Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
CROMATOGRAFIA
Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodata de
analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie ntre
doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula ntr-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila, denumit i eluent , se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea speciilor chimice dintr-un amestec se petrece n coloana
cromatografica, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobila, se scurge continuu, cu
viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoac migrarea,
cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la nceputul coloanei,
folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la
gazcromatografie i pomp de nalt presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si
se afla initial fixat ntr-o zona ngusta de la nceputul coloanei. Spalati de eluent, o parte
din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se
datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu
orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenie si
aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza n
grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila
sesizarea pe rnd a componentilor, la parasirea coloanei cromatografice de catre un
detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (n mod ideal la oricare)
dintre speciile moleculare ce traverseaz coloana ceomatografic. Detectorul d un
semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component n faza mobila.
Intr-o exprimare plastic se poate spune c detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia
din substantele ce compun initial amestecul analizat n mod similar cu un sistem
Video care nregistreaza trecerea liniei de sosire de ctre concurenti n atletism.
mai simpl cromatogram posibil de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind
reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea
(injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului exprimat n unitati
arbitrare.
In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de baz:
1.
Peak- urile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele doua semnale
sau vrfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate n
toate metodele
cromatografice n scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in
amestecul analizat. In acest sens inlimea peak-ului sau suprafaa lui reprezint o
msur a concentraiei speciei chimice i timpul de sosire la detector ( denumit timp de
retenie) reprezint o caracteristic a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogram
este asemntoare
cu o spectrogram. Diferenele intervin la faptul c la o
spectrogram identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de und
care este o constant fizic, iar la o cromatogram identificarea speciilor se face prin
timpul de retenie care este
o mrime caracteristic numai in conditii date de
temperatur, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe
cromatografia este superioar spectrometriei. La analiza spectrometric a unor
amestecuri complexe, cu lungimi de und specifice apropiate pentru unele specii
chimice,
se poate ajunge la identificri greite. Asemenea erori snt excluse la
cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferii prin
dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclus att confuzia acestora ct i
posibilitatea ca acestia s prseasc coloana neidentificai .
Primul peak din cromatogram, de nlime mai redus, corespunde unui
component inert ( gazul purttor n cromatografia de gaze sau diluantul lichid in
cromatografia de lichide ) - care este retinut n foarte mic msur de coloana
cromatografic. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice n cazul
de fata) analizate. Sosirea intirziat a grupului de molecule a acestei specii fa de
eluent se datoreaz staionarii mai ndelungate n coloana cromatografic ca urmare
afinitii mai mari a acestei specii fa de materialul coloanei. Gradul de afinitate este
exprimat prin numrul absorbiilor i desorbiilor repetate de pe umplutura sau pere ii
coloanei i este o caracteritric a naturii speciilor analizate. Cu ct numrul absorbiilor
i desorbiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de ctre o specie chimic
cu att mai trziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe
timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval
Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet neretinut de catre
faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pna la detector. Acesta nu
poate fi zero. n cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu
timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul
scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloana si aparitia maximului de
concentratie n detector, pentru componentul neretinut.
Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al
amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie n detector. De exemplu, n cazul prezentat anterior n
fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pna la
verticala prin vrful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau n amestec.
Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie
(legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Qe):
VR = tRQe
Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea
compara timpii masurati pe coloane diferite, n cazul aceluiai component - este dat de
diferenta:
tR' = tR - tM
Volum de retentie ajustat are expresia :
VR' = VR - VM
unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
VM = tMFe
si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.
nclzire n alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiz este acela n care
amestecurile supuse analizei snt n stare lichid din care snt aduse n stare gazoas
prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este
la substanele la care temperatura de vaporizare este mai mare dect temperatura de
descompunere a substantelor de analizat rezultind ali compui dect cei supui
analizei. In aceste cazuri nainte de introducerea probei n cromatograf se pot realiza
niste derivati (compusi noi), volatili, utiliznd anumite reactii chimice specifice, procedeu
denumit derivatizare. Uurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa,
posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele
principale ale acestei metode.
Printre domeniile n care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia,
industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica.
