Sunteți pe pagina 1din 35

II.

CROMATOGRAFIA
Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodata de
analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie ntre
doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula ntr-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila, denumit i eluent , se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea speciilor chimice dintr-un amestec se petrece n coloana
cromatografica, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobila, se scurge continuu, cu
viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoac migrarea,
cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la nceputul coloanei,
folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la
gazcromatografie i pomp de nalt presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si
se afla initial fixat ntr-o zona ngusta de la nceputul coloanei. Spalati de eluent, o parte
din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se
datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu
orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenie si
aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza n
grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila
sesizarea pe rnd a componentilor, la parasirea coloanei cromatografice de catre un
detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (n mod ideal la oricare)
dintre speciile moleculare ce traverseaz coloana ceomatografic. Detectorul d un
semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component n faza mobila.
Intr-o exprimare plastic se poate spune c detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia
din substantele ce compun initial amestecul analizat n mod similar cu un sistem
Video care nregistreaza trecerea liniei de sosire de ctre concurenti n atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme


Dac se inregistreaz semnalele date de detector in funcie de timp se obine o
cromatogram. Pe cromatograma se disting o serie de maxime, numite peak-uri (peak
engl. = vrf), care se produc deasupra liniei de baza sau a portiunii orizontale a curbei,
paralela cu axa timpului. In cazul ideal, oricare peak are forma distributiei normale
Gauss. In cazul introducerii unui singur component intr-un eluent inert se obine cea

mai simpl cromatogram posibil de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind
reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea
(injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului exprimat n unitati
arbitrare.
In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de baz:
1.
Peak- urile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele doua semnale
sau vrfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate n
toate metodele
cromatografice n scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in
amestecul analizat. In acest sens inlimea peak-ului sau suprafaa lui reprezint o
msur a concentraiei speciei chimice i timpul de sosire la detector ( denumit timp de
retenie) reprezint o caracteristic a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogram
este asemntoare
cu o spectrogram. Diferenele intervin la faptul c la o
spectrogram identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de und
care este o constant fizic, iar la o cromatogram identificarea speciilor se face prin
timpul de retenie care este
o mrime caracteristic numai in conditii date de
temperatur, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe
cromatografia este superioar spectrometriei. La analiza spectrometric a unor
amestecuri complexe, cu lungimi de und specifice apropiate pentru unele specii
chimice,
se poate ajunge la identificri greite. Asemenea erori snt excluse la
cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferii prin
dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclus att confuzia acestora ct i
posibilitatea ca acestia s prseasc coloana neidentificai .
Primul peak din cromatogram, de nlime mai redus, corespunde unui
component inert ( gazul purttor n cromatografia de gaze sau diluantul lichid in
cromatografia de lichide ) - care este retinut n foarte mic msur de coloana
cromatografic. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice n cazul
de fata) analizate. Sosirea intirziat a grupului de molecule a acestei specii fa de
eluent se datoreaz staionarii mai ndelungate n coloana cromatografic ca urmare
afinitii mai mari a acestei specii fa de materialul coloanei. Gradul de afinitate este
exprimat prin numrul absorbiilor i desorbiilor repetate de pe umplutura sau pere ii
coloanei i este o caracteritric a naturii speciilor analizate. Cu ct numrul absorbiilor
i desorbiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de ctre o specie chimic
cu att mai trziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe
timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval
Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet neretinut de catre
faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pna la detector. Acesta nu
poate fi zero. n cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu
timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul
scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloana si aparitia maximului de
concentratie n detector, pentru componentul neretinut.
Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al
amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie n detector. De exemplu, n cazul prezentat anterior n
fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pna la
verticala prin vrful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau n amestec.
Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie
(legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Qe):

VR = tRQe
Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea
compara timpii masurati pe coloane diferite, n cazul aceluiai component - este dat de
diferenta:
tR' = tR - tM
Volum de retentie ajustat are expresia :
VR' = VR - VM
unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
VM = tMFe
si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.

II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE


S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de
altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge:
a. cromatografia de gaze (GC) cnd faza mobila este un gaz;
b. cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobila este un lichid
c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat
peste temperatura critica.
In cadrul cromatografiei de gaze (GC) se disting urmatoarele tehnici:
1. Cromatografia gaz-lichid (cromatografie de repartiie), faza stationara este un lichid
nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, de
tip silicagelul sau alumina, situat ntr-o coloan, la asa-numita cromatografie
conventional sau suportul poate fi chiar peretele coloanei, confectionat la
dimensiuni capilare, la aa numita cromatografie pe coloana capilara.
2. Cromatografia gaz-solid (cromatografie de absorbie), faza stationara o constituie tot
silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (niste silicati naturali sau
sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importanta
pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE


Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze
sau solide care pot fi trecute sau exist n stare gazoas i care nu se descompun la

nclzire n alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiz este acela n care
amestecurile supuse analizei snt n stare lichid din care snt aduse n stare gazoas
prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este
la substanele la care temperatura de vaporizare este mai mare dect temperatura de
descompunere a substantelor de analizat rezultind ali compui dect cei supui
analizei. In aceste cazuri nainte de introducerea probei n cromatograf se pot realiza
niste derivati (compusi noi), volatili, utiliznd anumite reactii chimice specifice, procedeu
denumit derivatizare. Uurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa,
posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele
principale ale acestei metode.
Printre domeniile n care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia,
industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica.
La cromatografia cu gaze proba este evaporat la intrarea
n coloana
cromatografic fie direct la captul acestei fie ntr-un dispozitiv special plasat tot la
intrarea n coloan. Separarea de-a lungul coloanei (eluia) are loc cu ajutorul unui gaz
purttor care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacioneaz cu faza
mobil , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din
amestec prin coloan. nceputurile Cromatografiei de gaze snt legate de coloane cu
umplutur n care se transfera amestecul de substane gazoase dup ce n prealabil
erau evaporate spontan ntr-un injector nclzit. La ora actual este folosit n
exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fr umplutur cu cele
dou[ tipuri :
- cromatografia de gaze pe faze staionare solide (cromatografie de absorbie)
- cromatografia de gaze pe faze staionare lichide (cromatografie de repartiie)
La cromatografia de gaze
pe faze staionare solide retenia speciilor de
analizat din amestec este realizat pe baz de absorbie fizic pe peretele interior al
coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii i lungimi
apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbii ireversibile, care duc
la rndul lor reproductibiliti slabe,
aceast tehnic este folosit rar i numai la
substane cu puine molecule n structur.
Cromatografia de gaze
pe faze staionare lichide se bazeaz pe repartiia
substanei de analizat ntre faza mobil gazoas i o faza lichid
imobilizat pe
peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este
folosit la ora actual la scara cea mai larga. Relaiile matematice care o descriu snt
valabile cu mici modificri i la cromatografia de lichide, aceste modificri snt dictate
de faptul c gazele snt compresibile i ca atare proprietile i comportarea reologic
snt influenate de presiune i de temperatur. Din acest motiv la cromatografia de
gaze este folosit n locul timpului de retenie tr volumul de retenie Vr care ine cont de
debitul mediu Q al fazei mobile exprimat n ml/min, debit ce depinde de presiune i
de temperatur :
Vr= tr . Q
Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen mare
asupra lirii de band ( vezi i cap. Cromatografia de lichide) influena difuziei
longitudinale fiind important dtorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine
de mrime la gaze fa de cel al lichidelor.

