Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen Nu putem vedea bine dect cu inima; esenialul este invizibil ochilor Antoine de Saint-Exupery (1900

- 1944 ), n romanul Micul Prin

Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen

Fluorescen, luminescen, fosforescen

Anumite combinaii chimice, aflate mai ales n soluie sau n stare solid, n urma excitrii moleculelor cu radiaii din domeniile vizibil i UV apropiat, reemit o parte din energia primit sub form de radiaie luminoas - adesea vizibil. Aceast reemisie se numete fluorescen. Maximul radiaiei de fluorescen este situat de obicei la o valoare a lungimii de und mai mare dect maximul picului radiaiei care a provocat excitarea, diferena de energie corespunztoare transformndu-se n cldur, fiind disipat n mediu. Simplificat, acest fenomen poate fi reprezentat conform schemei din fig. 1.

Excitare Fluorescen

Dezexcitare
Fig. 1. Schema procesului de apariie a fluorescenei. Radiaia incident are lungimea de und mai mic dect cea emis

Dup excitare, intensitatea luminii emise de ctre atomi, F, scade exponenial n timp respectnd o ecuaie de forma: F = I0 e kf t

unde F este radiaia de fluorescen produs de ctre o substan, I0 - intensitatea radiaiei incidente, kf - o constant caracteristic substanei (analog constantei de vitez) iar t - timpul. Trebuie fcut o distincie ntre fluorescen, care corespunde unei scderi rapide a intensitii luminoase emise i fosforescen - la care scderea n timp este cu mult mai lent. De aceea o specie molecular poate fi, deodat, att fluorescent ct i fosforescent. Pe de alt parte, luminescena este tot o reemisie de lumin dar aceasta are la origine energia unei reacii. Aceast energie nu se degaj sub form de cldur (ca n majoritatea cazurilor) ci sub form de energie radiant. De fapt o putem considera ca pe o excitare a electronilor cu ajutorul cldurii de reacie.
Timpul de via a unei specii moleculare excitate, 0, se definete chiar cu ajutorul

constantei de vitez kf din relaia precedent: 0 = 1/kf

Chimie Analitic i Instrumental 155

11

Dup acest timp intensitatea rezidual nu reprezint dect 36.7% din cea iniial adic peste 60% dintre moleculele excitate au revenit la starea neemisiv. De aceea fluorimetria lucreaz n regim staionar - excitarea avnd loc pe tot parcursul msurtorii - pe cnd fosforescena, la care diminuarea intensitii n timp este mult mai lent, se studiaz doar dup ce a ncetat faza de excitare. Fluorescena, riguros vorbind, implic emisia de radiaie prin tranziia ntre dou niveluri care au aceeai multiplicitate (de exemplu singlet la singlet sau triplet la triplet). Dac tranziia are loc ntre dou niveluri de multiplicitate diferit, aceasta poart numele de luminescen. Metodele de analiz bazat pe fluorescen nu sunt general aplicabile oricror substane. Dar, toate metodele analitice bazate pe att pe fluorescen ct i pe i luminescen pe lng c sunt foarte specifice sunt i foarte sensibile. De exemplu, putem aminti c limita de determinare a unei metode fluorimetrice, pentru o anumit combinaie chimic, este de circa 1000 de ori mai cobort dect cea a unei metode prin absorbie n vizibil sau n ultraviolet. De aceea, din aceast categorie de metode exist cteva extrem de utile n analiza i monitorizarea unor poluani ai mediului. Dei am amintit la nceput c fluorescena apare n strile lichid i solid, anumite gaze, de exemplu aflate n atmosfera terestr, pot fi determinate cantitativ prin fluorescena indus de excitarea cu un puls de durat foarte mic (1sec) cu ajutorul unui laser de mare putere (dispozitiv cunoscut sub denumirea de lidar). ntruct nivelul radiaiei de luminescen nu este ntotdeauna foarte ridicat, exist dou tipuri de instrumente diferite: fluorimetre i spectrometre de chemiluminescen. Ultimele iau gsit aplicaii n domeniul analizelor N sau S din materiale precum i n monitorizarea NOx, H2S din aer precum i n studiile, respectiv analizele fenomenelor de mbtrnire a materialelor plastice.

