Analiza Probelor Biologice

Curs 6
Prof. Stefan Ioan VOICU
Facultatea de Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor
Departamentul de Chimie Analitica si Ingineria Mediului
stefan.voicu@upb.ro; svoicu@gmail.com
Cromatografia

https://www.polymersolutions.com/blog/what-is-chromatography/
Cromatografia

Metodele cromatografice reprezinta in primul rand metode de separare care au la baza afinitatea diferita
a componentilor unui amestec dintr-o faza mobile si una stationara. Scopul principal al cromatografie il
reprezinta separea unui amestec de compusi in scopui analitice, dar de asemenea poate servi la
indentificarea si cuantificarea compusilor din amestecul de analizat (analiza calitativa si analiza
cantitativa) . In toate variantele cromatografice, separarea precede analiza calitativa si/sau cantitativa.
Din punct de vedere istoric, descoperirea cromatografie ii este atribuita botanistului M.S. Tswett, care
anul 1900 a separat pigmenti vegetali (clorofila si carotenoizi) folosind o coloana umpluta cu CaCO 3
(faza stationara) si un amestec de eter-etanol ca eluent .
O coloana (sau un alt support ex. TLC –thin layer chromatography), contine faza staionara, iar faza
mobile transporta proba (amestceul de separa) in sistem . Componentii care prezinta o mai buna
afinitate pentru faza stationara raman mai mult timp in coloana fiiind separati de componenti cu
afinitate pentru faza mobile care trec mai repede prin coloana. Altfel spus cromatografia are la baza
echilibru de distributie intrce cele doua faze. Efectul, este numit retentie şi aceasta provoaca o asa-
numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza in grupuri, in fiecare grup existand doar
molecule de acelasi fel.
Cromatografia

Prima faza este faza stationara (imobila) , care de regula se afla intr-un tub subtire, denumit coloana ,
iar cea de a doua faza este faza mobila (eluent) ce se deplaseaza prin golurile primei faze, procesul de
separare avand in coloana cromatografica. Amestecul de separat se introduce sub forma de solutie la
inceputul coloanei, pentru ca mai apoi sa fie spalat de eluent , moment in care componentii probei
migreaza prin coloana la viteze diferite , datorita interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei
si faza stationara.
Dupa iesirea componentilor din coloana ei pot fi determinati cantitativ utilizand detectori sau pot fi
conectati pentru analize ulterioare. Reprezentarea grafica a semnalului detectorului în functie de timp
poartă numele de cromatograma.
Un instrument analitic poate fi combinat cu o metoda de separare, iar in practica de zi cu zi de obicei
cromatografele sunt conectate cu alte instrumente de analiza - cromatografie de gaze sau cromatografie
de lichide sunt cuplate cu spectrometrie de masa (GC-MS; LC-MS), sau cu spectrometrie in IR cu
transformata Fourier (GC-FTIR), cromatografie de lichide de inalta performanta cu spectrometria de
absortie in UV-VIS (HPLC-UV-VIS).
Cromatografia

Metodele cromatografice au la baza mecanisme de sorbtie, precum :

 Adsorbtia
 Repartitia
 Schimbul ionic
 Excluderea sterica
 Afinitatea biospecifica

Adsorbtia – sta la baza cromatografiei gaz-solid, moleculele solutului fiind retinute la suprafta unei
faze stationare solide,; faza mobile putand fi lichida sau gazoasa
Repartitia – faza stationara este un lichid, depus pe un support inert; faza mobile putand fi lichida sau
gazoasa
Schimbul ionic – faza stationara este un schimbator de ioni , faza mobila fiind lichida
Excluderea sterica – faza stationara este un gel cu dimensiuni controlate ale porilor, faza mobile fiind
lichida
Afinitatea biospecifica – faza sationara contine suprafete biochimic active
 