II.2.1. Aparate folosite n gazcromatografia de gaze

Un gazcromatograf respect schema bloc din figura avnd particulariti specifice


pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arat ca n figura II.2.

Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purttor, 2-reductor de


presiune, 3 - manometru de nalt presiune, 3- manometru de joas presiune, 5- regulator
de presiune i debit, 6- sering de injecie pentru substane de analizat n stare iniial
lichid, 7-dispozitiv de evaporare rapid , 8-cuptor termostatat de nclzire, 9- coloan
cromatografic tubular, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de
achiziie prelucrare i afiare date, 13 calculator, 14- imprimant

II.2.1.1. Alimentarea cu gaz purttor


Gazul purttor trebuie s fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de
vedere intr n discuie gazele inerte, hidrogenul, azotul i bioxidul de carbon. Natura
gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rndul lui de
mai muli factori dar n principal de clasa de substane analizate. Gazele purttoare de
nalt puritate snt preluate de regul din butelii speciale de nalt presiune prevzute cu
reductoare de presiune ce asigur presiuni de intrare cuprinse ntre 1,5 i 3 ata, dar pot
fi produse i pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purttor
se gsete un debitmetru electronic precum i o sit molecular pentru reinerea
vaporilor de ap i a eventualelor impuriti solide de dimensiuni mici.

II.2.1.2. Sistemul de injecie


Caracteristicile sistemului de injecie asigur n mare parte calitatea analizelor
cromatografice, fiind responsabile de lirea de band a peak-urilor. Un sistem

Fig.II.3. Fazele de injecie ale amestecului lichid de analizat


performant de injecie trebuie s asigure injecia n timp scurt a unor cantiti extrem de
mici de subsatan de analizat numai aa snt asigurate peak-uri nguste la baz.
Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticl aezat pe suportul
mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale acionat automat.
Acul seringii perforeaz un dop de cauciuc siliconic sau i absoarbe o cantitate bine
definit de prob, figura II.3. , dup care se ridic automat , se deplaseaz i injecteaz
proba printr-un semptum prevzut cu un dop de cauciuc siliconic ntr-un dispozitiv de
evaporare rapid situat la intrarea n coloan. Este foarte important ca evaporarea s
se produc practic instantaneu astfel nct amestecul fazei purttoare cu substana de
analizat s se produc chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe
analizate pentru coloane analitice normale variaz de la civa l la cca 30 l, la
coloane capilare volumul probei este mult mai mic de ctiva nl fiind necesar folosirea
unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigur
preluarea pentru analiz numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat n mediu.
Aceste sisteme de splitare snt n principiu divizri de debit cu tuburi de tip T,
existente att pe traseul gazului purttor ct i pe cel al amestecului gazos, pe ale crori
ramuri se creaz rezistene hidraulice bine controlate astfel nct s poat fi purjat cea
mai mare parte din substana de analizat, pe coloan ajungnd numai o parte infim de
amestec i gaz purttor aa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantiti

Fig. II.4. Dou procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze


a. tub de evaporare cu dop de vata de sticl sau de cuar , 4 corpul
dispozitivului de injecie , 5- ventil cu 3 ci, 6- ventil cu ace cu debit
reglabil

mici de prob, aa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manual duce la erori
importante motiv pentru care pentru dozare i injecie snt recomandate dispozitive de tip
autosampler.

II.2.1.3. Coloane cromatografice


Termenul de coloan cromatografic este oarecum impropriu pentru
cromatografia de gaze, el provine inc din timpul n care se foloseau coloane cu
umplutur de lungimi rezonabile care ncpeau n gazcromatograf sau care erau
montate n poziie vertical lng aparat avnd o termostatare concentric. Diametrul
interior al coloanelor cu umplutur pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm
sau la aa numitele coloane micro <1mm. Acest tip de coloane este astzi extrem de
rar folosit din cauza faptului c au o capacitate de separare redus i o rezoluie slab.
Astzi snt folosite cu precdere coloane capilare care se prezint sub forma unor
tuburi metalice de cupru , oel inoxidabil sau din sticl cele din urm fiind trase ntr-un
film de poliamid sau de aluminiu pentru a le mri rezistena mecanic la incovoiere.
Coloanele capilare snt goale, au diametre interioare submilimetrice i lungimi de zeci
de metrii putnd depi i o sut de metri. Coloanele capilare au capacitate de separare
i rezoluie mare n schimb din cauza cantitilor extrem de mici de substan analizat
au au o limit de detecie sczut i un timp de analiz mai ridicat. Din cauza
volumului extrem de mic necesar ntr-o coloan capilar , de ordinul l, ale amestecului
gazos de analizat nainte de intrarea n coloana cromatografic se folosete splitarea

(divizarea) probei ,prin aceast operaie numai o mic parte a acesteia, la limita dozrii
volumice, este admis n colan cealalt parte fiind purjat n atmosfer. Aceast
cantitate emic de substan analizat este motivul limitei de detecie mai sczute. Att
coloanele cu umplutur ct i cele capilare pot funciona n regim de cromatografie de
absorbie (gaz- solid) sau n regim de cromatografie de repartiie (gaz - lichid).
La folosirea coloanelor cu umplutur pentru cromatografia de absorbie umplutura
este format dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de repartiie
umplutura este format dintr-un material poros figura II.5, a crui suprafa este
impregnat cu o faz lichid staionar.

Fig.II.5. Tipuri de coloane utilizate n gazcromatografie. a- coloane cu umplutur pentru


cromatografia de absorbie, 1-perete coloan, 2-umplutur poroas . b-coloane cu
umplutur pentru cromatografia de repartiie, 1-perete coloan, 2- umplutura, 3-faz
staionar lichid depus pe umplutur, 3-umplutur. c-coloan capilar cu film lichid
subire, 1-perete coloan, 2-film lichid , d-coloan capilar cu strat subire impregnat
cu lichid, 1-perete coloan, 2- film lichid, 3-strat granular subire.

La folosirea coloanelor capilare se deosebesc coloane cu film i capilare cu strat.


La coloanele capilare cu film, figura, faza staionar ader sub forma unui film subire
de peretele interior neted al coloanei capilare iar la coloanele capilare cu strat, figura,
faza stationar este aplicat sub forma unui strat subire de diatomee impregnat cu faza
lichid staionar. n cadrul cromatografiei de gaze snt valabile tot relaiile stabilite la
ceromatografia de lichide cu condiia ca influena temperaturii i a presiunii s fie
redus la maxim. n acest scop procesul de sparare n coloan trebuie s fie izoterm
iar trecerea amestecului n faz gazoas ct mai rapid posibil.
Pentru alegerea corect a unei coloane pentru gazcromatografie este nevoie s se
in cont de urmtoarele:
- proprietile negative ale unei coloane ( cost, timp de analiz, absorbie
rezidual) snt proporionale cu lungimea crescnd deci cu creterea acesteia
- singura proprietate pozitiv a coloanei i anume capacitatea ei de separare
crete abia cu ptratul lungimii coloanei, acesta fiind i motivul folosirii unor
coloane de lungime medie de 20 -30 m n locul unor lungimi ce pot depi 100
m. Afar de aceasta la coloane scurte scade timpul de analiz i absorbia
rezidual deoarece ea este proporional cu lungimea drumului parcurs de faza
mobil n mediul absorbant

Atunci cnd se solicit o separare avansat se vor folosi coloane de lungime


mare cu recomandarea ca drept gaz purttor s se foloseasc hidrogenul
deoarece se reduc sensibil timpii de analiz. Trebuie avut n vedere c aici crete
timpul de analiz
Reducerea timpului analiz prin mrirea presiunii iniiale a gazului purttor
duce la reducerea capacitii de separare a coloanei capilare

