DETERMINAREA FIERULUI DIN FLUIDE

BIOLOGICE (SIDEREMIA) PRIN METODA

SPECTROMETRICĂ CU
1, 10 FENANTROLINĂ

Scopul lucrǎrii
Lucrarea constǎ în determinarea conţinutului total de fier în probe
biologice. Metoda descrisǎ este aplicabilǎ la concentraţii de ioni de fier de
0,2-5,0 mg/dm3, iar prin concentrarea probelor biologice sau diluarea lor
corespunzǎtoare se pot determina cantitǎţi de fier mai mici sau mai mari
decât acest domeniu. Eroarea metodei este de maximum 5%.

1. Generalităţi
Cantitatea totală de fier din organism diferă ȋn funcţie de vȃrstă şi
sex. Nou-născuţii la termen au ~75 mg Fe/kgc provenit ȋn principal de la
mamă ȋn timpul trimestrului al treilea de sarcină. Depozitele de fier scad ȋn
timpul perioadei de creştere. După adolescenţă nevoia de fier scade, bărbaţii
prezentȃnd o creştere graduală a depozitelor de fier pe parcursul vieţii (au un
minim de 50 mg Fe/kgc). Ȋn schimb, femeile prezintă o pierdere continuă de
fier pȃnă la menopauză (au ~35 mg Fe/kgc); după menopauză femeile
acumulează fier, ȋntr-un mod liniar, ajungȃnd la un nivel asemanător
bărbaţilor.
Cea mai mare parte a fierului din organism se gaseşte ȋn compuşii
hem, ȋn special hemoglobina şi mioglobina. O cantitate foarte mică este
conţinută ȋn enzimele care utilizează fierul ȋn schimbul de electroni:
peroxidaze, catalaze şi ribonucleotid reductaze. Cea mai mare parte a
fierului non-hemic este depozitat sub formă de feritină sau hemosiderina ȋn
macrofage şi hepatocite. Numai o fracţiune foarte mică (~0,1%) circulă ȋn
plasmă sub formă de Fe3+ legată de o proteină de transport – transferina.
Fierul este absorbit din intestinul subţire proximal sub formă de fier
hemic şi fier feros (Fe2+), absorbţia sa fiind influenţată de aciditatea gastrică,
factori potenţiatori şi inhibitori alimentari. Absorbţia se realizează prin
intermediul unor proteine transportoare şi cu ajutorul unor enzime:
ferireductaza, care converteşte Fe3+ din alimente ȋn Fe2+ pentru transferul ȋn
celulele mucoasei intestinale, şi o ferioxidază (hefaestina), care converteşte

1
Fe2+ ȋn Fe3+ la nivelul membranei bazolaterale, pentru transferul plasmatic.
Deoarece organismul uman nu posedă un mecanism fiziologic de
eliminare a excesului de fier, absorbţia acestuia este foarte bine controlată,
elementul cheie fiind hepcidina cu rol reglator negativ asupra fierului
plasmatic, avȃnd ca efect scăderea eliberării de fier din enterocit şi din
celulele sistemului reticulo-endotelial. Sinteza de hepcidină este stimulată
de inflamaţie sau atunci cȃnd depozitele de fier ale organismului sunt
saturate. Hipoxia ca şi creşterea necesarului de fier pentru eritropoeza inhibă
sinteza hepatică a hepcidinei. Afectarea mecanismului reglator al hepcidinei
- respectiv a moleculelor semnal ce intervin ȋn stimularea sau inhibarea
sintezei acesteia – are rol ȋn patogeneza unor afecţiuni datorate tulburărilor
metabolismului fierului (anemia feriprivă, hemocromatoza ereditară,
ȋncarcarea cu fier din eritropoieza ineficientă, anemia asociată cu infecţii şi
inflamaţii, anemia din boli cronice).
Excreţia de fier are loc prin pierderile celulare la nivel
gastrointestinal, cutanat, urinar şi pierderile menstruale la femeie. Cea mai
mare parte a fierului funcţional din organism provine din reutilizarea fierului
deja existent provenit din eritrocitele senescente distruse la nivelul
sistemului reticuloendotelial, ȋn principal din splină.