Cromatografia

1. CROMATOGRAFIA PLANA
 
 Cromatografie pe hartie
 Cromatografie pe strat subtire (TLC)
Cromtografia plana pe hartie – faza stationara este depusa pe o suprafata plana ( foaie de hartie de
filtru ) iar faza mobila si analitul trec prin faza sationara prin capilaritate sau sub actiunea gravitatiei.
Cromatografia plana pe strat subtire – faza stationara este depusa intr-un start subtire pe o placuta de
plastic sau sticla ; faza stationara este un start subtire de adsorbent pulverulent precum silicagel,
celuloza, alumina, poliamida . Proba lichida sau dizolvata intr-un solvent organic se depune sub
picatura pe faza stationara. Compenentii probei se deplaseaza pe placuta cu viteze diferite datorita
afinitatii diferite fata de cele doua faze. Componentii amestecului putand fi indentificati/vizualitati fie
cu ajutorul unor substante reactive, fie sub actiunea unor gaze reactive , fie sub vapori de iod sau pot
fi vizualitati in lumina UV.
Cromatografia plana pe strat subtire este des utilizata in separarea compusilor organici si in
monitorizarea evolutiei reactiilor organice.
 
Cromatografia

https://www.news-medical.net/life-sciences/Planar-Chromatography.aspx
Cromatografia

https://journals.plos.org/plosone/article/figures?id=10.1371/journal.pone.0042942
Cromatografia

https://www.nlm.nih.gov/exhibition/visibleproofs/
galleries/exhibition/newscience_image_2.html
Cromatografia

1. CROMATOGRAFIA PE COLOANA
Coloana (elementul de baza al cromatografiei)
este umpluta cu faza stationara, iar proba este
dizolvata in faza mobila (eluent) si injectata la varful
coloanei. Odata cu trecerea amestecului prin
coloana, acesta se partitioneaza intre faza mobile si
faza stationara . Astfel, compusii cu afinitate mai
mare pentru faza stationara trec mai lent prin
coloana .
Cromatograma – reprezentarea grafica a semnalului
detectat in functie de timpul de elutie (timpul
petrecut in coloana ).
Legenda : h- inaltimea picului; w- latimea
Eluent – faza mobila introdusa la varful coloanei
picului la baza; σ- abaterea standard
pentru a elua proba
= ;atimea picului la 0.607 din inaltime; tR-
Eluatul – speciile (componetii) eluate pe la baza timp de retentie; tM- timp mort
coloanei (componentii separati)
Cromatografia

Pe o cromatograma se disting o serie de maxime, numite picuri (peak), care se produc

deasupra liniei de baza sau a porţiunii orizontale a curbei, paralelă cu axa timpului. Aceasta
portiune apare ori de câte ori in detector nu apare nici un component, în afara eluentului.
Oricare peak are, în cazul ideal, forma distribuţiei normale Gauss. Timpul de retentie (tR) –
timpul din momentul injectarii probei si aparitia maximului de concentratie ; este o marime
caracteristica fiecarui component in parte. Timpul mort (tM- timpul necesar unui component
neretinut de catre faza stationara pentru a parcurge coloana. Timpul de retentie corectat
(ajustat) (tR`) – timpul suplimetar necesar probei sa traverseze coloana, din care se scade
timpul necesar fazei monile; a fost introdus in cromatografie pentru a se putea compara
timpii petrecuti in coloane diferite pentru acelasi component. Coeficientul de distribuţie, K -
definit prin raportul dintre concentraţiile componentului în faza staţionara, CS, respectiv
mobila, CM. Coeficientul de distributie determina viteza medie a zonei unui compus care
migreaza prin coloana cromatografica fiind antrenat de faza mobile.
Cromatografia

Timpii de retentie sunt utili in identificarea calitativa a speciilor din amestec. In aceleasi conditii,
acelasi analit va avaea intotdeauna acelasi timp de retentive. O proba de control a analitului
presupune determinarea timpului de retentie al analitului , iar prezenta analitului intr-o proba
complexa este identificat prin prezenta unui pic la acelais timp de retentive ca Acela din proba de
control. Inaltimea picului si aria de sub acesta este utilizata in obtinerea de date cantitative .Astfel,
concentratia analitului este proportional cu aria (sau inaltimea) picului observat pe cromatograma.
Cromatografie gaz-solid GSC (FS – solid ; FM-gaz); mecasnisme de adsorbtie
Cromatogarfie gaz-lichid GLC (FS –lichid ; FM- gaz); mecanisme de rapartitie
Cromatografie lichid-solid LSC (FS-solid; FM-lichid); mecansme de adsorbtie
Cromatografie lichid-lichid LLC (FS- lichid; FM-lichid); mecanisme de partitie
Cromatografie de schimb ionic IEC (FS-schimbator de ioni; FM-lichid); mecanisme de schimb ionic
Cromatografie de excludere EC (FS- gel ; FM- lichid); mecanisme de excludere sterica
Cromatografie de afinitate (FS- suprafata biochimic active; FM- lichid)
Cromatografia

