1

CROMATOGRAFIA


Metodele cromatografice de separare i purificare a substanelor organice i-au gsit o
deosebit de larg rspndire n chimia ultimelor decenii, fcnd posibile progrese spectaculoase mai
cu seam n domeniul chimiei produilor naturali (aminoacizi, steroide, alcaloizi, terpenoide,
vitamine, aditivi alimentari, pesticide, glicide, etc.). Chimia organic a zilelor noastre nu poate fi
conceput fr contribuia tehnicilor cromatografice.

1. Definiie i caracteristici

Denumirea de cromatografie a fost dat de botanistul rus M.S.Tvet, care a dezvoltat i
aplicat aceast metod la separarea coloranilor vegetali. Acesta a artat ns, c metoda nu se
limiteaz numai la separarea substanelor colorate, ci poate fi aplicat, cu succes, la separarea i
purificarea majoritii substanelor.
Cromatografia reunete o serie de metode de analiz bazate pe separarea componenilor unei
probe, prin migrarea lor diferenial ntre dou faze dintre care una este staionar, iar cealalt
mobil. Migrarea diferenial este o consecin a vitezelor diferite cu care componenii amestecului
antrenai de faza mobil se deplaseaz de-a lungul fazei staionare, n coloana cromatografic sau
un echivalent al acesteia: hrtie cromatografic sau strat subire depus pe o plac.
Mecanismul unei analize cromatografice poate fi reprezentat printr-un proces dinamic
constituit din sorbii, desorbii i resorbii multiple. Repetarea echilibrului interfazic de foarte multe
ori conduce la migrarea componenilor cu viteze diferite, ca o consecin a acumulrii diferenelor
ntre comportamentele lor manifestate n procesul de distribuie. Cu ct componenii probei vor
avea afiniti mai difereniate pentru cele dou faze cu care sunt pui n contact, cu att se vor
obine separri mai nete, datorit reteniei lor selective.
n funcie de afinitatea fa de faza staionar i cea mobil, diferitele specii moleculare ale
unui amestec sunt antrenate cu viteze diferite prin micarea fazei mobile, realizndu-se separarea
lor. Afinitatea componenilor fa de faza staionar se poate baza pe fenomene de adsorbie (S-L;
S-G), absorbie sau repartiie (L-L, L-G), schimb ionic, excluziune steric (principiul sitelor
moleculare) etc.



2
Caracteristicile metodei cromatografice. Eficacitatea i aplicabilitatea analizei
cromatografice se datoreaz atributelor caracteristice ale acestei metode, care permit rezolvarea
unor probleme complexe, dintre care multe sunt inabordabile pe alt cale.
Capacitatea de rezoluie foarte mare face posibil separarea unor amestecuri speciale de
componeni asemntori, prin eliminarea interferenelor i atingerea unor selectiviti, care merge
pn la separarea izotopilor, indivizilor enantiomorfi sau izomerilor cu caracteristici structurale i
de volatilitate apropiate. Trebuie subliniat faptul c nici unul dintre componeni nu se pierde n
cursul analizei, iar uneori pot s apar constatri surprinztoare privind descoperirea unui
component neateptat, prezent n proba analizat. Aceast capacitate mare de separare a metodelor
cromatografice, a condus la apariia unui termen nou n terminologia chimic uzual i anume
calificativul de "cromatografic pur", care definete gradul foarte mare de puritate a substanelor
separate cromatografic. Totodat, analizele cromatografice realizeaz sensibiliti remarcabile,
limitate doar de posibilitile metodelor de identificare. Utilizarea detectorilor moderni ultrasensibili
i a tehnicilor speciale de mbogire, extind aceast sensibilitate. Detectarea i evaluarea
componenilor separai se poate realiza simultan, fie direct pe coloan, fie dup extragerea lor .
Varietatea practic nelimitat a posibilitilor operative constituie o mare calitate a
cromatografiei. Fazele participante n procesul de separare au importan major, dar alegerea lor
se poate efectua dintr-o gam larg de produse, dup natura, compoziia i modul lor de utilizare.
Totodat, parametrii operaionali sunt variabili, putnd fi selecionai n funcie de optimizarea
procesului de separare. Componenii amestecului supui analizei se pot transforma n derivai dac
sunt instabili chimic, termic sau prezint dificulti la detectare. De asemenea, cantitatea de prob
luat n analiz variaz de la microvalori - fapt preios pentru substane scumpe sau greu de colectat
- la macrocantiti, cnd metoda se aplic n scopuri preparative.
Dei metodele cromatografice posed aceste caracteristici deosebite, rmn, n principiu,
extrem de simple, accesibile i rapide, durata unei analize cromatografice fiind mult mai redus
comparativ cu a altor metode.
n esen cromatografia este o metod de separare de mare performan prezentnd
asemnri cu distilarea fracionat, fapt subliniat prin teoria talerului din cromatografia de
repartiie. n cromatografie coloana poate fi considerat ca fiind construit dintr-un ir de talere,
fiecare din acestea definit ca o seciune din coloan n care s-a stabilit echilibrul ntre talere. Cele
dou tipuri de talere sunt comparabile n mod strict, deoarece un taler de distilare este echivalent cu
10-30 talere cromatografice. Astfel, pentru realizarea unei separri necesitnd 100 de talere n
distilare, o coloan cromatografic ofer un numr de 3000 de talere. n cromatografie acestea
se pot realiza relativ uor n cteva minute, n timp ce n coloana de distilare este nevoie de un
timp de cteva zile pentru atingerea eficienei maxime. n cromatografia de gaze este posibil
separarea pe coloan cu 30000 de talere sau chiar cu 500000 sau mai mult, folosind coloane
3
capilare. Numrul de talere este foarte important, deoarece reprezint msura puterii de
separare a coloanei.

2. Clasificare

Clasificarea metodelor cromatografice se poate realiza lund ca baz numeroase criterii:
Funcie de participanii n procesul de separare:
o starea i natura probei de analizat;
o mediul de sorbie (lichid, solid, substan mrunit, hrtie, strat subire, etc.)
o modul de curgere al developantului sau eluentului (ascendent, descendent, radial,
bidimensional, n flux programat, etc.).
Condiiile de lucru:
o dup tehnica de lucru adoptat (eluie, frontal, prin deplasare);
o dup forma izotermei de sorbie (liniar-neliniar); n regim izotermic, cu regim
programat etc.
n funcie de mecanismul ce st la baza procesului elementar de separare i dup
natura celor dou faze, metodele cromatografice se pot clasifica n felul urmtor:
Cromatografia de adsorbie. Acest tip de separare cromatografic const n distribuirea
componenilor unui amestec dat, n funcie de afinitile lor ntre o faz mobil i o faz staionar,
care este un solid dotat cu proprieti adsorbante. Distingem dup natura fazei mobile:
cromatografia lichid-solid sau cromatografia gaz-solid.
Cromatografia de repartiie. Aceast metod se bazeaz pe solubilitatea selectiv a
componenilor amestecului de analizat ntre dou faze nemiscibile. Faza staionar este lichid,
nfurnd sub forma unui film aderent o suprafa inert, iar faza mobil poate fi lichid sau
gazoas. Astfel deosebim: cromatografia lichid-lichid sau cromatografia gaz-lichid.
Cromatografia prin schimb ionic. n aceast metod mecanismul procesului elementar de
separare are la baz schimbul reversibil de ioni i anume ntre ionii din soluie i ionii de acelai
semn, care neutralizeaz sarcina electrostatic purtat de gruprile ionizabile ale schimbtorului de
ioni.
Cromatografia de excludere-difuzie. n aceast metod cromatografic faza staionar este
de aceeai natur i compoziie cu faza mobil. Un rol esenial l joac suportul care este un material
cu porozitate controlat, de obicei geluri. Moleculele de solut prsesc coloana cromatografic n
ordinea descresctoare a masei lor moleculare. Componenii cu mas molecular mare neputnd
ptrunde n faza staionar coninut n cavitile granulelor de gel, vor prsi primii coloana-
excludere; cei cu mas molecular mic vor difuza liber ntre faza intragranular (faza staionar) i
faza intergranular (faza mobil) i vor iei ultimii - difuzie liber. Soluii cu mas intermediar, a
4
cror difuzie n cele dou faze este mai mult sau mai puin ncetinit n funcie de masa lor, vor iei
n ordinea descreterii masei lor moleculare-filtrare (sitare) molecular. n aceast metod
cromatografic pe lng procesul de excludere, au importan fundamental fenomenele de difuzie
i de micare brawnian.
n mod obinuit, metodele cromatografice sunt clasificate n primul rnd, dup natura
fazei staionare, iar n al doilea rnd dup natura fazei mobile. Apar, astfel, patru tipuri
principale de procedee urmate de alte subdiviziuni.