2. Recoltare
Recomandări pentru determinarea sideremiei se realizează ȋn
principal ȋn:
- diagnosticul diferenţial al anemiilor;
- evaluarea anemiei feriprive, talasemiei, anemiei sideroblastice;
- diagnosticul supraȋncărcării cu fier şi hemocromatozei;
- diagnosticul intoxicaţiei cu fier.
Pregătirea pacientului se realizează astfel:
- dimineaţa (cȃnd valorile sideremiei sunt cele mai mari);
- ȋnaintea administrării de preparate de fier/transfuzii de sȃnge;
- dacă pacientul a fost transfuzat, determinarea sideremiei se face
după 4 zile.
Recoltarea se realizează din sȃnge venos, ȋntr-un recipient de
recoltare - vacutainer fără anticoagulant cu/fară gel separator. După
recoltare, se separă serul prin centrifugare cȃt mai repede posibil (1÷2 ore).
Volumul de probă - minim 0,5 mL ser, iar cauzele posibile de respingere a
probei sunt de specimen hemolizat.

2
 Proba este stabilă după separarea serului, astfel serul separat este
stabil: 7 zile la 15÷25 °C; 3 săptămȃni la 2÷8 °C; cȃţiva ani la temperturi de
(-15)÷(-25) °C.

3. Valori critice
Tabelul
Valorile de referinţă a concentraţiilor de fier
Varsta Valori (mg/dL)
Barbati Femei
<1 luna 32 - 112 29 - 127
1-12 luni 27 - 109 25 - 126
1-3 ani 29 - 91 25 - 101
4-6 ani 25 - 115 28 - 93
7-9 ani 27 - 96 30 - 104
10-12 ani 28 - 112 32 - 104
13-15 ani 26 - 110 30 - 109
16-18 ani 27 - 138 33 - 102
>18 ani 59 - 158 37 -145

Notă: Factori de conversie: µmol/L⋅5,59 = µg/dL; µg/dL⋅0,179 = µmol/L.

4. Metoda de analiză

4.1. Principiul lucrării

Se adaugă la proba de analizat o soluţie de 1,10-fenantrolină și se
măsoară absorbanța complexului colorat în roșu oranj la lungimea de undă
de 510 nm.
Pentru dozarea fierului total şi a fierului total dizolvat este necesară
adăugarea de clorhidrat de hidroxilamină pentru a reduce fierul (III) la fier
(II). Dacă sunt prezenţi compuşi nedizolvaţi ai fierului, ca oxizi sau
complecşi de fier este necesară pretratarea probelor. Pentru solubilizarea
acestor compuşi (a se vedea 4.3.1.2).
Complexul fier (II)-1,10-fenantrolină este stabil ȋn intervalul de pH
2,5...9, iar intensitatea coloraţiei lui este proporţională cu cantitatea de fier
(II) prezentă. Relaţia dintre concentraţie şi absorbanţă este liniară pȃnă la
concentraţii de 5 mg Fe/L. Absorbanţa maximă se situează ȋn jurul a 510 nm
[coeficientul de absorbţie molară este de 11⋅10-3 L/(mol·cm)].

4.2. Reactivi şi aparatură

- Acid sulfuric ρ = 1,84 g/mol;