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/0726090
Cromatografia – secventiere ADN

https://brcf.medicine.umich.edu/cores/advanced-genomics/faqs/sanger-sequencing-faqs/interpretation-of-sequencing-
chromatograms/
Cromatografia - separare si detectie proteine prin UV-Viz

https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=11396
Micoscopia optica

https://www.drugtargetreview.com/news/27846/uv-light-microscope-useful-tool/
Microscopia optica
 Microscopia optica – scurt istoric

În ultimul timp, în multe domenii s-a înregistrat o cre ștere substan țială a aplica țiilor microscopiei optice pentru
investigații la nivel micrometric și submicrometric. Dezvoltarea rapidă a tehnicilor de fluorescen ță a accelerat
extinderea microscopiei de fluorescență în aplicații de laborator și în cercetare. De asemenea, dezvoltarea imagisticii și
analizei digitale a permis obținerea măsurătorilor cantitative rapid și eficient pe probe metalice, ceramice, polimerice
sau biologice. Utilizând tehnicile video digitale, microscopia optică poate fi utilizată pentru analiza unor sec țiuni
optice foarte fine, sistemele optice confocale fiind folosite în majoritatea institu țiilor de cercetare.
Până în secolul al XIX-lea, microscopi știi erau deranja ți de abera ții optice, imagini neclare și de lentilele incorect
proiectate. Pe la mijlocul acelui secol, abera țiile au fost par țial corectate prin introducerea obiectivelor acromatice de
către Lister și Amici care au redus aberațiile cromatice și au crescut aperturile numerice la aproximativ 0,65 la
obiectivele uscate și 1,25 la obiectivele cu imersie omogenă.
În 1886, cercetările lui Ernst Abbe și ale lui Carl Zeiss au condus la producerea obiectivelor bazate pentru prima dată
pe principiile opticii, acusticii și pe proiectarea lentilelor. Aceste obiective avansate au oferit imagini cu abera ții de
sfericitate reduse și fără distorsiuni coloristice (aberații cromatice) la aperturi numerice mari.
Câțiva ani mai târziu, în 1893, profesorul August Köhler a descris o metodă de iluminare pentru optimizarea
fotomicrografiei care permitea folosirea întregii puteri de rezolvare a obiectivelor Abbe. Ultima decadă a secolului al
XIX-lea a oferit multe inovații în domeniul microscopiei optice, incluzând microscoapele metalografice, fotolentile
astigmatice, microscoape binoculare cu prisme și primul stereomicroscop. La începutul secolului XX, producătorii de
microscoape au dezvoltat sisteme de obiective care permiteau men ținerea imaginii focalizate la schimbarea
obiectivului prin rotirea revolverului.
Microscopia optica – tipuri de microscopie

In principiu exista doua tipuri de bază de microscoape optice:

microscoape simple și microscoape compuse. Un microscop simplu
folosește puterea optică a unui singur obiectiv sau a unui grup de
lentile pentru mărire. Un microscop compus folosește un sistem de
lentile (un set mărind imaginea produsă de altul) pentru a obține o
mărire mult mai mare a unui obiect. Marea majoritate a
microscoapelor moderne de cercetare sunt microscoape compuse.
Microscopul simplu
Un microscop simplu folosește un obiectiv sau un set de lentile
pentru a mări un obiect numai prin mărire unghiulară, oferind
privitorului o imagine virtuală mărită. Utilizarea unei singure
lentile convexe sau a unor grupuri de lentile se găsește în
dispozitive de mărire simple, cum ar fi lupa, lupele și ocularele
pentru telescoape .
Microscopia optica – tipuri de microscopie