3. CROMATOGRAFIA LICHID

Cromatografia lichid include patru tipuri distincte de procedee cromatografice (vezi
"Clasificarea metodelor cromatografice"):
lichid-solid;
lichid-lichid;
pe schimbtori de ioni;
cromatografia prin excluziune.

3.1. Cromatografia lichid-solid

Adsorbia, principiul pe care se bazeaz cromatografia lichid-solid, reprezint fenomenul de
cretere a concentraiei unei substane la interfaa a dou faze sau, cu alte cuvinte acumularea
moleculelor substanei adsorbite la suprafaa adsorbantului.
Separarea componenilor unui amestec dizolvai ntr-un solvent potrivit, depinde de
stabilirea echilibrelor adsorbie-desorbie ntre componenii adsorbii la suprafaa fazei staionare
solide i dizolvai n faza lichid, mobil.
Factorii hotrtori n cromatografia de adsorbie sunt polaritatea moleculei compuilor de
separat, activitatea adsorbantului i polaritatea fazei mobile. n cromatografia solid-lichid solventul
joac un rol deosebit n competiia selectiv cu moleculele solvatului pentru ocuparea centrilor de
adsorbie ai adsorbantului.
n general adsorbia unei componente pe suprafaa fazei staionare variaz direct
proporional cu polaritatea grupelor sale funcionale, descrescnd n ordinea: acizi i baze organice
tari, alcooli, amine, mercaptani, esteri, aldehide, cetone, compui aromatici, derivai halogenai,
eteri, olefine, hidrocarburi.
Activitatea adsorbanilor depinde att de natura acestora, ct i de modul de preparare.
5
Adsorbanii cei mai folosii n practica cromatografic (nirai n ordinea descrescnd a
activitii lor: crbune activ, oxid de aluminiu, oxid de magneziu, silicagel - acid silicic - sulfat de
calciu, talc - silicat de magneziu, zaharoz, amidon, celuloz) pot fi clasificai n dou grupe:
adsorbani polari (hidrofili), care se caracterizeaz printr-o afinitate mare fa de ap i fa de
dizolvanii polari i care constituie marea majoritate a adsorbanilor folosii n practic (oxizi,
hidroxizi, carbonai, etc.);
adsorbani nepolari (hidrofobi), care nu prezint afinitate fa de ap i fixeaz mai puternic
dizolvanii i substanele nepolare. Din rndul acestor absorbani face parte crbunele activ.
n cazul adsorbanilor polari, adsorbabilitatea substanelor organice din soluie depinde n
mare msur de numrul i natura gruprilor funcionale, de prezena nucleelor aromatice i
heterociclice, deci de structura moleculei.
n cazul adsorbanilor nepolari adsorbabilitatea este determinat n mod hotrtor de
mrimea moleculei (factor care n cazul adsorbanilor polari este fr importan) i anume ea crete
odat cu creterea masei moleculare, dar numai pn la o anumit limit.
Pentru ca adsorbanii s poat fi folosii ct mai eficace n practica cromatografiei, ei trebuie
s ndeplineasc anumite condiii i anume:
s aib o capacitate de adsorbie ct mai mare, repartizat pe o suprafa mare de contact;
s aib o dimensiune corespunztoare a particulelor i anume acestea s fie suficient de mici
pentru stabilirea ct mai rapid a echilibrului de adsorbie, dar nu prea mici, pentru a nu opune o
rezisten prea mare la curgerea lichidului;
s nu conin impuriti capabile s modifice puterea de adsorbie sau s reacioneze cu
substanele adsorbite i s nu conin urme de umiditate, care micoreaz considerabil puterea de
absorbie, mai ales n cazul adsorbanilor polari;
s fie ineri fa de solvenii folosii i fa de substana ce se adsoarbe;
s fie pe ct posibili albi sau de culoare deschis, n cazul separrii substanelor colorate.
Alegerea potrivit a adsorbantului depinde de natura produilor a cror separare se
urmrete. Astfel, de exemplu, celuloza, amidonul, zaharoza, sunt utilizate pentru separarea unor
produi naturali polifuncionali cu structuri labile; talcul pentru separarea steroidelor, uleiurilor
eterice i ai unor derivai acetilai ai glucidelor; silicagelul pentru separarea esterilor i acizilor.
Cel mai utilizat adsorbant este silicagelul alturi de oxidul de aluminiu obinut pe de o
parte sub form acid, bazic sau neutr, iar pe de alt parte prin varierea gradului su de hidratare.
Oxidul de aluminiu acid (pH=4) (obinut prin splarea acid), este utilizat la separarea compuilor
cu caracter acid (acizi carboxilici, unii aminoacizi), iar cel bazic (pH=9) la separarea substanelor cu
caracter bazic de genul aminelor. Oxidul neutru (pH=7) se folosete la separarea substanelor ce nu
au nici caracter acid, nici bazic.
6
Modificarea activitii oxidului de aluminiu, prin controlarea umiditii sale, este
concretizat prin obinerea adsorbantului cu diverse grade de activitate n funcie de coninutul de
ap (scara Brockman): activitatea I, anhidru, activitatea II cu 3% ap, III cu 6%, IV cu 10% i
activitatea V cu 15% ap. Cea mai activ varietate utilizat pentru a izola compui greu separabili
este oxidul de aluminiu de activitate I.
Folosirea oxidului de aluminiu de activitate nalt trebuie fcut cu discernmnt, pentru c
ea poate avea ca efect descompunerea anumitor categorii de substane organice n decursul
cromatografierii, ducnd la izomerizri, deshidratri, hidrolize, condensri, etc. Aa de exemplu,
aldehidele i cetonele cu mas molecular mic pot suferi condensri aldolice i cetolice, n timp ce
esterii, lactonele i derivaii halogenai pot suferi hidrolize, datorit prezenei apei, dac se lucreaz
cu un oxid de aluminiu de activitate mai joas (care conine ap). Alturi de aceti adsorbani
amintii se utilizeaz n ultimul timp celita i diatomita.
n afar de variaia pH-ului sau a umiditii adsorbantului, proprietile acestuia pot fi
modificate prin mbibarea sa cu diverse substane.
n ceea ce privete solvenii folosii n cromatografia lichid de adsorbie, utilizarea lor
necesit o selecionare judicioas (cunoscut fiind influena dizolvantului asupra stabilitii
adsorbiei), trebuind s ndeplineasc anumite condiii:
s aib o adsorbabilitate mai mic pe faza staionar, dect cea a substanei de separat,
deoarece, n caz contrar, cel care se adsoarbe este dizolvantul i nu substana;
s dizolve n ntregime amestecul de substane ce urmeaz s fie supus cromatografierii;

Oxid de aluminiu (alumin) Silicagel
Solvent
0
Solvent
0

Pentan 0 Ciclohexan -0,05
Ciclohexan 0,04 Heptan -0,01
Tetraclorur de carbon 0,18 Pentan 0
Toluen 0,29 Clorbenzen 0,18
Clorbenzen 0,30 Toluen 0,22
Benzen 0,32 Benzen 0,25
Eter etilic 0,38 Cloroform 0,25
Cloroform 0,40 Nitrobenzen 0,25
Clorur de metilen 0,42 Eter etilic 0,25
Aceton 0,56 Acetat de etil 0,25
Dioxan 0,56 Aceton 0,25
Acetat de etil 0,58 Acid acetic 0,25
Dimetilsulfoxid 0,62 Alcool metilic 0,25
Acetonitril 0,65 Ap 0,25
Piridin 0,71
Alcool propilic 0,82
Alcool etilic 0,88
Alcool metilic 0,95
Etilengliocol 1,11
7

s fie n stare de puritate avansat (s nu conin mai ales fraciuni nevolatile i solveni mai
polari). Solvenii cei mai des folosii n practica adsorbiei cromatografice sunt nirai n ordinea
cresctoare a "triei" lor
0
, definit ca energia de adsorbie a eluentului pe unitatea de suprafa. n
este prezentat seria elutropic a solvenilor raportat la oxid de aluminiu i silicagel, avnd ca i
criteriu de baz al ordinii lor "tria eluentului",
0
(s-a luat etalon pentanul cu
0
=0).

