EXTINCŢIA FLUORESCENŢEI UNEI SOLUŢII DE

FLUORESCEINĂ PRIN IONI DE IOD

Anumite substanţe au proprietatea de a emite lumină dacă sunt expuse la o sursă de lumină.
Acest fenomen se numeşte luminescenţă. După durata de emisie a radiaţiei distingem:
 fosforescenţa - luminescenţa care durează un timp după excitaţie (de ordinul minutelor sau
chiar orelor);
 fluorescenţa – luminescenţa care dispare imediat ce sursa de excitare încetează să mai
acţioneze asupra substanţei, denumită în acest caz fluorofor.
Mecanismul procesului de fluorescenţă este prezentat în figura 1. O moleculă poate exista în
stări electronice de energii diferite, din care cea mai stabilă (energie minimă) este starea
electronică fundamentală, notată cu S0, iar stările excitate de singlet, superioare ca energie,
notate cu S1, S2 ....., sunt instabile. Pentru fiecare nivel electronic, corespund mai multe nivele
energetice de vibraţie, caracterizate de numerele cuantice de vibraţie (nv) 0, 1, 2, 3... . La
temperatura camerei cele mai multe molecule se găsesc pe nivelul vibrațional cu nv=0 al stării S0.
Dacă moleculele sunt excitate (expuse la o sursa de lumină din domeniul UV-viz), ele pot să
absoarbă energie radiantă și să treacă astfel pe unul din nivelele vibraţionale ale stărilor S1 sau S2,
în funcţie de energia cuantei de lumină absorbite. Dacă au ajuns în starea S2, foarte instabilă,
moleculele trec rapid pe un nivel vibraţional superior al stării S1. Acest proces neradiativ (fără
emisie de fotoni), rapid (10-10s), care presupune tranziţia între două stări cu acelaşi spin (în cazul de
faţă stări singlet, în care toți electronii sunt împerecheați), se numeşte conversie internă (C.I.).
Odată ajunse pe unul din nivelele vibraţionale superioare ale stării S1 (nv0), moleculele vor pierde
energie neradiativ şi vor suferi o tranziţie pe nivelul cu nv= 0 al stării S1. Acest proces neradiativ
între două nivele vibraţionale ale aceleiaşi stări electronice, pus pe seama ciocnirilor dintre
moleculele în stare excitată şi moleculele de solvent, se numeste relaxare vibrațională (R.V.).
Starea S1 este însă de asemeni instabilă, astfel încât de pe nivelul nv= 0 al stării S1 moleculele vor
suferi o tranziţie pe diferite nivele vibraţionale ale stării S0. Acest proces de dezexcitare, S1-S0,
poate avea loc radiativ (cu emisia unui foton) sau neradiativ (conversie internă). Procesul radiativ,
însoţit deci de emisia unui foton şi care presupune tranziţia S1  S0 se numeşte fluorescenţă. De
aici se desprind câteva concluzii:
 1. Prin absorbţie de radiaţie electromagnetică de diferite lungimi de undă, o moleculă poate
ajunge într-una din stările electronice excitate singlet S1, S2, …; astfel, spectrul de absorbţie va fi
alcătuit din mai multe benzi, notate S0S1, S0S2, ….
2. Emisia are loc numai din prima stare excitată, S1; spectrul de emisie va fi alcătuit dintr-o
singură bandă, banda S1S0.
3. Prima stare excitată singlet se poate dezactiva atât radiativ, cât şi neradiativ; astfel numărul
fotonilor emişi va fi mai mic sau cel mult egal cu numărul fotonilor absorbiţi. De asemeni, ea fiind
instabilă, are un timp de viaţă scurt, de ordinul a 10-7-10-12 s.

nv=2
R.V.
nv=1
nv=0 C.I.
S2

R.V. nv=2
nv=1

S1 nv=0

absorbtie fluorescenţa

nv=2
nv=1
S0 nv=0

Fig. 1 Diagrama Jablonski: Mecanismul emisiei de fluorescență.

Legendă: săgeti drepte-procese emisive, săgeți șerpuite-procese neemisive

După cum se observă din figura 1, deoarece absorbţia şi emisia au loc între diferite nivele
vibraţionale ale stărilor S0 şi S1, numai tranziţiile între nivelele vibraţionale de zero (nv=0), au
aceeaşi energie, pentru toate celelalte tranziţii energia cuantei absorbite este mai mare decât energia
cuantei emise. Indiferent de frecvenţa radiaţiei absorbite (abs), spectrul de fluorescenţă va consta

dintr-o bandă de fluorescenţă poziţionată la frecvenţe (şi energii) mai mici decât cele absorbite (f),

2
deci lungimi de undă mai mari (figura 2). În plus, spectrul de emisie se prezintă ca imaginea în
oglindă a primei benzi din spectrul de absorbţie.

Absorbtie Fluorescenta →λ

Fig. 2. Dispunerea spectrelor de absorbţie şi emisie în funcţie de lungimea de undă.