II.2.1.4. Cuptoare de termostatare


Temperatura coloanei este un parametru esenial pentru gazcromatografie deoarece
ea provoac practic gradientul de presiune ce transport gazul prin coloan. Creterea
Temperaturii duce la creterea exponenial a presiunii amestecului gazos care la
rndul ei duce la creterea vitezei de migrare reducnd sensibil timpul de retenie. n
general se consider c o cretere atemperaturii cu cca 300C duce la reducerea la
jumtate a timpului de retenie. n realitate nu intereseaz viteza absolut de migrare ci
viteza relativ de migrare vr ca fiind raportul dintre viteza medie vma liniar a substanei
analizate raportat la viteza medie vmp a gazului purttor:

vr

v ma
v mp

valoarea vitezei relative de migrare se situeaz ntre 0 i 1, ceea ce nseamn c la


valoarea zero nu are loc nici o migrare, temperatura fiind prea mic, iar la valoarea 1
nu are loc nici o separare deoarece amestecul de de analizat traverseaz coloana cu
aceei vitez cu gazul purttor nefiind reinui difereniat n timp diferiii componeni.
Care valoare intermediar ntre zero i 1 este optim depinde n mare parte de
dificultatea separrii. Temperatura optim a coloanei depinde de temperatura de
fierbere i de gradul de separare. Pentru amestecuri a cror temperatur de evaporare
se situeaz ntr-un domeniu destul de apropiat se poate spune cu o apreciere relativ
bun c
o temperatur egal sau ceva mai mare dect temperatura medie de
evaporare a probei duce la un timp de eluie apreciat de cca 4-30 minute ceea ce
reprezint valori acceptabile. Dac se folosete acest raionament se apeleaz la
regimul de lucru izoterm (temperatura coloanei constant). In cadrul lucrului n regim
izoterm valoarea temperaturii trebuie meninut constant n limitele 0,1 0C motiv pentru
care coloana se gsete ntr-un cuptor termostatat . n cazul unor probe cu un interval
mare de fierbere este de dorit s fie folosit un program de temperatur n cadrul
cruia temperatura este crescut fie n mod continuu fie n trepte . La injecie proba se
gsete la temperatura cea mai sczut optim pentru componentele volatile dar
necorespunztoare pentru componentele cu temperatur de vaporizare mare. n timpul
analizei temperatura este crescut progresiv pn cnd se obine n final temperatura
corespunztoare componentelor volatile. n cadrul programelor de temperatur nu
trebuie depit ns temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative
de migrare vr

II.2.1.5. Detectoare pentru gazcromatografie


II.2.1.5.1. Caracteristicile detectoarelor
La ieirea din coloana gascromatografice exist condiii optime de msurare pentru
multe tipuri de detectoare deoarece aici ies pe rnd substane gazoase pure cu o diluie
ideal realizat cu un gaz inert. Pentru identificri calitative este indicat folosirea de
spectrometre la ieirea gazcromatografelor. Cele mai utilizate combinaii snt:
gazcromatograf- spectrometru de mas ( GC-MS) sau gazcromatograf- spectrometru n
infrarou cu transformat Fourier (GC-FTIR). Pentru analiza cantitativ a probelor
( probe a cror compoziie calitativ este deja cunoscut) s-au impus cteva detectoare
utilizate la ora actual la scar mare acestea se clasific dup principiul lor fizic n:
-

Detectoare sensibile la variaie de concentraie


Detectoare sensibile la variaie de debit masic

La detectoarele
sensibile la variaie de concentraie semnalul electric al
detectorului este proporional cu concentraia momentan a substanei (i) din volumul
din imediata vecintate a detectorului. La un detector sensibil la variaie de debit masic
semnalul electric al detectorului este proporional cu debitul masic (Mi), adic cu masa
de substan ce trece n unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile
la variaia de concentraie snt influenate de debitul de gaz purttor motiv pentru care
debitul de gaz purttor trebuie reglat automat n vederea meninerii constante a valorii
lui. Influena debitului de gaz purttor nu se manifest la detectoarele sensibile la
variaie de debit masic.
Sensibilitatea S a detectorului reprezint nivelul de conversie a mrimii
fizice neelectrice ntr-o mrime electric proporional. La detectoarele sensibile la

Fig.II.6. Componente duntoare ale semnalului electric al detectoarelor


variaie de concentraie sensibilitatea detectorului
este dat de raportul dintre
semnalul electric Ei i concentraia substanei i din gazul purttor, iar la detectoare
sensibile la variaie de debit masic sensibilitatea este dat de raportul dintre
semnalul electric Ei i debitul masic Mi - mas n unitate de timp). Prin nregistrarea
semnalului electric al detectorului (potentialul electric E-mV sau curentul electric I-

10

mA) n funcie de timp se obine cromatograma. Semnalul electric al unui detector


conine pe lng semnal electric util i componente duntoare sau parazite
precum: abateri, zgomot de fond , drift (plaj de variaie) , figura II.6., care pot
duce la erori importante de msurare. Abaterile periodice i au originea n reglrile
periodice automate ale temperaturii i debitului gazului pe cnd oscilaii neperiodice
trebuie puse mai ales pe seama coloanelor de separare inclzite incomplet sau
murdare. Zgomotul de fond are frecven ridicat este specific fiecrui detector i
electronicii sale aferente i se manifest mai ales atunci cnd amplificarea
electronic a semnalului este mare. Componentele parazite din semnalul electric se
determin n felul urmtor: din semnalul nregistrat al detectorului n funcie de timp
se alege ntimpltor un interval de 15 minute si se traseaz pe ambele pri ale
liniei de baz a semnalului dou linii paralele n aa fel nct aceste linii s ating
tangenial intr-un interval de cca 10 minute peak-urile (virfurile) a cele mai mari.
Drift-ul , figura , este definit ca fiind nclinaia celor dou linii paralele fa de
abscis. Abaterile snt definite ca distana ntre cele dou linii. Pentru stabilirea
mrimii zgomotului de fond se alege intervalul de un minut care prezin cel mai
mare zgomot. Nivelul zgomotului de fond se determin prin mrimea distanei ntre
cele dou linii paralele ce unesc vrfurile semnalului de zgomot.
Limita de detectare Ld reprezint concentraia [mg/l] sau debitul masic [g/s] a
substanelor analizate de valoarea cea mai mic care snt detectabile cu un senzor
cromatografic adecvat:
Pentru descrierea capacitii unui senzor
folosit n
cromatografie se folosete exclusiv limita de detectabilitate i nu sensibilitatea lui. Limita
de detectabilitate se determin din
raportul dintre nivelul p a tuturor semnalelor
parazite praportat la sensibilitate S:
Ld =p/S
Numai atunci cnd diferena E ntre valoarea mrimii msurate i valoarea medie a
unei analize oarbe este de trei ori mai mare dect abaterea standard (s) a tuturor
semnalelor parazite p se poate susine cu o siguran de 99% c c un punct de
msurare oarecare P de pe cromatogram reprezint un punct a semnalului util i
nu a componentelor parazite ale semnalului. La acest raionament se iau n calcul
numai abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jumtatea
semnalului de eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este
modificat n practica cromatografic n sensul c se iau n considerare
att
abaterile pozitive ct i cele negative , msurtorea fcndu-se vrf vrf. Din
aceste msurtori ar rezulta prin mprire un factor f , (f = 1,5 (n loc de 3) pentru
distana punctului de msurare P de la valoarea median a semnalului
de
abatere . de regul pentru calculul limitei de detectabilitate Ld se fololosete un
factor f =1,2 2:
Ld = (1,5...2) semnal de abatere /Si
Ld = (5...10) semnal de abatere /Si
n conformitate cu alte standarde snt folosite i alte valori pentru factorul f,
IUPAC recomand f = 3.

