IV .

Descoperirea
biofarmaceuticelor
1.Descriere
Au la baza molecule proteice cu masa moleculara mare;
Structura similara cu compusi biochimici din organism sau reprezinta
fragmente care simuleaza activitatea unor compusi naturali;
Descoperirea :
examinarea compusilor biologici din organism si determinarea
rolului lor;
Studierea unor virusuri sau bacterii(realizarea vaccinurilor);
Daca medicamentele clasice se realizeaza in instalatii specifice
industriei farmaceutice, biofarmaceuticele(BP) sunt fabricate in
sisteme biologice, celule vii sau sunt extrase din fluidele biologice ale
unor animale;
Avantaje: mai specifice si mai eficiente decat cele sintetizate chimic;
Exista trei directii principale de utilizare:
Profilactic(vaccinuri);
Terapeutic(anticorpi);
Terapia de inlocuire (hormoni, factori de crestere);
Statisticele arata ca in 2006 :
165 de BP aprobate pentru SUA si UE;
Faza descoperirii (2500 produse) , trialuri preclinice (900); trialuri clinice( 1600);
Ca si pondere : 44% din totalul de medicamente aflate in faza descoperirii; 27% din
totalul de MD din studiile preclinice si clinice:
2.Istoric.Stadiul actual .Perspective
Cercetarile in domeniu incep in 1950 odata cu depistarea unor
proteine produse pe cale naturala in organismul uman si care
manifesta evidente efecte terapeutice(interferoni, interleukine, factori
de crestere). Desi potentialul lor terapeutic a fost apreciat ,
principalul inconvenient a fost cantitatea mica in care se gasesc in
mod natural.
Punerea la punct a tehnologiilor de ADN recombinant, a avut un rol
hotarator asupra dezvoltarii acestor produse :
Eliminarea problemelor legate de existenta lor in cantitati reduse in
organism;
Eliminarea unor probleme legate de siguranta. Extragerea directa a
produsului din surse biologice a dus la transmiterea involuntara a unor
boli(hepatita B si C, HIV etc);
Reprezinta o alternativa la extractia directa din surse nepotrivite unele
chiar periculoase.Un numar de proteine terapeutice erau initial extrase
din urina. Altele cum ar fi de exemplu enzima ancrod (manifesta
proprietati anticoagulante ) era extrasa in mod natural din veninul de la
o specie de vipera din Malaiezia.
Faciliteaza posibilitatea ca prin aceste tehnici sa se obtina produse cu o
calitate superioara celor naturale;
Dezvoltarea unor tehnici de
mutageneza, faciliteaza
introducera unor modificari in
secventa aminoacida a
proteinei.Aceste modificari pot
fi unele simple(insertia ,
stergerea sau alterarea unei
singure secvente ) sau chiar
unele mai substantiale care sa
duca la generarea unor
proteine de tip hibrid.
Produs Modificare Actiune
Insulina cu
actiune
rapida
Modificarea
secventei
aminoacide
Actiune
rapida
Insulina cu
actiune
lenta
Modificarea
secventei
aminoacide
Actiune
lenta
Modificarea
activatorului
tisular de
plasminogen
(tPA)
Indepartare
a trei din
cele 5
domenii
native ale
tPA
Generarea
unui agent
trombolitic
cu actiune
mai rapida
Chiar si in conditiile dezvoltarii biotehnologiilor inca exista pe piata produse
pe baza de proteine terapeutice , extrase din surse naturale;
Exista unele cazuri in care extractia este mai simpla, aceste proteine
gasindu-se in cantitati suficiente in mod natural(Ex albumina serica);
Desi majoritatea acestor medicamente au la baza terapia cu proteine exista
si cateva exceptii ce utilizeaza produse pe baza de acizi nucleici (Ex:
Vitraven-oligonucleotid antisens, Macugen aptamer );Chiar daca in faza
studiilor clinice exista si alte medicamente pe baza de ADN, predomina
totusi medicamentele pe baza de proteine ;
Productia in animale transgenice
Desi majoritatea produselor pe baza de proteine terapeutice sunt obtinute in
linii de celule animale sau E coli , S cerevisiae , unele sunt produse in lapte
de animale transgenice
