea enzimatică, sinteza citokinelor, activarea genelor și
concentraţii ionice.
S-a determinat că FAD contribuie la durate de viață foarte scurte de fluorescență și
prin urmare, o reducere a FADH 2 și/sau legare redusă a proteinelor de FAD din cauza
hipoxiei, ce conduce la durate de viață mai lungi de fluorescență în condiții ischemice.
 Figura 7

4. Corioretinopatia seroasă centrală (CRSC)

Corioretinopatia seroasă centrală (CRSC) este o afecțiune care duce la acumularea de
lichid sub centrul retinei (maculă) – structură ce se afla în interiorul ochiului, esențială pentru
vedere. În CRSC apare o permeabilitate anormală a vaselor din stratul de sub retină, numit
coroidă. Această anomalie duce la extravazarea de lichid sub retină.
Scurgerea lichidului prin epiteliul pigmentar retinian duce la detașarea seroasă a
retinei. În mod normal, boala se autolimitează cu resorbția spontană a lichidului. Cu toate
acestea, în peste 50% din cazuri, corioretinopatia seroasă centrală poate apărea într-o formă
cronică de peste 6 luni cu lichid subretinian persistent sau într-o formă cronică recurentă cu
reapariția periodică a lichidului.
Astfel, la pacienții cu debut raportat al simptomelor de mai puțin de șase luni, au fost
măsurate durate de viață mai scurte de fluorescență în zonele afectate în comparație cu
valorile pacienților sănătoși. Prezența sau absența lichidului subretinian nu influenţează
valorile. Cu toate acestea, durata scurtă de viață s-a corelat cu prezența segmentelor exterioare
alungite ale fotoreceptorilor, posibil din cauza acumulării de produse secundare ale ciclului
vizual, cum ar fi A2PE, A2-DHP-PE și A2-GPE.
În stadiul cronic al bolii apar modificări retiniene secundare, cum ar fi formarea de
cicatrici și atrofia retinei cu pierderea RPE și stratul fotoreceptor ce conduc la valori mai lungi
de viață în comparație cu valoarea medie a autofluorescenței pe durata de viață a retinei
sănătoase.
 Figura 8

5. Degenerescența maculară Stargardt 

Maladia maculară Stargardt reprezintă o tulburare genetică a ochiului, ce duce la
pierderea progresivă a vederii. Este o formă de distrofie a țesutului foto-senzitiv ce afectează
zona centrală a retinei numită maculă.
De obicei, apar depozite alb-gălbui pe polul posterior al retinei. În etapele ulterioare,
aceste depozite conduc la o distrugere a RPE și a structurii stratului retinian și în final rezultă
atrofia retinei. În măsurătorile intensității autofluorescenței, depozitele retiniene apar ca pete
hiperfluorescente în comparație cu retina din jur, care în general prezintă o intensitate crescută
a autofluorescenței, după cum se identifică prin măsurători cantitative. În etapele ulterioare,
intensitatea redusă a autofluorescenței în zonele atrofice a fost găsită datorită absenței
stratului RPE.
Durata de viață a autofluorescenței în zonele cu structura normală a stratului retinian
fără depuneri sau atrofie a fost comparabilă cu valorile pacienților sănătoși. În zonele de
depozite retiniene hiperfluorescente corespunzătoare petelor vizibile fundoscopic, mai scurte
și mai lungi au fost observate valori ale fluorescenței cu durata de viață comparativă cu retina
normală. În examinările ulterioare, s-a demonstrat că petele cu durate de viață inițial scurte se
schimbă la durate de viață mai lungi, indicând o modificare a compoziției acestor depozite.
 Figura 9

Concluzii
După cum este ilustrat în acest referat, FLIO se bazează pe măsurarea timpilor de
dezintegrare a fluorescenței intrinseci. Imagistica cu fluorescență în oftalmologie s-a dovedit a
fi foarte reproductibilă și oferă informații distincte și specifice pentru diverse boli ale retinei.
Diverse aplicații ale măsurătorilor FLIO sunt rezumate anterior, variind de la tulburări
vasculare, boli degenerative și modificări legate de vârstă la disfuncțiile ereditare ale retinei.
Valorile individuale ale duratei de viață pot fi analizate atât într-un mod calitativ și cantitativ.
Informațiile de bază sunt furnizate în valoarea medie a duratei de viață, Tm, reprezentând
valoarea medie ponderată a duratei de viață a fluorescenței. Tm este în prezent considerat
principalul parametru rezultat în FLIO, reprezentând cea mai importantă informație.
Histogramele codificate prin culori ale măsurătorilor Tm pe durata de viață a fluorescenței
oferă o imagine de ansamblu a schimbărilor petrecute de-a lungul vieții la nivelul retinei.
În ciuda confocalității sistemului FLIO, semnalul ce reprezintă durata de viață obținut
în orice pixel dat reprezintă un semnal brut, obținut prin analiza mai multor fluorofori
adiacenți.

Bibliografie

[1] C. W. S. B. M. S. L. H. M. Z. M. Dysli, Fluorescence lifetime imaging ophthalmoscopy, Progress in

Retinal and Eye Research, Progress in Retinal and Eye Research, 2017.

[2] G. C. a. D. T. E. Barrett, „Amino acids and peptides.,” Cambridge ; New York,, 1998.

[3] W. Becker, „. Advanced time-correlated single photon counting techniques,” Berlin ;, 2005.

[4] W. a. A. B. Becker, „"Lifetime imaging techniques for optical microscopy.",” 2003.

[5] M. Y. a. S. A. Berezin, „"Fluorescence Lifetime Measurements and,” Chemical reviews, 2010.

[6] C. S. F. C. A. T. a. M. K. Bowes Rickman, „"Dry age-related macular degeneration: mechanisms,

therapeutic targets, and imaging.",” Invest OphthalmolVis, 2013.

[7] A. A. M. A. D. E. B. M. Z. N. F. F. J. a. F.-C. Daruich, „"Central serous chorioretinopathy: Recent

findings and new physiopathology hypothesis",” 2015.

[8] F. C. Delori, „ "Spectrometer for noninvasive measurement of intrinsic fluorescence and

reflectance of ocular fundus.",” 1994.

[9] C. S. W. a. M. S. Z. Dysli, „ "Fluorescence lifetime imaging in retinal artery occlusion ",” 2015.

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9]