156

Horea Iustin NACU, Lorentz JNTSCHI

Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen

Bazele fizice ale fluorescenei

Din punct de vedere fundamental, fluorescena compuilor moleculari (de interes pentru analiza chimic) se poate nelege ca o absorbie de radiaie UV-VIS urmat de o serie de tranziii energetice ntre ultimii orbitali ocupai, n starea fundamental a moleculei, i primii orbitali externi vacani. Iniial moleculele se afl n repaos, n starea fundamental, notat S0 (fig. 2). Dup absorbia unui foton incident electronii trec n starea S1 - prima stare de tranziie electronic, excitat. Apoi, foarte rapid (10-12s), are loc un proces denumit
conversie intern, prin care moleculele sufer rearanjri, fr a emite fotoni, timp n care

electronii ajung n starea caracterizat prin numrul de vibraie V0 a strii electronice urmtoare, S1. Abia apoi intervin tranziiile de fluorescen (timp de 10-9-10-7s) n urma crora moleculele revin pe unul din nivelele notate V0, V1, ... (stri energetice de vibraie caracterizate fiecare prin numrul de vibraie respectiv, Vi) - aparinnd nivelului iniial S0 [91].
V4 V3 V2 V1 V0 V4 V3 V2 V1 V0

S1

T1
Fosforescen

S0

S0

Fig. 2. Diagrame energetice prezentnd comparativ fluorescena i fosforescena. Sgeile scurte simbolizeaz conversii interne fr emisie de fotoni. S = singlet; T = triplet; V1 V4 = numere cuantice de vibraie i totodat notaii ale strilor de vibraie

Se poate observa (fig. 2) c moleculele pot pstra o parte din energia lor sub form de energie de vibraie. Acest exces de energie urmeaz a fi disipat n mediul nconjurtor prin coliziuni mecanice sau alte procese neradiative cunoscute sub denumirea de relaxare
vibraional. Se mai poate uneori totui produce i o emisie de fotoni, evident mai sraci n

energie, care stau la baza unei fluorescene situate n IR apropiat. Spectrul de absorbie i cel de fluorescen pentru diferii compui prezint (cu o bun aproximaie) o simetrie, unul reprezentnd aproape imaginea n oglind a celuilalt. Cum e i

[91] S0, S1, T1 ... reprezint stri electronice (nivele energetice), iar V0, V1, ...nivele energetice de vibraie caracterizate fiecare de un numr cuantic de vibraie uneori notat tot V0, V1,... . S i T sunt prescurtri amintind sensurile de singlet, respectiv de triplet. Chimie Analitic i Instrumental 157

11

firesc absorbia este situat la lungimi de und mai mici, respectiv n conformitate cu ecuaiile: E = h = hc/, la valori ale energiei, E, mai ridicate (fig. 3).

Fig. 3. Poziiile relative ale absorbiei i fluorescenei n cazul eozinei. Se remarc o zon de lungimi de und comun

Fosforescena, pe lng faptul c nsoete o reacie chimic, analog luminescenei, corespunde i unui mod diferit de revenire la starea fundamental. Dup faza de absorbie o dat cu transferul unui electron pe nivelul S1 (prima stare electronic excitat dup cea fundamental - o stare de singlet) are loc, dac relaxarea vibraional se produce suficient de lent, modificarea spinului electronului la o stare de triplet, notat T1 (fig. 2), ceva mai stabil (metastabil). Din acest motiv, revenirea la starea fundamental este ncetinit, deoarece implic o nou modificare de spin a acestui electron. Ca urmare, durata strii excitate n fosforescen poate fi de 108 ori mai mare dect n fluorescen. Se cunosc cteva reguli privind legtura dintre structura compuilor organici i
y Moleculele organice care nu absorb puternic lumina peste 200 nm n general nu sunt y Moleculele care au banda de absorbie corespunztoare tranziiei: S0S1 (v. fig. 1),
fluorescente.

fluorescena acestora:

localizat la = 250nm i pentru care absorbia luminii se datorete unei tranziii (') sunt
y Substituenii - donori de electroni - grefai pe un sistem -delocalizat mresc ntotdeauna

fluorescente.

absorbia luminii, intensificnd fluorescena. n acest sens, se pot aminti, de exemplu,

y Grupele funcionale puternic atragtoare de electroni (grefate la sistemul ') tind s

funciunile: OH > OR > NH2.

reduc fluorescena moleculei respective. n plus prezena, alturi de acestea, a unor grupri donoare de electroni, tinde s diminueze fluorescena (i nu s o intensifice).

158

Horea Iustin NACU, Lorentz JNTSCHI

Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen

n consecin, moleculele organice care au cel puin dou legturi conjugate i care conin i o band de absorbie la > 200nm, cu un coeficient de absorbie 103Lmol-1cm-1, prezint fluorescen i pot fi analizate fluorimetric. De exemplu, compuii moleculari ciclici cu sisteme conjugate (fig. 4), care mai posed grupri funcionale donoare de electroni, se preteaz foarte bine la acest tip de determinri.