3
- Acid sulfuric, soluţie C(1/2 H 2 SO 4 ) aprox. 4,5 mol/L. Se adaugă treptat
şi agitȃnd energic, 1 volul de acid sulfuric (ρ = 1,84 g/mol) la 3 volume
de apă, răcind tot timpul;
- Acid azotic, concentrat ρ = 1,40 g/mL;
- Acid clorhidric soluţie ρ = 1,12 g/mL, C HCI aprox. 7,7 mol/L;
- Tampon acetat - Se dizolvă 40 g acetat de amoniu (CH 3 COONH 4 ) ȋn
apă, se adaugă 50 mL acid acetic glacial (CH 3 COOH) (ρ = 1,06 g/mL) şi
se completează la 100 mL cu apă;
- Clorhidrat de hidroxilamina, soluţie 100 g/L. Se dizolvă 10 g clorhidrat
de hidroxilamină (ClH 4 NO) în apă şi se completează la 100 mL cu apă.
Această soluţie este stabilă o saptămȃnă;
- 1,10-Fenantrolină soluție. Se dizolvă 0,5 g clorură de 1,10-fenantrolină
monohidrat (C 12 H 9 ClN⋅H 2 O) şi se completează la 100 mL cu apă. Ca o
alternativă, se dizolvă 0,42 g 1,10-fenantrolina monohidrat (C 12 H 9 ClN⋅
H 2 O) ȋn 100 mL apă care conţine 2 picături de soluţie de acid clorhidric
(ρ = 1,12 g/mL). Soluţia este stabilă o săptămȃnă dacă se păstrează la
întuneric;
- Peroxidisulfat de potasiu, soluţie 40 g/L. Se dizolvă 4 g peroxidisulfat de
potasiu (K 2 S 2 O 8 ) în apă şi se completează la 100 mL. Această soluție
este stabilă mai multe săptamâni dacă este păstrată la temperatura
ambiantă într-o sticlă brună;
- Fier, soluție mamă corespunzătoare la 0,10 g Fe/L. Într-un balon cotat de
500 mL se introduc 50 g fir de fier (puritate 99,99 %). Se adaugă 20 mL
apă, 5 mL sotuţie de acid clorhidric (4,5 mol/L) și se încălzește ușor
pentru a se dizolva. Se răcește și se completează la semn, cu apă. 1 mL
soluţie conține 0,10 mg fier. Această soluție este stabilă cel puțin o lună
dacă este păstrată într-un flacon de sticlă sau de material plastic. Pot fi de
asemenea folosite alte soluții standard de fier comercializate;
- Fier, soluție etalon I, corespunzător la 20 mg Fe/L. Într-un balon cotat de
500 mL se introduc 100 mL soluție mamă și se completează cu apă până
la semn. Se prepară în ziua folosirii;
- Fier, soluție etalon II, corespunzător la 1 mg Fe/L. Într-un balon cotat de
500 mL se introduc 5 mL soluţie etalon și se completează cu apă la semn.
Se prepară în ziua utilizării;

Aparatură - Înaintea folosirii, toată sticlăria și flacoanele de prelevare

trebuie să fie spălate cu acid clorhidric (ρ = 1,12 g/mL) și apoi clătite cu
apă.
- Spectrometru, cu prismă sau cu rețea, adecvat pentru măsurări la 510 nm;

4
- Cuve fotometrice, cu drumul optic de cel puţin 10 mm, corespunzătoare
domeniului de absorbanță a probei;
- Filtru de membrană cu dimensiunile porilor mai mici de 0,45 μm;
- Vas pentru oxigen (vas Winkler) cu capacitatea de 100 mL.

4.3. Modul de lucru

4.3.1. Fier total

4.3.1.1 Determinare directă

Se iau pentru analiză 50 mL probă acidulată: imediat dupa prelevare,
se acidulează proba la pH=1. În general pentru 100 mL probă este suficient
1 mL acid sulfuric concentrat (ρ = 1,84 g/mol). Dacă este necesar, se
ajustează pH-ul adăugând acid sulfuric concentrat (4,5 mol/L) și ținând
seama în calcul, de volumul adăugat.
Dacă proba conține fier nedizolvat, oxizi de fier sau complecși de
fier, se transvazează proba de analizat într-un flacon de 100 mL și se face
următoarea pretratare.
Oxidare - Se adaugă 5 mL soluţie de peroxidisulfat de potasiu și se
fierbe ușor timp de 40 min, asigurându-se că volumul să nu scadă sub 20
mL. Se răcește și se transvazează într-un balon cotat de 50 mL și se aduce la
semn cu apă.
NOTA – Amestecul poate fi de asemenea pus ȋn autoclavă într-un balon de
100 mL cu dop, timp de 30 min, apoi răcit și diluat la 100 mL. În calculul
rezultatelor se ţine seama de această diluție, înmulțind rezultatul cu 2.
Dacă după oxidare soluția este tulbure, se filtrează imediat pe filtru
de membrană într-un balon cotat. Se spală filtrul cu o cantitate mică de apă,
adaugând apele de spălare la filtrat și completând cu apă până la semn.
Reducerea la fier (II) - Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă
de 100 mL se adaugă 1 mL soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, și se agită
energic. Se adaugă 2 mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprins între
3,5 și 5,5, de preferat 4,5.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 min. Apoi, se măsoară absorbanța soluţiilor cu
un spectrometru la 510 nm, utilizând apă în cuva de referință.

