Metode microscopice de investigatie

Microscopia electronica si microscopia optica

Microscopia optica- generalitati

Microscopul optic

este aparatul bazat pe principiul formrii imaginilor virtuale a unor obiectele reale ale cror dimensiune limit este de cca. 0,2 m. Imaginea mrit este rezultatul interaciunii radiaiei electromagnetice din domeniul vizibilului a crei lungime de und este = 390 nm .750 nm, cu elementele optice ale microscopului. Lentilele componente au indici de refractie diferiti si distante focale diferite.

Parametrii unui microscop optic

Marirea transversala= raportul dintre lungimea imaginii si

lungimea obiectului, ambele fiind perpendiculare pe axa axa optica. Puterea= raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede obiectul prin microscop si dimensiunea liniara a obiectului situat perpendicular pe axa optica. Grosismentul= marirea unghiulara= raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede obiectul prin instrument si tangenta unghiului sub care se vede obiectul cand este privit cu ochiul liber de la distanta de 25 cm. Puterea de rezolutie (de separare) = distanta minima dintre doua puncte ale obiectului care mai pot fi vazute separat unul de celalalt prin microscop.

u = unghiul format de razele extreme care pleaca de la obiect inspre marginile obiectivului

Fig. 1. Porcine hepatocytes after 1-hour culture (phase-contrast microscopy, original magnification400). Fig. 2. Porcine hepatocytes after 24-hour culture (phase-contrast microscopy, original magnification400). Fig. 3. Ultrastructure of porcine hepatocytes after 24-hour culture (transmission electron microscopy, original magnification4000). M: mitochondrion; R: ribosome; ER: endoplasmic reticulum; N: nucleus; CJ: cell junction. Fig. 4. Spheroids of porcine hepatocytes after 24-hour culture (scanning electron microscopy, original magnification300).

Fluorescence microscopy of endothelial cells using three labels. Red lables the mitochondria, green lables the F-actine cytoskeleton and blue lables the nucleus.

This confocal microscopy image of the organ of Corti

Microscopia electronica
Microscopul optic nu poate oferi imagini clare ale

obiectelor mai mici decat 0,15 m deoarece puterea separatoare a instrumentelor este invers proportionala cu lungimea de unda a radiatiilor utilizate. Puterea de separare (rezolutia) unui microscop poate fi marita daca in loc de lumina vizibila se utilizeaza un fascicol de electroni, deoarece lungimea de unda asociata electronilor este mult mai mica decat cea a radiatiei vizibile sau UV pe care le utilizeaza microscopul optic.

Microscopie electronica
Viteza unui electron in miscare, accelerat sub o diferenta de potential U

este

v
de Broigle) este

Lungimea de unda asociata unui electron in miscare (conform teoriei lui

2eU m

h 2meU
unde m= masa electronului, h= constanta lui Plank, e= sarcina electronului

MICROSCOPUL ELECTRONIC

Sursa de iluminare este un fascicol

de electroni, emisi de un catod de tungsten incalzit pana la incandescenta. Intre catod si anod este o diferenta de potential de 50 000-100 000 V, numita tensiune de accelerare. Lentilele sunt de fapt electromagneti. Lentilele condensor fcalizeaza electronii pe proba, iar lentilele obiectiv si proiector focalizeaza in continuare electronii care au trecut prin proba , asigurand formarea imaginii pe un ecran sau computer. Coloana microscopului trebuie mentinuta la un vid inalt de 10-6 torr.

TEM- microscopie electronica de transmisie

Este cea mai utilizata varianta de microscopie electronica

pentru cercetari structurale, se utilizeaza pentru probe transparente.

Transmission electron microscopy (TEM) scan of Salmonella typhi, the bacteria which causes typhoid fever in humans.

SEM- microscopie electronica tip scanning

Se utilizeaza pentru studiul suprafetelor. Permite observarea aspectului tridimensional al celulelor,

tesuturilor, pe cand prin TEM se poate observa doar imaginea bidimensionala. Tesuturile si macromoleculele biologice prt fi vizualizate folosind diverse tehnici auxiliare: - metalizarea= pulverizarea unor vapori de metal (argint) pe suprafata probelor pentru a produce un efect de umbrire. - criofracurarea- permite vizualizarea interiorului membranelor dupa ce au fost congelate in azot lichid (-196C). - Contrastare negativa- pentru observarea macromoleculelor izolate (ADN, proteine). Suprafata probei se trateaza cu o solutie concentrata de metale grele, dupa uscare metalul formeaza o pelicula, iar la microscop se observa doar conturul macromoleculei investigate.

SEM- microscopie electronica tip scanning

Tesut osos tanar22 ani

Limfocit

Tesut osos varstnic (osteoporoza)

Imagini SEM ale componentelor sangelui uman: hematiile (celule rosii, rotunde si plate) , lymphocytes, monocyte, neutrophile, si plachete (trombocite de forma unor discuri mici)

Furnica