3.1.1. Cromatografia lichid-solid pe coloan
n coloana cromatografic umplut cu adsorbant (faz staionar), o component A a unui
amestec este adsorbit selectiv (n funcie de polaritatea sa i de selectivitatea adsorbantului) ntr-o
zon inelar n partea superioar a coloanei. Adugnd un solvent (faza mobil), care strbate n
mod continuu coloana, acesta va ntlni n drumul su stratul care conine componenta A adsorbit.
Contactul dintre solventul pur i substana adsorbit pe faza staionar are ca rezultat stabilirea unui
echilibru de adsorbie, n sensul desorbiei componentei A de pe suport i al mbogirii
concomitente a fazei mobile n componenta A, mbogire care crete continuu pn la atingerea
zonei n care concentraia substanei adsorbite pe suport este maxim. Continundu-i drumul de-a
lungul coloanei, solventul coninnd componenta A ntlnete straturi de adsorbant din ce n ce mai
srace n aceast component, ceea ce are ca rezultat stabilirea de noi echilibre de adsorbie n
sensul depunerii substanei A pe straturile de adsorbant proaspt. Dup un anumit timp de trecere a
fazei mobile peste adsorbant, acesta pierde cantitativ componenta transportat, care se adsoarbe pe
faza staionar ntr-o zon mai joas dect cea n care s-a aflat n faza iniial. Rezultatul ntregului
proces de adsorbii-desorbii succesive este migrarea de-a lungul coloanei a componentei A. n
cazul existenei mai multor componente ntr-un amestec de separat, fiecare va migra, n funcie de
izoterma sa de adsorbie, cu vitez diferit, vitez care va fi cu att mai mic cu ct afinitatea
adsorbantului pentru componenta respectiv este mai mare. Viteza de migrare v a fiecrei
componente n condiii date (temperatur, adsorbant, solvent) este dat de relaia:
v = viteza frontului adsorbit/viteza fazei mobile, (20)
n care v are ntotdeauna o valoare subunitar.
Pentru ca separarea a dou componente A i B s
decurg n condiii bune, este necesar o difereniere
suficient de mare a vitezelor lor de migrare. Dac valorile v
sunt prea apropiate de unitate, separarea componentelor nu se
poate realiza n mod satisfctor, deoarece
componentele migreaz ntr- un timp care este prea puin
diferit de cel necesar fazei mobile s parcurg coloana.
8
n cazul alegerii potrivite a adsorbantului i a solventului, componentele unui amestec vor
migra difereniat, ocupnd zone distincte de-a lungul coloanei. Continund trecerea de solveni cu
polariti din ce n ce mai mari prin coloan, se realizeaz eluarea coloanei. Fraciunile colectate
separat n timpul elurii sunt apoi evaporate i cantitatea de compus recuperat din fiecare fraciune
este reprezentat grafic funcie de numrul fraciunilor. Se obine astfel o cromatogram de felul
celei prezentate n figura 79. Se observ c ntre fraciunile 20 i 30 separarea componetelor A i B
nu este total, n schimb componentele B i C au fost complet separate.
Aparatura folosit de obicei n laborator pentru adsorbie cromatografic se compune dintr-
o coloan de adsorbie (figura 80) din sticl, al crei raport obinuit ntre
nlime i diametru e recomandabil s fie cuprins ntre 8:1 i 15:1, o
plnie de picurare (montat cu un dop n gtul coloanei), din care se
introduce amestecul de separat i vasul de colectare a fraciunilor
(montat cu un dop la captul de jos al coloanei), care poate fi un
flacon conic de vid pus n legtur cu o surs slab de vid, n cazul
necesitii unei treceri mai rapide a lichidului prin coloana de adsorbie.
Tehnica de lucru. Coloana de adsorbie perfect curit i uscat, prevzut cu un robinet
preferabil din teflon (nu necesit utilizarea de unsoare de robinete, care poate fi solvit de solveni
ducnd la impurificarea compuilor separai), se umple cu adsorbantul de granulaie potrivit (cu
diametrul de aproximativ 150), calculnd n general 20-30 g de adsorbant pentru un gram de
amestec de separat; n cazul unor componente de separat cu structuri asemntoare, proporia
trebuie mrit la 50-100 g adsorbant. Umplerea coloanei este de o deosebit importan pentru
bunul mers al cromatografiei i de aceea trebuie neaprat respectate cteva condiii: umplutura s
fie de granulaie uniform, fr bule de aer, baza i partea superioar a adsorbantului s fie plan
(realizabil cu ajutorul celor dou straturi de substan inert, de exemplu nisip sau bile mici de
sticl, figura 80), iar coloana s fie inut n poziie vertical. Umplerea coloanei se face
introducnd nti adsorbantul uscat i adugnd apoi solventul. Metoda are ns dezavantajul c se
pot forma pungi de aer, care sunt greu de eliminat; pe de alt parte, unii adsorbani ca silicagelul
(sau unele rini schimbtoare de ioni) i mresc volumul la mbibare i pot s provoace spargerea
coloanei de sticl. Se recomand, de aceea, umplerea coloanei nti cu un solvent (cel mai puin
polar - eter de petrol) peste care se adaug n fir continuu cantitatea necesar de adsorbant. n cazul
adsorbanilor cu o granulaie neuniform i densitate mic, acest mod de umplere a coloanei
provoac o sedimentare neuniform a particulelor, cele cu mas mai mare predominnd n partea de
jos a coloanei. Acest inconvenient poate fi evitat preparnd o suspensie groas a adsorbantului n
solvent, care se introduce rapid n coloana goal. Peste adsorbant se adaug apoi un strat subire de
nisip, care s evite deformarea suprafeei adsorbantului n timpul picurrii eluentului din plnia de
picurare. Dup ce coloana a fost corect umplut, nivelul solventului de la suprafaa adsorbantului se
9
coboar, manevrnd robinetul coloanei i apoi, substana solvit n solventul mai puin polar (10-15
ml pentru un gram substan), se adaug cu grij n coloan.
Se ncepe apoi eluarea cromatogramei, prin adugarea unor noi cantiti de solvent, care are
ca scop diferenierea ct mai complet a zonelor din coloan, n care diferitele componente au fost
adsorbite. n cazul unei viteze de curgere prea mici prin coloan, accelerarea curgerii se poate
realiza prin depresiune, punnd n legtur coloana cu o surs de vid slab. Eluarea cromatogramei
se continu prin adugare de solvent, considerndu-se ncheiat atunci cnd zona de adsorbie care
migreaz cel mai repede a ajuns aproape de captul inferior al coloanei. Aceast migrare se poate
observa cu ochiul liber doar n cazul substanelor colorate. n cazul substanelor incolore, dar
fluorescente n ultraviolet, observarea zonelor se face prin iluminare cu radiaii ultraviolete. O alt
posibilitate de depistare a zonelor de adsorbie este aceea de folosire a adsorbanilor impregnai cu
mici cantiti de substane fluorescente sau de transformare a produilor incolori n derivai colorai
ai acestora.
Dup ce eluarea cromatogramei s-a efectuat, coloana poate fi lsat s se usuce puin, apoi
se mpinge afar adsorbantul cu ajutorul unui piston (prin extrudere), se separ zonele distincte prin
tierea coloanei de adsorbant, dup care substanele astfel separate se extrag cu ajutorul unor
solveni polari corespunztori. Varianta mult mai des folosit a cromatografiei de adsorbie este cea
care realizeaz eluarea n continuare a coloanei cu dizolvani sau amestecuri de dizolvani din ce n
ce mai polari (din seria elutropic), care produc desorbia succesiv a diferitelor componente
adsorbite. Dac substanele de separat sunt apropiate ca structur, schimbarea compoziiei
solventului prin adaos de solvent mai polar se face n proporii foarte mici, limitate la abia cteva
procente la fiecare sut de mililitri.
Separarea componentelor avnd grupri funcionale diferite, se poate realiza printr-o mult
mai drastic schimbare a compoziiei solventului, adugnd de exemplu 25% solvent mai polar n
solventul sau amestecul de solveni folosit anterior. O grij deosebit trebuie acordat puritii
solvenilor (preparai special pentru cromatografie), deoarece urme de solveni mai polari sau de ap
pot diminua sau anula total activitatea adsorbantului.
n cromatografia prin eluie, diferitele componente pure ale unui amestec se obin prin
colectarea separat a fraciunilor eluatului, urmat de evaporarea solventului, evitndu-se astfel
necesitatea urmririi micrii i separrii zonelor de adsorbie. Din coloan se recupereaz 90-95%
din substana introdus n coloan.