Obtinerea animalelor transgenice:
Injectarea ADN exogen in celula ou;
In unele cazuri acest ADN este integrat stabil in genomul celulei;
Dupa fertilizare ovulele sunt implantate intr-o mama surogat ;
Fiecare celula a animalului transgenic , astfel obtinut va purta o copie a
ADN-ului transferat ;
In felul acesta animalul
transgenic ce gazduieste o
gena care exprima o anumita
proteina umana, cu potential
terapeutic , va deveni un
bioreactor live producator de
astfel de proteine;
Pentru ca un astfel de sistem
biologic sa fie eficient ,
proteina recombinanta , trebuie
inlaturata intr-un mod cat mai
practic ,fara a ucide animalul:
laptele produs de glandele
mamare
Proteina animal Nivel de
expresie
(mg/l)
tPA capra 6000
IL-2 iepure 0.5
Factor VIII porc 3
Factor IX oaie 1000
EPO iepure 50
IGF-I iepure 1000
Proteina C porc 1000
3.Obtinerea proteinelor in plante transgenice
Avantaje -fata de animale transgenice:
Costurile de cultivare reduse;
Echipamentul de recoltare si metodologia nu sunt costisitoare;
Trecere usoara la o scara mai mare;
Sistemele pe baza de plante nu au patogeni umani(HIV);
Proteinele exprimate in seminte sunt stabile pe o perioada mare de timp(ani);
Dezavantaje:
Nivel de expresie foarte mic(EPO-eritroproietina exprimata in tutun 0.003% din totalul de
proteine solubile din planta);
Prezenta unor potentiali metaboliti, biologic activi din plante (alcaloizi) ce pot contamina
produsul;
Aparitia unor structuri glicozilate ce difera mult fata de glicoproteinele umane , existand
astfel un caracter imunogenic prin administrarea la om;
Aspectul sezonier caracteristic plantelor;
Avand in vedere ca protectia patentului la o serie de BP din prima generatie a
expirat (insulina, EPO, interferon alpha) au aparut deja primele generice;
Cercetarile continua in directia gasirii unor cai de administrare neparenterale care
sa imbunatateasca complianta pacientului
4.Impactul genomului asupra tehnologiilor biofarmaceutice
Datele obtinute prin secventierea (determinarea secventei nucleotidice )
genomului uman sunt de o deosebita importanta pentru procesul dezvoltarii
medicamentelor:
Informatii despre proteinele din organism: identificarea unor potentiale
biofarmaceutice:
Identificarea unor posibile tinte terapeutice(TT) pentru toate medicamentele
(datele din literatura arata existenta a peste 500 TT pentru medicamentele
existente pe piata(enzime, hormoni , canale ionice, receptori nucleari );
Rezultatele proiectului genomului uman : se estimeaza existenta a unui
numar mai mare de TT, 3000-10000;
Pentru multe din secventele identificate nu s-a determinat functia biologica ,
cercetarile pe viitor fiind orientate in elucidarea modului de exprimare al unor
gene: genomica functionala;
Genomica functionala : importanta pentru stabilirea relatiei genotip-fenotip,
dar si pentru descoperirea de noi TT;
Costurile de secventiere au fost reduse de la an la an(2001: 3 mild $; 2008:
250000$; 2009: o echipa de la Standford , secventierea genomului unui
individ : 50000$+ 2 specialisti);
In contextul genomic functia genei inseamna mai mult decat
activitatea biologica a proteinei exprimate:
locul de actiune al proteinei si cu ce alte elemente celulare
interactioneaza;
rolul acestor interactiuni in desfasurarea proceselor
fiziologice din organism;
Aceasta determinare functionala necesita apelarea la o serie
de tehnici si metode specifice:
Studiu comparativ al secventelor genomice omoloage;
Profilul filogenetic;
Studii pe animale knockout;
Tehnologia microarray;
Abordarea proteomica ;
Abordarea prin genomica structurala ;
Cu exceptia animalelor knockout , aceste abordari necesita:
studii de secventiere , comparare prin apelare la metode
specifice bioinformaticii si librarii de ADN complementar ;
Exemplu:
Studiul comparativ al secventelor genomice omoloage :
compararea(cu ajutorul unor softuri specializate ) genei cu functie
necunoscuta cu secventele din librarii ale caror functii se cunosc(se
poate astfel stabili functia pentru 40-60% din noua secventa genica);
Studiile pe animale knockout: au la baza observatii fenotipice ce
constau in studierea comportamentului unor soareci in care este
blocata activitatea unei gene ;
Abordarea proteomica: studiu la scara larga al proteinelor
exprimate de genom. Initiata in 1980 avand scopul :
identificarea biomarkerilor proteici care sa furnizeze informatii privind
diagnosticul unei afectiuni si privind fiziopatologia bolii;
Identificarea secventei de aminoacizi:
Extractia proteinelor din celula sau tesutul analizat;
Separarea lor cu ajutorul electroforezei bidimensionale;
Eluarea spoturilor de pe gelul electroforetic si supunerea unor analize
ulterioare(degradarea Edman);
Dupa obtinerea secventei aminoacide are loc cautarea in baza de date
pentru a stabili functia biologica a acesteia;
Analiza electroforetica bidimensionala:
nu permite diferentierea a mai mult de 2000 proteine;
proteinele exprimate la un nivel redus nu pot fi intotdeauna detectate(
deosebit de utila in contextul detectarii a noi tinte terapeutice care sunt
exprimate la nivele foarte mici de concentratie;
De aceea se face apel la tehnici mai moderne de separare(tehnici
cromatografice de inalta rezolutie ) cuplate cu spectrometrie de masa de
inalta rezolutie;
Genomica structurala :abordarea de baza consta in modalitatea de
clonare a proteinelor prin tehnici de ADN recombinant urmata de
metodele de purificare si de analiza a structurii 3D;
Determinarea structurii proteice la o rezolutie cat mai mare;
In anul 2000 bancile de date ce contineau structuri 3D ale proteinelor
aveau cam aproximativ 12000 locatii , existand proteine care aveau
rezervate mai multe locatii;
Introducerea unor tehnici de analiza (cristalogarafia de raze X ) a permis
determinarea structurii multora dintre proteine , principalul dezavantaj
fiind necesitatea cristalizarii proteinelor;De aceea s-a facut apel la
tehnici ce nu necesita aceasta operatie cum ar fi de exemplu Rezonanta
Magnetica Nucleara ;
5. Caracterizarea biofarmaceuticelor
Stabilirea proprietatilor fizico-chimice:anterior testelor preclinice;
Operatia de purificare: ultrafiltrare, diafiltrare, purificare cromatografica
(cromatografia prin schimb ionic,cromatografie de afinitate, cromatografie de
interactie hidrofoba) , metode de purificare prin imunoafinitate, HPLC.Aceste
metode trebuie optimizate astfel incat aplicarea lor sa nu altereze activitatea
biologica a BP.
Posibile alterari:
influente chimice(agenti de oxidare , detergenti);
Influente fizice(valori pH , temperaturi ridicate , agitari intense);
Influente biologice(degradari proteolitice);
Exemple:
Alterari non-covalente:denaturari partiale sau complete prin micsorarea
fortelor ce stabilizeaza si care dau o anumita conformatie proteinelor (atractii
ionice , hidrofobice , legaturi de hidrogen);
Alterari covalente:hidrolize , oxidari , izomerizari , fotodescompuneri ,
deamidare;
Contaminarea cu proteine de la genomul gazda:chiar daca produsul obtinut
este derivat din genomul uman exista aceasta posibilitate tinad cont ca BP se
obtin in culturi celulare si pe microbi;
Determinarea secventei aminoacide este o tehnica la indemana multor
laboratoare de analiza , in special in cazul polipeptidelor cu masa moleculara
mica(< 10kDa)-hidroliza in solutie de HCl la 110 C si in vid-operatie efectuata
cu grija pentru a nu distruge secventele analizate;
Evitarea contaminarii cu endotoxine(provenite din membrana externa a
bacteriilor Gram-negative) sau alte substante pirogenice:operatie dificil
