Analiza Probelor Biologice

Curs 4
Prof. Stefan Ioan VOICU
Facultatea de Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor
Departamentul de Chimie Analitica si Ingineria Mediului
stefan.voicu@upb.ro; svoicu@gmail.com
Curs 4, Metode spectrofotometrice pentru analiza
probelor biologice 1

https://www.sib.swiss/about-sib/news/10307-deep-learning-a-leap-forward-for-protein-
structure-prediction
Lumina

Interactiunea luminii cu materia se afla la baza perceptiei vizuale umane, deoarece o parte
semnificativa a cortexului cerebral este dedicata procesarii vizuale. Acest mecanism complex incepe cu
izomerizarea indusă de lumină a unei molecule din retină care declan șează o cascada de mesageri
pentru a putea avea loc transmiterea unui impuls nervos din retină; si precum este cunoscut datorita
vederii, omul acumuleaza cea mai mare parte de informatii (peste 90%).
O mare parte din chimia instrumentala moderna se bazeaza pe studiul schimbului de energie
dintre radiatia electromagnetica si materie, putand fi astfel obtinute atat informatii calitative cat si
cantitative despre natura substantelor.
Conform fizicii elementare, o sarcina este inconjurata de un camp electric si o sarcina în miscare,
adică un curent electric, genereaza la randul sau un camp magnetic. De asemenea sarcinile accelerate
emit radiatii electromagnetice, in timp ce radiatiile accelerează particulele incarcate.
Radiatia electromagnetica se refera la undele campului electromagnetic ce se propaga prin spatiu
transportand energie radiant electromagnetica. Aceasta are un comportamnet dual – atat de unda cat
si de particula. Componentele (electrica si magnetica) oscileaza perpendicular una pe alta dar si pe
directia de propagare
 
Lumina - unda electromagnetice
Lumina – caracteristici cantitative

Caracteristicile cantitative ale luminii sunt :

- Lungimea de unda a oscilatiei λ - [cm]
- Frecventa – ν [Hz]
- Amplitudinea – A [cm]
- Ungiul de polarizare [°]
 
, unde c este viteza luminii
Lumina – caracteristici cantitative

Radiatia electromagnetica (lumina) este alcatuita din “pachete discrete” de

energie numite fotoni, a caror energie poate fi redata prin urmatoarea
ecuatie. Orice raza de lumina este asociata unui flux de fotoni, astfel
fiecare foton are energia E si masa m, astfel :

unde – numarul de unda [cm], λ

- constanta lui Plank =6.63*10-34J-s
Spectrul electromagnetic

Spectrul electromagnetic. In functie de lungimea

de unda si de frecventa, o undă
electromagnetica este inclusa intr-una dintre
regiunile in care este impartit spectrul. Spectrul
electromagnetic acopera o gama larga de
frecevente, iar domeniul vizibil reprezinta doar o
mica parte din acesta. Traditional, divizarea
spectrului electromagnetic in regiuni este
artificiala deoarece nu exista diferente
fundamentale intre radiatiile din aceste regiuni
dincolo de energiile implicate. Cu toate acestea,
fiecare regiune poate fi de obicei legata de
anumite aplicatii tehnologice (de la comunicatii
radio pana la chirurgia cu raduatii gamma) sau
de o anumita metoda spectroscopica, aceasta
din urma depinzand de nivelurile de energie la
care radiatia provoaca o tranzitie sau alte
procese ce pot apărea in atomii sau molecule
expuse acelei radiatii.
Spectrul electromagnetic – analize efectuate cu ajutorul
diferitelor tipuri de radiatii
Interactiunea radiatiei cu materia

Din studiile mecanice cuantice, in special postulatele lui Bohr, s-a putut stabili ca absorbtia sau
emisia radiatiilor este posibila datorita nivelurilor cuantificate de energie din inetriorul atomilor sau
moleculelor. Astfel un sistem poate experimenta o tranzitie intre doua stari (1 si 2) daca energia
radiatiei electromagnetice absorbite este egala cu diferenta de energie dintre cele doua stari (conform
ecuatiei)
ΔE1 → 2 = E2 - E1 = hν
Pe de alta parte, emisia de radiatii se datoreaza revenirii unui sistem (atomic sau molecular) dintr-o
stare excitata la o stare de energie mai scazuta, , iar energia radiatiei emise corespunde diferenetei de
energie dintre cele doua stari de tranzitie