3.1.2. Cromatografia pe strat subire
Dei intrat mai trziu n practica curent de laborator, cromatografia pe strat subire (CSS)
s-a impus ntr-un timp foarte scurt, ca o metod de analiz fizico-chimic de mare utilitate, att n
cercetare ct i n producie.
10
Asemnndu-se ca principiu i ca tehnic att cu cromatografia pe coloan ct i cu
cromatografia pe hrtie, cromatografia n strat subire combin o serie de avantaje ale acestor
tehnici.
Cele mai importante avantaje ale metodei sunt:
eficiena mare de separare a substanelor. Se datoreaz, n mare msur, structurii adsorbanilor
folosii, care datorit suprafeei specifice foarte mari, permit adsorbia difereniat chiar la
concentraii mici a moleculelor de separat. CSS permite separri de ordinul 0,01g, ceea ce alte
metode de pn acum nu au realizat;
universalitatea metodei. CSS se poate aplica la separarea substanelor hidrosolubile, ct i a
celor liposolubile. Sunt posibile separri cromatografice n strat subire utiliznd i suporturi cu
proprieti schimbtoare de ioni, fapt care lrgete posibilitile de aplicare ale metodei;
simplitatea metodei i prin aceasta accesibilitatea ei;
rapiditatea metodei. Chiar n cazul celor mai complicate amestecuri se poate realiza o separare
de mare finee n numai 15-60 minute. Durata mic de separare cromatografic permite
separarea n bune condiii i a substanelor instabile;
reproductibilitatea rezultatelor n condiii de lucru standard;
posibilitatea analizei simultane a mai multor probe (la fel ca n cromatografia pe hrtie i spre
deosebire de cromatografia pe coloan);
posibilitatea utilizrii pentru identificare a reactivilor corozivi sau a developanilor acizi;
posibilitatea de a efectua direct pe placa cromatografic oxidri, reduceri, deshidratri etc.
Cromatografia n strat subire este o variant mult simplificat a cromatografiei de adsorbie,
n care locul adsorbantului din coloan este luat de un strat subire adsorbant ntins pe o suprafa
neted (placa cromatografic). Eluia sau mai corect developarea cromatogramei, n acest caz, are
loc prin migrarea solventului de-a lungul stratului subire pe baza fenomenului de capilaritate.
Adsorbanii cei mai folosii n cromatografia pe strat subire sunt silicagelul, oxidul de aluminiu,
kiselgurul i celuloza, dintre care primii doi (dar mai ales silicagelul) se detaeaz net ca frecven a
utilizrii. Adsorbanii au o granulaie mai fin dect cea utilizat pentru coloanele cromatografice i
de obicei sunt amestecai i cu un liant (de exemplu gips sau amidon), care le asigur aderena la
plac.
Alegerea celui mai potrivit eluent se face prin tatonri preliminare, dup aceleai criterii ca
i n cromatografia pe coloan, innd cont de natura adsorbantului i a amestecului substanelor de
analizat.
Localizarea poziiei componenilor se face fr nici o dificultate n cazul substanelor
colorate. n cazul celor incolore, fie c se recurge la o reacie de culoare dat de componeni, fie se
11
utilizeaz lumina ultraviolet pe un strat subire care conine fosfor, fie se carbonizeaz substanele
cu acid sulfuric la cald.
Cel mai frecvent indicator pentru localizarea spoturilor de pe cromatogram este iodul
(vaporii si), care acioneaz asupra substanelor organice dnd natere unor compleci de transfer
de sarcin de culoare brun; este suficient pentru acest scop s se plaseze placa developat i uscat
ntr-un recipient nchis n prezena ctorva cristale de iod. Ca reactivi de culoare pot fi folosii o
serie de reactivi specifici analizei calitative funcionale.
Fosforul se utilizeaz prin nglobarea sa n amestecul adsorbant cu care se confecioneaz
plcile. Prin iluminarea plcilor developate cu radiaii ultraviolete are loc o emisie n vizibil; dac
substana organic conine sisteme conjugate n molecul, aceasta va absorbi lumina emis i
spoturile vor fi n acest fel localizate prin observarea unor pete mai ntunecate pe fondul luminos al
plcii. n mod similar, se pot folosi plci care conin urme de fluorescein n adsorbant; locul
componentelor incolore se poate decela prin stingerea fluorescenei n ultraviolet n punctele n care
exist componente pe plac.
Acidul sulfuric, prin proprietatea sa de a carboniza substanele organice la cald, se preteaz
bine pentru identificarea spoturilor, fie c este nglobat n stratul subire, fie c este pulverizat
ulterior pe plac. Prin plasarea plcilor pe o plit electric, petele mai nchise la culoare apar n
scurt timp.
n cazul unei standardizri riguroase a preparrii plcilor i condiiilor de lucru,
cromatografia pe strat subire poate fi utilizat i n ncercri de identificare a compuilor, tiind c
spotul acestora se va deplasa pe plac ntotdeauna cu aceeai vitez (la aceeai distan) relativ fa
de un compus etalon adugat n amestec sau fa de frontul solventului. Compuii organici puri pot
fi caracterizai cu ajutorul cromatografiei pe strat subire prin dou constante, R
f
-ul i R
x
-ul lor:
R
f
=
s
c
d
d
, (21)
R
x
=
e
c
d
d
, (22)
unde:
d
c
= distana parcurs de compus;
d
s
= distana parcurs de frontul solventului;
d
e
= distana parcurs de etalon.
n scopul identificrii unor substane, se recomand efectuarea pe aceeai plac a
cromatogramei substanei de identificat, a etalonului i a amestecului lor.
Aparatura i tehnica de lucru. La cromatografia pe strat subire "coloana deschis" este
constituit dintr-un strat subire (0,2-0,3 mm) de material adsorbant (silicagel, alumin etc.;
12
granulaie circa 5-10m) care ader, cu ajutorul unui liant (ghips, amidon, agar+agar, etc.), la un
suport plan de sticl, metal (folie de aluminiu) sau material plastic.
Prepararea plcilor se efectueaz cel mai simplu prin introducerea a dou plci perfect
curate i uscate, lipite una de alta, ntr-o past obinut prin scuturarea sau agitarea adsorbantului
timp de 2-3 minute ntr-un solvent organic (35 g silcagel sau 60 g oxid de aluminiu n 100 ml
amestec 2:1 n volume cloroform - metanol sau 25 g silicagel, 5 g de gips i 90 ml ap distilat).
Dup uscarea n aer a plcilor ele se introduc n etuv, la 105C, timp de 1-2 ore, pentru activare.
Plcile care nu se utilizeaz imediat pot fi pstrate n atmosfer uscat, fr a uita ns s le activm
prin introducere n etuv nainte de utilizare.
Proba (5-10l), sub form de soluie 0,01-1%, se
depune, n forma unui mic spot circular sau liniar, pe o
linie (linie de start) situat n apropierea marginii inferioare
a startului adsorbant, nu mai aproape de 1 cm de marginea
sa. Alturi de spotul corespunznd probei se depun
i o serie de spoturi "martor", cu componeni ce se presupune
a se afla n amestecul de analizat. n continuare, placa se
introduce, n poziie vertical, ntr-o "cuv de
developare" (figura 81), care conine pe fund un strat de faz mobil.
nlimea acestui strat nu trebuie s ajung la linia de start. Eluentul se ridic,
prin capilaritate, pn la extremitatea superioar a plcuei. n
cromatografia pe strat subire se obinuiete ntreruperea coloanei deschise,
prin practicarea unei zgrieturi orizontale, situate la circa 1 cm de
marginea superioar, n acest fel se limiteaz nlimea zonei umezite.
Unii autori recomand developarea plcuelor numai pn cnd frontul de lichid ajunge la
2/3 din nlimea acestora. n orice caz o developare prea ndelungat nu este recomandabil.
Camerele de developare pot fi cilindrice (figura 82).
Dac n cursul unei cromatografii n strat subire are loc o evaporare de faz mobil, poate
s apar o uscare local a plcii. Se poate ajunge la ntreruperea migrrii sau la o adsorbie
exagerat de faz mobil, care circul de la baz spre vrf, unde se pierde progresiv; ca urmare, toi
componenii sunt antrenai anormal de mult spre partea superioar a coloanei deschise. (R
f
tinde
spre 1 pentru toi componenii). n ambele cazuri menionate, rezultatele sunt mult falsificate, iar
separarea se nrutete.
Pentru evitarea unor astfel de fenomene, cuvele de developare sunt prevzute cu capace
etan, i au spaiul interior saturat 100% cu vaporii fazei mobile. n scopul asigurrii acestei
saturaii, pereii cuvei se cptuesc cu foi de hrtie de filtru umezite cu faza mobil.
13
Valorile R
f
sunt puternic dependente de polaritatea fazei mobile, crescnd odat cu aceasta.
Puterea de eluare a solvenilor uzuali crete n seria "elutropic"
Hexan Acetat de butil - metanol (99:1)
Hexan - clorur de metilen (5:2) Benzen - eter (1:9)
Benzen Eter - metanol (99:1)
Benzen - cloroform (1:1) Eter
Cloroform Eter - dimetil formamid (99:1)
Ciclohexan - acetat de etil (8:2) Ciclohexan - eter etilic (1:1)
Cloroform - aceton (95:5) Cloroform - eter (8:2)
Benzen - aceton (9:1) Benzen - aceton (8:2)
Benzen - acetat de etil (8:2) Cloroform - metanol (99:1)
Cloroform - ester (9:1) Benzen - metanol (9:1)
Cloroform - eter (9:1) Cloroform - aceton (95:15)
Benzen - metanol (95:5) Benzen - eter (4:6)
Benzen - eter (6:4) Acetat de etil
Benzen - acetat de etil (1:1) Acetat de etil - metanol (99:1)
Cloroform - ester (6:4) Benzen - aceton (1:1)
Ciclohexan - acetat de etil (2:8) Cloroform - metanol (9:1)
Cloroform - eter (6:4) Dioxan
Acetat de butil Aceton
Cloroform - metanol (95:5) Metanol
Cloroform - aceton (7:3) Dioxan - ap (9:1)
Benzen - acetat de etil (3:7)