de controlat deoarece:
Majoritatea biofarmaceuticelor sunt produse in sisteme bacteriale Gram-
negative;
Chiar si in prezenta normelor GMP , majoritatea BP sunt contaminate cu
cantitati mici de bacterii Gram negative , la diferite etape ale procesului de
manufacturare;
Stabilitea la caldura caracteristica endotoxinelor face ca autoclavarea sa nu
fie eficienta;
Reactii adverse cauzate de endotoxine : apar la doze de aprox. 0.5
ng/kg de greutate corporala;
Necesitate efectuarii unor teste de pirogenicitate:
teste pe iepuri , recomandate de Farmacopeea Europeana produsul este
non-pirogenic daca suma cresterilor de temperatura de la 3 iepuri nu
depaseste 1.5 C .Dezavantajul metodei:costisitoare ,(animale , gazduire ,
personal de ingrijire), posibila aparitie a unor infectii , care sa determine un
efect fals pozitiv;o serie de biofarmaceutice(citokine IL-1 sau TNF) pot avea
un raspuns pirogenic natural;
Solutia: teste in vitro (prezenta unei bacterii Gram negativa in sistemul
vascular al unei specii de crab Limulus Polyphemus , determina un
proces de coagulare) ;
Sistemul este introdus in 1970 sub forma unui kit de analiza;
Avantajele kitului: sensibilitate crescuta;cost mic; analiza
rapida(15-60 min);
Dezavantaje:
selectivitate redusa, permitand detectia doar a endotoxinei
(pirogenul cel mai frecvent intalnit in preparatele BP);
Tendinte in cercetare: reducerea contaminarilor cu ADN ,
studii recente demonstrand existenta unor posibile
oncogene active in genomul unor linii celulare ;
Detectarea ADN contaminant se face prin:
izolarea acestuia (extractie in cloroform si fenol);
precipitarea in etanol si aplicarea lui sub forma unui spot pe hartia
de filtru;
Incalzirea si denaturarea acestuia la 80C in vid(desfacerea ADN-
ului in monocatene care se fixeaza pe hartia de filtru);
Izolarea ADN-ului de la celula gazda , denaturarea prin incalzire ,
radiomarcarea acestuia si hibridizarea acestuia pe acelasi suport
(metoda permite detectia unor cantitati de ordinul ng);
6.Patentarea produselor BP
Chiar daca gasirea unor substante naturale noi (proteine, enzime) este
considerata o descoperire, ea nefiind patentabila , gasirea unor metode prin
care substanta respectiva este prima oara produsa , modificata , purificata
poate duce la patentarea procedurilor;
Exemplu;vitamina B
12
era un produs natural cunoscut , care nu era utilizat
in scopuri terapeutice;dezvoltarea unor protocoale de fermentatie si
purificare a permis obtinerea ei in stare pura , cristalina putand fi utilizata
clinic(acest procedeu stand la baza unui patent aprobat de US Patent and
Trademark Office- PTO;
Progresele rapide in cadrul acestor biotehnologii a impus ca PTO sa
confirme in 1980 ca este posibil si patentarea unor organisme multicelulare
non umane;
Astfel in 1988 este patentat primul animal transgenic in cadrul Universitatii
Harvard(acest soarece era mai susceptibil la dezvoltarea unor forme de
cancer);
Un alt domeniu de patentare este legat de secventele ADN;
Aceste reguli de patentare sunt reglementate si de legi ale UE prin
introducerea in 1998 a unor Directive de Patentare Europene;
Conform acestor directive materialul biologic (celulele specifice , proteine,
gene, secvente nucleotidice) care in prealabil exista in natura poate fi
patentatibil;
7.Administrarea biofarmaceuticelor
Un aspect ce trebuie analizat in faza preclinica este calea de
administrare;
Pana in prezent majoritatea sunt administrate parenteral de obicei
IV ,subcutanat sau intramuscular .Exista cateva exceptii, cum ar fi
de exemplu enzima DNase pentru tratamentul fibrozei cistice si
factorul de crestere derivat plachetar ,PDGF, pentru tratamentul
unor ulceratii ale pielii(caz in care medicamentul de fapt nu trebuie
sa ajunga in sange);