Absorbitia si emisia de
energie intre doua niveluri
de energie
 Spectrofotometria UV-Viz

Printre primele metode instrumentale optice de analiza utilizate frecvent in laboratoarele de analize
chimice se numara metoda bazata pe absorbtia luminii din domeniul vizibil (VIS). Exista mai multe
variante pentru acest tip de metoda: colorimetria, fotometria si spectrofotometria. Colorimetria – este o
tehnica folosita in special pentru determinari cantitative, ce consta in compararea (vizual sau
instrumental) in lumina alba a intensitatii culorii probei cu un set de solutii etalon (a caror concentratie
este cunoscuta). Atunci cand compararea se face cu ajutorul ochiului uman intra in discutie atat
subiectivitatea cat si sensibiliatea ochiului uman , astfel acest tip de tehnica nu este foarte specifica. Pe
de alta parte colorimetria instrumentala este mult mai obiectiva, dar in practica nu este utilizata foarte
des. Fotometria si spectrofotometria masoara instrumental lumina transmisa de o solutie colorata
lucrand cu o sursa de lumina monocromata. In functie de spectrul luminii incidente avem – fotometrie
(fascilul incident este filtrat cu ajutorul unor filter optice – se obtine un spectru mai larg);
spectrofotomerie – fascilul incident este filtrat cu ajutorul unor monocromatoare – se obtine un spectrul
mai ingust. In ambele variante se va obtine un spectru de absorbtie, adica o curba obtinuta prin
masurarea semnalului in fucntie de lungimea de unda a radiatiei incidente.
In legatura doemniul lungimilor de unda unde pot fi folosite, in practica, de cele mai multe ori vom
intalni spectrofotometre care lucreaza in ambele domenii de lungimi de unda – UV (ultraviolet) – VIS
(vizibil) .
Spectrofotometria UV-Viz
Spectrofotometria UV-Viz

Asa cum se observa si din reprezentarea grafica, radiatia incidenta produsa de sursa S, este focalizata
cu ajutorul unei lentile – L , pentru ca mai apoi cu ajutorul unei prisme (monocromator) – P, altui set de
lentile (L) si a unor fante (F) aceasta este redusa la o lungimea de unda (spectrul dorit- cat mai ingust)
avand o intesitatea I0., pentru ca mai apoi sa treaca prin cuva de proba (ce contine solvent si solut),
unde intensitatea fasciculului scade (I), pentru ca acesta sa ajunga pe un detector care va transforma
semnalul optic in semnal electric urmand a fi transmis unui calculator dotat cu un sistem specific de
calcul si de prelucrarea datelor. In practica exista doua tipuri de spectrofometre – monocanal (un singur
drum optic – proba de analizat si proba etalon – vom avea nevoie de doua masuratori diferite);
comparative (doua canale) - proba etalon si proba de analizat vor fi asezate simultan in aparat – o
singura masuratoare).
Spectrofotometria UV-Viz

Sergio Braga, Mauro & Gomes, Osmar & Jaimes, Ruth & Braga, Edmilson & Borysow, Walter & Salcedo, Walter. (2019).
Multispectral colorimetric portable system for detecting metal ions in liquid media. 1-6. 10.1109/INSCIT.2019.8868861.;
Fig 2 Schematic representation of the dual-beam UV-VIS spectrometer.
Spectrofotometria UV-Viz

Absorbția radiațiilor vizibile și ultraviolete (UV) este asociata cu excitarea electronilor, din atomi sau
molecule, de la niveluri de energie mai mica până la niveluri mai mari. Deoarece nivelurile de energie
ale materiei sunt cuantificate, numai lumina cu o cantitatea precisă de energie poate provoca tranzi ții
de la un nivel la altul si va fi absorbita. Orbitali electronici ai atomilor și moleculelor au energii
caracteristice, dând naștere la un set de nivele de energie discrete. Un electron este capabil să se
schimbe de la un orbital ocupat la un alt orbital, câ știgând sau pierzând energie doar în cantită ți
corespunzătoare exact diferenței dintre două niveluri: trecerea de la starea initiala stabila (cea mai
mică energie posibilă) E0 la un nivel mai ridicat la energie. En este posibilă dacă molecula absoarbe
radiație electromagnetice cu lungimea de undă corespunzătoare