Alegerea solventului potrivit se face pe baza unor teste
preliminare, dup cum urmeaz. Se picur o pictur de prob
(presupus colorat) pe o plac cromatografic, iar dup adsorbia
ei se pipeteaz, peste spotul format, cteva picturi de eluent.
Formarea unei zone punctiforme (figura 83a) indic o putere de
eluare insuficient, iar un inel mare, cu toi componenii spre
periferie (figura 83c), denot o putere de eluare prea mare. Eluentul
adecvat formeaz mai multe zone inelare separate i nu foarte deprtate de centru (figura 83b). Ca
i la cromatografia pe coloan i la cromatografia pe strat subire este suficient un numr mic de
solveni, sau amestecuri, pentru a se separa o larg varietate de produi.
14
Interpretarea rezultatelor. ntr-o cromatografie pe coloan deschis mrimile
caracteristice sunt: poziia, suprafaa i intensitatea spoturilor. Poziia spotului este caracteristic
pentru natura chimic a componentului respectiv. Comparaia favorabil a poziiei unui spot obinut
dintr-un amestec, cu unul obinut dintr-o mostr autentic, sugereaz identitatea chimic a celor doi
compui. Suprafaa i intensitatea spoturilor caracterizeaz cantitatea de component. Pentru
substanele colorate spoturile sunt vizibile direct. n cazul componenilor incolori, vizualizarea se
poate realiza prin mai multe procedee, prezentate anterior. Pulverizarea se poate realiza cu
pulverizatoare de sticl ce se pot uor confeciona n laborator; unii reactivi speciali pentru acest
scop se livreaz sub form de spray. n cazul unor spoturi vizualizate se poate realiza o dozare
cantitativ, prin explorarea plcii cu un densimetru.
n cazul n care valoarea R
f
-ului este mai mic de 0,4, pentru mbuntirea rezoluiei,
cromatograma poate fi redevelopat (cromatografie succesiv) cu acelai solvent sau cu unul diferit.
n cazul plcilor mari, de form ptrat, mbuntirea
rezoluiei se poate realiza cu ajutorul cromatografiei
bidimensionale, repetnd developarea cu acelai
developant (sau cu altul), dup ce placa a fost rotit cu
90 i introdus n aceeai poziie n solvent. n figura 84 a
i b se prezint un astfel de exemplu, n care cele 6
componente ale unui amestec sunt separate, doar dup ce s-a realizat cea de-a doua developare pe o
direcie perpendicular fa de prima.

3.2. Cromatografia pe schimbtori de ioni

Cromatografia pe schimbtori de ioni se bazeaz pe schimbul ionilor din soluie (care
trebuie separai) cu ionii grupelor active superficiale ale schimbtorilor de ioni. Dup ce au fost
reinui, ionii componentelor de separat sunt pui n libertate (schimbai) treptat, selectiv de pe
schimbtorul de ioni prin modificarea treptat a pH-ului soluiei cu care se face eluarea.
Cromatografia prin schimb ionic este deosebit de util pentru separarea componentelor
ionice cum ar fi acizii carboxilici, aminele, aminoacizii, peptidele, alcaloizii, mononucleotidele din
hidrolizatele acizilor nucleici etc., sau pentru ndeprtarea unor ioni anorganici nedorii din
amestecul lor cu unele substane organice.
Sunt cunoscui schimbtori de ioni naturali ca zeoliii, schimbtori de ioni sintetici minerali
ca permutiii, ns majoritatea schimbtorilor de ioni, utilizai n practica chimiei organice, sunt
rinile artificiale macromoleculare solide, crora li se ataeaz grupri funcionale acide sau bazice
capabile de a efectua schimbul ionic. Cele mai utilizate rini sunt cele sintetizate prin
copolimerizarea stirenului cu divinilbenzenul urmat de substituirea inelelor aromatice ale
15
polimerului cu grupri acide (SO
3
H, COOH) sau bazice (NH
2
). Se obin astfel anionii (cu grupri
bazice), care rein anionii i cationii (cu grupri acide), care rein cationii. Un exemplu clasic de
utilizare a schimbtorilor de ioni l constituie separarea aminoacizilor din hidrolizatele proteinelor
cu pH puternic acid. Cationitul transformat n prealabil n sarea de Na reine toi cationii
aminoacizilor:
R-SO
3
-
Na
+
+ H
3
N
+
-CHR-COOH R-SO
3
-
H
3
N
+
-CHR-COOH + Na
+
Apoi, prin eluare cu o soluie cu pH din ce n ce mai mare, aminoacizii sunt eliberai pe rnd odat
cu atingerea pH-ului lor izoelectric, deoarece amfiionul bipolar nu mai este reinut de cationit:
R-SO
3
-
H
3
N
+
-CHR-COOH R-SO
3
-
Na
+
+ H
2
O + H
3
N
+
-CHR-COO
-
n alte cazuri separarea se poate efectua prin modificarea concentraiei ionilor eluentului.
Cantitatea de substan, care poate fi separat prin tehnica schimbtorilor de ioni, este
limitat de capacitatea dinamic de schimb a coloanei, deci de numrul ionilor ce pot fi fixai pe
schimbtorul de coloan. Capacitatea dinamic de schimb este indicat pentru fiecare schimbtor de
ioni, prin numrul miliechivalenilor de ion schimbabil pe gramul de rin uscat; n general
aceast valoare oscileaz ntre 2 i 10 miliechivaleni/gram i ea trebuie luat n considerare n
calculul capacitii de schimb a coloanei.
Cteva exemple de schimbtori de ioni uzuali (cu denumirile lor comerciale), care pot fi
acizi i baze (tari sau slabe).
Toate rinile schimbtoare de ioni amintite, obinute prin polimerizare, au o reea rigid de
ale crei dimensiuni depinde i dimensiunea contraionului ce poate fi reinut. Deoarece nici una din
aceste rini nu permite transportul prin coloan a unor substane macromoleculare (de tipul
proteinelor, de exemplu), s-au sintetizat schimbtori de ioni cu matrice poroas, nerigid, prin
introducerea unor grupri funcionale acide sau bazice n moleculele unor geluri poliacrilamidice, a
celulozei sau ale unor dextrani. Cu ajutorul acestor schimbtori de ioni cu structur nerigid a fost
posibil separarea multor macromolecule de origine biologic.
Caracteristica Denumirea Funciunea activ
Cationii Dowex 50
Amberlit IR-120
Dualite C-20
Aminex A-6

-SO
3
-
H
+
Amberlit IRC-50 -COO
-
Na
+
Anionii Dowex 1
Amberlit IRA-400
Dualite A-101
Aminex A-27

-CH
2
-N
+
(CH
3
)
3
Cl
-
Dowex 3
Amberlit IR-45
Dualite A-2

-N
+
HR
2
Cl
-


16
Aparatura i tehnica de lucru n cromatografia cu schimbtori de ioni sunt
similare celor folosite n tehnica general a separrii pe coloane cromatografice.
Figura 85 prezint o coloan cromatografic tipic umplut cu schimbtori de ioni.
Caracteristic este faptul c, dup eluarea selectiv a componentelor reinute pe
coloan, aceasta poate fi regenerat prin trecerea pe coloan a ionului ce urmeaz s-i
reia locul la gruparea funcional a rinii.

4. Cromatografia gazoas

Cromatografia gazoas, numit i cromatografia de gaze (gaz cromatografie) sau n faz
gazoas, este tehnica de separare a substanelor care utilizeaz o faz mobil gazoas cu o faz
staionar solid n cazul cromatografiei gaz-solid, sau cu o faz staionar lichid, n cazul
cromatografiei gaz-lichid.