Daca administrarea parenterala nu ridica probleme la administrarea
la intervale mari de timp , in cazul unor administrari mai frecvente
(zilnic) cum este cazul insulinei, se cauta noi cai de administrare
alternative mai putin invazive , mai putin dureroase :orala, nazala
transdermica , pulmonara;
Desi aceste cai sunt accesibile pentru alte medicamente , in cazul
BP ridica o serie de probleme :
-masa moleculara mare, susceptibilitate la o inactivare enzimatica,
tendinte de agregare;
7.1Administrarea orala:
-inactivare in mediul acid din tractul GI, datorita proteazelor
digestive(pepsina , tripsina);
-masa moleculara mare si natura hidrofilica fac dificila absorbtia prin
membrana intestinala;
-supuse metabolismului primului pasaj;
De aceea biodisponibilitatea orala a BP este < 1% , cautandu-se noi
strategii pentru a evita aceste obstacole:
Protejarea fizica prin incapsulare sau formulare sub forma de
microemulsii/microparticule sau includerea unor inhibatori de proteaze sau de
crestere a permeabilitatii;
Incapsularea cu invelisuri enterice(rezistente la pH acid), microincapsularea
utilizand diverse substante polimerice, celuloza:
-a fost deja realizata cedarea medicamentelor prin sisteme pe baza
de lipozomi sau invelisuri din ciclodextrine , sisteme ce au incluse
inhibatori de proteaze(aprotinina);
Cresterea absorbtiei prin celulele mucoasei gastrice prin folosirea
unor substante pe baza de agenti tensioactvi;
Studii recente au la baza sisteme de cedare mucoadezive care sa interactioneze
cu mocoasa intestinala , retinand BP la suprafata un timp prelungit(interactiuni
non-specifice de tip electrostatic sau biospecifice datorita unor proteine ce adera
pe anumite bacterii);
Administrarea orala :obiectiv inca neindeplinit
7.2Administrarea pulmonara
Cedarea pe aceasta cale este posibila.Chiar
daca primul sistem de administrare a
insulinei-Exubera a fost retras de pe piata in
26 septembrie 2008 , aceasta cale reprezinta
totusi o alternativa promitatoare pentru
administrarea biofarmaceuticelor.
Desi plamani nu sunt permeabili la
medicamente cu masa moleculara mica ,
surprinzator , macromoleculele sunt bine
absorbite, majoritatea proteinelor avand o
biodisponibilitate pe aceasta cale >50%.
Incomplet elucidat acest mecanism ,
biodisponibilitatea crescuta, ar putea fi
datorata:suprafetei mari de absorbtie pe
aceasta cale , stratului de difuzie foarte
subtire , prezentei unor inhibatori proteolitici;
Absorbtia macromoleculelor este datorata
transcitozei:
prin care acestea sunt preluate pe una din
suprafetele membranei prin endocitoza;
traversarea celulara sub forma unei
vezicule endozom;
eliberarea pe fata opusa prin exocitoza ;
Mecanismele de trecere ale MD printr-o membrana
formata din celule(epiteliul celular):
1.transport paracelular(MD cu masa moleculara mica);
2.a transport activ;
2.b difuzie pasiva(molecule neionizate sau caracter lipofilic;
2c.Transcitoza(biofarmaceutice , macromolecule);
3. efluxul (datorat glicoproteinei -P)
Various Inhalation Systems
For Insulin
KOS
Pfizer/Aventis/Nektar
Aradigm/Novo Nordisk
Mannkind
Aerogen Lilly/Alkermes
7.3 Sisteme de cedare nazale ;
Administrarea nazala este atractiva:
cale usor accesibila ;
cavitatea nazala este puternic vascularizata ;
microvilii nazali genereaza un inalt potential de absorbtie ;
evita primul pasaj;
Dezavantaje:
existenta unor proteze nazale; existenta unui clearance datorat actiunii cililor
nazali;
pe aceasta cale trec mai greu moleculele cu masa moleculara mare(> 10kDa),
fiind astfel necesara administrarea unor substante tensioactive;
Sisteme de cedare transdermice;
Se studiaza intens si administrarea transdermica ce prezinta avantaje fata
de administrarea orala(evitarea pasajului hepatic,difuzia rapida a
medicamentului,dupa trecerea prin corneum).
