CURSURI ANALIZA MEDICAMENTULUI

Cromatografia in controlul si analiza medicamentului

Introducere
- Cromatografia este una dintre ramurile mari ale analizei instrumentale cu aplicatii largi in separarea, detectia si determinarea
substantelor chimice in general si in analiza si controlul medicamentelor in particular;
- Tehnicile cromatografice de analiza sunt tehnici de separare selective si eficiente, putand fi folosite inclusiv pentru urme de substante;
- Tehnicile cromatografice de analiza sunt metode instrumentale performante caracterizate prin urmatoarele avantaje:
1. Rapiditate;
2. Eficienta;
3. Forta (in ceea ce priveste selectivitatea, sensibilitatea, automatizarea, miniaturizarea senzorilor si a altor componente, tratarea
datelor analitice);
- Tehnicile cromatografice au ca elemente comune o „faza stationara” si o „faza mobila”, iar componentii unui amestec analizat sunt
antrenati in lungul coloanei de un flux de faza mobila (gazoasa sau lichida), cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al
separarii.
- La baza tuturor proceselor cromatografice de separare stau 4 procese fundamentale:
1. Adsorbtia pe suporturi solide;
2. Repartitia intre faza stationara si cea mobila;
3. Schimbul ionic;
4. Excluderea – difuzia.
- Chiar daca principiul separarii poate fi diferit, etapele analizei cromatografice sunt aceleasi si anume:
1) Pregatirea fazei stationare;
2) Fixarea initiala a analitilor in capul coloanei;
3) Deplasarea selectiva – caracteristica analitilor care sunt antrenati de catre faza mobila in cadrul procesului de developare sau elutie;
4) Identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si trec in detector;
5) Inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor picurilor si a altor parametri si dozarea analitilor corespunzatori concomitent cu
evaluarea statistica a rezultatelor.
- CLASIFICARE
- In functie de procesele care stau la baza separarilor cromatografice exista:
1. Cromatografia de absorbtie, faza stationara este un suport solid care are proprietati adsorbante;
2. Cromatografia de repartitie in care faza stationara este o pelicula de lichid fixata pe un suport solid, faza stationara lichida nefiind
miscibila cu faza mobila;
3. Cromatografia de schimb ionic in care faza stationara este un compus macromolecular reticulat care contine un numar mare de
grupari functionale acide sau bazice capabile sa schimbe protoni sau ioni alcalini cu cationi bi si trivalenti sau anioni precum
hidroxil sau clorura de anioni mai grei si cu sarcina mai mare (gruparile bazice) schimbatori de ioni se mai numesc si rasini
cationice (sau cationiti) sau anionice (anioniti);
4. Cromatografia de excludere sterica sau de excludere-difuzie in care faza stationara este, de regula, un gel care se comporta ca o sita
moleculara fixand anumite molecule si eliminand altele in functie de marimea, respectiv masa lor moleculara.
- Se poate face o clasificare a metodelor cromatografice si in functie de procedeul practic utilizat si anume:
1. Cromatografie pe coloana in care faza stationara este plasata intr-o coloana sau tub de metal sau de sticla sau de silice topita;
2. Cromatografie planara sau de suprafata, pe hartie sau pe strat subtire.

- In functie de migrarea fazei mobile se disting

1. Cromatografie prin developare in care analitii raman pe faza stationara sau sunt localizati pe aceasta in functie de directia de
migrare; exista developare ascendenta sau descendenta, monodimensionala sau bidimensionala (migrari in directii perpendiculare);
2. Cromatografia de elutie in care analitii sunt eluati pana la iesirea lor completa din coloana, deci din faza stationara, fiind posibila
culegerea succesiva a fractiunilor de analiti; in acest caz detectia se face in efluenti.

Bazele teoretice ale cromatografiei

- Exista o serie de notiuni teoretice general valabile referitoare la procesele de separare cromatografica, notiuni care se pot transforma sau
adapta tuturor metodelor cromatografice;
- Daca se analizeaza un amestec de analiti (diferit) care trebuie sa fie separati (acesta fiind scopul principal al cromatografiei) indiferent
de tehnica aleasa, metodele au urmatoarele aspecte comune:

1
 a. Analitii din amestec se repartizeaza intre faza stationara si faza mobila care sunt nemiscibile (sau foarte putin solubile una in alta),
intre cantitatile de analiti repartizati in cele doua faze unde exista un echilibru ce depinde de insusirile fiecarui analit fata de cele 2
faze;
b. Adaugand continuu faza mobila „noua sau proaspata” are loc deplasarea echilibrului de repartitie antrenand migrarea analitilor de-a
lungul fazei stationare cu viteze diferite;
c. Separarea consta in eluarea continua a analitilor care, migrand cu viteza caracteristica fiecaruia, parasesc succesiv coloana.

Faza stationara
- Este formata din particule fine solide, sferice, pe suprafata carora se produc interactiunile cu analitii (ex: in cromatografia de adsorbtie);
- Este formata din particule fine solide care sunt suportul pe care se fixeaza faza stationara lichida ca in cromatografia de repartitie;
- In coloanele capilare utilizata in cromatografia de gaze, faza stationara este fixata in stare omogena sub forma unui film sau pelicula pe
peretii interiori ai acesteia.
- Particulele de faza stationara se caracterizeaza prin cativa parametri printre care diametrul lor mediu, omogenitatea marimilor si
suprafata specifica.
Aplicatiile metodelor cromatografice
- Metodele cromatografice au devenit, in prezent, unele dintre cele mai selective metode de separare cu larga aplicabilitate in toate
domeniile analizei;
- Cromatografia are aplicatii largi in analiza calitativa care inseamna separare si identificare.
- Cromatografia are aplicatii importante si in analiza cantitativa.

Cromatografie de lichide de inalta performanta

- Sub aceasta denumire sunt descrise principalele metode moderne de analiza cromatografica baze pe repartitia lichid-lichid, pe adsorbtia
lichid-solid, pe schimbatori de ioni si pe procesele de excludere-difuzie;
- HPLC se poate practica pe coloana sau pe o suprafata plana, de exemplu pe straturi subtiri de faza stationara de unde si denumirea de
cromatografie planara. Aceasta tehnica se noteaza prescurtat TLC (thin layer crom...), iar tehnica de inalta performanta HPTLC (high....)
- In HPLC sunt necesare presiuni mari de cateva sute de atmosfere pentru a asigura debite corespunzatoare ale fazei mobile, avand in
vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC este mica, diametrul particulelor fiind de 3-10 microni; din acest motiv, aparatura utilizata
este mai complicata si, deci, mai scumpa.

Cromatografia HPLC pe coloana

- Este tehnica cea mai utilizata in prezent pentru separari, detectii si mai ales pentru determinari cantitative;
- In cadrul acestei metode se inscriu:
 Cromatografia HPLC de adsorbtie;
 De repartitie;

Cromatografia HPLC de adsorbtie

- Aceasta tehnica se practica pe faze stationare de silicagel si alumina (singurele care se utilizeaza in aceasta tehnica); dintre aceste 2 faze
stationare se utilizeaza mai ales silicagelul deoarece poate fi folosit intr-o varietate mai mare de conditionare;
- Ca faza mobila se utilizeaza un solvent organic sau un amestec de 2 sau mai multi astfel de solventi;
- HPLC de adsorbtie se aplica la separarea unor substante organice relativ nepolare datorita capacitatii metodei de a fractiona amestecul
de izomeri de pozitie: derivati disubstituiti in meta si para ai nucleului aromativ).

HPLC de repartitie
- Este cea mai utilizata dintre tehnicile cromatografice in faza lichida si se poate practica sub forma cromatografiei HPLC lichid-lichid si
HPLC lichid-faza grefata sau legata;
- In HPLC de repartitie se disting 2 procedee, in functie de polaritatea fazelor stationara si mobila:
1. Cromatografia pe faza stationara normala – f polara; ca faza mobila se utilizeaza un solvent practic nepolar sau foarte slab polar;
2. Cromatografia pe faza inversa in care faza stationara este nepolara iar faza mobila este relativ polara.
- Regula de alegere a fazei mobile pt cromatografia de repartitie este urmatoarea:
- Faza mobila trebuie sa aiba o putere mare de dizolvare dar sa nu interactioneze clinic cu analitii din probe (sa fie inerta fata de acestia);
trebuie sa fie compatibila cu sistemul de detectie;
- Sa nu dizolve faza stationara si sa nu interactioneze chimic cu aceasta (sa fie inerta chimic fata de ea);
- In cromatografia pe faza inversa, faza stationara este nepolara iar faza mobila este polara, fiind formata din apa, metanol, acetonitril sau
din amestecuri in diferite proportii ale acestora.