4.1. Cromatografia gaz-lichid

4.1.1. Generaliti
Cromatografia gaz-lichid utilizeaz o faz staionar lichid (greu volatil), dispersat sub
forma unui film pe suprafaa unui suport solid, granulat, cu care se umple coloana cromatografic.
Faza mobil, numit i gaz purttor, joac rolul eluentului,
separarea componentelor efectundu-se pe baza repartiiei
difereniate a componentelor n faza lichid i gazoas. Faza
staionar lichid duce la o distribuie (pe baza coeficientului
lor de distribuie, K) a componentelor amestecului,
astfel nct, acestea formeaz zone separate n gazul purttor
(eluent). Componentele care prsesc pe rnd coloana odat cu gazul purttor, sunt detectate cu
ajutorul unui detector i apoi nregistrate n funcie de timp, sub forma cromatogramei cu ajutorul
unui nregistrator, aa cum se observ n figura 86, care prezint dou picuri corespunztoare celor
dou substane separate. Alegerea potrivit, dintre numeroasele faze staionare lichide disponibile,
ofer posibilitatea separrii eficiente a unui numr foarte mare i variat de amestecuri de substane
organice. Folosirea unui gaz ca faz mobil permite stabilirea rapid a echilibrelor ntre cele dou
faze. Utilizarea unei viteze optime a gazului purttor duce la o separare rapid a componentelor i
deci la un timp scurt de analiz. Folosind faze staionare potrivite, cromatografia gaz-lichid poate
rezolva uor i rapid separarea amestecurilor cu puncte de fierbere practic identice, care nu pot fi
separate prin distilare sau prin aplicarea altor tehnici.
Fig.85
Fig.86
17
Utilizarea unor detectoare deosebit de sensibile pot pune n eviden cantiti de ordinul a
10
-12
g, un avantaj deosebit al acestei excepionale sensibiliti fiind cantitile extrem de mici
necesare pentru o prob. Adugnd la aceasta, simplitatea manevrrii gaz cromatografelor i
uurina interpretrii datelor, se poate explica cu uurin dezvoltarea vertiginoas a tehnicii
cromatografiei gaz-lichid n scopuri analitice i preparative, n ultimele decenii, de cnd James i
Martin (1952) au instituit-o. Cuplarea gaz-cromatografului cu spectrometrul de mas, care
determin cu precizie masa molecular i ofer preioase detalii referitoare la structura compuilor
separai de ctre cromatograf din amestecuri extrem de complexe, constituie o realitate excepional
n domeniul chimiei analitice organice.
Cromatografia gaz-lichid utilizeaz noiunile generale caracteristice proceselor de separare
cromatografic. Exemplificnd cu ajutorul figurii 86, se poate observa c rezoluia (R) pentru dou
componente ale amestecului, care caracterizeaz eficacitatea unei separri, este dat de relaia:
R=
2 1 2 1
2
) ( 2
1 2
w w
d
w w
t t
R R
+
=
+

, (23)
n care
1
R
t i
2
R
t sunt timpii de retenie n coloan a celor dou componente, w
1
i w
2
, limile
picurilor calculate prin trasarea tangentelor, iar d distana dintre picuri.
Rezoluia este cu att mai bun cu ct benzile sunt mai ndeprtate i mai nguste. Pentru o
valoare R egal cu unitatea, dou picuri de suprafee egale sunt separate 98%, iar dac R = 1,5
separarea atinge 99,7%.
n relaia (23), care definete rezoluia R, s-au utilizat timpii de retenie apareni
(necorectai), care nglobeaz i timpul de reinere al componentei neadsorbite t
0
(aa numitul timp
mort, adic timpul n care eluentul i componentele neadsorbite parcurg distana pn la detector).
Timpul de retenie real (corectat) t
R
'
, reprezint diferena dintre timpul scurs de la injectarea probei
pn la apariia picului t
R
(timpul aparent) i timpul scurs pn la apariia componentei nereinute t
0

(de exemplu aerul injectat odat cu proba):
t
R
'
= t
R
- t
0
, (24)
Eficacitatea coloanelor de separare n cromatografia gaz-lichid este msurat fcndu-se uz
de conceptul de taler teoretic, mprumutat din teoria distilrii fracionate. Eficacitatea coloanelor se
msoar i prin nlimea echivalent a unui taler teoretic, H, (25) care reprezint raportul dintre
lungimea coloanei L i numrul talerelor teoretice N i care permite compararea eficacitii
coloanelor de diverse lungimi:
N
L
H = , (25)

4.1.2. Influena diverilor factori n cromatografia gaz-lichid.
18
Suportul solid pe care este distribuit faza staionar lichid trebuie s fie inert, rezistent
mecanic, s aib suprafa ct mai mare, form regulat i mrime uniform.
Cel mai des folosit suport este diatomitul sau kieselgurul (schelete silicioase de alge
unicelulare -diatomee) cunoscut sub numele comercial de Chromosorb (diverse sortimente), Celit
i Firebrick. Chemosorbul W (de la white = alb) i P (de la pink = roz) reprezint dou astfel de
sorturi mult utilizate, obinute prin calcinarea diatomitului natural, urmat de un tratament adecvat
care s-i asigure un pH potrivit (6-7 pentru Chemosorbul P i 8-10 pentru Chemosorbul
W).Compoziia tuturor acestor supori este asemntoare, fiind alctuit din SiO
2
, 89-91%; Al
2
O
3
,
3,6-5,1%; Fe
2
O
3
, 1-1,6%; CaO, 0,4-1,8%; MgO, 0,6-1% etc.
Pentru anularea efectelor adsorbante ale acestor supori (care provoac apariia unor "cozi"
ale picurilor cromatografice) ei pot fi tratai cu acid clorhidric concentrat pentru distrugerea
centrilor activi i apoi splai cu metanol i ap; pot fi acoperii cu materiale inerte (teflon, argint)
sau pot fi tratai chimic, de exemplu cu dimetildiclorosilan (silanizare), pentru nlocuirea centrilor
activi hidroxilici prin grupri esterice stabile i inerte.
Pe lng suporii menionai mai sus, se utilizeaz i derivai fluorurai ai polietilenei (teflon)
sub numele de Fluoropak 80 i Haloport F sau granule de sticl cu suprafa special prelucrat
(aceasta din urm doar pentru concentraii mici - 0,5% - de faz lichid).
n ceea ce privete diametrul particulelor suportului, dimensiunile uzuale sunt cele cuprinse
ntre 0,3 mm i 0,1 mm, valori care se consider optime pentru a nu opune rezisten prea mare
gazului purttor (ceea ce ar necesita presiuni prea mari de lucru).
Faza staionar trebuie s ndeplineasc anumite cerine:
s fie un solvent bun i selectiv pentru componentele amestecului;
s aib o volatilitate ct mai sczut (presiune de vapori de 0,01-0,1 mm Hg la temperatura de
lucru);
s fie termic stabil i chimic inert.

Tabelul 18
Nr.
crt.
Denumire Compoziie
Temperatura
maxim, ( C)
Polaritat
e
1. Adipat de etil Adipat de etil 150 I
2. Adiponitril Adiponitril 50 I
3. Apiezon L Ulei parafinic 300 N
4. Apiezon M Ulei parafinic 275 N
5. Butandiolsuccinat 225 P
6. Carbowaxuri (400-600) Polietilenglicoli 100-200 P
7. Carbowax 20 M Polietilenglicol-tereftalat 250 P
8. DC-200 (Dow-Corning) Metilsilicon (lichid) 225 P
9. DC-550 (Dow-Corning) Fenilsilicon (lichid) 225 P
10. DEGA Dietilenglicoladipat 190 P
19
11. DEGS Dietilenglicolsuccinat 225 P
12. LAC 446 Dietilenglicoladipat 225 P
13. Nujol Ulei de parafin 200 N
14. QF-1-650 Gum siliconic
fluorurat
260 I
15. SE-30 Gum metil siliconic 300 N
16. SF-96 Fluorosilicon lichid 300 I
17. TCP Tricresilfosfat 125 I
18. THEED Tetrahidroxi etil-
etilendiamin
150 P
19. Ucon Polialchilenglicoli 225 P,N
P = polar, N = nepolar, I = intermediar.