Bifenil O

Fluoren NH2 N

Naftalina OH

Acetofenona Benzen Anilina Oxina Fig. 4. Diveri compui fluoresceni aromatici. Oxina (8-hidroxichinoleina) formeaz combinaii complexe fluorescente cu numeroi ioni metalici

Intensitatea fluorescenei

Semnalul analitic n fluorimetrie l constituie intensitatea fluorescenei, F. Valoarea acesteia depinde att de poziia punctului de unde este emis radiaia ct i de poziiile fantelor de intrare i ieire din celula de msur. Astfel, o parte a radiaiei incidente (excitante) este absorbit de ctre lichidul din celul nainte de a atinge punctul de emisie iar o parte a radiaiei de fluorescen, o dat emise, este absorbit de aceeai soluie, nainte ca aceasta s prseasc celula. Asadar, intensitatea radiaiei de fluorescen care atinge detectorul corespunde unui volum de soluie relativ mic prezent n spaiul delimitat de proieciile ferestrelor de intrare i ieire din celul. Fenomenul de diminuare a intensitii luminoase - numit impropriu filtrare intern se datorete mai ales suprapunerii pariale a spectrelor de fluorescen i de absorbie (fig. 3). n afar de absorbia propriu zis, denumit i diminuare prin culoare, mai pot interveni transferuri de energie de la molecule excitate la alte molecule sau la ioni strini din celul, n urma unor coliziuni sau formri de compleci. Acest fenomen se numete diminuare chimic. De exemplu, prezea oxigenului atmosferic provoac o diminuare suplimentar de fluorescen. De aceea, pentru soluii, se definete o mrime denumit randamentul fluorescenei, f, cuprins ntre 0 i 1 - un parametru independent de intensitatea sursei:
Chimie Analitic i Instrumental 159

11

f = (Numrul de fotoni emii)/(Numrul de fotoni absorbii)

(1)

Se poate observa c aceast mrime reprezint fracia radiaiei incidente absorbite, care este reemis sub form de fluorescen. Cu ajutorul acesteia, n soluii diluate, se poate scrie o ecuaie a intensitii fluorescenei, F. n primul rnd trebuie s se in cont de factorii care determin absorbana, A, ct i de lungimea, notat cu b, a parcursului radiaiei de fluorescen prin celul. n consecin expresia intensitii fluorescenei se poate scrie: F = fI0Ab lungimea parcursului radiaiei de fluorescen prin celula de msur. nlocuind A avem: F = fI0lbC respectiv de soluie, ntr-o singur constant, K, obinem o ecuaie mai simpl: F = KI0C (4) Pe baza acestei ecuaii se poate gsi experimental o curb de etalonare n coordonatele F, C care este o dreapt (fig. 5 - stnga). Desigur c aceasta este valabil doar n soluii diluate, ntruct s-a constatat c poate suferi modificri accentuate la concentraii superioare (fig. 5 - dreapta) tocmai din cauzele amintite. F log(F) (3) unde C este concentraia molar a soluiei. nglobnd toate constantele care depind de celul, (2) unde cu I0 s-a notat intensitatea radiaiei incidente, A - absorbana soluiei (A = lC) iar b -

C log(C) -5 10 510 -5 -4 -3 -2 Fig. 5. Relaia liniar dintre intensitatea fluorescenei, F, i concentraia C. Domeniul liniar este relativ ngust iar la concentraii ridicate liniaritatea dispare
-5

160

Horea Iustin NACU, Lorentz JNTSCHI

Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen

Aparatura

Deoarece proba spus analizei emite radiaia de fluorescen n toate direciile, pe fotodioda sau fotomultiplicatorul instrumentului folosit cad doar radiaiile care vin n direcia acestuia, n timp ce restul se pierd. De aceea suprafaa senzorului care preia radiaia trebuie s fie ct mai mare. n general se msoar radiaia care prsete celula sub un unghi de 90
fa de radiaia incident. Pentru soluii cu absorban ridicat studiul se poate realiza i n

prelungirea fascicolului incident. Pentru soluii semiopace se preconizeaz o observare sub un unghi variabil ntre 90-180. Geometria fluorimetrelor poate fi sintetizat prin schema din fig. 6.
Surs Monocromator (1) - de excitare Celul
Unghiul: 90-180

Monocromator (2) F Detector - de emisie Fig. 6. Geometria unui spectrofluorimetru actual; unghiul preferat de observare a fluorescenei este 90; F = fanta Sursele optice ale fluorimetrelor actuale emit un spectru luminos continuu. Au devenit

y Lmpile cu arc de deuteriu (190-400nm), y Lmpile cu arc de xenon (200-850nm),

uzuale urmtoarele lmpi folosite n calitate de surse:

y Lmpile cu arc de wolfram (380-700nm).

