Curs 5 Analiza si Controlul Medicamentelor CROMATOGRAFIA METODE CROMATOGRAFICE APLICATE IN CONTROLULMEDICAMENTELOR CROMATOGRAFIA este una din ramurile vaste

ale analizei (instrumentale) medicamentului,cu aplicatii largi in separarea, detectia si determinarea substantelor chimice in general si inanaliza si controlul medicamentelor in particular.Tehnicile cromatografice de analiza sunt in primul rand tehnici de separare, dintre cele maiselective si eficiente, inclusiv pt urme de substante si asociate cu metode de detectie. Suntcapabile sa sesizeze cantitati infime de substante, ceea ce le confera o mare sensibilitate,selectivitate si eficienta.Se poate spune ca toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si ofaza mobila iar componentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de unflux de faza mobila, gazoasa sau lichida, cu viteze diferite, ceea ce constituie procesulfundamental al separarii.Pe de alta parte, la baza tuturor metodelor cromatografice de separare, stau 4 procesefundamentale:a. Adsorbtia pe suporturi solide b. Repartitia intre faza stationara si cea mobilac. Schimbul ionicd. Excluderea, difuzia.Prin urmare, principiul separarii poate fi diferit, dar etapele analizei cromatografice suntaceleasi:Pregatirea fazei stationareFixarea initiala a analitilor, in capul coloanei, pe faza stationara, dupa introducereasolutiei de probaDeplasarea selectiva, caracteristica a analitilor, antrenati de faza mobila, in cadrul procesului de elutie, developare.Identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si trec indetector.-

Inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor pick-urilor si a altor parametri sidozarea analitilor corespunzatori, concomitent cu evaluarea statistica a rezultatelor. 2 Tinand cont de natura fazelor stationare si a celor mobile se poate realiza o clasificareacceptabila si rezonabila a metodelor cromatografice:

Cromatografia in faza gazoasa

Cromatografia in faza lichidaPlanara o Pe hartie o Pe strat subtire (css)Pe coloana o De adsorbtie solid-lichid o De repartitie lichid-lichid o De schimb ionic o De excludere-difuzieAlegerea fazelor stationare se face in functie de masa moleculara a analitilor, de solubilitatealor in solventi organici si apa, de caracterul lor (nepolar, polar sau ionic).In cromatografia de absorbtie, faza stationara este un suport solid (oxid de aluminiu)

care are proprietati absorbante.In cromatografia de repartitie faza stationara este o pelicula de lichid fixata pe un suport solid,cele 2 faze nefiind miscibile.In cromatografia de schimb ionic faza stationara un compus macromolecular care contine unnr mare de grupari functionale, acide sau bazice, capabile sa schimbe cationi (care sunt grupariacide) sau anioni mai grei si cu sarcina mai mare. Aceste macromolecule schimbatoare de ioni se mai numesc si rasini cationice sau cationiti si anionice/anioniti.In cromatografia de excludere sterica sau de excludere-difuzie, faza stationara un gel care secomporta ca o sita moleculara, fixand anumite molecule si eliminand altele, in functie demarimea si masa lor.In afara de aceste tipuri fundamentale exista si unele procedee cromatografice specifice,caracteristice unor specii chimice:Cromatografia chirala, de absorbtie sau de repartitie; se caracterizeaza prin structura chiralaa fazei stationare sau a fazei mobile ceea ce permite separarea selectiva a analitilor chirali.Cromatografia cu lichide super-critice, care exploateaza solubilitatea analitilor intrun fluidsuper-critic; ex: CO2 ca atare sau modificat (+ metanol); - metoda asigura extragereaanalitilor din matrice si ulterior separarea cromatografica.Electro-cromatografia capilara micelara o tehnica hibrida care imbina cromatografia cuelectroforeza; 3 In functie de procedeul practic utilizat: o Cromatografie pe coloana

in care faza stationara este plasata pe o coloana, tub demetal, sticla, silice o Cromatografie planara/de suprafata pe hartie sau pe strat subtireIn functie de migrarea fazei mobile se disting:

Cromatografie prin developare in care analitii raman pe faza stationara sau suntlocalizati pe aceasta; in functie de directia de migrare, ascendenta sau descendenta,