5
4.3.1.2 Fier total după mineralizare
Într-un balon cotat de 100 mL se introduc 50 mL probă acidulată
(imediat dupa prelevare, se acidulează proba la pH=1. În general pentru 100
mL probă este suficient 1 mL acid sulfuric concentrat (ρ = 1,84 g/mol).
Dacă este necesar, se ajustează pH-ul adăugând acid sulfuric concentrat (4,5
mol/L) și ținând seama în calcul, de volumul adăugat, se adaugă 5 mL acid
azotic, 10 mL acid clorhidric și se încălzește amestecul la (70…80 °C) până
la dizolvarea completă. După circa 30 min se adaugă 2 mL acid sulfuric (ρ =
1,84 g/mol) și se ține pe o sursă de căldură până la apariția vaporilor albi
denși de anhidridă sulfurică. Se recomandă evitarea evaporării până la sec.
Se răcește la temperatura ambiantă, se adaugă 20 mL apă, transvazând
cantitativ într-un baton cotat de 50 mL şi se completează la semn.
Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă de 100 mL se adaugă 1
mL soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, și se agită energic. Se adaugă 2
mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprin între 3,5 și 5,5, de preferat
4,5.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 minut, apoi se măsoară absorbanța soluţiilor cu
un spectrometru la 510 nm, utilizând apă în cuva de referință.

4.3.2. Determinarea fierului dizolvat

Se ia o proba de apă de analizat de 50 mL (imediat după prelevare şi
se filtrează proba. Se acidulează filtratul la pH=1 (ȋn general este suficient 1
mL acid sulfuric (ρ = 1,84 g/mol) pentru 100 mL probă) și se trece într-un
balon cotat de 100 mL.
Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă de 100 mL se adaugă 1
mL soluţie de clorhidrat de hidroxilamină, și se agită energic. Se adaugă 2
mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprins între 3,5 și 5,5, de preferat
4,5.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 min. Apoi, se măsoară absorbanța soluţiilor cu
un spectrometru la 510 nm, utilizând apă în cuva de referință.

4.3.3. Determinarea fierului (II)

Într-un balon cotat de 100 mL se introduc 50 ml probă. Se introduce
1 mL acid sulfuric (ρ = 1,84 g/mol) într-un vas pentru oxigen cu capacitatea

6
de 100 mL şi se umple exact cu proba de apă. Se evită orice contact inutil cu
aerul.
Se transvazează cantitativ soluția într-o fiolă de 100 mL. Se adaugă 2
mL tampon acetat pentru a obține un pH cuprin între 3,5 și 5,5, de preferat
4,5.
Atenţie! Fără adăugare de hidroxilamină.
Notă - Reducerea fierului (III) la fier (II) are loc cel mai bine la pH = 1.
Soluția tampon trebuie deci adaugată ulterior.
Se adaugă câte 2 mL soluție 1,10 fenantrolină fiecărei soluții și apoi
se păstrează la ȋntuneric 15 min. Se evită pe cât posibil contactul cu aerul.
Apoi, se măsoară absorbanța soluţiilor cu un spectrometru la 510
nm, utilizând apă în cuva de referință.

Preparare soluțiilor etalon

Se prepară o serie de soluții etalon de fier care să acopere o gamă de
concentrații corespunzând concentrației presupuse a fierului din probe, prin
măsurarea cu precizie a unor volume din soluția etalon I sau etalon II într-o
serie de baloane cotate de 50 mL. Se adaugă în fiecare balon 0,5 mL soluţie
de acid sulfuric (4,5 mol/L) și se completează volumul cu apă.
Se tratează apoi seria de soluții etalon în mod similar cu soluțiile de
probe, urmând modul de lucru indicat pentru fiecare formă de fier de
determinat.
Proba martor - Se prepară o soluție pentru proba martor, urmând
întocmai modul de lucru indicat pentru probe, dar folosind 50 mL apă ȋn
locul a 50 mL probă de analizat.