Se mai utilizeaz i lmpile cu vapori de mercur care produc linii spectrale intense (la 254, 313 i 365nm). Acestea, pot fi izolate individual folosindu-se nite simple filtre optice. De asemenea au mai aprut surse cu laser heliu-cadmiu (325nm, 5-10mW) care de asemenea necesit un filtru optic i impun folosirea unor fotomultiplicatori. Constructiv se pot distinge dou tipuri de fluorimetre: (1) bazate pe determinarea raportului fluorescenelor i (2) spectrofluorimetre.
Fluorimetrele bazate pe determinarea raportului fluorescenelor (fig. 7) dup ce

selecteaz radiaia excitant optim, gsit prin ncercri preliminare, radiaia incident este desprit, de o oglind semitransparent, n dou raze: una care cade pe prob (aflat n celula de msur) iar cealt pe o fotodiod. Din celula de msur iese radiaia de fluorescen, care se observ la un unghi de 90 fa de cea incident. Un al doilea monocromator, denumit
de emisie, selecteaz radiaia dorit, de regul cea mai intens. Proba poate fi nlocuit cu un

etalon metrologic pentru reglaje. Folosirea celor dou fotodiode n opoziie elimin fluctuaiile de intensitate inerente oricrei surse bazate pe arc electric. Calculul concentraiei
Chimie Analitic i Instrumental 161

11

necunoscute se face pe baza ecuaiei F = KI0C n care KI0 este o constant pentru orice pereche de valori C, F. Rezult: Cnec Cet Fnec Fet

unde Cnec este concentraia probei necunoscute, Inec - intensitatea fluorescenei probei necunoscute, Cet - concentraia probei etalon, cunoscute i Iet - intensitatea fluorescenei pentru proba etalon - cunoscut.

Surs de xenon Oglind semitransparent Monocromator -1 Fotodiod1 Monocromator -2 Calcul raport Rezultat, F Referin Prob

Fotodiod2

Fig. 7. Schema unui spectrofluorimetru cu doi detetectori care elimin deriva sursei Spectrofluorimetrele permit, pe lng cele amintite anterior la fluorimetre, obinerea

unor spectre de fluorescen. Fiecare din cele dou monocromatoare baleiaz ntreg domeniul spectral. Pentru fiecare valoare a radiaiei excitante exist un spectru de fluorescen separat. Pentru tot domeniul se obine o familie de spectre care caracterizeaz n mod unic o combinaie chimic sau un material fluorescent. Cu ajutorul acestora se pot seleciona condiiile optime de lucru pentru o determinare de rutin.

162

Horea Iustin NACU, Lorentz JNTSCHI

Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen

Aplicaii

Exist un numr mic de molecule care posed o fluorescen natural. Acestea pot fi analizate cantitativ prin fluorimetrie dac se dispune de substana pur (etalon). Numrul acestora este foarte mic (5-8% din total). Pe de alt parte, aa cum exist reactivii de culoare, exist i o serie de reactivi de fluorescen care duc, n urma unei reacii chimice, la produi fluoresceni. Din primul grup de metode amintim analiza hidrocarburilor policiclice aromatice din ape, n urma separrii acestora prin cromatografie. Tot n categoria acestui prim grup intr i determinarea aflatoxinelor - nite ageni cancerigeni prezeni n alimente dar i o serie de alte substane importante cum ar fi steroizi i vitamine. Din a doua grup de metode amintim determinrile unor cationi metalici cum ar fi Be2+ cu reactivul morin sau unii compleci ai metalelor trivalente cu oxina (8-oxichinoleina).