Cromatografie de elutie, in care analitii sunt eluati (spalati) pana la iesirea lor completa din coloana, fiind posibila culegerea succesiva a fractiunilor de analiti siin acest caz detectia se face in eluenti.Pentru intelegerea corecta a proceselor cromatografice trebuie precizati parametri saumarimile care definesc procesele cromatografice de separatie.Ex: o proba cu 2 analiti.Pe coloana pregatita in prealabil se introduce un volum din proba, se adauga faza mobila, putincate putin, incepe developarea, adica migrarea analitilor cu viteze diferite. Se produce elutia,adica extragerea din coloana a fiecarui analit, iar la aparatele moderne de croma eluentul seconduce direct la detector, in care se face detectia analitilor separati.Se observa ca procesul de separare se produce treptat intre faza stationara si faza mobilaexistand un echilibru determinat de concentratiile fiecarui analit in cele 2 faze si a caror raportreprezenta coeficientul de repartitie sau de distributie ( k d ).Pentru un amestec de analiti este posibil sa se utilizeze un detector plasamt cat mai aproape deiesirea eluentului din coloana si care inregistreaza continuu semnalul analitic, semnal proportional cu variatiile concentratiilor analitilor separati si eluati, care traverseaza coloana,obtinandu-se cromatograma corespunzatoare, inregistrata de un inregistrator care face parte dinansamblul

instrumentului de analiza cromatografica.Fiecarui analit ii corespunde un pick pe cromatograma care se inregistreaza intr-un sistem decoordonate. 4 Parametrii/marimile de retentie cromatografica sunt:timpulvolumuldistantafactorul/raportul de retentie, acestia fiind legati de coeficientul de distributie ( k d ) intrefaza stationara si cea mobila. Timpul de retentie t r = timpul scurs de la introducerea probei de analit in coloana si momentulin care apare maximul pick-ului din coloana. t 0 sau t m = timpul mort = timpul necesar ca faza mobila sa ajunga la detector si se datoreaza parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spatiile fazei stationare.De regula, eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pick al detectorului, sidin acest moment, se masoara timpul de retentie al analitului, numit timp de retentie corectat . Volumul de retentie V r

= reprezinta volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul cuconcentratia sa maxima in detector.Similar timpului de retentie, volumul de retentie corectat. (V r =V r -V 0 )Raportul de retentie se exprima prin raportul dintre viteza medie de deplasare a analitului siviteza medie de deplasare a fazei mobile. R r Factorul de retentie se exprima prin raportul dintre cantitatea de analit care se gaseste in fazastationara (Q s ) si cantitatea de analit care se gaseste in faza mobila(Q m ). 5 Curs Analiza si Controlul Medicamentelor CROMATOGRAFIA PE HARTIE (C.H.) Realizeaza separarea sau distribuirea componentelor dintr-un amestec intre:

o faza stationara, constituita din hartia cromatografica (de regula celuloza 9599%)impregnata cu un solvent polar (apa, solutii tampon)

o faza mobila, constituita dintr-un sistem de solventi de polaritate opusa, adica nepolari.Procesul de separare are la baza in general un mecanism de repartitie dar se pot intalni simecanisme de absorbtie, schimb ionic, reactii chimice.Aparatura este dependenta de procedeul ales pentru developare.In general se utilizeaza camere sau bac-uri cromatografice din sticla sau metal (de regula inox),cu posibilitatea de inchidere etansa (cu vizoare), de forma cilindrica sau paralelipipedica, prevazute cu un dispozitiv de fixare a hartiilor cromatografice si cu o cuva care in cazul tehniciiascendente se fixeaza pe fundul vasului cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente sefixeaza la partea superioara a vasului.Benzile de hartie cromatografica sunt specificate in monografia respectiva, sorturile utilizate(Watmann, Munktel, Schull) fiind caracterizate prin:-