Trasarea curbei de etalonare

Pentru fiecare serie de soluţii etalon se stabilește o curbă de
etalonare înscriind pe abscisă concentrația fierului în miligrame la litru, iar
pe ordonată absorbanțele soluțiilor etalon corespunzătoare.
O curbă de etalonare se stabilește pentru fiecare formă de fier, pentru
fiecare tip de aparat și pentru fiecare drum optic al cuvelor.
De exemplu, din soluţia etalon de lucru pentru fier se mǎsoarǎ cu o
biuretǎ: 0; 2; 5; 7; 10; 15; 20; 30; 40 şi 50 cm3 soluţie etalon de lucru. Se
aduce la 100 cm3 cu apǎ bidistilatǎ. Apoi se prepară proba zero constituind
proba martor (sau proba de referinţă). Soluţiile finale din baloanele cotate
conţin urmǎtoarele cantitǎţi de ioni de fier 1; 0.02; 0.05; 0.07; 0.10; 0.15;
0.20; 0.30; 0.40; 0.50 mg Fe2+.

Calcul

7
 Fier (Fe2+) = (c · V 1 · r) / V (mg/dm3)

unde:
c - conţinutul de fier citit pe curba de etalonare, ȋn mg/dm3;
V 1 - volumul soluţiei pregatită pentru măsurarea absorbanţei, ȋn cm3;
V - volumul probei luat ȋn lucru, ȋn cm3;
r - raportul de diluţie a probei, dacă este cazul.

4.4. Interpretarea rezultatelor

După efectuarea calculelor, se vor interpreta rezultatele conform
limitelor maxime admisibile şi se vor ȋncadra ȋn valori normale, critice sau
letale.
Valorile critice se ȋncadrează ȋn intervalul: 280-2550 µg/dL sau 50-
456 µmol/L la copii cu intoxicaţie acută cu fier.
Valorile letale se ȋnregistrează la valori: >1800 µg/dL sau >322
µmol/L.
Creşterile se pot datora următoarelor cauze:
- talasemie;
- anemii;
- hemocromatoza idiopatică;
- intoxicaţie acută cu fier (la copii);
- necroza hepatică severă (hepatite virale acute; poate atinge
>1000 µg/dL) şi unele hepatopatii cronice.
Scăderile se pot datora următoarelor cauze:
- anemia feriprivă: dietă deficitară;
- absorbţie scazută de fier: aclorhidrie, gastrectomie, boala
celiacă, by-pass duodenal;
- pierdere cronică de sȃnge;
- nevoi crescute de fier: sarcină, lactaţie, perioada de creştere;
- anemia din bolile cronice (boli inflamatorii, infecţii cronice,
boli renale etc.);
- sindromul nefrotic (pierderea urinară a proteinei de legare a
fierului).
Simptome ale intoxicaţiei cu fier includ: vărsături, diaree, şoc,
letargie, comă.
Pot să apară creşteri sau scăderi cauzate de:
- Factori fiziologici:

8
 - Creşteri ȋn perioada premenstruală;
- Scăderi ȋn timpul menstruaţiei.
- Medicamente:
- Creşteri: acid acetilsalicilic, cefotaxim, cloramfenicol,
cisplatin, contraceptive orale, fier dextran (se produc creşteri
care se menţin mai multe săptămȃni, uneori >1000µg/dL);
meticilina, metimazol, metotrexat, multivitamine care conţin
fier, pirazinamida.
- Scăderi: alopurinol, aspirina, colestiramina, corticotropin,
cortizon, metformin, pirazinamida.

Bibliografie

1. Andrews N. Iron Deficiency and Related Disorders. In Wintrobe’s

Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 11 Ed.,
2004; 980-1004.
2. Frances Fischbach. Blood Studies: Hematology and Coagulation. In A
Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 8 Ed., 2009; 99-101.
3. Frances Fischbach. Effects of Drugs on Laboratory Tests. In A Manual
of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins,
USA, 8 Ed., 2009; 1244.
4. Ivana De Domenico, Diane M.Ward, Jerry Kaplan. Hepcidin regulation:
ironing aut the details. In J. Clin. Invest. 117(7):1775-1758 (2007).
5. Jacques Wallach. Afectiuni hematologice. In Interpretarea testelor de
diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001; 451-452.
6. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate.
2010. Ref Type: Catalog.
7. Lothar Thomas. Iron. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and
Assessment of Clinical laboratory Results. TH-Books
Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998; 273-
275.
8. Paul R.Finley, Harold J.Grady, Eugene S.Olsowka et al. Chemistry. In
Laboratory Test Handbook. David S. Jacobs, Wayne R. DeMott, Paul R.
Finley et al., LEXI-COMP.Inc., USA, 3 Ed., 1994.