2
 Introducere in CSS
- Rezultatele spectaculoase obtinute in domeniul chimiei in ultimele decenii, atat in cadrul cercetarii cat si al multiplelor si variatelor
aplicatii ale acesteia, se datoreaza intr-o masura considerabila folosirii tehnicilor experimentale si bagajului teoretic pe care fizica le-a
pus la dispozitie.
- In aceasta directie aplicarea metodelor fizice in analiza chimica, proces inceput de la consituirea acesteia ca disciplina stiintifica a
condus la elaborarea unor numeroase tehnici de laborator cu mare potentialitate, printre care se inscrie si metoda cromatografica cu
diferitele sale variante;
- CSS este una dintre vechile si din noile metode de analiza care, alaturi de celelalte metode cromatografice si fizico-chimice in general
contribuie la studiul si identificarea substantelor chimice naturale si de sinteza.

Generalitati despre CSS

- CSS este o metoda fizico-chimica de separare a substantelor dintr-un amestec, pe baza capacitatii deosebite de distributie intre o faza
stationara si una mobila;
- Metoda cromatografica se bazeaza pe un proces de migrare dinamica diferentiala a substantelor din amestecul respectiv, ca urmare a
unor diferente in adsorbtie, repartitie, solubilitate, presiune de vapori, marimea moleculei etc.

Principiul CSS
- Un analit migreaza in susul sau de-a latul unui strat de faza stationara, de obicei silicagel, sub influenta unei faze mobile (de obicei un
amestec de solventi organici) care se deplaseaza prin faza stationara prin efect capilar;
- Distanta parcursa de un analit este determinata de afinitatea sa relativa, pentru faza stationara vs faza mobila;
- Compusii amestecului sunt repartizati intre un adsorbant (faza stationara – de obicei silicagel – SiO2) si un solvent (faza mobila) care se
deplaseaza prin faza stationara in efect capilar.

Importanta CSS in analiza medicamentului

- Determinarea impuritatilor in produsele farmaceutice din materiile prime sau produse preparate;
- Folosita adesea ca metoda de baza pentru verificarea materiilor prime farmaceutice;
- Poate fi folosita pentru validarea curatirii, o treapta in fabricarea produselor farmaceutice.

Aparat tipic pentru CSS

- In figura apare o diagrama tipica a unei placi de CSS dupa ce a fost dezvoltata si pulverizata pentru localizarea analitului.
- Aparatul Linomat: aplica probele in forma de benzi pe straturile subtiri;
- Aspectul placilor si al spoturilor la vizualizare: in lumina UV (stanga), in lumina vizibila (dreapta);

Cromatograma CSS cu silicagel ca faza stationara

- In figura compusul A este mai putin polar decat compusul B si parcurge o distanta mai mare odata cu faza lichida.

Aplicatii ale cromatografiei in analiza medicamentului

- CSS a devenit o tehnica foarte sofisticata pentru identificarea compusilor si pentru determinarea prezentei impuritatilor;
- Complexitatea ei deriva din vasta gama de faze stationare si faze mobile ce pot fi folosite cat si din marele numar de reactivi de
pulverizare ce pot fi utilizati pentru vizualizarea cromatogramei.

Analiza calitativa
- Principala metoda de identificare prin CSS consta in localizarea zonelor diferitilor componenti separat si prin masurarea valorilor Rf
corespunzatoare Rf (retardation factor); acesta se calculeaza altfel:
- Distanta parcursa de componentul dat supra distanta parcursa de frontul solventului;
- Tot in scopul realizarii analizei calitative, se poate realiza si cromatografia bidimensionala; placa se vizualizeaza si se compara cu o
placa etalon pe care exista un amestec similar, dar cunoscut.

Teste calitative de identitate

- CSS se foloseste adesea de monografiile BP ca parte a unui numar de teste de indentitate efectuate pe substante pure. Pentru confirmarea
suplimentara a identitatii se folosesc mai multe sisteme de solventi si, de asemeni, diferite tipuri de reactivi – spray.

CURS 4 – 28.10.2013

3
 Cand structura impuritatii este cunoscuta
- Un test limita se bazeaza pe comparatia intre o solutie concentrata a analitului si o solutie diluata a unei impuritati. O cantitate mica de
hidrocortizon impuritate se poate vedea coborand sub spotul mare produs de hidrocortizonul acetat, care este componenta principala a
probei. In linie cu pozitia unde a fost aplicat spotul de hidrocortizon acetat se observa un spot foarte mic. In acest caz, spotul produs de
impuritatea hidrocortizonului din proba apare mai intens (mai mare) decat spotul produs de etalonul de hidrocortizon 0,01% g/v si deci
proba nu a trecut testul limita.
- Cand structura impuritatii este necunoscuta
- Un tip asociat de test limita C.S.S. se face cand identitatea impuritatilor nu este pe deplin cunoscuta. Acest tip de test de face, de
exemplu, pe compusi de origine naturala care pot contine o gama de compusi cu structuri asociate cu a substantei de test si care sunt co-
extrasi opdata cu materialul brut.
- Trei probe de codeina sunt analizate cum s-a descris, ceea ce arata daca testele limita de mai jos au fost trecute sau ratate. Solutiile 1-3
apar in ordine numerica de la stanga la dreapta.
- i-trece deoarece niciun spot din cromatograma solutiei 1 nu este mai intens decat spotul produs de solutia 2;
- ii-nu trece deoarece spotul de la origine este mai intens decat cel produs de solutia 2;
- iii – trece deoarece desi un spot de deasupra codeinei este mai intens decat spotul solutiei 3, nu exista niciun spot mai intens ca cel al
solutiei 2.

Aplicatii ale HPLC

- multe teste farmaceutice limita curente ar putea fi efectuate cu un grad mai mare de acuratete daca s-ar folosi metodele HPTLC.
- HPTLC pentru rifampicina, isoniazida si pirazinamida.

Sensibilitate in CSS
- Tehnica CSS a fost utilizata pe scara larga in domeniul farmaceutic pentru a analiza o varietate de aplicatii specifice si utile, de
exemplu:
 Pentru a identifica prezenta nedorita a unor compusi organici, ce prezinta impuritati intr-un numar de substante farmaceutce:
morfina in clorhidratul de apomorfina; hidrazina in carbidopa; 3-aminopropan in dexampanthenol;
 Substante inrudite prezente in medicamente oficiale si anume: substantele aferente prezente intr-un numar mare de substante
farmaceutice: aminofilina;
 Alcaloizi straini prezenti in medicamente alcaloide: sulfatul de atropina; codeina;
 Steroizi straini prezenti in medicamente steroidiene.

Introducere in HPLC
- HPLC acopera astazi in proportie de aproximativ 80% analiza substantelor moleculare
- HPLC reprezinta evolutia unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica care servea in primul rand la izolarea preparativa a
compusilor naturali;
- Prin introducerea pompelor si, in consecinta, lucrandu-se la presiuni tot mai ridicate (200 atm), dezvoltarea unor faze stationare
performante, de dimensiuni tot mai mici, in coloane tot mai scurte (3-10 cm) s-a ajuns la configuratia actuala.

Generalitati cu privire la HPLC

- HPLC este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care faza mobila este un lichid iar faza stationara, continuta intr-o
coloana, este constituita dintr-un solid cu granulatie fina sau un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupari
organice.
- HPLC este o metoda ce prezinta urmatoarele avantaje:
 Usor de controlat cu o precizie cantitativa asigurata prin introducerea exacta a probei;
 HPLC este tehnica cromatografica ce a cunoscut cea mai puternica dezvoltare in anii recenti, ducand la imbunatatirea coloanelor, a
detectorilor si a soft-urilor de control;
 Varietatea coloanelor si a detectorilor face ca selectivitatea metodei sa poata fi usor ajustata.

Metodele cromatografice pot fi clasificate in functie de mai multe criterii:

- Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentur a denumi o gama exinsa de sisteme cromatografice care au in comun faptul ca
utilizeaza o faza mobila lichida.
- In functie de mecanismele de separare:
 Cromatografia de lichide;
 Cromatografia de gaze;
4
  Cromatografia cu fluide supracritice;
- In functie de tehnica utilizata:
 Cromatografia pe hartie;
 CSS;
 CSS de inalta performanta.

Cromatograma in HPLC
- In orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu concentratia, alteori cu masa componentului aflat in celula
de masura, semnal ce poate fi inregistrat in functie de timp. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de eluent se numeste
cromatograma.

Elementele de baza ale cromatogramei HPLC:

- Picurile cromatografice – acestea sunt semnalele valorificabile in analiza calitativa si cantitativa, in toate metodele cromatografice.
- Timpul mort, tM – este timpul in care un component, complet neretinut de catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura
pana la detector.
- Timpul de retentie, tR – o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului separat de coloana – reprezinta timpul scurt de
la injectarea probei si aparitia maximului de concentratie in detector.
- Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie;
- Timpul de retentie ajustat – tR’ – introdus in cromatografie pentru a se putea compara timpii masurati pe coloane diferite;
- Volum de retentie ajustat – reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la coloana la detector.