n tabelul 18 sunt menionate cteva din cele mai folosite faze lichide, indicndu-se att
numele comercial i compoziia, ct i polaritatea i temperatura maxim de lucru peste care faza
lichid ncepe s aib o volatilitate suficient de mare pentru a prsi coloana odat cu produii
separai (pe care i impurific) i cu gazul purttor. Alegerea fazei staionare depinde de compoziia
amestecului i n principiu, trebuie astfel fcut, nct s fie asemntoare ca structur cu cea a
componentelor amestecului.
Polaritatea fazei staionare este un alt factor care influeneaz n mod decisiv procesul de
separare a componentelor unui amestec de substane organice, contribuind la reinerea difereniat a
componentelor amestecurilor, un timp mai ndelungat sau mai scurt (n funcie de polaritate).
Concentraia fazei staionare pe suport joac i ea un rol important n procesul separrii.
Creterea concentraiei, corespunztoare unui timp mai ndelungat
pe care l petrece o component n faz lichid, duce la o distanare
mai mare a picurilor n cromatogram (d mai mare, figura 87), dar
n acelai timp i la o lrgire a picurilor (w mai mare) i bineneles
i la o mrire a timpului de analiz (t
R
mai mare). Aceast
dependen se observ n figura 87, n care pentru aceeai
temperatur (50) sunt nfiate cromatogramele corespunztoare
unei concentraii de 30% (a), 10% (b) i 1% (c) faz lichid.
Concentraia fazei lichide trebuie astfel aleas nct
separarea s fie bun i timpul de analiz scurt. Tendina actual este de a folosi concentraii ale
fazei lichide cuprinse ntre 2 i 10% pentru a asigura rapiditatea analizei. Suporturile de teflon sunt
utilizate cu maxim 10% faz lichid, iar granulele de sticl (cu suprafa mult mai mic) cu
maximum 0,25%.
Pentru depunerea pe suport a fazei staionare (care la temperatura normal poate fi solid),
aceasta se dizolv ntr-un solvent potrivit, se adaug peste cantitatea corespunztoare de suport i
suspensia se vaporizeaz pn la sec ntr-un evaporator rotativ sau ntr-o capsul sub agitare
20
continu. Umplutura de coloan astfel obinut, care are faza lichid omogen repartizat pe suport,
se introduce n coloan (lovind-o din cnd n cnd pentru depunerea ct mai uniform a umpluturii).
Omogenizarea umpluturii se efectueaz apoi trecnd prin coloan un gaz inert la o presiune ceva
mai mare dect cea de lucru i punnd coloana n contact cu un vibrator. nainte de folosire, coloana
se purjeaz cu un gaz inert (azot, heliu) i se condiioneaz n cromatograf timp de 1-2 ore la
temperatura maxim de lucru.
Gazul purttor are dublul rol de transportor al componentelor volatile ale amestecului de-a
lungul prilor componente ale cromatografului i acela de a participa la procesul de separare gaz-
cromatografic prin repartizarea componentelor amestecului ntre faza lichid i gazul purttor.
Faza mobil introdus n cromatograf cu debit constant trebuie s fie inert, pentru a evita
interaciuni ale gazului cu produii de separat sau cu faza lichid, s fie uor de obinut n stare pur
i s fie potrivit pentru detectorul gaz - cromatografului. Pentru detectoarele prin conductibilitate
termic (catarometre) i cele cu ionizare n flacr (FID) se utilizeaz heliu sau hidrogen, iar pentru
cele cu ionizare cu radiaii , argonul.
Temperatura coloanei este un factor esenial n
separrile cromatografice, avnd n vedere dependena puternic
de temperatur a coeficientului de repartiie. n multe cazuri o
cretere de 30 njumtete coeficientul de repartiie i
dubleaz viteza migrrii componentelor, reducnd
astfel timpul de analiz, dar afectnd n acelai timp i distana (d)
dintre picurile componentelor ce se separ, aa cum se vede n
figura 88. n general, rezoluia poate fi mbuntit prin scderea temperaturii, care se alege n aa
fel nct s nu fie prea nalt (spre a duce la suprapunerea picurilor) i nici prea joas (pentru a
cauza timpi de retenie prea lungi). O condiie n alegerea temperaturii coloanei trebuie s fie aceea
de a asigura o temperatur minim, care s depeasc punctul de topire al fazei staionare,
asigurnd totodat i volatilizarea celei mai nevolatile componente i o temperatur maxim care s
nu duc la volatilizarea fazei lichide (s nu apar mai mult de 10
-4
g faz staionar la 1 litru gaz
purttor).
Meninerea constant a temperaturii (separare izoterm) n decursul separrii este o condiie
esenial, care asigur cromatogramei o linie de baz (de fond) orizontal, dar care nu poate fi
respectat dect n cazul amestecurilor cu componente cu volatiliti apropiate.
Compuii mai greu volatili sau mult mai polari ai unui amestec sunt puternic reinui n
coloan, au timpi de reinere mai lungi i picurile pot fi n cazuri extreme att de aplatizate, nct se
confund la un moment dat, cu mici devieri ale liniei de baz, sau nu se mai observ deloc.
Inconvenientul poate fi ocolit prin programarea temperaturii coloanei, adic prin creterea
progresiv a temperaturii pe msur ce din coloan ies componente din ce n ce mai nevolatile.
21
Avantajul cromatografiei cu temperatur programat reiese clar din compararea cromatogramelor a
i b din figura 89.
Creterea progresiv a temperaturii are i un dezavantaj: presiunea de vapori a fazei
staionare nevolatile, dei foarte redus, crete odat cu temperatura, astfel c gazul purttor, care
prsete coloana saturat cu faza staionar la temperatura respectiv, antreneaz din ce n ce mai
mult faza staionar, care se comport ca o component eluat din coloan, rezultatul fiind creterea
nceat i continu a liniei de baz. Acest dezavantaj poate fi ns ocolit, dac se utilizeaz n
cromatograf dou detectoare, trecndu-se prin al doilea gazul de comparaie care strbate o coloan,
identic cu cea prin care trec componentele amestecului, coninnd aceeai faz staionar la aceeai
temperatur. Dac compoziia n faz staionar a eluentului se modific n aceeai proporie cu
compoziia gazului de comparaie, cele dou semnale se compenseaz i linia de baz rmne n
permanen la valoarea iniial. Un astfel de sistem cromatografic poart numele de sistem "dual".



n afara temperaturii coloanei o mare importan prezint i temperatura blocului de injecie
a probei, care trebuie s fie astfel aleas nct s fie suficient de ridicat ca s asigure volatilizarea
imediat a probei injectate, dar n acelai timp suficient de joas spre a nu provoca descompuneri
termice sau izomerizri ale componentelor de separat. Experimental, temperatura optim a blocului
de injecie se stabilete ridicnd treptat temperatura i urmrind pe cromatogram efectul: dac
eficiena separrii sau forma picurilor se mbuntete, nseamn c temperatura anterioar a fost
prea joas; dac timpul de retenie, suprafaa sau forma picului se schimb simitor, nseamn c
ridicarea temperaturii a provocat o descompunere sau izomerizare. n ceea ce privete temperatura
detectorului, ea trebuie s fie suficient de ridicat pentru ca s nu poat avea loc condensarea
produilor sau a urmelor de faz lichid nainte de a strbate detectorul.
22
Aparatura. Aparatura utilizat n cromatografia gazoas poate varia n limite largi, de la o
aparatur relativ simpl, la una cu un grad nalt de
complexitate. Componentele de baz ale unui
gaz cromatograf, schiate n figura 90, sunt: sursa
(butelia) de gaz purttor sub presiune (1), reductorul de
presiune (2) i msurtorul de debit, rotametru
sau flaumetru (3), blocul (capul) de injecie al probei (4), coloana (5), detectorul i amplificatorul
(6), nregistratorul (7), termostatul pentru blocul de injecie, coloan i detector (8).
Gazul purttor aflat n butelia (1) sub presiune de aproximativ 150 atm. este introdus n
aparatura propriu-zis, dup ce n prealabil, cu ajutorul reductorului (2), s-a ajuns la o presiune
constant de 2-3 atm. i la un debit constant (de cteva zeci sau sute de cm
3
/min), msurat cu
ajutorul msurtorului de debit (3). Gazul purttor ptrunde n blocul de injecie (4) (nclzit i
termostatat), n care se injecteaz i proba cu ajutorul unei microsiringi, printr-un dop de cauciuc
sau de material plastic. Substanele lichide se injecteaz ca atare, iar cele solide se dizolv ntr-un
solvent volatil. Blocul de injecie (camera de evaporare) se menine la o temperatur suficient de
ridicat (funcie de natura amestecului), pentru a asigura volatilizarea componentelor. Curentul de
gaz coninnd componentele de analizat este condus apoi n coloana cromatografic nclzit i
termostatat.
Coloana cromatografic este un tub metalic (oel inoxidabil, aluminiu, cupru) spiralat, cu un
diametru de 4-8 mm, n cazul coloanelor analitice i 15-35 mm, n cazul coloanelor preparative.
Lungimea coloanei variaz n funcie de dificultatea separrii, fiind cuprins pentru coloanele
analitice obinuite ntre 1 i 3 m. Pe lng coloanele metalice cu umplutur, se utilizeaz i
coloanele capilare de sticl, cu diametrul interior de 0,2-0,25 mm i lungimi variind de la 20 pn
la 300 m, n care faza staionar lichid este depus sub forma unui film (3500 ) pe pereii tubului.
Cu acest fel de coloane se obin separri foarte eficiente pe cantiti extrem de mici (0,01-0,1g) de
substan.
Vaporii diferitelor componente se adsorb pe faza staionar din coloan i ncep s migreze
cu viteze diferite de-a lungul acesteia, ajungnd pe rnd la detectorul care msoar una dintre
constantele fizice ale gazului (densitatea, conductivitatea termic, ionizarea la ardere ntr-o flacr
sau la bombardament cu radiaii ), care variaz n funcie de natura i concentraia componentelor
amestecului. Aceast variaie este transformat ntr-un impuls electric, care dup ce este amplificat,
se nregistreaz n funcie de timp sub forma cromatogramei ce indic numrul i cantitile
diferitelor componente din amestec.
Detectorul reprezint, alturi de coloan, partea esenial a unui cromatograf. Metoda de
detecie a componentelor eluate din coloan se bazeaz n principiu pe punerea n eviden a unor
diferenieri (ale unei proprieti fizice care permite att deosebirea componentelor ntre ele, ct i
23
deosebirea acestora de gazul eluent). Caracteristicile principale ale unui detector sunt: sensibilitatea,
viteza rspunsului i proporionalitatea acesteia cu concentraia componentelor, stabilitatea n timp.
Marea majoritate a detectorilor utilizai n practic sunt detectori de conductibilitate termic
(catarometre) i detectori de ionizare.