Determinarea dioxidului de sulf (SO2) prin fluorimetrie n UV

Se bazeaz pe excitarea moleculelor de SO2 din prob cu o lamp UV pulsatorie (avnd o frecven de 20kHz) cu < 214nm. Moleculele de SO2 emit prin excitare o fluorescen cu lungimea de unda de 214nm, foarte specific. Aceast metod st la baza celor mai performanre analizoare de SO2 permind determinarea 1ppb n aer. Mai mult, folosindu-se cuptoare de conversie oxidative prin care H2S este convertit la SO2 se pot construi analizoare att pentru SO2 ct i pentru H2S. O scem de principiu a analizorului pentru SO2 prin fluorescen n UV este prezentat n fig. 8.
Prob Lamp UV Evacuare

SO2
Filtru primar

Fotodetector de control Filtru secundar (214 nm) Semnal

Fotomultiplicator

Fig. 8. Schema de principiu a analizorului pentru dioxid de sulf bazat pe fluorescen n UV

Chimie Analitic i Instrumental

163

11

Chemiluminescena

Exist reacii chimice care sunt nsoite de emisie luminoas. O astfel de substan este luminol-ul care poate reaciona cu ferul (II) i permite punerea n eviden a unor concentraii mici din acest element. O astfel de reacie este i cea utilizat pentru determinarea monoxidului de azot, NO n amestec cu dioxidul de azot, NO2. Aceti oxizi rezult prin arderea combustibililor la temperaturi ridicate n prezena azotului din aer i constituie poluani ai aerului. Metoda are la baz reacia de oxidare a NO cu ozon rezultnd, ntr-o prim faz, NO2* (adic o form excitat a dioxidului de azot) - o specie chimic luminescent. Pentru determinarea compoziiei amestecului NO plus NO2 se procedeaz astfel. Pe o fraciune cunoscut din proba de aer (1 pe fig. 8) tot dioxidul de azot este redus la monoxid i n urma reaciei cu ozonul se determin NO + NO2. Pe o alt fraciune, (2), se determin prin aceeai metod doar NO (NO2 prezent, nefiind n stare excitat, nu prezint luminescen). Apoi, prin diferen se determin NO.
Evacuare

Aer pur Uscare (pe sit molecular)

Generator Ozon (O3)

NOx
(2) (1)

Etalon NOx
Prob V

Microprocesor
Mo Convertiz or

Filtru

NO

NOx
NOx

Fig. 8. Reprezentarea schematic a utilizrii metodei msurrii luminescenei pentru monitorizarea oxizilor de azot din aer

Un astfel de monitor NOx este prezentat schematic n fig. 8. Proba de aer este n prealabil filtrat pe un filtru i se desparte prin dou conducte. Pe drumul (1) exist o etuvconvertizor care conine o coloan umplut cu pulbere de molibden. La nclzire, Mo din coloan provoac reducerea doar pentru dioxidul de azot: NO2 + Mo NO + MoO3 Deci, pe drumul (2) gazul rmne nemodificat iar pe drumul (1) amestecul este convertit integral la NO. Apoi, fraciunile (1) i (2) intr n cele dou celule de luminescen,
164 Horea Iustin NACU, Lorentz JNTSCHI

Fluorimetria i spectrometria de chemiluminescen

ambele alimentate cu ozon (O3) - produs de un ozonizator (inclus n instalaie). n celule au loc exact aceleai reacii: NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + h Luminescena este emis doar de dioxidul de azot proaspt obinut (fiind n stare excitat - notat *), aprut prin reacia amintit anterior, avnd lungimea de und = 1.2m (1200nm), situat n infraroul apropiat. Semnalele de la cele dou celule ajung alternativ la blocul fotomultiplicator B - durata fiind determinat de poziia chopper-ului (notat C). O perioad de timp se nregistreaz semnalul din celula NOx i o alt perioad, cel din celula NO (fig. 8). De aici semnalul este preluat de un microprocesor i transformat n concentraie rezolvndu-se ecuaia: F = KCNO (5) Pentru a se putea determina concentraia NO, pe baza semnalului F msurat, este necesar cunoaterea prealabil a valorii K. Aceast constant se determin, nainte de analiz, prin introducerea n cele dou celule a unui gaz-etalon, format din aer i un amestec cunoscut de NO + NO2 - coninut ntr-un cilindru sub presiune, legat la aparat. Dup evaluarea K se determin pe o prob necunoscut concentraia CNO i separat, CNO + CNO2 (notat in mod uzual NOx - fig. 8). n final, prin diferen se determin CNO2. Metoda servete att pentru monitorizarea NO i NO2 din aer ct i la determinri ale coninutului de azot cu ajutorul unor analizoare specializate de azot i sulf. n acestea din urm sulful se determin tot printr-o reacie de luminescen i tot n prezena ozonului: O3 + H2S H2O + SO2*; SO2* SO2 + h (luminescen n UV apropiat)

Chimie Analitic i Instrumental

165