Principalele etape in HPLC

Solvent -> pompa->injector->coloana->detector->inregistrator (solventul intra in pompa, din pompa in injector, coloana, din coloana ies
pe rand componentii amestecului, vor trece prin detector si, apoi, se va face o inregistrare a semnalului emis de detector)

Aparatura din care este alcatuit sistemul HPLC

- Sistem HPLC tipic, reglat la un debit de 1 ml/min indicand o presiune a coloanei de 1265 psi si conectat la un dectector UV/vizibil care
este reglat sa monitorizeze efluentul coloanei la 260 nm.

Analiza tabelelor de paracetamol si aspirina

- Un extract de tablete continand paracetamol si aspirina rulat la un pH 3,7 in 0,05M acetat de sodiu/acetonitril (85:15) (coloana ODS 150
nm x 4,6 nm, debit 1ml/min)
- Extractul de tablete rulat la pH 4,4 in 0,05 M acetat de sodiu tampon/ acetonitril (85:15). Coloana ODS 150 nm X 4,6 nm, debit
1mL/min. Detectie UV la 243 nm.

Analiza cremei cu hidrocortizon fata de un etalon intern

- Cromatograma in urma analizei cremei cu hidrocortizon folosinu-se betametazona ca standard intern pe o coloana ODS (25 cm X 46
nm) cu metanol/apa (70:30) ca faza mobila.
- (A) etanolul de calibrare (Sol 1);
- (B) extract de crema – etalonul intern (Solutia 3);
- (C) extract de crema fara adaugare de etalon intern (Sol2);

Avantaje HPLC
- HPLC grupeaza o variata si importanta gama de metode care permit cercetatorului sa separe compusi foarte asemanatori din amestecuri
complexe.
- HPLC este o tehnica de un urias potential si chiar are avantajul ca furnizeaza atat informatii calitative cat si cantitative.

Avantaje HPLC - Majoritatea aplicatiilor HPLC sunt folosite in analizele farmaceutice pentru determinarea calitativa si cantitativa a
substantelor utilizate in formulari. Cu astfel de analize nu se pierde mult timp pentru pregatirea fazelor mobile si selectionarea
coloanelor sau a detectorilor potriviti in cazul amestecurilor complexe.

Generalitati – introducere gaz-cromatografiei

- Unele dintre cele mai dificile si frustrante probeleme in domeniul analizei medicamentului sunt de separare simultana, identificare si,
mai presus de toate, analiza cantitativa a uneia sau mai multor substante dintr-un amestec complex al unui produs farmaceutic.
- Cresterea exponentiala a cromatografiei de gaze poate fi atribuita potentialului incomparabil de a solutiona problema separarii
componentelor dintr-un amestec complex.
5
 Definitie (FRX)
- Cromatografia de gaze este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica, in care faza mobila este un gaz (gaz purtator), iar faza
stationara este un solid sau un lichid cu care este impregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat uniform pe peretii unei coloane
capilare;
- Faza stationara se afla intr-o coloana cromatografica, confectionata, de obicei, din sticla sau din otel inoxidabil;
- Faza mobila se deplaseaza continuu printr-o coloana, iar la iesire gazul purtator trece prin detector.

Principiul separarii cromatografice

- Consta in distributia inegala a componentelor unui amestec intre faza mobila si faza stationara;
- Amestecul strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila.

Schema cromatografului de gaze – cauta pe net!:D

Principalele etape in cromatografia de gaze

Prepararea probei -> injectarea in coloana -> separarea componentilor -> detectarea componentilor -> identificare si masurare

Introducerea probelor lichide in coloana cromatografica – prin evaporare.

Introducerea probelor solide in coloana cromatografica – sunt introduse in coloana prin injectare cu microseringi dupa ce au fost
dizolvate intr-un solvent adecvat.

Cromatograma – reprezentarea grafica a semnaului detectorilor in functie de timp, obtinuta cu ajutorul inregistratorului, se numeste
cromatograma.

Parametrii specifici
- Timp de retentie, tR este timpul la care apare maximul unui pic, masurat din momentul introducerii probei si constituie caracteristica
calitativa a componentului respectiv;
- Inaltimea picului, h, sau aria suprafetei lui, A, constituie parametrul cantitativ, proportional cu cantitatea de component;
- tM este timpul in care elentul si componentele care nu interactioneaza cu faza stationara parcurg distanta pana la detector.

Aparatura pentru cromatografia de gaz – cauta pe net! :D

Aplicatii ale cromatografiei de gaze in analiza medicamentului

- caracterizarea uleiurilor volatile (care pot fi folosite ca excipienti in formulari), brevetarea amestecurilor complexe pentru tuse, a
tonicelor si a acizilor grasi in uleiurile stabile;
- teste de limita pentru reziduuri de solvent si alte impuritati volatile in substantele medicamentoase;
- caracterizarea unor medicamente neformulate in particular in ceea ce priveste procesul de detectare a impuritatilor;
- cuantificarea medicamentelor in formulari in particular daca medicamentul nu are un cromofor.

Analiza cantitativa si calitativa

- primele analize de medicamente au inceput cu steroizii anabolizanti;
- folosirea abuziva a medicamentelor analgezice, narcotive si halucinante a impus analiza lor calitativa si cantitativa si cantitativa intr-un
timp cat mai scurt, pentru a putea interveni la timp cu antidotul cel mai potrivit;
- o categorie importanta de medicamente o reprezinta substantele folosite in tratarea bolilor vasculare. Pentru clonidina, detectorul cu
captura de electroni a permis masurarea unei concentratii de 100 pg clonidina intr-un mL de plasma.

Analiza acidului valproic in plasma

- o aplicatie tipica a GC in analiza unui medicament in plasma este determinarea medicamentului antiepileptic acid valproic dupa
extragerea fazei solide prin GC cu ionizare cu flacara;
- in aceasta prodedura s-a folosit ca etalon intern acid caprilic care este izomeric cu acidul valproic.

Analiza atropinei din picaturile oculare

- picaturile oculare cu atropina sunt folosite pentru a dilata pupila inainte de operatiile de cataracta;
- metoda implica extragerea atropinei si a unui etalon intern de homatropina din faza apoasa.

Determinarea dimetilanilinei din solutia injectabila bupivacaina

- dimetilanilina este atat o impuritate de fabricatie in bupivacaina cat si un posibil produs de descompunere in solutiile injectabile.

6
 Cromatografia de gaze cuplata cu spectrometria de masa
- atat cromatografia de gaze cat si spectrometria de masa sunt tehnici analitice de mare utilitate pentru analiza compusilor organici;
- combinarea lor intr-un singur sistem duce la obtinerea unor rezultate care depasesc mult ceea ce s-ar realiza prin simpla insumare a
datelor oferite de cele doua tehnici.

Realizarea practica a analizelor – GC-MS

- fixarea spectrometrului de masa la o anumita valoare m/z caracteristica doar pentru o anumita componenta care ne intereseaza, el
functionand in acest caz ca un detector foarte specific.
- Parcurgerea (scanarea) intregului domeniu de masa intr-un interval de timp redus, ceea ce inseamna ca se obtin sute sau chiar mii de
spectre pentru fiecare analiza. Toate aceste spectre sunt stocate in memoria calculatorului atasat instrumentului.

Aplicatii ale CG-SM – calculator

- O metoda de mare utilitate in diagnosticarea, urmarirea evolutiei si tratamentului unor boli, in special determinand constituentii volatili
de masa moleculara mica ai fluidelor biologice (metaboliti biologici volatili din urina, ser, plasma si fluid cerebrospinal).

CURS 6, 11.11.2013

Spectrometria de absorbtie UV-VIS in analiza si controlul medicamentelor

Domeniul spectral UV-VIS

- Spectrometria in UV-VIS se aplica in domeniul spectral 180-1100 nm;
- Domeniul spectral UV-VIS este alcatuit din 3 zone spectrale:
 UV apropiat – 185-400 nm;
 Vizibilul – 400-700 nm;
 IR – 700-1100;
- Determinarile spectrometrice in acest domeniu se bazeaza pe fenomenul de absorbtie a radiatiilor cuprinse in acest domeniu spectral de
catre speciile chimice analizate.
- Determinarile in acest domeniu au la baza masuratori de absorbanta (sau transmitanta) cu ajutorul spectrofotometrelor automatizate,
inclusiv pentru analiza multicomponent;
- Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detectori ai mai multor analiti, din amestecuri cu mai multe componente, dupa
prealabila lor separare prin cromatografia de lichide;
- Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucreaza intre 185 si 900 nm. Limita inferioara se opreste la cca 185 nm datorita
aerului care devine opac sub aceasta limita.