Eficienţa emisiei fluorescente este măsurată de randamentul cuantic de fluorescenţă. Prin

randament de fluorescenţă () se înţelege raportul între numărul de fotoni emişi şi numărul de
fotoni absorbiţi de substanţă, indiferent de lungimea de undă.
nr. fotoni emisi
 = (1)
nr. fotoni absorbiti
Datorită proceselor de dezactivare neradiativă care determină ca numărul de fotoni emişi să
fie mai mic decât numărul de fotoni absorbiţi, randamentul de fluorescenţă este subunitar. El este,
de asemenea, proporțional cu aria benzii de fluorescență.
O serie de factori cum ar fi temperatura, concentraţia, prezenţa unor impurităţi pot duce la
micşorarea randamentului de fluorescenţă, proces care este denumit stingere a fluorescenței. Astfel
stingerea fluorescenţei prin mărirea concentraţiei, denumită autostingere, se datorează fie unor
procese de emisie urmată de absorbţia radiaţiei de către molecule aflate în stare fundamentală, fie
unor asocieri moleculare. Pentru a evita autostingerea, concentrația probelor cărora li se măsoară
spectrul de fluorescență trebuie să fie relativ mică, de ordinul 10-5 – 10-6 M.
Micşorarea randamentului de fluorescenţă datorită prezenţei unor substanţe străine are loc ca
urmare a unui transfer de energie de la molecula excitată de fluorofor la “impuritate” prin ciocnire.
Impuritatea poartă denumirea de stingător şi eficienţa stingerii depinde de concentraţia sa. Dacă 

3
este randament de fluorescenţă în absenţa stingătorului şi Q în prezenţa sa, este valabilă ecuaţia
liniară Stern-Volmer:


 1  k[Q] (2)
Q

unde: [Q] este concentraţia stingătorului, τ este timpul de viaţă al speciei fluorescente, iar k este
constanta de viteză a procesului de stingere.
În cazul în care stingătorul nu modifică spectrul de emisie, randamentul de fluorescenţă este
proporţional cu intensitatea fluorescenţei, iar ecuaţia (2) se scrie:
I
 1  k[Q] (3)
IQ

În cele mai multe dintre cazuri, stingerea, care poate fi asimilată cu o ciocnire, urmează un
mecanism de transfer de energie controlat de difuzie, adică stingerea este un proces foarte rapid,
astfel că etapa determinantă de viteză este difuzia celor două molecule, de fluorofor şi de stingător,
în soluţie. Atunci constanta procesului de stingere este egală cu constanta de difuzie, care poate fi
calculată conform ecuaţiei:

8RT
k= (4)
3
unde R-constanta gazelor , T temperatura absolută, iar  este vâscozitatea solventului exprimată în
Poise.
Reprezentarea grafică a raportului I / IQ funcţie de [Q] , permite ca din panta dreptei obţinute
(tg  = k ) să se determine timpul de viaţă  al speciei excitate.

Modul de lucru

În această lucrare se va examina influenţa ionilor de iod asupra fluorescenţei unei soluţii de
fluoresceină, având ca scop determinarea timpului de viaţă al stării excitate a fluoroforului
(fluoresceina). Măsurătorile se fac la concentrație constantă de fluoresceină și la concentrații
crescătoare de ioni iodură. Se va măsura intensitatea fluorescenţei unor soluţii de aceeaşi
concentrație de fluoresceină (4 x 10-5 M), dar de diferite concentraţii ale ionilor de iod: 0,30 N; 0,20
N; 0,15 N; 0,1 N; 0,05 N; 0,005N.
La prepararea soluţiei s-a folosit o soluţie tampon care asigură acelaşi grad de disociere a
substanţei fluorescente în soluţie, având în vedere că în cazul fluoresceinei numai anionul este
fluorescent.
4
 +
H- O O OH
O O OH

pK 2.2 pK 4.4

   
COOH COOH

cation forma neutra anion

 Se înregistrează spectrul de fluorescență la spectrofluorimetrul Jasco. În programul

Spectra Measurement se alege Measure/Parameters. Se fixează parametrii de
lucru: lungimea de undă a luminii excitatoare, λex=470 nm, domeniul de înregistrare
480-650 nm. Pentru înregistrarea spectrului se alege Measure/Sample measurement.
 În programul Spectra Analysis se măsoară cu ajutorul cursorului intensitatea la
maximul benzii de fluorescenţă și lungimea de undă la care apare banda.
 Se repetă măsurătoarea pentru toate soluțiile de lucru, în ordinea creșterii concentrației
iodurii de potasiu. Se notează intensitatea la maxim (maximul benzii nu se deplasează).
 Se face raportul între intensitatea relativă a soluţiei de fluoresceină fără stingător şi
intensităţile soluţiilor cu stingător (ioni de iod), obţinându-se în acest mod raportul
(I/IQ ).
 Se reprezintă grafic I/IQ în funcţie de concentraţia ionilor de iod şi din panta dreptei
obţinute se determină timpul de viaţă al fluoresceinei.
Vâscozitatea soluţiilor la diferite temperaturi este:
tC  (Poise)
20 0,01
25 0,00894
40 0,00653
50 0,00550
60 0,00466

1 Poise = 10-1 Pas = 10-1 Kgm-1s-1

R = 8,31107 ergmol-1K-1
1 erg = 10-7 J
Întrebări şi exerciţii
1. Care sunt procesele fotofizice pe care le suferă o moleculă după excitare?
2. Care sunt asemănările şi deosebirile între procesul de conversie internă şi relaxarea vibraţionala.
3. Indicaţi care este ordonata la origine în cazul unei reprezentări grafice Stern-Volmer.