λ = ch / (En - E0),

unde
c este viteza luminii și h este constantă a lui Planck.
Spectrofotometria UV-Viz

Tranziții electronice:
o Tranziții care implică electroni p, s și n.
o Tranziții care implică electroni de transfer de sarcină
o Tranziții care implică electroni d și f
 
Nivele excitate există de obicei numai pentru o perioadă foarte scurtă de timp (femtosecunde la
microsecunde), deoarece starea energetică mai mare este instabilă, iar energia suplimentară se pierde
prin procese de relaxare, cum ar fi emisia de lumină. De obicei, diferen ța de energie dintre nivelul E 0
și primele niveluri excitate pentru multe molecule corespunde undelor electromagnetice din domeniul
ultraviolet (UV) și vizibil ale spectrului electromagnetic.
In general moleculele se gasesc în stare “normala” (nivel energetic de baza – fundamental) Supuse
iradierii, moleculele absorb energie, rezultatul fiind trecerea pe nivele superioare (stsri excitate)
Reprezentarea grafică a varitiei unei mărimi dependente de absorbtia energiei, în functie de lungimea
de unda, de frecventa sau de numarul de undă = SPECTRU
Atomii – spectre de linii
Moleculele – spectre de benzi (complexitatea moleculelor)
 Spectrofotometria UV-Viz

Legea Beer-Lambert:
Aceasta lege reprezinta legea de baza folosita in analizele sau determinările spectrofotometrice. Daca
consideram o radiatie incidenta monocromatica, I 0, care cade pe o celula continand proba. Celula are
lungimea l iar concentratia substantei ce absoarbe lumina, C. Conform schitei din fig. 1, intensitatea
finala, I, este mai mică decât cea initiala, I0 in urma absorbtiei luminii, la trecerea prin celula. Daca o
lungimea l provoaca o reducere cu un anumit procent a intensitatii initiale, I0, de exemplu cu 50%, un
nou strat de lungime l, egala cu primul, va actiona, conform legii Lamber - Beer, în acelasi mod, adica
va diminua tot la jumatate noua radiatie incidenta.

unde: A – Absorbanta
– coeficinetul de absorbtie molara [M-1cm-1]
– concentratia molara [M]
– lungimea pe care o parcurge radiatia prin proba [cm]
Spectrofotometria UV-Viz

Coeficientul de absorbtie molara este o caracteristica a substantei supuse analizei si este independent
de concentratia ei si variaza cu lungimea de unda.
Este importnat de stiut ca aplicabilitatea acestei legi este buna pentru solutii diluate, astfel pentru
solutii de concentratii marii (peste 10%) vor aparea erori majore.
Spectrele de absorbtie
Spectrele de absorbtie reprezinta dependenta semnalului de lungimea de unda λ. Cea mai des folosita
este dependenta absorbantei in functie de lungimea de unda A=f(λ).
Fiecare substanta are un spectru de absorbtie caracteristic , ca forma generala , ca omneiul spectral ,
ca numar de maxime (pick-uri) precum si ca raporturi intensitatile diverselor pick-uri.
Cacarctersticele unui spectru sunt redate in figura, astfel pozitia pick-ului este carcaterizata de
valoarea sa maxima λmax. Se numeste maxim de absorbtie atat varful ca atare cat si lungimea de unda
care corespunde maximului (pot exista unul sau mai multe maxime).Numarul de maxime si forma
generala acurbei reprezinta caracteristica calitativa dupa care se pot indentifica substatele.
Spectrofotometria UV-Viz

Prin spectrofomerie de absorbtie in UV-VIS,

se pot determina cantitativ concetratiile
substantelor pe baza Legii Lambert-Beer.
Astfel, in practica pentru inceput trebuie
trasata o curba de etalonare (calibrarea),
pentru care se vor prepara solutii etalon
de concentratie cunoscuta (cel putin 5
probe), iar dupa trasarea curbei A=f(c), se
poate determina concentratia probei de
analizat ( se va lucra in aceiasi parametri-
lungime de unda, celula etc).