Absorbtia luminii
- Producerea absorbtiei luminii se explica prin faptul ca in UV-VIS radiatiile au o energie mai mare decat in IR ceea ce duce la tranzitii
electronice de pe anumite niveluri (orbitali) pe altele;
- Tranzitiile electronice se suprapun peste tranzitiile rotationale si peste cele vibrationale care sunt produse de energii mai mici: deltaE =
deltaE rotatie + delta E vibratie + delta E electronice
- La impactul unui foton asupra unei molecule izolate se modifica termenul E electronic ceea ce determina variatia energiei mecanice
totale.
- Compusii organici obisnuiti, inclusiv cei medicamentosi, sunt formati din atomi usori, precum C, H, N, O, iar tranzitiile care se observa
pentru acesti compusi sunt determinate de electroni implicati in legaturile sigma si pi si de electronii n neparticipanti care formeaza
dublete neimplicate in legaturi;
- In cursul acestor tranzitii se produc modificari ale polaritatii legaturilor iar spectrele care se obtin pentru acesti compusi se mai numeste
si „spectre de transfer de sarcina”;
- In afara de tipurile de tranzitie mentionate mai sus exista si tranzitii in care sunt implicati orbitalii moleculari d specifice compusilor
anorganici;
- Din punctul de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor existenti intr-o molecula, la tranzitii electronice se disting 4 tipuri de
electroni:
1) invelis de electroni inchis, in care electronii nu sunt implicati in legaturi chimice deoarece au energii de excitare foarte mari; acesti
electroni nu contribuie la absorbtia in UV-VIS;
2) electroni de tip sigma in legaturi covalente sigma care au de asemenea energii mari de excitare si deci nu contribuie la absorbtii in
UV-VIS
7
 3) electronii n, care se gasesc sub forma electronilor neparticipanti, pot fi excitati cu radiatii UV-VIS si pot contribui la absorbtii in acest
domeniu spectral;
4) electroni pi, situati pe orbitali pi, in legaturile duble si triple fiind mai usor excitabili, ei fiind responsabili pentru majoritatea
spectrelor electronice.

Producerea culorii. Cromofori. Solvatocromie. Deplasari bato si hipsocrome.

- La originea tranzitiilor electronice stau gruparile cromofore care includ diverse tipuri de electroni;
- Daca o molecula contine mai multi cromofori separati prin cel putin doua legaturi simple, se poate observa o suprapunere a efectelor
gruparilor individuale;
- Este important de precizat ca atat potizia cat si intensitatea si chiar forma benzilor de absorbtie ale compusilor in solutie sunt influentate
de natura solventului. Procesul acesta se numeste solvatocromie iar modificarile mentionate sunt datorate interactiunilor analit-solvent.

Efectul hisocromic si efectul batocromic

- Efectul hipsocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai mici;
- Efectul batocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai mari.

Spectrofotometria UV-VIS
- Pentru inregistrarea spectrelor electronice se utilizeaza un spectrofotometru UV-VIS care este compus dintr-o sursa de radiatii, un sistem
dispersiv combinat cu un monocromator si un detector.

Legea fundamentala a absorbtiei

- In spectrometria de absorbtie in UV-VIS se masoara de regula absorbanta care este proportionala cu concentratia analitului, conform
legii Lambert-Beer:
- A= epsilon X b X c
- In care:
- A=absorbanta; b=grosimea stratului de solutie (cm); c=concentratia analitului determinat; epsilon=absorbanta molara.

Inregistrarea spectrelor
- Este una dintre problemele de mare importanta in detectia si dozarea substantelor medicamentoase;
- Inregistrarea spectrelor se poate face fie prin reprezentarea grafica a absorbantei in functie de lungimea de unda fie a transmitantei in
functie de lungimea de unda;
- Aceasta inregistrare se face automat, datele experimentale fiind inmagazinate in calculator, acesta avand programe de prelucrare a
datelor;
- Inregistrarea spectrelor in UV-VIS se face in solutiile analitilor in solventi potriviti, iar alegerea solventului in fiecare caz este o
problema deosebita;
- Spectrometria UV se poate utiliza si in studiul unor reactii chimice care se petrec in solutie. De exemplu, salicilatul de metil sufera in
solutie apoasa alcalina o reactie de hidroliza din care rezulta acid salicilic, iar cu exces de baza salicilatul alcalin corespunzator.

Tratarea rezultatelor analitice

- Pentru tratarea (prelucrarea sau evaluarea) rezultatelor analitice sunt necesare cateva cunostinte de analiza statistica, care permit
analistului sa inteleaga semnificatia rezultatelor obtinute si pentru a ordona limitarile fiecarei etape si tehnici de analiza;
- Analistul trebuie sa aiba propria lui intelegere cu privire la felul rezultatelor pe care trebuie sa le raporteze.

Spectrometria IR in analiza si controlul medicamentului

Introducere
- IR analitic grupeaza metode de identificare si dozare (nedistructive) bazate pe absorbtia sau reflexia de catre proba a radiatiilor
electromagnetice cuprinse intre 0,78 microni (780 nm) si 1000 microni (1 mm) fiind subdivizat in IR apropiat, IR mijlociu si IR
indepartat.
- Regiunea fundamentala situata intre 2,5 si 15 microni este regiunea care furnizeaza cele mai multe informatii privind structura
moleculara, majoritatea spectrometrelor fiind limitate la masuratori in aceasta regiune;
- Spectrele de absorbtie in IR sunt spectre de vibratie ale moleculelor. Atomii situati la cele doua extremitati ale unei legaturi sunt supusi
unei miscari de vibratie.
- Prin absorbtie de energie legatura chimica isi creste nivelul energetic vibrational. Moleculele probei vor absorbi energii din radiatia IR
numai la anumite lungimi de unda dand nastere in spectrul IR unor maxime de absorbtie;
- La lungimile de unda la care nu se absoarbe energie, inregistratorul spectrometrului va inscrie linia zero a spectrului;

8
- Maximele de absorbtie in IR se manifesta in spectru ca benzi (si nu ca linii) deoarece orice modificare energetica vibrationala este
insotia, de regula, de modificari energetice rotationale si, din acest motiv, spectrele in IR se mai numesc si spectre de vibratie – rotatie
ale moleculelor.
- Fiecare maxim spectral este asociat unei vibratii corespunzatoare unei anumite legaturi din molecula probei, insa trebuie mentionat ca
orice vibratie a moleculei de nastere unui maxim de absorbtie intrucat regulile de selectie fundamentale ale mecanicii cuantice arata ca
un maxim apare numai daca vibratia corespunzatoare produce o modificare a distributiei de sarcina (a marimii sau directiei momentului
de dipol).
- In absenta momentului de dipol permanent cum este cazul moleculelor simetrice nu apar benzi de absorbtie in IR. Legatura din acetilena
nesubstituita nu se manifesta in IR. In aceste cazuri se spune ca legatura este transparenta in IR mediu sau inactiva.
- Vibratiile pe care le executa o molecula in ansamblu cu pastrarea imobila a centrului sau de gravitatie se numesc vibratii normale sau
fundamentale.
- Cresterea numarului de benzi fata de numarul teoretic se datoreaza:
1) Armonicelor;
2) Benzilor de combinare;
3) Rezonantelor Fermi.
- Armonicele sunt benzi de intensitate mica care apar la un numar de unda dublu fata de banda fundamentala;
- Benzile de combinare – benzi de intensitate mica care apar la nume de unda egale cu suma sau cu diferenta numerelor de unda a 2
vibratii fundamentale.
- Rezonanta Fermi – reprezinta scindarea unei benzi fundamentale atunci cand in imediata ei apropiere se gaseste o armonica sau o banda
de combinare;
- Scaderea numarului real de benzi fata de cel teoretic se datoreaza:
1) Vibratiilor care nu produc modificari ale momentului de dipol al moleculei;
2) Vibratiilor degenerate care dau benzi la acelasi numar de unda;
3) Vibratiilor situate in afara domeniului IR uzual.

- Frecventele de grup
- Unele grupe de atomi, in special gruparile functionale din chimia organica, prezinta in IR benzi de absorbtie caracteristice, intense,
situate la frecvente bine determinate numite frecvente de grup sau caracteristice;
- Grupele functionale se comporta ca si cum ar fi izolate de restul moleculei desi aceasta influenteaza intr-o masura mica pozitia benzilor
de grup. Aceste mici deplasari sunt frecvent utilizate in studiul structurii compusilor organici;
- Intensitatea uneori foarte mare a benzilor de grup este rezultatul polaritatii crescute a gruparilor functionale respective.

Aspecte tehnice ale spectrometriei in IR

- In IR aparatura utilizata se subimparte in:
 Spectrometre cu transformata Fourier;
 Analizoare specializate;
 Spectrometre de tip dispersiv – pentru IR apropiat;

Spectrometru cu transformata Fourier

- Radiatiile provenite de la o sursa lovesc o interfata constituita dintr-un film semitransparent de germaniu depus pe lama de KBr. Acest
dispozitiv permite generarea a doua fascicule, unul dirijat spre o oglinda fixa, celalalt spre o oglinda mobila care permite modificarea
distantei fata de interfata. Cele doua fascicule recombinate pe aceeasi directie traverseaza proba inainte de a ajunge la detectorul care
masoara intensitatea luminoasa globala.