La cromatografia cu gaze proba este evaporat la intrarea
n coloana
cromatografic fie direct la captul acestei fie ntr-un dispozitiv special plasat tot la
intrarea n coloan. Separarea de-a lungul coloanei (eluia) are loc cu ajutorul unui gaz
purttor care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacioneaz cu faza
mobil , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din
amestec prin coloan. nceputurile Cromatografiei de gaze snt legate de coloane cu
umplutur n care se transfera amestecul de substane gazoase dup ce n prealabil
erau evaporate spontan ntr-un injector nclzit. La ora actual este folosit n
exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fr umplutur cu cele
dou[ tipuri :
- cromatografia de gaze pe faze staionare solide (cromatografie de absorbie)
- cromatografia de gaze pe faze staionare lichide (cromatografie de repartiie)
La cromatografia de gaze
pe faze staionare solide retenia speciilor de
analizat din amestec este realizat pe baz de absorbie fizic pe peretele interior al
coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii i lungimi
apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbii ireversibile, care duc
la rndul lor reproductibiliti slabe,
aceast tehnic este folosit rar i numai la
substane cu puine molecule n structur.
Cromatografia de gaze
pe faze staionare lichide se bazeaz pe repartiia
substanei de analizat ntre faza mobil gazoas i o faza lichid
imobilizat pe
peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este
folosit la ora actual la scara cea mai larga. Relaiile matematice care o descriu snt
valabile cu mici modificri i la cromatografia de lichide, aceste modificri snt dictate
de faptul c gazele snt compresibile i ca atare proprietile i comportarea reologic
snt influenate de presiune i de temperatur. Din acest motiv la cromatografia de
gaze este folosit n locul timpului de retenie tr volumul de retenie Vr care ine cont de
debitul mediu Q al fazei mobile exprimat n ml/min, debit ce depinde de presiune i
de temperatur :
Vr= tr . Q
Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen mare
asupra lirii de band ( vezi i cap. Cromatografia de lichide) influena difuziei
longitudinale fiind important dtorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine
de mrime la gaze fa de cel al lichidelor.
mici de prob, aa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manual duce la erori
importante motiv pentru care pentru dozare i injecie snt recomandate dispozitive de tip
autosampler.
(divizarea) probei ,prin aceast operaie numai o mic parte a acesteia, la limita dozrii
volumice, este admis n colan cealalt parte fiind purjat n atmosfer. Aceast
cantitate emic de substan analizat este motivul limitei de detecie mai sczute. Att
coloanele cu umplutur ct i cele capilare pot funciona n regim de cromatografie de
absorbie (gaz- solid) sau n regim de cromatografie de repartiie (gaz - lichid).
La folosirea coloanelor cu umplutur pentru cromatografia de absorbie umplutura
este format dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de repartiie
umplutura este format dintr-un material poros figura II.5, a crui suprafa este
impregnat cu o faz lichid staionar.
vr
v ma
v mp
La detectoarele
sensibile la variaie de concentraie semnalul electric al
detectorului este proporional cu concentraia momentan a substanei (i) din volumul
din imediata vecintate a detectorului. La un detector sensibil la variaie de debit masic
semnalul electric al detectorului este proporional cu debitul masic (Mi), adic cu masa
de substan ce trece n unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile
la variaia de concentraie snt influenate de debitul de gaz purttor motiv pentru care
debitul de gaz purttor trebuie reglat automat n vederea meninerii constante a valorii
lui. Influena debitului de gaz purttor nu se manifest la detectoarele sensibile la
variaie de debit masic.
Sensibilitatea S a detectorului reprezint nivelul de conversie a mrimii
fizice neelectrice ntr-o mrime electric proporional. La detectoarele sensibile la
10
de ex
11
Limita de determinare real Ldet reclam valori mai mari pentru (f) dect n
cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie s fie cuprins ntre 5-10
corespunztor cu sigurana statistic cerut pentru rezultatul msurtorilor.
Constanta de timp () , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a
electronicii aferente, reprezint timpul care trece din momentul iniierii msurtorii
pn n momentul n care este indicat 63,2% a ntregului semnal. Dup (5) se obin
99,3 % a ntregului semnal
Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie
12
13
Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3sistem de adaptare pentru sonda optic, 4-flacr de hidrogen, 5-lentil colimatoare din
sticl de cuar, 6- fibr optic de transmisie, 7-spectrometru cu reea de difracie i
detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afiare i tiprire spectre
14
a)
b)
Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P). 1arztor, 2- flacr de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin, 6plasm, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afiare
15
Fig.II.12.
Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic
compact bine termostatat n care se gsesc patru celule de gaz identice prevzute
cu filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm, legate electric ntr-o
punte de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o msurare comparativ de
compensaie. n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale
braelor punii, trece gazul purttor pur, iar prin celelalte dou brae ale punii trece
gazul purttor n amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt
parcurse de un curent electric care provoac nclzirea acestora prin efect JouleLenz. Temperatura srmelor i prin aceasta i rezistena lor electric depinde de
16
17
Sensibilitatea relativ
Hidrocarburi
eteri, esteri
10
100
104
105
106
Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizrii.
Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleiai grupri chimice deoarece
ea depinde de structura legturilor .
18
19
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, n functie de
mecanismele de separare, astfel exist :
- cromatografia de lichide pe coloana inchisa;
- cromatografia de lichide pe coloana deschisa;
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana inchis snt cunoscute metodele:
1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu
molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina,
folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.
2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara
solida, poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni substante cu o retea solida afnata, de natura organica sau anorganica. Cele
mai raspndite sunt rasinile schimbatoare de ioni.
3.
Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare
poroase dar cu porozitatea selectionata astfel nct sa corespunda
dimensiunilor moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin
pori, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic neretinute odata cu faza
mobila. Tehnica se mai ntlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau
permeatie prin geluri n functie de natura apoasa sau organica a fazei mobile.
4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza stationara este o faza lichida,
nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, ntr-o coloana. Aici
suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este
cea mai raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide.
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana deschisa faza mobila circula
printr-un material poros dispus ntr-un plan si formnd un strat relativ subtire, dar
20
21
22
Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt presiune, 3manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem
distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pomp cu sistem de gradient,
11-sistem de msurare a presiunii i a debitului, 12-sistem de introducere prob, 13,14-injector,
14-precoloana cromatografic, 17-, 18-coloan cromatografic, 19-regulator debit de curgere
7- incinta de termostatare a coloanei, 20-detector, 21-preamplificator electronic, 22-sistem de
achiziie i prelucrare date, 23-calculator electronic
23
24
25
unor amestecuri de compusi numerosi avnd aceleasi functiuni reactive (de exemplu
aminoacizi).
Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente
analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.
26
6
7
Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de la
coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin
care circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva
detectorului
M
5
6
C
2
I
10
27
Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6,6 *fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcie de
unghiul sub care cad razele
Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce
separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe
detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt
diferite, motorul primete un semnal de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are
loc compensarea modificrii indicilor de refracie. In urma deplasarii urubului 8 ,
sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta
dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic
nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n
eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n
momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre
detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face
necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea
relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal,
dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia
eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu,
neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura
(0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.
28
doi electrozi situai in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta
este msurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata.
Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat n figura
II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati
din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula
conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica
conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub
forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A
doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce
la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in
cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de
ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu
5kH.
6
1
4
3
29
i
3
10
4
7
6
2
5
9
8
Fig.II.22.
+i
E6
E5
E4
E3
E0
E1
E2
E(mv)
-i
30
16
15
3
4
t
5
Fig.II.24.
13
14
7
10
11
12
Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la
detectorul de fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si
preluat de sistemul de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate
sub forma unei cromatograme (16).
31
10
7
t
8
9
Fig.II.25. Principiul de funcionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaii ultraviolete, 2substana ce vine de la coloana cromatografica,3- substana ce pleac la tratament
chimic, 4- fereastr cuart, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6reea de difracie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziie si
afiare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de
unda)
32
Detectori LC
Limita de
detectie
1-10pg
Caracteristici
Electrochimici
(Amperometrici)
10pg = 1ng
Sensibilitate 10-10M
Compusi oxidabili sau reductibili
Da
Bazati pe
Spectrometria
de Masa (MS)
100pg 1ng
Da
FT-IR
1g
Da
Difuzia luminii
Activitate optica
Electrozi ion
selectivi
10g
1ng
10ng
Da
Nu
Nu
Fotoionizare
1pg- 1ng
Nu
Fluorimetrici
Disponibilitateco
merciala
Da
33
electrozi
Solutie
tampon
A
C
C
A+B
B+C
B+C
A+B+C
b
7
8
10
+
I
Fig.II.27.
2
3
1
11
Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice
U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de
potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din amestecul de
analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la
stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi
34
35