Un microscop compus folosește o lentilă apropiată de obiectul

vizualizat pentru a colecta lumina (numită lentilă obiectiv) care
focalizează o imagine reală a obiectului în interiorul
microscopului. Imaginea respectivă este apoi mărită de un al
doilea obiectiv sau grup de lentile (numit ocular) care oferă
privitorului o imagine virtuală mărită inversată a obiectului.
Utilizarea unei combinații obiective compuse / ocular permite o
mărire mult mai mare. Microscoapele obișnuite compuse au
adesea lentile de schimb interschimbabile, permițând
utilizatorului să regleze rapid mărirea. Un microscop compus
permite, de asemenea, configurări de iluminare mai avansate,
cum ar fi contrastul de fază.
Microscopia optica

Microscoapele compuse, in functie de modul de transmisie a luminii se impart in

urmatoarele tipuri :
 microscopul cu fond clar (cu camp luminos; de transmisie directa ) – cel mai comun
microscop, proba este iluminată direct cu lumina vizibilă, proba de analizat trebuie să fie
colorată şi translucidă;
 microscopul cu contrast de fază – proba este iluminată direct în lumină vizibilă, folosit
pentru vizualizarea probelor incolore şi transparente;
 microscopul cu fond întunecat - proba este iluminată indirect cu lumină vizibilă,
observatorul percepe razele refractate, difractate sau reflectate, proba pare sa lumineze;
 microscopul cu fluorescenţă – proba este iluminată direct însă este vizualizată doar
lumina emisă, proba trebuie să conţină flourocromi ce au fluorescenţă;
 microcopul cu UV - proba este iluminată direct cu lumină UV;
 microscopul cu lumină polarizată – pentru vizualizarea probelor ce conţin substanţe optic
active.
Rezolutia

Distanta dintre doua puncte care

se pot observa distinct

In MO rezolutia maxima este de

aproximativ 0,2 microni

http://www.histology.ro/Histology/Biologie_celulara_MG_an_I_files/03_Microscopie%20optica_site_2018.pdf
Microscopia optica

http://www.histology.ro/Histology/
Biologie_celulara_MG_an_I_files/03_Microscopie
%20optica_site_2018.pdf
Microscopia optica de flourescenta

Se folosește pentru examinarea celulelor vii sau fixate, în care diferite componente celulare/tisulare
sunt marcate cu fluorocromi/fluorofori (substanțe fluorescente). Fluorocromii absorb lumină de o
anumită lungime de undă (excitație) și emit apoi lumină la o lungime de undă superioară (emisie).
Lumina de excitație poate proveni de la un laser (monocrom) sau de la o lampă (policromă) cu un filtru
care lasă să treacă doar o anumită lungime de undă. Preparatele de fluorescență se studiază în
întuneric, pentru a se detecta mai ușor emisia luminoasă.

http://www.histology.ro/
Histology/
Biologie_celulara_MG_an_I_files
/03_Microscopie
%20optica_site_2018.pdf
 Teste de viabilitate celulara pe membrane pentru osteointegrare

S.I. Voicu, R.M. Condruz, V. Mitran, A. Cimpean, F. Miculescu, C. Andronescu, M. Miculescu, V.K. Thakur, Sericin Covalent Immobilization onto Cellulose
Acetate Membranes, ACS Sustainable Chemistry and Engineering, 2016, 4(3), 1765-1774, DOI: 10.1021/acssuschemeng.5b01756
Teste de viabilitate celulara pe membrane pentru osteointegrare

A.M. Pandele, P. Neacsu, A.

Cimpean, A.I. Staras, F.
Miculescu, A. Iordache, S.I.
Voicu, V.K. Thakur, O.D.
Toader, Cellulose acetate
membranes functionalized with
resveratrol by covalent
immobilization for improved
Osseointegration, Applied
Surface Science, 2018, 438, 2-
13.
Celule canceroase mamare

https://dissolve.com/stock-photo/Fluorescence-
microscopy-stress-fibers-breast-cancer-royalty-free-
image/101-D943-211-356
Neuron

https://br.pinterest.com/pin/313985405243350995/
SARS-COV 2

https://
www.electrooptics.com/
feature/how-super-
resolution-microscopy-
can-reveal-coronavirus