Caracteristicile maximului de absorbtie

 Spectrofotometria UV-Viz

Spectrometria in IR
Domeniul IR al spectrul undelor electromagnetice contine radiatii cu lungimi de unda cuprinse intre
0.8-1000µm. La randul sau spectrul IR poate te impartit in 3 subdomenii : IR apropiat (0.8-2,5µm), IR-
mediu (2.5-25 µm) si IR indepartat (peste 25 µm). Domeniul IR mediu se mai numeste si IR fundamental
si sic el mai bogat in informatii sic el mai accesibil din punct de vedere experimental.
Ca si in cazul spectrofotmetrie de absorbtie in UV-VIS , si in spectrometria in IR se determina
transmitanta .
T=I0/I,
T100%=100∙T
A=log(1/T)
A=absorbanta
T%=transmitanta procentuala
Spectrul IR al unei substante este adesea o reprezentare grafica , in coordinate (T, ), unde este numarul
de unda .
λ.
Spectrofotometria in infrarosu

Absorbtia in IR se datoreaza interactiunilor dintre radiatia electromagnetica incidenta (component

electrica a acesteia) cu dipolii electrici ai unei molecule. Astfel, energia radiatiilor IR provoaca o
amplificare a energiei e vibratiei a moleculelor datorita faptului ca dipolul corespunzator legaturii
oscileaza cu o frecventa apropiata cu cea a componentei electrice amintite. In mod natural intr-o
molecula atomii componenti executa miscari de vibartie de-a lungul legaturii in timp ce molecula se
roteste . O intensificare a miscarii de vibartie duce la o alunjire si simultan, la o slabire a legaturii,
dar si la intensificare a miscarii de rotatie. Miscarea de vibratie a unei legaturi dintr-o molecula poate
fi asimilitata unei deplasari asemanatoare cu un arc spiral – situtat in directia legaurii. Astfel se
explica de ce in absenta oricarui dipol permanent nu apare nici un cuplaj cu unda electromagnetica
si nu are loc nici o diminuare a intensitatii radiatiei IR incidente. Ca de exemplu, gazele monoatomice
(gazele rare) si substantele cu molecule simetrice (O 2, N2, Cl2) avand legaturi nepolare sunt perfect
transparente in domeniul IR. In moleculele poliatomice posibilitatile de aparitie ale spectrelor IR sunt
mai mari deaorece aici vibratiile asimetrice pot duce , chiar in moleculele nepolare, la aparitia unor
dipoli electrici , astfel aparitia vibratiilor de deformare creste.
Spectrofotometria in infrarosu

Spre deosebire de UV-Vis, care are un singur maxim de absorbtie pentru

toata molecula (o amprenta a intregii molecule), in FT-IR exista o banda
caracteristica fiecarei miscari de vibratie sau rotatie pentru fiecare
legatura in parte.
http://laurenhill.emsb.qc.ca/
science/kinetic.html
Spectrofotometria in infrarosu - aparatura

Din punct de vedere al componentelor de baza a spectrometrelor in IR , aveam :

- Sursele de radiatii – becul cu filament de W (pentru IR apropiat), tuburile Nernst, lampile Globar,
filament Nicrom – pentru IR mediu si lampi cu mercur sub presiune pentru IR indepartat.
- tuburile Nernst – rezistente confectionate din oxizi de pamanturi rar (Y siEr) si ZrO2 ; sunt
folosite in domeniul spectral 0.4-20µ
- lampile Globar (GLOBAR TM) rezistente confectionate din SiC.
- filament Nicrom – filament de NiCr ; cele mai putin pretentioase
- Monocromatoarele – pot fi sub forma de prisme sau retea de prisme, dar un anume tip de
monocromator nu poate fi folosit pe tot domeniul IR, astfel in mod current se folosesc LiF (0.115-7μm),
CaF2 (0.125-10μm) BaF2 (0.2-13.5μm), NaCl (0.2-17μm), KBr (0.2-26μm) sau CsI (1-40μm).
- Detectorii – sunt clasificati in doua grupuri
- detector cuantici – bazati pe efectul fotonilor asupra materialelor . Din acasta categorie fac parte
detectorii fotovoltaici , detectorii piroelectrici .
- detector termici – se bazeaza pe modificarea proprietatilor fizice ale materialelor in raport cu
temperatura . Din aceasta categorie avem termocuplurile, termorezistentele, detectorii pneumatici.
Spectrofotometria in infrarosu - aparatura