de ex

11

Limita de determinare real Ldet reclam valori mai mari pentru (f) dect n
cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie s fie cuprins ntre 5-10
corespunztor cu sigurana statistic cerut pentru rezultatul msurtorilor.
Constanta de timp () , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a
electronicii aferente, reprezint timpul care trece din momentul iniierii msurtorii
pn n momentul n care este indicat 63,2% a ntregului semnal. Dup (5) se obin
99,3 % a ntregului semnal

Fig.II.7. Influena consatantei de timp asupra timpul de rspuns t


Selectivitatea unui detector Si,j descrie sensibilitile diferite pentru dou
materiale diferite i i j. Selectivitatea Si,j este indicat ca fiind raportul sensibilitii
detectorului pentru cele dou substane:
Sij= Si/Sj

Dac sensibilitatea pentru substana j se apropie de valoarea unu detectorul este


specific pentru substana i, (Si = )
Domeniul liniar
al unui detector, figuraII.8, reprezint domeniul unde
sensibilitatea Si este constant . n partea de jos domeniul liniar este limitat prin limita

Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie

12

de detectabilitate Ld. n partea de sus prin o abatere tolerat de 5% de la dreapta ideal


de liniaritate. Pentru exemplificare grafic a domeniului liniar se reprezint n
coordonate dublu logaritmice suprafaa peak-ului Ai sau a semnalului detectorului
Ei n funcie de cantitatea m i a probei, concentraia Ci , respectiv fa de debitul
masic Qmii, figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosit se reprezint
sensibilitatea Si n funcie de cantitatea de prob folosit mi, n funcie de
concentraia Ci sau n funcie de debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul
liniar se exprim prin raportul dintre limita superioar a domeniului liniar i limita de
detectabilitate, este obligatorie i indicarea naturii substanei analizate i. Domeniul
dinamic al detectorului este plasat n continuarea domeniului liniar i reprezint
domeniul n care o modificare a concentraiei sau a debitului masic mai provoac
o modificare sensibil i posibil de calibrat a semnalului detectorului, figura II.8.a,b.

II.2.1.5.2. Detectorul de ionizare cu flacr ( FID)


Detectorul de ionizare cu flacr, figura II.9, este un detector folosit pentru
substane organice ( hidrai de carbon) ce are aplicaia de baz la cromatografele
de gaze deoarece mbin o sensibilitate ridicat cu robusteea. Un detector de
ionizare cu flacr este de cca 1000 ori mai sensibil dect un detector de
conductivitate termic. Alte domenii de aplicare ale acestui detector snt la
supravegherea apelor privind prezena de hidrocarburi volatile precum i la
supravegherea polurii atmosferei i a aerului din spaii interioare cu hidrocarburi
gazoase. Principiul detectorului se bazeaz pe msurarea conductivitii electrice
unei flcri de hidrogen plasat ntre doi electrozi. Substanele de analizat snt
transportate n flacr cu un gaz purttor unde snt ionizate termic datorit
aportului de cldur din flacr. n felul acesta n cmpul electric dintre cei doi
electrozi apare un curent ionic msurabil care este nregistrat n funcie de timp
de ctre nregistrator sub form unor vrfuri (Peak-uri) cu aplicaii n analiza chimic
calitativ. Intensitatea semnalului electric al detectorului (nlimea maxim al Peakului) este liniar i proporional cu coninutul de hidrocarbur ntr-un domeniu
foarte larg de concentraie , cu aplicaii n analiz cantitativ. Din acest motiv
concentraia unei hidrocarburi poate fi determinat direct din semnal fr a se folosi
curbe de etalonare.
Unele substane organice ( de ex. acidul formic,
acetaldehida) au detectabilitate slab . Alte substane precum: gazele nobile, H 2 ,
N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legturi de halogen ,
halogenuri de siliciu

13

Fig.II.9. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip FID. 1-areztor, 2-flacr de


hidrogen, 3,4- electrozi colectori de electroni, 5 amplificator electronic, 6- sistem
electronic de prelucrare i afiare

Sistemul cromatospectrometric prezentat in figura II.10 permite determinarea


concomitent a compoziiei calitative i cantitative moleculare precum i a celei
calitative i cantitative atomice din amestecuri complexe de gaze. n acest scop este
folosit un gazcromatograf
echipat cu detector FID
dispozitivat cu o structur
spectrometric modular format dintr-o sond, compus la rndul ei dintr-o lentil
colimatoare, o fibr optic, un spectrometru miniatural compact echipat cu reea de
difracie fix , detector Diode- Aray, soft pentru prelucrare informaii spectrale de emisie
atomic precum i un sistem de procesare, afiare i tiprire spectre. Sonda se
monteaz perpendicular pe direcia de ardere a flcrii de hidrogen i valorific emisia
spectral a atomilor elementelor chimice excitate n flacra de hidrogen la cca 3.000
0
C. Informaia spectral ajunge prin lentila colimatoare i fibra optic pe reeaua de
difracie a unui spectrometru miniatural, iar dup difracie, pe un detector Diode-Array
care mpreun cu microprocesorul spectrometrului furnizeaz spectrograma de
emisie atomic a speciilor chimice elementare (elemente chimice) prezente in
amestecul de gaze analizat.

Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3sistem de adaptare pentru sonda optic, 4-flacr de hidrogen, 5-lentil colimatoare din
sticl de cuar, 6- fibr optic de transmisie, 7-spectrometru cu reea de difracie i
detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afiare i tiprire spectre

II.2.1.5.3. Detectorul pentru compui de azot i fosfor (NPD)


Detectorul pentru azot i fosfor este un detector modificat de tip FID care conine o
surs alcalin
de silicat sub forma unei perle din sticl sau ceramic dopat cu
elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce elibereaz uor electroni. Perla alcalin este

14

fixat pe o srm de platin ntre flacra de hidrogen i electrozii colectori de electroni


ai detectorului, figura fiind nclzit att pe cale electric prin srma de platin pus sub
tensiune ct i prin flacra de hidrogen, n jurul ei formndu-se un nor termic plasmatic
care prin norul de electroni emii are totdeauna sarcina negativ fa de sarcina
pozitiv a electrozilor colectori .
Detectorul NPD poate fi folosit n dou moduri:
- ca detector de fosfor (P)
ca detector de azot (NP)
n cazul utilizrii lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flacra de hidrogen arde ca la
detectorul FID deasupra arztorului cu deosebirea c arztorul este legat la pmnt,
figura, deoarece electronii rezultai din arderea unor componente ce conin atomi de
carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , snt respini n
acest caz de potenialul negativ al perlei scurgndu-se la mas, n schimb electronii
ce iau natere pe suprafaa perlei alcaline , al cror numr este proporional cu
concentraia de fosfor, ajung nestingherii la electrozii colectori formnd semnalul
electric al detectorului. n ce privete mecanismul propriuzis de reacie trebuie artat c
la nceput se formeaz n flacr oxizi de fosfor cu un numr impar de electroni , prin
fixarea a electronului impar se formeaz n prima faz anionii diferiilor acizi fosforici
care n flacr snt oxidai n flacr cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,

a)

b)

Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P). 1arztor, 2- flacr de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin, 6plasm, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afiare

ocazie cu care electronul fixat este eliberat i se constituie n semnalul electric al


detectorului. La folosirea detectorului pentru compui de azot mecanismul este
asemntor ca la fosfor deoarece i i azotul are un numr impar de electroni care
duce la formarea de oxizi numai c acetia se descompun prea repede i nu
reacioneaz cu perla alcalin . Dac n schimb se scade regimul termic de nclzire al
perlei se formeaz radicali cian care dau reacie alcalin specific . Pentru a reduce
regimul termic se micoreaz debitul de hidrogen la un nivel de cca 1-3 l/min i cel de
aer la cca 100 l/min, condiii n care flacra de hidrogen se stinge iar aportul slab de
hidrogen existent , ca urmare a reducerii debitului acestuia, duce la aprinderea lui n
jurul perlei sub forma unui nor plasmatic slab . Radicalii cian formai prin piroliz
termic fixeaz un electron
iar anionii CN - formai reacioneaz cu hidrogenul
o
respectiv cu radicali OH cu formare de compui neutrii de tip CO2, H2O, N2 cu

15

eliberarea unui electron ce se constituie , aa cum s-a mai artat, n semnalul


detectorului .
Detectorul azot - fosfor este un detector selectiv putnd fi folosit n principiu
pentru toate elementele care au un numr impar de electroni , inclusiv pentru compui
volatili de bor i arsen , utilizarea lui de baz este totui cea pentru compui fosfor i
azot n regimul de lucru N-P, figura II.11 b. n regimul de lucru numai pentru fosfor
(regimul P) detectorul este selectiv pentru compui de fosfor dar are sensibilitatea mai
redus ca n regimul de lucru N-P. Un mod de lucru numai pentru azot (regim de lucru
de tip N) nu este posibil fiind indicate alturi de compui de azot totdeauna i compui
de fosfor , bineneles dac acetia snt prezeni n amestecul de subsatane analizate

II.2.1.5.4. Detectorul de conductivitate termic


Detectorul de conductivitate termic este unul din cele mai vechi detectoare
folosite n cromatografie. El se bazeaz pe msurarea continu a conductivitii termice
a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purttor i amestecul gazos de analizat,
figura. Conductivitatea termic este o mrime fizic specific naturii i concentraiei
substanelor. Amestecuri de gaze de compoziii i concentraii diferite ce scald cei patru
rezistori nclzii ai punii Wheatstone
modific proporional cu natura i cu
concentraiilor substanelor rezistena acestor rezistori ducnd la apariia unei tensiuni
de dezechilibru a punii.

Fig.II.12.

Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul punii


Wheatstone. 1- amplificator electronic, 2- sistem electronic de achiziie , prelucrare i
afiare, R1,R2, R3, R4 - rezistori din platin nclzii electric

Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic
compact bine termostatat n care se gsesc patru celule de gaz identice prevzute
cu filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm, legate electric ntr-o
punte de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o msurare comparativ de
compensaie. n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale
braelor punii, trece gazul purttor pur, iar prin celelalte dou brae ale punii trece
gazul purttor n amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt
parcurse de un curent electric care provoac nclzirea acestora prin efect JouleLenz. Temperatura srmelor i prin aceasta i rezistena lor electric depinde de

16

conductivitatea termic a gazelor ce trec prin celule. Modificri ale compoziiei


gazelor
provoac prin conductivitile lor termice specifice modificri
corespunztoare de temperatur i prin aceast modificri ale rezistenei electrice
a filamentelor de srm. Diferenele de temperatur a filamentelor n celulele de
msurare i n celulele de referin duc la un dezechilibru electric msurabil al punii
Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este proporional cu
natura substanei care traverseaz la acel moment dou brae opuse ale punii , iar
valoarea dezechilibrului este proporional cu concentraia acelei substane din
amestecul de gaze. Detectorul de conductivitate termic este un detector universal,
utilizabil la aproape toate substanele, singurele ngrdiri snt la substane puternic
corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de sczut.

II.2.1.5.5. Detectorul cu capcan de electroni (ECD)


Detectorul cu capcan de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este
un detector specific pentru gazcromatografie folosit n analiza substanelor sulfuroase,
substanelor cu azot i a substanelor halogenate ( ex. PCB, Lindan, etc). Aplicaiile de
baz snt n analiza urmelor i n chimia mediului. Detectorul este format dintr-o camer
de ionizare ce conine un catod i un anod i un flux continuu de gaz. Pentru ionizare
snt folosite radiaii () emise de o surs radioactiv sub forma unei folii foarte subiri al
izotopului Ni63,
sursa de radiaii constituie totodat i catodul, figura II.13.
Descompunerea radiaiei () duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu
moleculele (N2) ale gazului purttor i ca urmare iau natere ioni N2 ncrcai pozitiv i
electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni ntre cei doi electrozi apare un
cmp electric prin care electronii secundari liberi se deplaseaz spre anod unde produc
un curent electric de civa nanoamperi numit curent de ionizare de baz. Dac n
amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare fa de electroni atunci aceast
substan colecteaz o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micorarea
curentului de ionizare de baz. Aceast micorare afecteaz proporional curentul de
baz i reprezint semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcan de electroni
reacioneaz la substane cu afinitate de electroni cum snt de exemplu substane
halogenate precum i anumite pesticide. Sistemul clasic cu msurarea curentului de
ionizare de baz, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv
pentru care n aparate moderne se folosete alt sistem de lucru. Astfel se aplic un
impuls de tensiune cu frecven variabil . n momentul n care exist semnalul de
tensiune (0,5 pn la 1s), electronii care nu au reacionat cu substanele amestecului
de gaze din gazul purttor snt colectai de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric
se aleg aa de scuri pentru ca ionii grei, rezultai ca urmare a absorbiei de electroni,
s nu poat ajunge la anod. Frecvena semnalelor electrice aplicate nu este constant ci
modificat continuu n sensul asigurrii unei intensiti de curent constante. Dac n
detector intr prin amestecul de gaze un numr mare de molecule electrofile pentru
compensarea scderii sub limit a curentului (ca urmare a scderii numrului de
electroni) se mrete frecvena curentului. La acest mod de lucru semnalul util al
detectorului nu-l mai reprezint micorarea curentului de ionizare de baz ci modificarea
frecvenei tensiunii aplicate n scopul meninerii constante a intensitii curentului ,
frecvena semnalului fiind proporional cu concentraia moleculelor captoare de
electroni. Prin timpul de pauz ntre semnale se asigur n limite largi un numr de
electroni liberi constant , ceea ce nsemn c i la concentraii mari ale substanei de

17

analizat snt suficieni electroni la dispoziie pentru ionizare. Numrul de electoni se


adapteaz concentraiei substanei de analizat prin acesta extinzndu-se sensibil i
domeniul liniar.

Fig.II.13. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip ECD. 1


Camera de ionizare, 2- folie de izotop Ni 63, 3- amplificator electronic, 4sistem electronic de prelucrare i afiare

Tab.II.1. Sensibilitatea aproximativ pentru diferite clase de compui organici


Gruparea chimic

Sensibilitatea relativ

Hidrocarburi

eteri, esteri

10

Alcoli alifatici, cetone, amine

100

Legturi mono-Cl- i mono-F-, mono-Br-, legturi di-Cl i di-F 1000


Aldehide i legturi tri-Cl

104

Legturi mono-J-, di-Br- i legturi nitro

105

Legturi di-J-, tri-Br-, legturi poly-Cl i poly-F

106

Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizrii.
Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleiai grupri chimice deoarece
ea depinde de structura legturilor .