viteza de migrare a solventuluiporozitateaspectul suprafeteigrosimesi eventual, utilizarea ei care deriva din pretratare (ex: hartia hidrofobizata, in scopulsepararii subst hidrofobe)Tehnica de lucru: daca nu se prevede altfel, cu 24 h inainte de determinarea cromatografica,vasul cromatografic se satureaza cu toate componentele fazei mobile (adica a developantului),introduse in cristalizoare la o temperatura de 20-25gradeC.Tehnica cromatografica ascendenta, descendenta, pregatirea benzilor de hartie cromatografica,developantul, modul de preparare al solutiilor de aplicat (proba si etalonul), volumele aplicate sidistanta parcursa de developant sunt prevazute in monografia respectiva.Linia pe care se aplica solutiile = linie de start trebuie sa fie situata la o distanta de 5-6 cm demarginea benzii de hartie pt tehnica ascendenta si de 10-12 cm pt tehnica descendenta.Distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin 2,5 cm.Solutiile se aplica pe hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, cu micropipete,microseringi, in puncte circulare cu diametru de cel mult 6 mm. Daca este cazul, solutia seaplica in mod repetat asteptand de fiecare data evaporarea solventului. 6 Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, hartia cromatografica se scoate, se usuca sise pun in evidenta petele conform prevederilor din monografie.Se trece la identificare, evaluare semi-cantitativa si dozare. Dozarea se mai poate efectua sidupa decuparea petei si eluarea acesteia cu un solvent potrivit conform prevederilor.Aplicatii ale cromatografiei pe hartie:metoda oficiala pt determinarea puritatii radiochimice a substantelor radioactiveidentificarea si dozarea fenobarbitalului din comprimateidentificarea si puritatea maleatului de ergometrina 7 CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE C.S.S.

Este o metoda ce permite separarea componentelor unui amestec pe baza diferentei lor dedeplasare de-a lungul unui strat absorbant care acopera o placa de sticla, metal sau polimer subactiunea unui sistem de solventi.Stratul absorbant constituie faza stationara si poate avea o grosime de 0,2-0,3 mm pentru scopcalitativ si 1-2 mm pentru scop cantitativ.Separarea evidentiaza un mecanism de adsorbtie, repartitie, schimb ionic, s.a.Cei mai uzuali adsorbanti ce alcatuiesc faza stationara, utilizati in C.S.S. sunt:silicagelulcelulozaoxidul de Alkieser......????Tehnica de lucru: asemanatoare C.H., iar particularitatile sunt prevazute in monografiarespectiva.In C.H. sau C.S.S. zona de migrare este definita prin R f care reprezinta raportul dintredistantele de migrare ale componentelor si frontul fazei mobile.Pentru indentificarea substantelor se compara pe aceiasi cromatograma valoarea R f , culoarea sifluorescenta petei obtinute cu solutia probei, cu valoarea R f , si culoarea si fluorescenta peteiobtinute cu solutia etalon

a distanta parcursa de substanta de la pc de aplicate al solutiei pana la centrul petei in cm b distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiei si pana la frontuldevelopantului, trecand prin centrul petei.De obicei, punerea in evidenta a punctelor de pe cromatograma se efectueaza prin examinareaacestora ca atare, sau dupa tratarea cu reactivi potriviti in lumina vizibila sau UV.Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza dupa razuirea petelor respectivesi eluarea

substantelor de pe absorbant cu un solvent potrivit prin spectrometrie. Comparareavizuala a dimensiunii petelor si a intensitatii coloratiei sau fluorescentei se foloseste ptevaluarea semi-cantitativa a impuritatilor.Aplicatii: identificarea teofilinei si papaverinei din supozitoareidentificarea fenacetinei, cofeinei, aspirinei din comprimatedeterminarea puritatii palmitatului de cloramfenicol, care admite cel mult 2%cloramfenicol neesterificatdeterminarea impuritatilor din tetraciclina 8 CROMATOGRAFIA DE GAZE C.G. Este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care faza mobila este un gaz (gaz purtator), iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care este impregnat un suport solid,inert, aflata intr-o coloana cromatografica, confectionata de obicei din sticla sau din otelinoxidabil. Faza mobila se deplaseaza continuu prin coloana, iar la iesire, gazul purtator trece prin detector.Cromatografia de gaz este o varianta a cromatografiei pe coloana si permite atat separarea substvolatile, cat si a celor care in urma unor reactii chimice pot fi transformate in derivati volatili sistabili.Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale:sursa de gazcamera de evaporarecoloana cromatograficatermostatuldetectorulsistemul de inregistrare.Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba deanalizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea componentelor.La iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu componentele separate prin detector care emite un semnal electric proportional cu concentratia componentei din fazagazoasa.Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare, iar rezultatele se prezinta sub forma unuigrafic