Principalul dezavantaj este legat de permebilitate mica in cazul
biofarmaceuticelor(datorita masei moleculare mare).Se incearca de aceea
folosirea unor strategii (iontoforeza, ultrasunete, caldura ) fara insa a se fi
obtinut rezultate semnificative;
8.Studii preclinice-biofarmaceutice
Se desfasoara ca si in cazul medicamentelor de sinteza chimica(masa
moleculara mica) , fara ca agentiile de reglementare sa impuna norme
speciale de desfasurare;
Obiectivele unui astfel de program sunt:
Evaluarea potentialului toxic;
Identificarea parametrilor optimi necesari monitorizarii studiilor clinice;
Stabilirea dozei necesara in studiile clinice;
Selectarea animalelor de experienta
Alegerea modelului animal tine cont de faptul ca aceste medicamente ,
avand o compozitie naturala formata din grupari aminoacide si carbohidrati,
nu sunt caracterizate printr-un efect toxic de natura chimica ;
Ele pot avea unele efecte adverse datorita unor activitati farmacologice
exagerate si/sau ca urmare a interactiunii nespecifice cu alte celule sau
tesuturi;
De fapt in aceste studii se urmaresc doar interactiunile mediate de receptorii
celulari.De aceea animalele selectate trebuie sa corespunda conditiilor de
specificitate ale BP analizate (cunoasterea tintelor terapeutice , distributia
acestora in concordanta cu cele exprimate de celulele umane);
In aceste conditii animalele cele mai potrivite sunt primatele umane;
Folosirea acestor animale limiteaza insa dimensiune grupului : cauze etice,
disponibilitatilor mai reduse, costuri mai ridicate;
Impediment:un numar mic de animale reduce drastic posibilitatea de a
intalni o serie de efecte cu o probabilitate redusa de aparitie ;
Solutia: utilizarea animalelor transgenice sau knockout caracterizate prin
expresii antigenice similare cu cele din organismul uman(in special in cazul
testarii anticorpilor monoclonali).Acestea sunt utilizate si in cazul in care
tintele sunt exprimate doar in anumite afectiuni.
Selectarea dozei
Deosebit de importanta este : alegerea dozei potrivite(in special doza
maxima)si regimul de dozare , mai ales in cazul regimului multidoza;
Selectarea acesteia are in vedere efectul farmacologic maxim cat si doza
anticipata in studiile clinice;
Este de preferat stabilirea unei doze maxim tolerabila.Daca acest lucru nu
este posibil se practica utilizarea unor doze multiplu ale dozei clinice (de
exemplu x10), tinand cont ca ar putea exista diferente de interactiune
specifica intre animalele folosite in experimentele preclinice si subiectii
umani din experimentele clinice;
Factorul de siguranta ales depinde de caracterul afectiunii (cronica sau
acuta ) cat si de populatia careia i se poate adresa MD (ca de exemplu copii)
Principalele teste efectuate:
Profil farmacocinetic;
Profil farmacodinamic;
Studii de bioechivalenta si biodisponibilitate;
Toxicitate acuta;
Toxicitate cronica;
Mutagenicitate;
Carcinogenicitate;
Imunotoxicitate;
Toleranta locala
Studii farmacocinetice si farmacodinamice
Rezultatele studiilor farmacocinetice(absorbtie, distributie, metabolism si
excretie-ADME) efectuate pe animale de experienta ajuta la identificarea
unor eventuale efecte toxice dar si la gasirea celei mai potrivite cai de
administrare si a celui mai potrivit regim de administrare;
Studiile se efectueaza de regula pe doua specii de animale(soareci si
caini) la diferite doze terapeutice atat pe masculi cat si pe femele;
Daca in studiile clinice ce urmeaza, apar o serie de diferente fata de
modelul animal, studiile preclinice se repeta pe primate ;
In acelasi timp se fac si studii de biodisponibilitate(tinand cont ca
majoritatea BP sunt administrate pe cale parenterala biodisponibilitatea
este 100% in timp ce la administrarea orala este aprox 0.
Testele se complica la administrarea intranazala;
Se efectueaza si teste de bioechivalenta atunci cand cand se incearca
punerea in evidenta a eventualelor modificari ce ar putea sa apara prin
modificarea unui produs deja aprobat(regimul dozei , calea de
administrare , modificari in formulare);
Farmacocinetica proteinelor
Metoda de dozare folosita trebuie sa fie foarte sensibila dar si foarte
selectiva , tinand cont ca proteina aflata in studiu se gaseste de regula
intr-un mediu cu foarte multi alti constituenti de aceeasi natura(proteica) si
aflati in exces in fluidele biologice;
De aceea se folosec metode ce au la baza radiomarcarea proteinei de
interes sau metode cromatografice HPLC.