Surse si detectori in IR
A. Surse luminoase
- In IR sursele se prezinta sub forma unor filamente groase fie sub forma unor batoane subtiri cu lungimea de 3-4 cm formate dintr-un
amestec de oxid de zirconiu si pamanturi rare incalzite de o rezistenta interioara sau de o bara de carbura de siliciu. Aceste surse sunt
alimentate la o tensiune joasa, ajung la 1500C si, in conditiile lipsei unui invelis protector, ele disipa o putere de ordinul sutelor de watt,
emitand intr-un domeniu larg cuprins intre vizibil si IR termic.
B. Materiale optice
- Materialele optice utilizate in mod obisnuit in vizibil sau in IR apropiat sunt in IR mediu opace;
- Prismele monocromatoare aparatelor secventiale utilizate in trecut erau confectionate din NaCl sau KBr si au fost inlocuite in aparatele
moderne de retele metalice a caror suprafata asigura reflexia luminoasa;
- Pentru peretii celulelor sau ferestrelor detectorilor se aleg materiale cristalizate sau amorfe, fiecare acoperind o anumita plaja spectrala.
C. Detectori
9
 - In functie de tipul de aplicatie sau aparat se utilizeaza ca detectori termistori, termocupluri sau alte dispozitive asociate.

Analiza calitativa in IR
- Identificarea compusilor se poate realiza cu ajutorul spectrotecilor generale sau a celor speciale propuse de societati sau edituri;
- Pentru realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie obtinute plecand de la compusi aflati in aceeasi stare fizica cu cei supusi
identificati;
- Analiza calitativa consta in compararea matematica a spectrului compusului necunoscut cu toate cele care formeaza spectroteca
considerata in vederea stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.

Analiza cantitativa in IR
- Analistul trebuie sa examineze cu atentie rezultatele si in cazul schimbarii algoritmului de comparare, acestea nu trebuie sa difere;
- In lipsa unor spectre de referinta, interpretarea spectrelor in IR urmareste punerea in evidenta a unor grupari functionale, asocieri prin
legaturi de hidrogen inter si intramoleculare, configurari sterice etc.
- Precizia cu care se masoara absorbanta si posibilitatile de repliere a spectrelor constituie avantaje ale analizei cantitative in IR;
- Metoda este frecvent utilizata, pe de o parte datorita faptului ca in IR mediu gasirea intr-un spectru al unui amestec al benzilor
caracteristice compusului dozat este relativ usoara, iar, pe de alta parte, exista la dispozitie metode statistice de prelucrare a datelor.

Analiza cantitativa in IR mediu

- In cazul probelor solide, acestea sunt dispersate in interiorul unui disc de KBr carora li se adauga un standard intern in cantitati egale
atat pentru standard cat si pentru proba;
- Pentru lichide determinarea absorbantei se face in cuve pe parcurs optic mic pentru a minimaliza absorbtia proprie solventului in cazul
in care solventul nu este transparent in acest domeniu.

Analiza cantitativa in IR apropiat

- Aceasta metoda utilizeaza domeniul spectral situat intre 800 si 2700 nm. Benzile observate in acest domeniu sunt date nu numai de
tranzitiile electronice ci si de benzile de vibratie de tipul armonicelor si benzilor de combinare;
- Benzile armonice sunt mai putin intense decat cele corespunzatoare vibratiilor fundamentale si de aceea se lucreaza in cuve cu parcursul
optic de 1 cm si pe probe nediluate.
- Chiar daca metodele de dozare in IR apropiat nu sunt sensibile, intotdeauna ele sunt usor de utilizat.

METODE CROMATOGRAFICE UTILIZATE IN IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR CE CONTIN SUNSTANTE ACTIVE

ORGANICE

CSS (cromatografia in strat subtire )

Rezultatele spectaculoase obtinute in domeniul chimiei in ultimele decenii atat in cadrul cercetarii cat si al multiplelor si variatelor
aplicatii ale acesteia, se datoresc intr-o masura considerabila folosirii tehnicilor experimentale si bagajului teoretic pe care fizica le-a pus la
dispozitie. In aceasta directie aplicarea metodelor fizice in analiza chimica, proces inceput de la constituirea acesteia ca disciplina stiintifica a
condus la elaborarea unor valoroase tehnici de laborator, cu mare potentialitate, printre care se inscrie si metoda cromatografica cu diferitele sale
variante.
CSS este una din noile metode de analiza, care alaturi de celelalte metode cromatografice si fizico-chimice in general contribuie la
studiul si identif subst chimice naturale si de sinteza
Limitari ale metodei CSS in ceea ce priveste identif subst active de natura organica :
 Sensibilitatea este de multe ori limitata
 Nu este adecvata pentru compusi volatili
 Are nevoie de mai multa indemanare din partea operatorului decat in cazul HPLC
Cromatografia de gaze cu coloane capilare s-a dovedit a fi f folositoare in identif med din tesuturi si lichide biologice. Imbunatatirea
tehnicilor de introducere a probelor si de prelucrare a coloanelor capilare a creat conditii de analiza prin cromatografie de gaze cu coloane
capilare pt toate med analizate cu coloane clasice cu umplutura.
Principalele avantaje ale cromatografiei de gaze sunt:
- Inalta frecventa de separare, chiar amestecurile complexe putand fi descompuse in componenti
- Nivel f inalt de sensibilitate in identif componentilor ( de ex doar cateva mg de mostra sunt suficiente pt o analiza completa)
- Viteza de analiza rapida
- Exactitate a rezultatelor
- Functionarea si cheltuielile de exploatare nu necesita personal cu inalta calificare
- Cost relativ redus al instalatiei

10
 - Viabilitate ridicata

Cromatografia de lichide de inalta performanta ( HPLC)

Acopera azi, in proportie aprox 80%, analiza subst moleculare: organice, organo-metalice si compusi cu masa moleculara ridicata (
naturali sau sintetici). De aceea, impreuna cu cromatografia de gaze constituie punct de sprijin important in analizele chimice moderne.

Analiza calitativa in IR
Identif compusilor se poate realiza cu ajutorul spectrotecilor generale sau a celor speciale propuse de societati sau edituri.
Pentru realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie obtinute plecand de la compusi aflati in aceeasi stare fizica cu cei supusi
identificarii.
Analiza calitativa consta in compararea matematica a spectrului compusului necunoscut cu toate cele care formeaza spectroteca
considerata in vederea stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.

Analiza calitativa in UV-VIS

Determinarile in acest domeniu au la baza masuratori de absorbanta ( sau transmitanta) cu ajutorul spectrofotometrelor automatizate,
inclusiv pt analiza multicomponent.
Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detectori ai mai multor analiti, din amestecuri cu mai multe componente dupa
prealabila lor separare prin cromatografia de lichide.
Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucreaza intre 185 si 900 nm. Limita inferioara se opreste la circa 185nm datorita
aerului care devine opac sub aceasta limita.

CURS 8, 25.11.2013

Metode volumetrice utilizate in analiza medicamentului

Puterea rotatorie
[αm]λt=puterea rotatorie specifica;
αD20(±5)= puterea rotatorie specifica
a unui lichid;
[αm]D20= puterea rotatorie specificaa unuei substante in solutie
Puterea rotatorie se masoara cu ajutorul polarimetrului

Puterea rotatorie specifica – rotatia planului luminii polarizate (rad) determinate de un strat cu grosimea de 1 m dintr-un lichid sau o
solutie care contine 1 kg de s.a. intr-un metro cub de solutie masurata la temperature t si lungimea de unda lambda.
Unitatea de masura in SI este radian ori metro cub/kg
- In practica se foloseste ca unitate de masura milirad ori m cub/kg;
- FRX defineste aceste unitati conventionale (care se folosesc in practica);
Puterea rotatorie a unui lichid reprezinta unghiul de rotatie a planului luminii polarizate, ezprimata in grade, la temperature de 20 C (plus
minus 5) la o lungime de unda D=589,3 nm, corespunzatoare radiatiei D monocromatice a Na ape un strat cu grosimea de 1 dm.
Un radian, avand simbolul rad, este o unitate de masura pentru masura unghiurilor.
- Un radian este egal 180C/pi;
- Lungimea unui arc de cerc este egala cu raza inmultita cu masura in radiani a arcului;
- Radianul face parte din SI.