Procesul instrumental normal este următorul:

1. Sursa: Energia infraroșie este emisă dintr-o sursă. Acest
fascicul trece printr-o deschidere care controlează cantitatea de
energie care ajunge la proba (și, în final, la detector).
2. Interferometrul: fasciculul intră în interferometru unde are loc
„codificarea spectrală”. Semnalul de interferogramă rezultat iese
apoi din interferometru.
3. Proba: fasciculul intră în compartimentul probei unde este
transmis prin sau reflectat în afara suprafe ței e șantionului, în
funcție de tipul de analiză efectuat. Aceasta este unde sunt
absorbite frecvențe specifice de energie, care sunt caracteristice
unic pentru eșantion.
4. Detectorul: fasciculul trece în final la detector pentru
măsurarea finală. Detectoarele utilizate sunt special concepute
pentru a măsura semnalul special de interferogramă.
5. Calculatorul: Semnalul măsurat este digitalizat și trimis
computerului în care se află Fourier transformarea are loc.
Spectrul final cu infraroșu este prezentat utilizatorului pentru
interpretare și orice altă manipulare.
Spectrofotometria in infrarosu – transformata Fourier

Termenul spectroscopie cu infraroșu

cu transformata Fourier provine de
la faptul că o transformare Fourier
(un proces matematic) este necesară
pentru a converti datele brute în
spectrul real, astfel transformarea
Fourier transformă ieșirea
semnalului de la detector într-un
spectru interpretabil. FTIR folosește
interferometrie pentru a înregistra
informații despre un material plasat
în fasciculul IR.
Spectrofotometria in infrarosu – CO2
Spectrofotometria in infrarosu – aplicatii biomedicale

 compusii biologici precum proteinele, carbohidra ții,

lipidele și acizii nucleici au structuri unice, astfel este
posibil să se obțină amprente spectrale corespunzătoare
gruparilor lor funcționalelor . Tehnicile spectroscopice
FTIR permit vizualizarea ușoară a componentelor
celulare pe baza, proprietățile lor intrinseci și compozi ția
lor chimică. Acesta oferă o posibiliate de indentificare a
markerilor de diagnostic pentru boli precum cancerul,
boli inflamatorii etc.
 spectroscopia FT-IR este de asemenea considerată ca
un instrument util pentru analiza compozi ției chimice a
calculilor umani. Analiza probelor de piatră (calculi) in
special pentru persoanle ce prezinta probleme cronice
de reformare a acestora , FT-IR pot oferi informatii
legate de compozitia lor astfel incat sa se poata
interveni punctual si eficinet in prevenirea reaparitiei
acestora.
Spectrofotometria in infrarosu – aplicatii biomedicale

 spectrele FT-IR ale țesuturilor umane și animale pot oferi informa ții despre structura moleculară
a țesuturilor. FT-IR a fost aplicat pe larg pentru determinarea unui metaboliti biochimici în
fluidele biologice pentru diagnosticul diferitelor tipuri de tumori maligne, cum ar fi cancerele
pulmonare, de sân, de piele, de col uterin și de colon. Spectrele sunt analizate pentru modificările
nivelurilor de molecule cum ar fi ARN, ADN, fosfa ți și carbohidra ți. Prin analiza raportului
ARN/ADN măsurat la 1121/1020 cm-1 – un raport mai mare pentru țesuturile maligne
comparativ cu non-maligne.
 FTIR a fost de asemenea utilizat si ca tehnică de diagnostic rapid pentru a identifica
medicamente care vizează căi moleculare specifice ce provoacă leucemie mieloidă cronica. Analiza
datelor chemometrice a fost utilizată pentru evaluarea medicamentului în celulele canceroase ex
vivo, oferind rezultate in legatura cu eficienta medicamentului.