semnal/timp.Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de vapori,camera de evaporare este incalzita la o temperatura suficient de ridicata pt a asigura o evaporarerapida si fara a produce o degradare termica a probelor.Cu ajutorul termostatului in timpul determinarii, temperatura coloanei cromatografice estementinuta constanta.Faza mobila este constituita dintrun gaz inert (He, neon, argon, H) = numite si gaze vector sau purtatoare, care antreneaza substantele de determinat.Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul coloanei este diferita, fapt ce duce la separareasi la eluarea lor din coloana intr-o anumita ordine.La iesirea din coloana componentele eluate succesiv de gazul vector sunt decelate de un aparatde masura (detector) care deosebeste proprietatile componentelor de cele ale gazului vector si produce un semnal, care se inregistreaza. 9 Se traseaza o curba in clopot analog unei curbe de distributie Gauss. Varful cromatografic sau pick-ul corespunde componentei separate, iar inaltimea lui este proportionala cu concentratiacomponentului in faza gazoasa.Detectia componentelor din gazul vector se realizeaza cu ajutorul unor detectoareuniversale/specifice, adica sensibile numai la anumite elemente chimice, grupe functionale saulegaturi chimice.La baza detectiei sta in principiu orice proprietate care deosebeste componenta de detectat deeluant. o r t c e p S m d l u r t e m s a (m.s.) cuplat la un gaz cromatograf ofera posibilitatea detectarii unuinr mare de compusi dintr-un amestec omplex, fiecare compus fiind identificat prin spectrul saude masa, obtinut prin introducerea eluantului direct in camera de ionizare a spectrometrului demasa. G z a o r c m l u f r g o t a se utilizeaza atat in determinari calitative cat si cantitative; la bazadeterminarilor cantitative sta relatia de proportionalitate intre aria de sub pick-ul cromatograficsi cantitatea componentului eluat. 10 CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA(HPLC) Sub aceasta denumire sunt descrise principalele si cele mai frecvent aplicabile metode deanaliza cromatografica bazate pe repartitie lichid-lichid, adsorbtie lichidsolid, schimbator deioni, procese de excludere-difuzie.Cromatografia de lichide clasica-

pe coloanape strat subtirepe hartie necesita o aparatura simpla dar este destul de lenta cu o capacitate de separarerelativ mica; detectia componetelor este dificila, costisitoare si necesita cantitati mari desolvent si pregatiri tehnice laborioase.Cromatografia de gaze s-a impus ca o metoda rapida, sensibila si a cunoscut o mare extindere prin cuplarea gaz-cromatografului cu spectrometrul de masa, limitele metodei, insa, fiindimpuse de conditia volatilizarii produsilor sau a transformarii lor in derivati volatili si stabilitermic, aspecte ce fac posibile determinari ale unui nr scazut de substante organice (aprox 15%).Cunostintele dobandite in gaz-cromatografie, transpuse in practica cromatografiei de lichide aucondus la o tehnica de inalta performanta, moderna, care se realizeaza cu o viteza mare, sielimina dezavantajele cromatografiei de gaze, utilizand absorbanti cu o structura fina, semareste rezistenta la curgere a fazei mobile, si o data cu scaderea vitezei de curgere cresc timpiide retinere a componentelor pe coloana.In aceste conditii pt realizarea unei separari eficiente in timpi scurti de analiza trebuie realizate presiuni mari care desi impun dificultati tehnice legate de o aparatura adecvata, permit separarianalitice, imposibil de realizat prin alte metode.Aceasta noua tehnica se numeste cromatografie de lichide la inalta performanta, sau la inalta presiune,sau la inalta viteza, HPLC.Denumirea la inalta performanta se refera la viteza analizei, capacitatea de separare,sensibilitatea metodei.In HPLC sunt necesare presiuni mari de cateva sute de atmosfere pt a asigura debitecorespunzatoare ale fazei mobile.Avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC moderne este foarte mica, (diametrul particulelor = 3 10 ) aparatura utilizata este mai complicata si foarte scumpa.Avantaje HLPC comparativ cu C.G.:substantele de analizat nu trebuie sa fie volatilemajoritatea separarilor se pot efectua la temperatura obisnuitatimpi scurti de analiza