II.2.1.5.6. Detectorul de emisie atomica


Detectorul de emisie atomic (AED - Atomic Emission Detector), figura II.14,
reprezint o realizare relativ recent fiind legat n principal de evoluia detectorului de
tip Diode- Array. Eluatul ce prsete colana cromatografic este introdus ntr-o
plasm termic de heliu generat ntr-un cuptor cu microunde . Energia nalt a
plasmei atomizeaz toate elementele din prob provocnd emisie atomic specific a

18

acestora . Prin decompunerea radiaiei rezultate cu o reea de difracie rezult


spectrul atomic al probei care este preluat de un detector Diode Array. Marele avantaj
al acestui tip de detector este analiza multipl fiind posibil detectarea mai multor
elemente n acelai timp. Profitnd de prezena unei plasme de nalt energie deja
existent la spectrometrele clasice cu plasm cuplat inductiv (ICP-MS), la ora actual
se realizeaz combinaii deosebit de performante ntre
cromatografe HPLC i
spectrometrele cu plasm cuplate inductiv (HPLC-ICP-MS) i gazcromatografe i
spectrometre cu plasm cuplate inductiv (GC -ICP-MS). Aceste combinaii snt
avantajoase ca pre de cost deoarece un cromatograf clasic beneficiaz de o plasm
termic deosebit de performant generat de un alt aparat , respectic un spectroscop
cu plasm cuplat inductiv (ICP) prezent poate chiar n acelai laborator.

Fig.II.14. Schema de principiu a detectorului de emisie atomic. 1-camer cu plasm termic


dat de microunde, 2- plasm termic, 3-oglind plan de reflexie, 4- retea de difracie, 5detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem electronic de achiziie , prelucrare
i afiare

II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare


Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, n cromatografia de gaze se
datoreaz att selectivitii ct i sensibilitii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor

19

Fig.II.15. Schema de principiu a detectorului cu fotoionizare. 1-camer de ionizare cu radiaii


ultraviolete, 2,3- electrozi, 4- lamp de ultraviolete, 5- amplificator electronic, 6- sistem
electronic de prelucrare i afiare

aromatice sau a speciilor organice cu heteroatomi . Acest tip de detector utilizez


ionizarea cu radiaii ultraviolete a compuilor ce prsesc coloana cromatografic
dup urmtorul model:
R h R e

Doi electrozi colecteaz electronii rezultai ca urmare a ionizrii, electroni ce formeaz


de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este proporional cu
gradul de ionizare , iar acesta la rndul lui este proporional cu concentraia specieiei
anlizate ce se gsete n acel moment n camera de ionizare.

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, n functie de
mecanismele de separare, astfel exist :
- cromatografia de lichide pe coloana inchisa;
- cromatografia de lichide pe coloana deschisa;
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana inchis snt cunoscute metodele:
1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu
molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina,
folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.
2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara
solida, poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni substante cu o retea solida afnata, de natura organica sau anorganica. Cele
mai raspndite sunt rasinile schimbatoare de ioni.
3.
Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare
poroase dar cu porozitatea selectionata astfel nct sa corespunda
dimensiunilor moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin
pori, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic neretinute odata cu faza
mobila. Tehnica se mai ntlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau
permeatie prin geluri n functie de natura apoasa sau organica a fazei mobile.
4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza stationara este o faza lichida,
nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, ntr-o coloana. Aici
suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este
cea mai raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide.
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana deschisa faza mobila circula
printr-un material poros dispus ntr-un plan si formnd un strat relativ subtire, dar
20

de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana


nchis. Se disting metodele :
1. Cromatogafia pe hrtie, tehnica n care faza stationara este o hrtie poroasa
din celuloza (initial o hrtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte
capilare.
2. Cromatografia pe strat subtire (TLC), n care faza stationara pulverulenta
este fixat de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant,
formnd un strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate.
3. Cromatografia pe strat subtire de nalta performanta (HPTLC), n care faza
stationara are granulatie extrem de fina ridicndu-se astfel eficienta
separarilor dar si viteza acestora.

II.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA


(HPLC)
Cromatografia de lichide de nalt performan ( engl. HPLC - High
Performance Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea
de cromatografie de nalt presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografic cea performant i este folosit n separarea i
identificarea calitativ i cantitativ a substanelor din amestecuri lichide.
Separri i analize de substane imposibul de realizat prin alte metode pot fi
realizate uor prin HPLC. Pe de alt parte la aceast tehnic pot fi fcute i
multe greeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experien
practic bogat dar i de cunostiine stiinifice fundamentale. Avnd n vedere c
att n cromatografia de gaze (GC) ct i in cromatografia de lichide HPLC starea
de agregare iniial a probelor este cea lichid trebuie luat decizia asupra
metodei cromatografice folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute
n vedere urmtoarele:

la cromatografia de gaze proba trebuie adus n stare gazoas prin


nclzire fr ca aceast operaie s duc la distrugere integritii
moleculare a speciei anlizate , in practic numai cca 20 % din speciile
moleculare ndeplinesc aceast condiie [LINDSAY
la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare i au limite
de detecie mai bune dect la cromatografia de lichide
comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare
cromatografic necorespunztoare n gazcromatografie ca urmare analiza
lor trebuie fcut in cromatografie lichid
n cromatografia de gaze exist numai o singur faz staionar care
poate interaciona cu moleculele probei , faza solid sau faza lichid, cu
aceasta faz poate absorbi proba gazoas n orice raport
n HPLC att faza staionar ct i cea mobil pot interaciona mai selectiv cu
proba . Multitudinea acestor interaciuni selective face cromatografia HPLC
multilateral fa de cromatografia de gaze cu ea putnt fi rezolvate
probleme de separare avansat deosebit de complexe.

21

n situaiile n care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru


gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare i snt mai
rapide, iar dac este vorba de determinri curente la anumite clase de
compui trebuie avut in vdere c un gazcromatograf este sensibil mai ieftin
dect un cromatograf pentru HPLC.
La cromatografia HPLC faza mobil purttoare denumit "Eluent"
mpreun cu substanele lichide de analizat este pompat cu ajutorul unei
pompe printr-o coloan cromatografic de separare ce conine faza staionar.
n mod obinuit naintea coloanei de separare propriu zise se cupleaz o pre coloan de separare pentru reinerea impuritilor, coloan care este sensibil
mai ieftin dect coloana de baz. O coloan de separare ntr-un cromatograf
HPLC are lungimea cuprins ntre 5 i 30 cm iar debitul de faz mobil este
cuprins ntre 1-5 ml/min.