- Puterea rotatorie specifica a unei substante in solutie – marimea unghiului de rotatie α a planului luminii polarizate, exprimat in
grade la temperature de 20C plus minus 5, la o lungime de unda corespunzatoare radiatiei D monocromatice a Na masurata pe Solutia
substantei de analizat care corespunde la 1 g/cm3 de substanta. Se exrpima in [1g/ml];

- Puterea rotatorie specifica a unui lichid – marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate care corespunde radiatiei D
monocromatice a Na la temperature de 20C masurata pentru un strat cu lungimea de 1 dm raportat la masa volumica. Se exprima in
[1g/cm3];
- Dpdv al controlului medicamentului polarimetria permite determinarea cu o sensibilitate de plus minu 0,05 unitati de grad si cu o
aproximatie de plus minus 0,05C.

- Inainte de orice determinare polarimetrica, aparatul se aduce la punctul 0 cu tubul polarimetric inchis la ambele capete;
- In cazul unei solutii a unei substante aducerea aparatului la 0 se face cu tubul polarimetric umplut cu solventul.

11
 - Daca substanta este solida se cantareste la balanta analitica o anumita cantitate de substanta in balonul cotat;
- Daca solutia nu este limpede se filtreaza, dupa care se fac determinarile pe solutia limpede;
- Se fac 5 citiri la polarimetru dupa care se face media acestor citiri, notand cu plus/minus sensul de rotire.
- αD20 = α/l X ρ0 – formula de calcul pentru puterea rotatorie specifica pentru lichide unde:
- α – marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
- L = lungimea tubului polarimetric (dm);
- ρ0 = masa volumica la temperature de 20C exprimata in g/cm3;

- αD20= α X 100/(l X c) = formula de calcul pentru puterea rotatorie specifica pentru substante in solutie, unde:
- α = marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
- L = lungimea tubului polarimetric (dm);
- C = concentratia solutiei in substanta de analizat (exprimata in procente de masa/volum);
- C= α X 100/l X αD20 – daca cunoastem puterea rotatorie specifica a unei substante intr-un anumit solvent, la o anumita temperature, si o
anumita lungime de unda putem afla concentratia unei substante necunoscute, unde:
- α – marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
- L – lungimea tubului polarimetric (dm);
- αD20= puterea sotatorie specifica (tabele);

Aplicatii in controlul medicamentului

- Identitate;
- Puritate;
- Dozare.
Daca cunoastem puterea rotatorie specifica αD20 intr-un lichid, masurand unghiul de rotatie, putem afla concentratia substantei analizate.

Indicele de refractie
- Cand un fascicul de lumina monocromatica patrunde dintr-un anumit mediu cu o anumita densitate optica intr-un alt mediu cu o alta
densitate optica, radiatia monocromatica poate suferi 2 fenomene diferite: o reflexie (se intoarce inapoi sub acelasi unghi – unghiul de
incidenta i) si o refractie (strabate mediul si se apropie de normal (unghi de refractie r);
- n = sini/sinr – viteza luminii in vid/ viteza luminii in substanta de analizat;
- n = indicele de refractive;
- i = unghiul de incidenta;
- r = unghiul de refractie;
- Daca i = 90 grade si sini =1 => marimea unghiului de refractive este maxima. Dupa acest principiu este construit un refractometru.
- Reprezinta criteriu de identitate, puritate si poate fi valorificat pentru determinari cantitative;
- Indicele de refractive este o caracteristica pentru fiecare substanta;
- La o anumita temperature (20C) si o anumita lungime de unda (589,3 nm); FRX noteaza indicele de refractive cu nD20.
- Indicele de refractive depinde:
 De temperatura;
 Lungimea de unda;
 Presiune;
 Natura substantei;
 Natura solventului.

- In cazul unei solutii daca mentinem toti factorii de mai sus constant, singura variabila este concentratia – s-a constatat ca exista
proportionalitate intre valorile indicelui de refractive si concentratie => constanta poate fi utilizata ca si criteriu de identitate, puritate si
dozare.

Indici oficinali FRX

- Indicele de aciditate – numarul de mg KOH necesar pentru a neutraliza acizii liberi din 1 g proba de analizat;
- Indicele de ester = numarul de mg KOH necesar pentru a neutraliza acizii grasi rezultati din saponificarea a 1 g proba de analizat;
- Indicele de hidroxil – numarul de mg KOH echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1 g proba de analizat;
- Indicele de iod = numarul de g I2 fixat de 100 g proba de analizat;
- Indicele de peroxide = numarul de ml de Na2S2O3 ori 10-2 M oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin actiunea peroxizilor din 1
g proba de analizat;

12
- Indice de saponificare – nr de mg KOH necesar pentru neutralizarea tuturor acizilor, a acizilor liberi si a celor rezultati prin
saponificarea a 1g proba de analizat.

Principalele metode de analiza utilizate in laborator. Consideratii teoretice si practice

2.1. Metode titrimetrice volumetrice
2.1.1. Principiu
- Metodele titrimetrice volumetrice, numite in continuare volumetrice, reunesc metodele chimice de analiza in care analitul din solutia de
analizat se determina cantitativ prin masurarea volumului de reactive de concentratie cunoscuta, care se aduce in cantitate
stoechiometrica peste acesta.
- aA + bB -> cC + dD + …. => volum de echivalenta;
- stoechiometria reactiei ori concentratie titrant, volum de echivalenta => concentratia probei.

- La baza oricarei metode chimice de analiza sta o reactie chimica:

- xX + yY + uU + vV + ….
- Care, pentru a putea fi utilizata in volumetrie, trebuie sa indeplineasca mai multe conditii:
- Sa fie cantitativa – transformarea, practic totala, a partenerilor de reactie (X, Y) in produsi de reactie (U, V etc);
- Reactia sa fie simpla, cu mecanism cunoscut, fara reactii secundare;
- Sa aiba viteza mare de reactie;
- Evidentierea neta a punctului final de titrare;
- In cursul reactiei chimice are loc practic un transfer al unei particule P (ioni, molecule, electroni) intre analit si titrant:

- X -> U + P;
- Y + -> V;
- X + U - > U + V.

Reactivii in volumetrie
- Standardul primar – folosit in titrimetrie – trebuie sa aiba urmatoarele proprietati:
 Puritate mare;
 Masa molecular mare pentru ca erorile de cantarie sa fie cat mai reduse;
 Stabilitate in aer si in solutie;
 Nehigroscopic;
 Solubil in solventul folosit la titrare;
 Sa reactioneze rapid si stoechiometric cu analitul de interes, fara reactii secundare;
 Cost cat mai redus;
 Numarul substantelor cu aceste proprietati (tabelul 2.2) este redus, in practica folosindu-se substante care indeplinesc cele mai
multe dintre conditiile enumerate;
 In titrimetrie se folosesc urmatoarele tipuri de titranti;
 Solutii standard primar – se obtin prin cantarirea directa a unui standard primar;
 Solutii standard secundar – se obtin din substante chimice care nu corespund criteriilor specifice unui standard primal, dar sunt
standardizate cu ajutorul unui standard primar;
 Substante ca hidroxidul de sodium sau acidul clorhidric nu pot fi folosite la obtinerea unor solutii standard primar avand o puritate
variabila.
Din acestea se obtin solutii standard secundar care, dupa standardizare, pot fi folosite la standardizarea altora.
Solutii standard diluate – sunt obtinutte prin diluarea solutiilor standard primare si seucndare standardizate.

Standarde primare si utilizarea lor in titrimetrie

Standard primar Tipuri de titrimetrie Utilizare

Ftalat acid de potasiu Acido – bazica Standardizarea solutiei de hidroxid de
Iodat de potasiu Redox sodium si de acid percloric in mediu de
acid acetic glacial;
Standardizarea solutiei de tiosulfat de
sodiu
Zinc metalic Complexometrie Standardizarea solutiei de EDTA
Colura de sodiu Prin reactii de precipitare Standardizarea solutiei de azotat de
argint

13
Detectia in titrimetrie
- Sesizarea Punctului de echivalenta se poate face prin mai multe metode, cele mai des intalnite fiind metodele vizuale.

- Metode vizuale (volumetria chimica) –> metode instrumentale (volumetria fizico-chimica) –> modificarea unei insusirii fizice a
participantilor la reactia chimica.