11 conditii de lucru simple pt pregatirea probelor, efectuarea analizei si prelucrarea datelor polaritatea fazei mobile si a fazei stationare poate fi variataIn HPLC separarea componentelor dintr-un amestec se bazeaza pe distribuirea lor intre 2 faze,iar mecanismele care stau la baza separarii definesc si tipurile de HPLC:HPLC de absorbtieHPLC Cu faze inverseHPLC de repartitieHPLC prin schimb ionicHPLC prin ecluziune molecularaTehnica de lucru: in fiecare monografie care utilizeaza tehnica HPLC sunt prevazutecaracteristicile coloanei cromatografice (tipuri, lungimea, diametrul interior, natura fazeistationare, dimensiunea particulelor etc) si conditiile de cromatografiere (concentratia solutieide analizat, concentratia solutiei standard, volumele de injectat din fiecare solutie, compozitia sidebitul fazei mobile, temperatura, modul de lucru, sistemul de detectare).Cu ajutorul solutiilor sandard se regleaza aparatul si se determina volumul solutiilor de injectat pentru a obtine un raspuns convenabil al detectorului. Se determina suprafata si inaltimea pick-urilor componentelor, iar din valorile obtinute se calculeaza concentratiacomponentei/componentelor de determinat.Gradul de separare a 2 suprafete intr-o cromatograma se defineste prin notiunea de o z e r u l i t .( R s ) alt parametru.Aplicatii HLPC:standardizarea si verificarea medicamentelor (puritate, stabilitate, analiza cantitativa sicalitativa)

 la analgezice, aspirina, fenacetina, acetaminofen, anestezice, procaina,lidocaina, tetracaina, antihistaminice, pseudoefedrina, clorfeniramin, steroizi, prednisolon, corticosteron, progesteron, narcotice si metabolitii lor, antibiotice(tetracicline)izolarea principiilor active din produsele vegetaledeterminarea concentratiei medicamentelor in sange si urina. 12 SPECTROMETRIA DE MASA (M.S.) Metoda de analiza care se bazeaza pe fragmentarea moleculelor substantelor organice la energiimari de pana la 100 V, iar numarul, sarcina si masa fragmentelor rezultate dau informatii asuprastructurii si identitatii substantelor cercetate.De regula, detectia compusilor organici, inclusiv medicamentosi, nu se face prin sepctrometriede masa decat daca ei se afla in stare pura.Din aceste considerente, spectrometria de masa se utilizeaza in cuplaj cu H.P.L.C. sau/si C.G.legand capatul de iesire al coloanei cromatografice la camera de ionizare a unui spectrometru demasa. In acest fel se poate analiza fiecare fractiune (pick) care iese din coloana cromatografica pe masura ce avanseaza elutia, inclusiv in cazul urmelor de substante existente in proba.Fragmentarea moleculelor este determinata de acumularea de energie care produce rupereaunor legaturi interatomice, proces din care rezulta mai ales ioni pozitivi, rar negativi, radicali simolecule neutre.Deoarece fragmentarea produce mai ales ioni pozitivi, fragmentele sunt purtatoare de sarcina,au masa determinata si se pot caracteriza prin raportul dintre masa lor si sarcina. (m/z)Pentru a putea produce fragmentarea moleculelor, substanta care trebuie analizata se aduce instare gazoasa, se introduce intr-o camera de ionizare, in care se produce fragmentarea, iar fragmentele sunt accelerate de un camp electric si supuse unuiproces de separare, in functie devaloarea raportului m/z si concentrata pe un colector inregistrandu-se abundenta lor relativa.Toate operatiunile se efectueaza in vid inaintat.