4.1.3. Aplicaii n chimia organic
Analiza calitativ a compuilor organici cu ajutorul cromatografiei gaz-lichid utilizeaz,
pentru identificarea produilor separai din coloan, n primul rnd timpul de retenie determinat
prin utilizarea unei coloane de o anumit lungime i diametru, umplut cu o anumit faz lichid
(de o concentraie bine stabilit), pe un anumit suport. Trebuie, de asemenea, precizate i celelalte
condiii de lucru, adic temperatura i debitul de gaz purttor. De obicei, se utilizeaz n analiza
cromatografic timpul de retenie relativ (t
rel.
) definit prin relaia:
et
x
rel
t
t
t =
.
, (26)
unde t
x
este timpul de reinere al componentei x (care poate fi timpul de retenie aparent t
R
sau
timpul de retenie real t
'
R
), iar t
et
timpul de retenie al substanei etalon (t
R
sau t
'
R
). Identitatea
timpilor de retenie a doi compui (componenta separat i un etalon pur) constituie un indiciu
preios al posibilitii ca acetia s fie identici.
Dovezi mai sigure se obin prin repetarea cromatogramei pe
mai multe coloane, cu umpluturi diferite, n condiii diferite, timpii
de reinere ai componentei i etalonului trebuind s rmn aceeai.
O alt posibilitate este aceea de a mbogi amestecul de analizat
ntr-o component pur (care se presupune c exist n amestec) i
de a urmri creterea picului corespunztor n cromatogram,
extinznd ncercarea pe coloane cu umpluturi diferite.
Identificarea riguroas, cert, a componentei unui amestec
dnd natere unui anumit pic cromatografic, nu se poate realiza
dect colectnd fraciunea respectiv dup ieirea din coloan i
caracteriznd-o spectroscopic sau prin constantele sale fizice. Gaz-
cromatografele pot fi legate i direct la un spectrometru infrarou sau la un spectrometru de mas,
eliminndu-se astfel operaiunea de colectare individual a fraciunilor.
Un exemplu concret de utilizare a cromatografiei gazoase, n vederea identificrii unor
componente dintr-un amestec de alcooli, este redat n figura 91 a i b. Comparnd cromatograma
amestecului necunoscut (figura 91a) cu cea a unui amestec standard (figura 91b), se pot identifica
picurile 2,3,4,7 i 9 ca aparinnd alcoolilor metilic, etilic, propilic, butilic i amilic. Bineneles c
prima condiie pentru a putea compara cele dou cromatograme este aceea ca ele s fi fost efectuate
24
n condiii riguros identice (faza staionar identic, de aceeai concentraie, pe acelai suport,
temperatur i vitez de eluare identice).
Analiza cantitativ a compuilor organici cu ajutorul cromatografiei gaz-lichid se bazeaz
pe msurarea suprafeelor picurilor (care reprezint o msur cantitativ a unei proprieti fizice, ca
de exemplu conductibilitatea termic, utiliznd ca detector catarometrul) proporionale cu
concentraia componentelor care ptrund din coloana
cromatografic n detector. Determinarea suprafeei
maximelor se poate face prin asimilarea fiecrui maxim cu
un triunghi a crui suprafa se calculeaz cu ajutorul
relaiei h
.
w (n care h este nlimea i w limea la 1/2 din
nlime, figura 92), utiliznd planimetre, sau cel mai uor
prin evaluarea ariilor cu ajutorul integratoarelor
electronice, care traseaz sub cromatogram o a doua
curb, aa cum se vede i n figura 92. Numrnd
picioarele liniei n zig-zag (i fraciunile acesteia) de sub
picul respectiv pentru fiecare maxim n parte, se poate afla
cu uurin suprafaa pe care acestea o reprezint. Raportul
celor dou componente ale cromatogramei din figura 92 este A/B=115/125,5=0,91. Exist i
integratoare mai perfecionate, care apar pe un cadran sau sunt imprimate pe hrtie.
n cazul utilizrii catarometrului ca detector, transformarea suprafeelor picurilor n
concentraii ale componentelor necesit n principiu cunoaterea conductibilitii termice ale
componentelor prezente n amestec. Evitarea acestui inconvenient, care ar ngrdi extrem de mult
utilizarea gaz cromatografiei n scopuri analitice, se realizeaz prin nregistrarea unei cromatograme
a unui amestec (exact cntrit) a componentelor pure i prin calcularea factorului de corecie:
F=
s
g
r
r
, (27)
unde: r
g
este raportul greutilor i r
s
este raportul suprafeelor fiecrei componente, relativ la una
din componente sau la un standard intern adugat amestecului.
Raportul suprafeelor (relativ la acea component sau la standardul intern folosit n
amestecul de compoziie cunoscut), determinat din cromatograma amestecului de necunoscute, se
transform n raportul greutilor prin nmulirea raportului suprafeelor cu factorul F. Deoarece
conductibilitile termice variaz cu temperatura, valorile F calculate pentru o anumit temperatur
a detectorului pot fi utilizate numai dac analiza a fost efectuat la aceeai temperatur.
Analiza calitativ i cantitativ cu ajutorul gaz-cromatografiei a dus la obinerea unor
rezultate spectaculoase n diferite domenii. n industria alimentar au devenit posibile studii legate
de procesul alterrii alimentelor, a contaminrii lor cu urme de pesticide sau de substane toxice
25
provenite din ambalaje, a compoziiei sucurilor, siropurilor, buturilor, analiza urmelor de substane
care dau "buchetul" vinurilor, a factorilor chimici care provoac modificri ale gustului alimentelor
i buturilor. n domeniul analizei urmelor de impuriti poluante ale solului, apei, atmosferei,
cromatografia gazoas joac, de asemenea, un rol deosebit.
Cromatografia preparativ utilizeaz pentru separarea componentelor unui amestec
neizolabil pe calea distilrii fracionate, coloane cromatografice de dimensiuni mai mari, pentru a se
putea menine raportul optim dintre cantitatea de faz staionar i proba injectat (de ordinul
mililitrilor). Componentele separate se colecteaz n trape puternic rcite (-78 cu CO
2
solid sau -
180 cu azot lichid), pentru a asigura o condensare ct mai complet a lor, deoarece n general sunt
n diluie foarte mare n gazul purttor.
Aparatura modern permite injectarea automat a probei (plasat ntr-un rezervor) n
fraciuni de ordinul mililitrilor i schimbarea automat a recipientelor de colectare, care se face n
momentul n care nregistratorul nscrie un nou maxim. Cu ajutorul unor cadrane de la 0-100% este
posibil prinderea automat numai a poriunii dorite din picul cromatografic atunci cnd picurile nu
sunt complet delimitate, cnd exist suprapuneri. Se poate colecta astfel fie prima parte a picului
(dac suprapunerea este ctre sfritul picului), fie ultima, fie numai mijlocul su, unde ansa de
impurificare cu componeni din picurile vecine este minim.