La ora actual exist urmtoarele metode de cromatografie de lichide :


cromatografie prin absorbie
cromatografie prin repartiie
cromatografie prin schimb ionic
cromatografie de excludere prin gel

La cromatografia schimbtoare de ioni faza stationar este este o rin


schimbtoare de ioni
iar gradul de separare este dat de intensitatea
interaciunilor intre ionii probei i grupele schimbtoare de ioni din rin . In
cromatografia de excludere ca faz staionar este folosit un gel cu pori mari
care poate separa moleculele dup mrime i form. La acest tip de
cromatografie moleculele mari traverseaz cel mai rapid sistemul cromatografic.
Dac n timpul separarii cromatografice compoziia substanei de analizat
rmne constant tehnica de cromatografic este denumit eluie izocratic.
Dac compoziia fazei analizate este schimbat n timpul procesului de
separare dup o modalitate prestabilit, tehnica poart denumirea de eluie de
gradient. Cea din urm tehnic este folosit atunci cnd domeniul timpilor de
retenie a moleculelor din prob este att de mare nct acetea nu pot fi eluate
ntr-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solveni.
Detectorii folosii n HPLC snt detectori selectivi, ceea ce nseamn c ei
nu rspund la toate moleculele existente nt-un amestec ci numai la anumite
molecule sau clase de compui. In cromatografia de lichide nc nu exist un
detector universal i de inalt sensibilitate aa cum este de exemplu detectorul
de ionizare cu flacr FID din cadrul cromatografiei de lichide, n schimb
detectoarele din cromatografia de lichide acoper un numr mult mai mare de
substane dect cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe snt
greu de detectat n HPLC i trebuiesc aduse dup prsirea coloanei
cromatografice ntr-o form detectabil tehnic denumit derivatizare dup
coloan. Ca i la alte cromatografii n condiii tehnice date pentru analiza
calitativ este definitoriu timpul necesar unei molecule din prob pentru a

22

traversa sistemul cromatografic i a ajunge la detector, timp denumit timp de


retenie. Dat fiind numrul extrem de mare de substane organice unele
substane au timpi de retenie identici situaie n care peak-urile se suprapun
putnd da natere la erori importante de interpretare. Pentru nlturarea acestui
neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC snt spectrometrele. Tot
mai des ieirile din coloanele cromatografice se cupleaz la spectrometre
clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de mas (MS) situaia clasic fiind
cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaii de aparate au sisteme de
performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automat prin
compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare, n momentul
sosirii ei din coloana cromatografic la spectrometru, cu spectrele etalon din
bibliotec electronic de spectre.

Aparatura folosit n cromatografia HPLC


Cromatografele de lichide de nalt performan snt formate dint-un sistem de
vase cu solveni (1) , o pomp de nalt presiune (3), o coloan cromatografic
(6), unul sau mai muli detectori (8), i un sistem de prelucrare a datelor (9), ele
mai snt completate cu elemente de reglare automat a debitului , a presiunii i a
temperaturii. In figura 1 este reprezentat schema de principiu a unui
cromatograf de lichide.

Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt presiune, 3manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem
distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pomp cu sistem de gradient,
11-sistem de msurare a presiunii i a debitului, 12-sistem de introducere prob, 13,14-injector,
14-precoloana cromatografic, 17-, 18-coloan cromatografic, 19-regulator debit de curgere
7- incinta de termostatare a coloanei, 20-detector, 21-preamplificator electronic, 22-sistem de
achiziie i prelucrare date, 23-calculator electronic

Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau


soluii tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul

23

lor de la recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele


folosite pe acest traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare.
O alt recomandare este aceea ca volumul mort , denumit i volum
extracolumnar, ntre introducerea probei i traversarea detectorului s fie
meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o lire de band (vezi i
cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin msuri
constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC
Cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC) acopera azi, n proportie
aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organo-metalice si
anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa
moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea, mpreuna cu cromatografia de

Fig. II.16. Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern


gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Desi
eficacitatea coloanelor nu o egaleaza nca pe cea din GC, prin faptul ca se poate
modifica, pe lnga faza stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face
posibile separari si analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu
spectrometria de masa a transformat, n ultimul timp, aceasta metoda n principalul
mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii

24

pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a dezvoltat biochimia si


biotehnologia moderna.
Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana
clasica, care servea n primul rnd la izolarea preparativa a compusilor naturali. Prin
introducerea pompelor si n consecinta, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm),
dezvoltarea unor faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent
constituite din granule de faze stationare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai
scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd cu anul 1969, la configuratia actuala figura II.16. Se
poate observa ca din recipientele continnd unul sau mai multi solventi pompa (sau
pompele), alimenteaza coloana cu eluent (de regula un amestec de doi sau mai multi
solventi). n imediata vecinatate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul
unui ventil cu by pass. n coloana aflata ntr-o etuva termostat, are loc separarea
propriu-zisa. Efluentul coloanei intra ntr-un detector de unde componentul, daca este
separat complet, poate fi colectat si izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni.
Semnalul este nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n
esenta, un cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai
prezentat colectorul de fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se
poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora constituind-o sursa de
eluent pompa.

Solvent Pompa Injector Coloana Detector nregistrator


Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

II. 2.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de nalta performanta


(HPLC)
Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii n
cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o
coloana si care pot nregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum
decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar
semnalul lor.
ntruct coloanele de separare performante au capacitati de ncarcare mici,
sistemul de detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca n LC volumul
de proba este de ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum
apropiat pentru a se putea sesiza n mod continuu picul cromatografic.
n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare dispozitiv de
analiza chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de
instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinatia dintre un detector
refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza
polimerilor n amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar
posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica n urma adaugarii, cu
un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate
practica chiar nainte de introducerea probei n coloana, dar si dupa iesirea din coloana
a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pna n prezent n special legata de
metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza

25

unor amestecuri de compusi numerosi avnd aceleasi functiuni reactive (de exemplu
aminoacizi).
Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente
analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici n UV-VIS


Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC,
ct si n HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie
colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe
de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.
Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea LambertBeer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita
de detectie sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS
(prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la
ntreaga scala, l. engl.). Astfel n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de
0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele
substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au
grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este
vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor
hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH 2). ntre
acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici
etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de
debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct proporionala cu coeficientul
de extincie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui
mrita lungimea celulei dar aceasta este restricionata. Sensibilitatea este de ordinul
5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.
Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.
1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza
doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa
luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un
domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui
astfel de detector este prezentata n figura II.18.

Sursa Monocromator Celula nregistrator


Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric
2. Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit
si selectarea lungimii de unda la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic
absorbanta celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai
mare sigurana analizei, n sensul ca permite stabilirea puritii, adic daca picul
constituie un semnal dat de o singura substana sau de un amestec (ceea ce se
cunoate sub numele de stabilirea puritii picului).
Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentat n figura II.19.
Detectorul este format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1l-10l care este
intersectata de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treac prin
celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la

26

fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta mrete intensitatea semnalului) si apoi la


sistemul de achiziie, prelucrare si afiare a datelor obinute (8); rezultatul este o
cromatograma (9) ale crui picuri va oferi informaii calitativa si cantitative despre
substanele din soluia analizata.
10
2

6
7

Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de la
coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin
care circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva
detectorului

II. 2.1.2. Detectori refractometrici


Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii.
Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de
transmitere a luminii prin medii transparente avnd un indicele de refractie dat. Astfel, un
fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente
unul continnd doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura
II.20
3

M
5

6
C
2

I
10

27

Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6,6 *fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcie de
unghiul sub care cad razele

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce
separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe
detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt
diferite, motorul primete un semnal de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are
loc compensarea modificrii indicilor de refracie. In urma deplasarii urubului 8 ,
sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta
dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic
nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n
eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n
momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre
detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face
necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea
relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal,
dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia
eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu,
neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura
(0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.

II. 2.1.3. Detectorii electrochimici


Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si
cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv
reduce. Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat
detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante
momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda
analiza si identificare a substantelor.
Exista doua tipuri de detectori electrochimici:
- Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti
- Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la
substantele organice;

II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici


Detectorii conductometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde
substantele disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere n
cromatografia pe schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici
inclusiv acizi organici. Sunt asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg1ng). Detectorii conductometrici msoar conductivitatea fazei mobile. Este constituit din

28

doi electrozi situai in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta
este msurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata.
Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat n figura
II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati
din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula
conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica
conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub
forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A
doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce
la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in
cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de
ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu
5kH.