- In titrimetria chimica detectarea PE are la vaza o reactie secundara intre titrant si a subsantei numita indicator adaugata sistemului,
reactie care are loc dupa consumarea completa a analitului. Indicatorul va suferi o schimbare care poate fi detectata (de exemplu,
modificarea culorii):
- Analit + titrant -> PE (cantitate stoechiometrica);
- Indicator + titrant -> PF punct final
- Culoare 1 culoare 2

La PF sesizarea schimbarii se face dupa ce a reactionat o cantitate suficienta de indicator cu titrantul, ideal aceasta cantitate trebuie sa fie
foarte mica;
In titrimetria fizico-chimica se masoara cu ajutorul instrumentelor o insusire fizica a sistemului, cum ar fi: diferenta de potential,
conductibilitate, intensitate de curent, absorbanta etc; corelata cu modificarea concentratiei analitului sau produsului de reactie in timpul
titrarii. Curba de titrare permite determinarea directa a PE si reprezinta variatia semnalului masurat in functie de volumul de titrant
adaugat. In cazul multor instrumente, aceasta se inregistreaza automat pe masura ce are loc titrarea.
- Titrarile bazate pe modificarea unei insusiri fizice a solutiei in cursul reactiei chimice sunt rare (de exemplu, reactia dintre acidul oxalic
si permanganat de potasiu cand are loc modificarea culorii datorita consumarii permanganatului);

Clasificarea metodelor volumetrice

- Clasificarea metodelor titrimetrice volumetrice se realizeaza dupa mai multe criterii (modul de executie al titrarilor, reactia chimica,
modul de detectie a punctului de echivalenta, natura solventului in care are loc reactia);
- In continuare, tratarea metodelor volumetrice se va face in principal tinand cont de clasificarea in functie de reactia chimica, intr-o
abordare coroborata cu celelalte principii de clasificare, accentuand metodele cu aplicabilitate in laborator.
- In functie de reactia chimica, metodele titrimetrice se impart in:
 Titrimetria prin reactii cu formare de combinatii complexe (complexometria);
 Titrimetria prin reactii de diazotare (nitritometria);
 Titrimetria prin reactii de precipitare;
 Titrimetria prin formare de compusi greu disociati;
 Titrimetria prin reactii redox (redoxometria);

2.1.2. Volumetria prin reactii acido-bazice (protometria)

2.1.2.1 volumetria prin reactii acido-bazice in mediu apos
- se bazeaza pe reactii de neutralizare a acizilor cu baze, respectiv, a bazelor cu acizi din medii apoase;

titrosubstante
- ca titrosubstante, in volumetria acido-bazica se utilizeaza:
 acidul oxalic;
 biiodatul de potasiu;
 acid benzoic;
 carbonatul de sodiu;
 boraxul;
 iodatul de potasiu.

Indicatori acido-bazici (de pH):

Se disting mai multe grupe de indicatori:

- indicatori de culoare;
- indicatori de fluorescenta;
14
 - indicatori turbidimetrici (precipitare);
- indicatori de adsorbtie.

Indicatori turbidimetrici
- sunt indicatorii care-si schimba brusc solubilitatea in functie de pH-ul solutiei. In general acestia sunt substante coloidale care la punctul
de echivalenta coaguleaza. Se utilizeaza in cazul solutiilor colorate sau la dozarea acizilor si bazelor slabe. Intervalul lor de viraj este
ingust si puternic influentat de temperatura (ex: izonitrozoacetil p-aminobenzen);
- Indicatori de adsorbtie – sunt substante care se adsorb (desorb) pe (de pe) suprafata unor coloizi ce se formeaza in timpul titrarii
concomitent cu schimbarea culorii la punctul de echivalenta (exemplu, galben de tiazol);

- Indicatorii de fluorescenta – sunt acei indicatori care la o anumita valoarea a pH-ului, in lumina UV devin fluorescenti sau isi pierd
fluorescenta si sunt utilizati in cazul solutiilor puternic colorate sau a celor netransparente (ex: tetrabromfluoresceina, albastru de timol
etc.)

- Aplicatii ale protometriei in mediu apos – metoda se bazeaza pe o reactie cu schimb de protoni, folosind fie o solutie titrata de acid
pentru dozarea substantelor cu functie bazica fie o solutie titrata de baza tare pentru determinarea substantelor cu functie acida;

- Se aplica s.m. care sunt acizi sau baze relativ tari, solubile in apa sau in solventi miscibili cu apa;
- Dozarea acizilor tari: HCl, acid sulfuric, acid azotic;
- Dozarea bazelor tari: hidroxizi alcalini, hidroxizi alcalino-pamantosi;
- Acizi organici: acid acetic, benzoic, boric, nicotinic, barbituric etc;
- Baze organice: amoniac, urotropina, meprobamat etc.

CURS 9, 02.12.2013

Volumetria prin reactii acido-bazice in mediu neapos

- Apa prezinta ca mediu de reactie o serie de dezavantaje:
 Multe s.m. sunt insolubile in apa;
 Este un solvent care niveleaza taria „acizilor tari” si a „bazelor tari” facand imposibila titrarea acestora din amestecuri utilizand
metode directe;
 Nu poate releva functiile acide sau bazice ale unor substante in asa fel incat sa fie titrabile, dozarile directe de acizi sau baze;
 Protometria in solutii neapoase este indicata ca metoda cantitativa in determinarea substantelor medicamentoase inca din 1955
(Farmacopeea US XV);
Protometria in mediu neapos, pe langa faptul ca a extins posibilitatile de determinare cantitativa la un numar foarte mare si divers
de substante, a adus si o interpretare progresista a acestor procese;
- Teoriile protonica si electronica considera ca fiecare substanta se caracterizeaza printr-o aciditate sau bazicitate proprie, intrinseca
dependenta de structura moleculara a substantei polare, independenta de solvent;
- Proprietatile acide sau bazice ale substantei sunt relevate in solutie, solventul consituind prin actiunea sa de modificare a aciditatii sau
bazicitatii intrinsece, un factor extrinsec.

Protometria in mediu neapos

Avantaje – pot fi titrate substante medicamentoase:
- Acizi sau baze slabe, sau foarte slabe;
- Neutre in apa;
- Din amestecuri complexe de substante cu polaritati bazice sau acide apropiate;
Permite titrarea directa a principiilor active din formele farmaceutice fara sa fie necesara o separare prealabila.

- Erori de titrare mai mici datorita tensiunii superficiale scazute a solventilor organici;
- Titrarea unor cantitati mai mici de substanta;
- Temperatura nu are o influenta majora asupra titrarii;

Dezavantaje:
- Solventi organici toxici – CI sa se inhaleze mult timp aceste substante;

15
 - Toxicitate;
- Manualitate – trebuie manipulate mai cu grija, experienta;
- Cost crescut comparativ cu apa.

Protometria in mediu neapos

- Caracterul acido-bazic al unei substante depinde de:
 Aciditatea/bazicitatea intrinseca
- Dependenta de structura chimica: aciditatea – grupari carboxil, fenolice; bazicitatea – grupari aminice;
- Independenta de solvent.
 Aciditatea/bazicitatea ionica sau aparenta a substantei
- Se manifesta in solutii
- Dependenta de afinitatea relativa fata de protoni a substantei si a solventului;
- In functie de solvent, o substanta poate manifesta fie proprietati acide, fie bazice.

Solventii neaposi:
- Proprietatile acide/bazice ale substantei sunt evidentiate prin dizolvare intr-o baza/acid;
- Echilibre in mediul neapos:
 Solvent cu proprietati bazice/SM cu caracter acid:
 SH + H-A ↔ SH2+ + A-;
 H-A – acidul, SH – solvent bazic; SH2+ - solvent solvatat, A- - baza conjugata.
- Cresterea bazicitatii solventului va duce la deplasarea echilibrului spre dreapta (disocierea completa a bazei);
- Solvent cu proprietati acide/SM cu caracter bazic
 SH + B ↔ S- + HB+
 SH – solvent acid, B – baza; S- - anionul solventului, HB+ - acidul conjugat

Clasificarea solventilor neaposi

- Dupa natura lor:
 Solventi inerti (aprotici); benzen, toluen, CHCl3, CCl4, acetat de etil;
 Solventi protici
+ protofilici – NH3, etilendiamina (EN), dimetilformamida (DMF), pridina (Py), dioxan, cetonele (acetona, metil-etilcetona), nitrili
(acetonitril), dimetilsulfoxid (DMSO);
+ protogenici – acizi carboxilici (acetic glacial, formic, propionic etc);
+ amfiprotici – alcooli (metilic, etilic, etilenglicol etc)

- Dupa capacitatea de a modifica taria acizilor/bazelor dizolvate:

 Solventi de nivelare: protogenici, protofilici
+ niveleaza functia acida sau bazica;
Vor exalta caracterul acid sau bazic al substantelor
CH3 –(CH2)2-NH2 + CH3COOH ↔ CH3-(CH2)2-NH3+ + CH3-COO-
Piridina + acid acetic → piridinaH+ + CH3COO-

 Solventi denivelatori: aprotici

+ determina o diferentiere neta in taria acizilor si bazelor;
+ nu au caracter acid sau bazic -> substantele sunt foarte putin disociate;
+ transferul protonului se va face direct de la acid la baza fara interventia solventului.

Mecanismul de interventie al solventului

1. Capacitate de dizolvare – dependenta de proprietatile fizice ale solventului si capacitatea de solvatare a ionilor sau moleculelor
SM;
2. Efectul prototropic – caracterul donor sau acceptor de protoni;
3. Constanta dielectrica (epsilon) – rol in disocierea ionica a substantei dizolvate.