6
1

4
3

Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta


frecventa, 2- celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat
ce vine de la coloana cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica,
6- amplificator, 7- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 8- cromatograma
in coordonate conductivitate si timp

II. 2.1.3.2. Detectorii amperometrici sau coulometrici


Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din
trei electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar
alimentat cu solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de
referinta se aplica o tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba
cinetica a curbelor de reducere, care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt
negative , figura II.23. ale elementelor care se gasesc in solutia electrolitica complexa.
Din E1 substantele incep sa se reduca, intensitatea de reducere creste cu potentialul.
Daca se aplica potential negativ in partea stanga a lui E0, se observa ca E3 reprezinta
inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii acelui element.

29

i
3

10

4
7

6
2

5
9
8

Fig.II.22.

Principiul de functionare al detectorului electrochimic amperometric. 1- substantele


ce vin de la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4celula electrochimica,5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6electrodul de referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem
de achiziie, prelucrare si afiare a datelor,10- cromatograma in coordonate
intensitatea cinetica si timp

+i

E6

E5

E4

E3
E0

E1

E2

E(mv)

-i

Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinuta


Pentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama
potentialelor. Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se
duc tangente la curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se
duc din capatul tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).

II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta


Detectorii de fluorescenta se bazeaz pe msurarea intensitii fluorescentei
pentru substanele ce prezint acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care
apare la unele substane cnd sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substane emit radiaii
pe o lungime de unda mai mare dect a radiatei incidente. Daca emisia de radiaii are

30

loc in acelai timp cu emisia de radiaie ultravioleta incidenta fenomenul se numete


fluorescenta. Putini compui prezint fluorescenta iar cei ce nu prezint pot fi
transformai in derivai ai lor ce au aceasta proprietate.
Fluorescenta s-a artat a fi foarte folositoare ca proces de detecie iar cu detectorii
bazai pe fluorescenta s-au obinut unele dintre cele mai nalte sensibilitati din
cromatografie de lichide. Tehnicile de detecie bazate pe fluorescenta confer o buna
sensibilitate probelor concentrate si o sensibilitate mult mai mica atunci cnd se folosesc
instrumente de genul senzorilor de temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina
de fluorescenta este msurata pe un fundal ntunecat( sau la zgomot de fond redus).
Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poat fi msurata instrumental, raportul
dintre cantitatea de radiaie remisa si cantitatea de radiaie UV incidenta trebuie sa aib
valori cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este
aranjat astfel incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90), figura
II.24., pe raza incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar
interactiona cu semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal
aproape negru (pentru a mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru).
Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce
monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi
foarte sensibil si relativ ieftin).
1
2

16
15

3
4

t
5

Fig.II.24.

13

14
7

10

11

12

Principiul de funcionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radiaie, 2- fanta,


3- filtru, 4- lentila, 5- substana ce vine de la coloana. 6- substana de analizat, 7cuva cu perei de cuar, 8- unghi de 90 grade,9- substana ce iese din cuva, 10lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem
de preluare, prelucrare si afiare a datelor, 16- cromatograma.

Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la
detectorul de fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si
preluat de sistemul de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate
sub forma unei cromatograme (16).

II. 2.1.5.Detectoare Diode Array

31

Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu


determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.
Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care
emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar
lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7).
Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda
acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este
preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare,
prelucrare si afiare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele
pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o
cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si
timpii lor de retentie (analiza calitativa).
Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10-7 g/ml iar domeniu dinamic
liniar de 5x103.
Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25
2

10
7
t
8
9

Fig.II.25. Principiul de funcionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaii ultraviolete, 2substana ce vine de la coloana cromatografica,3- substana ce pleac la tratament
chimic, 4- fereastr cuart, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6reea de difracie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziie si
afiare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de
unda)

II. 2.1.6. Alti detectori


In practica analitica se mai ntlnesc si alti detectori prezentati schematic n tabelul
2. Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria
de masa si FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin
alte variante de detectie n lipsa etaloanelor cunoscute.
Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre
cunoscute, sa se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate
substantele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenti n proba.
Tab. II.2. Alti detectori utilizati n LC

32

Detectori LC

Limita de
detectie
1-10pg

Caracteristici

Electrochimici
(Amperometrici)

10pg = 1ng

Sensibilitate 10-10M
Compusi oxidabili sau reductibili

Da

Bazati pe
Spectrometria
de Masa (MS)

100pg 1ng

Necesare coloane capilare


Necesara pulverizarea
Pret de cost ridicat

Da

FT-IR

1g

Pret de cost ridicat

Da

Difuzia luminii
Activitate optica
Electrozi ion
selectivi

10g
1ng
10ng

Adecvati pentru macromolecule


Pentru substante optic active
Doar pentru ioni sau compusi
ionizabili

Da
Nu
Nu

Fotoionizare

1pg- 1ng

Nu

Fluorimetrici

Este necesara uneori derivatizarea


Sensibilitate 10-10M

Disponibilitateco
merciala
Da

II. 2.2. Electroforeza capilara


Electroforeza este o metoda cromatografica de analiza la care separarea
componentilor se face pe baza unui gradient de potential in curent continuu.
Electroforeza poate fi:
fara medii stabilizante;
cu medii stabilizante.
Mediile stabilizante pot fi:
hartia electroforetica;
geluri speciale pe placi de sticla;
structuri de pulberi depuse in tuburi.
Bazele electroforezei au fost puse de catre Tisellius ce a dezvoltat electroforeza
fara medii stabilizante figura II.26. a si b. In fig. II.26. a este reprezentata forma initiala a
montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand
sistemul este alimentat cu tensiune electrica componentele se separa in functie de
gradientul lor de potential, fig. II.26.b.

33

electrozi
Solutie
tampon
A

C
C

A+B

B+C

B+C

A+B+C
b

Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante


Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita
incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC
doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe
cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre
electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de
detectare al eletroforezei capilare).

7
8

10

+
I

Fig.II.27.

2
3

1
11

Principiul electroforezei capilare.1- anod, 2- solutie tampon, 3- celula electroforetica,


4- catod, 5- fotodetector (in UV, Dioda Array etc), 6- tub capilar, 7-sursa de radiatie,
8-fanta, 9- Amplificator, 10- sistem de preluare,achiziie si afiare a datelor, 11cromatograma electoforetica

Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice
U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de
potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din amestecul de
analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la
stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi

34

detectati cu ajutorul unui sistem de detectie ce vor transmite semnalul la un amplificator.


Dupa amplificarea semnalul ajunge la sistemul de preluare, achiziie si afiare a datelor
care ne va oferi informatiile in ceea ce priveste substantele din amestecul analizat sub
forma unei cromatograme electroforetice. Fiecare substanta este caracterizata de timpul
propriu de retentie (analiza canlitativa) iar inaltimea picului corespunzator ofera informatii
despre cantitatea de substanta existenta.
Avantaje ale electroforezei capilare sint:
- separarea componentilor dintr-un amestec este mai avansata ca la HPLC i creste cu
cit tensiune electrica aplicata este mai mare
- pretul este mult mai mic decat cel de achizitie a unui HPLC;
- fiabilitate mai buna decit la HPLC

35