II. efectul prototropic

Solventii:
- Reactioneaza cu substantele dizolvate;
- Pot transforma o legatura covalenta in una ionica
16
 S-H + B ↔ S-- HB+ (efect prototropic)
S-- HB+ ↔ S- + HB+ (constanta dielectrica)
S-H + B ↔ S-- HB+ ↔ S- + HB+
Ionizare disociatie ionica (constanta dielectrica)
(efect prototropic)

III. Constanta dielectrica

- Disocierea unei substante ionice
A+B- ↔ A+ + B-
- Clasificarea solventilor:
 Putin disocianti: epsilon < 10-15; ex: benzenul (2,28);
 Mediu disocianti: 15<epsilon<40;
 Puternic disocianti: epsilon>40; ex: apa (80,4)
- Constanta de disociere ionica a unei substante este cu atat mai mare cu cat constanta dielectrica a solventului este mai mare;

Exemple de interventie a solventului

- Solventi protogenici – acid acetic glacial
- R-NH2 + acid acetic -> R-NH3+ + CH3COO-
- R-NH2 + CH3COO- -> R-NH3+ + CH3COO-

- R-NH2 + acid acetic -> R-NH3+-CH3COO- -> R-NH3+ + CH3COO-

Ionizare (efect prototropic) disociatie ionica (constanta dielectrica)
- Solventi protofilici – DMF
- R-H + (CH3)2NCHO -> R--(CH3)2NHCHO+
- R--(CH3)2NHCHO+ -> R- + (CH3)2NHCHO+
- R-H + (CH3)2NCHO -> R--(CH2)2NHCHO+ -> R- + (CH3)2NHCHO+
Ionizare disociatie ionica

- Exemple de interventie a solventului

 In protometria in mediu neapos, cresterea caracterului acid sau bazic al SM se realizeaza:

- In cazul bazelor prin dizolvarea in solventi protogenici (acizi);
- In cazul acizilor prin dizolvarea in solventi protofilici (bazici);
 Cresterea caracterului acid/bazic este cu atat mai mare cu cat diferenta dintre valoarea pKa (pKb) ale solventului si pKa (pKb) a
substantei este mai mare;

Solutii titrate
- Titrarea substantelor bazice
 Solutia titrata: acid percloric 0,1N;
 Acid percloric in acid acetic sau dioxan;
 Titru stabilit cu ftalat acid de potasiu.

- Titrarea substantelor acide

 Solutia titrata: metoxid de sodiu 0,1 N;
 Metoxid de sodiu in benzen;
 Titru stabilit cu acid benzoic.

Indicatori acido-bazici in mediu neapos

- Se aleg astfel incat erorile posibile sa fie cat mai reduse -> se va tine seama de:
 Mediul de reactie (solvent);
 Natura substantei care se dozeaza;
 Nuantele prin care trece indicatorul in jurul punctului de echivalenta.

Alegerea indicatorului
- Solventi acizi (acid acetic glacial, anhidrida acetica, acid propionic)
17
  Cristal violet in acid acetic glacial;
- Solventi bazici (DMF, piridina);
 Albastru de brom-timol in DMF;
- Solventi neutri (acetona, dioxan, benzen);
 Galben de metanil in dioxan.

Mecanismele schimbarii culorii indicatorilor

- Cristal violet – clasa indicatorilor trifenil metanici
- Violet – H+ - albastru verde – H+ galben.

Concluzii
- SM cu caracter bazic:
 Solventi: protogenici (acizi);
 Solutia titrata: acid percloric 0,1N – in acid acetic glacial sau dioxan;
 Indicator: cristal violet – in acid acetic glacial; sau galben de metanil in dioxan.
- SM cu caracter acid:
 Solventi: protofilici (bazici);
 Solutia titrata: metoxid de sodiu 0,1N in benzen;
 Indicator: albastru de bromtimol in DMF

Aplicatiile protometriei in mediu neapos

- SM cu grupari functionale bazice:
 Amine primare, secundare, tertiare;
 Amide;
 Compusi azotati heterociclici: fenazona, aminofenazona, antibiotice, alcaloizi, baze purinice, antihistaminice;
 Saruri organice si anorganice (prin partea lor bazica);
 Saruri de alcaloizi.

Observatii
- Pentru alegerea conditiilor optime de reactie este necesara o evaluare a:
- Structurii substantei:
 Existenta unei singure grupari bazice slabe sau foarte slabe;
 Prezenta in aceeasi molecula a doua sau mai multe polaritati bazice mai mult sau mai putin apropiate ca tarie;
- Amestecului din care face parte substanta:
 Substanta in care polaritatile acide sau bazice se neutralizeaza sau compenseaza (ex: clorhidratii, sulfatii, azotatii);
 Amestecuri de baze tari si slabe sau amestecuri cu polaritati apropiate;
 Forme farmaceutice.

- SM cu o singura grupare bazica:

 Baze: codeina, reserpina, efedrina, papaverina;
 Saruri alcaline ale acizilor organici: salicilati de sodiu, benzoat de sodiu, citrat de sodiu, gluconat de potasiu;
 Saruri ale bazelor organice cu acizi organici sau anorganici: fosfat de codeina, propionat de eritromicina, malea de prometazina.

- SM cu o singura grupare bazica:

 Dizolvare in acid acetic glacial
 Titrare cu acid percloric 0,1N in prezenta cristalului violet;
 La papaverina si codeina.
- SM cu doua sau mai multe grupari bazice titrabile
 Hidrazida izonicotinica H.I.N;
 Procaina;
 Tetracaina;
 Chinina;
 Vitamina B1;
 Aminofenazona;
18
  Fenazona.

Bazicitatea scade – R2NH>R-NH2->R3N>N heterociclic > Ar-NH2

Chinina – 2 atomi de azot cu polaritati slabe si apropiate, in apa se comporta ca o baza monovalenta, in acid acetic glacial se comporta ca o baza
bivalenta (acidul acetic echivaleaza ambii atomi de azot).
Vitamina B1 – tiamina – 4 atomi de azot, in acid acetic glacial se titreaza amina primara si azotul tertiar din ciclul tiazolic; ceilalti doi atomi de
azot nu interfera titrarea;
Aminofenazona – 3 atomi de azot, in acid acetic glacial se titreaza bazicitatea azotului alifatic si bazicitatea partiala a celor 2 azot din ciclu;
dizolvare in acid acetic + dicloretan sau in cloroform -> titrarea azotului din catena laterala;

- Saruri ale bazelor cu acizi minerali tari:

 In cazul halogenurilor, sulfatilor si azotatilor bazelor organice, bazicitatea este slava -> titrarea se face doar dupa indepartarea
anionilor Cl-, SO42-, NO3-;
 Halogenuri
 2BH + X- + Hg(CH3COO)2 -> HgX2 + 2CH3COOH + 2BH;
 Ex: efedrina clorhidrat, procaina clorhidrat;
 Sulfati – se indeparteaza cu solutie de benzidina (ppt.);
 Azotati – reducere cu acid ascorbic si indepartarea vaporilor de azot;

- Determinarea SM dupa transformarea in baze

 Eliberarea gruparilor aminice dupa hidroliza acida bazica
 Titrarea gruparii aminice cu acid percloric 0,1N;
 Ex: fenacetina care prin hidroliza (mediu acid ) se transforma in p-fenetidina si acid acetic.

- SM cu grupari functionale acide:

 Derivati cu hidroxil alcoolic:
+ alcooli primari alifatici;
+ alcool cetilic;
+ colesterol;
+ polioli: glicerina, zaharoza, dextroza.
 Derivati cu OH fenolic
+ fenol, vanilina, morfina.

- Acizi carboxilici si derivati

 Acid benzoic, salicilic, nicotinic, nalidixic;
 Saruri ale acizilor organici – citrati, tartrati;

- Compusi cu grupari
 Imidice: -CO-NH-CO-
 Amidice - -NH-CO-NH- (derivati barbiturici, sulfamide).

Fenobarbital (titrare cu metoxid de sodiu)

AVANTAJELE DOZARII IN SOLVENTI NEAPOSI

- Majoritatea SM (acizi sau baze foarte slabe putin sau insolubile in apa) pot fi titrate (dozate) cu acizi sau baze relativ tari in solventi
neaposi anhidri in care, de obicei, sunt mai solubile;
- Titrarea poate fi extinsa si la substantele care in solutii neapoase sunt neutre;
- Cel mai important este solventul;
- Prin utilizarea corecta a unor amestecuri de solventi neaposi pot fi dozate amestecuri de substante organice medicamentoase cu polaritati
acide sau bazice apropiate;
- Metoda poate fi aplicata si la dozarea sm slab acide sau bazice din forme farmaceutice;
- Solventii neaposi avand o tensiune superficiala mica, picaturile care se strang din biureta au volum mic -> erori mici de titrare;
- Dozarile in mediu neapos permit titrari la diferite temperaturi cu evidentierea punctului de echivalenta cu ajutorul indicatorului sau prin
metode fizice (potentiometric, voltametric).
-
19
20