Masa moleculara mare si unele proprietati specifice (sarcina) reprezinta
obstacole in procesul de trecere prin membranele biologice din organism;
Distributia initiala este astfel limitata initial la volumul spatiului extracelular
pentru ca ulterior el sa crasca prin ajungerea la nivelul tesuturilor;
Metabolizarea are loc in conditii similare ca in cazul proteinelor endogene
prin:degradari proteolitice pana la nivel de secvente aminoacide , ce pot
sta la baza sintezei unor noi proteine sau degradate in continuare;
Acest proces este limitat in sange el fiind de fapt mult mai intens la nivel
intracelular.
Procesul de clearence al proteinelor terapeutice din fluxul sangvin incepe
in urma trecerii acestora prin endoteliul capilar, proces puternic influentat
de masa si sarcina;
Proteinele cu masa <30 kDa sunt eliminate de catre rinichi in urma
filtrarii glomerulare: prezenta glicoaminoglicanilor face ca filtrul
glomerular sa fie incarcat negativ , astfel ca unele proteine incarcate
negativ sunt slab filtrate datorita acestei repulsii;
Dupa aceasta filtrare multe proteine sunt reabsorbite prin endocitoza de
catre tubul proximal si supuse degradarii lizozomale , urmata de
reabsorbtia ulterioara a secventelor aminoacide ->cantitate mica de
proteine ajung in urina intacte;
Captarea biofarmaceuticelor de catre hepatocite :
Endocitoza mediata de receptori;
Pinocitoza neselectiva , urmata de proteoliza proteinei;
Procesele farmacocinetice dar si unele caracteristici farmacodinamice
pot fi influentate de prezenta unor factori , ca de exemplu : prezenta
proteinelor plasmatice , care in unele cazuri au rol de transportor natural
iar legarea de ele pot influenta o serie de caracteristici , ca de exemplu
eliminarea serica;
Imunogenicitatea proteinelor
Majoritatea proteinelor terapeutice au un potential imunogenic in cazul
administrarii la subiecti umani, fiind supuse actiunii anticorpilor care se
fixeaza de ele si le neutralizeaza activitatea;
In cazul medicamenteloca de sinteza chimica , datorita masei moleculare
mici acest fenomen este evitat;
Pe parcursul evolutiei unui organism , acesta manifesta toleranta la propriile
antigene ;
In aceste conditii ar fi de asteptat ca o proteina terapeutica , obtinuta fie prin
extractia directa de la sursa umana(preparatele pe baza de anticorpi) sau
prin tehnologia ce utilizeaza ADN recombinant(ce utizeaza secvente ce
apartin genomului uman ) sa fie neimunogenica prin administrarea la
subiecti umani;
Desi in general acest principu se pastreaza exista si cateva exceptii:
Diferente datorita unor modificari post-translationale ce apar in urma reactiei de
glicolizare(multe proteine sufera o serie de modificari ale legaturilor covalente
dupa asamblarea lor la nivelul ribozomilor):unele resturi de carbohidrati au un
caracter imunogenic;
Alterarea in timpul operatiei de pastrare(degradare partiala, denaturare, agregari
sau precipitari);
Unele moduri de administrare administarea s.c. poate initia un proces de
agregare ducand la un prelungire a duratei de existenta in prezenta celulelor
sistemului autoimun
Nivelul dozei terapeutice si durata tratamentului:administrarea unor doze mari;
Factori genetici si/sau imunologici-existenta unor anomalii imunologice in cazul unor
indivizi:cadere a tolerantei la self;
Chiar daca BP pot declansa un raspuns imun , acesta nu este semnificativ din punct
de vedere clinic;
Se studiaza astfel gasirea unor cai de protejare(cazul anticorpilor monoclonali-
atasarea covalenta de polietilenglicol PEG);
Este unanim recunoscut de catre comunitatea stiintifica ca modelul animal este in
general incapabil sa prezica imunogenicitatea produsului terapeutic in cazul
pacientilor umani;
Pentru ca pe viitor acest lucru sa poata avea loc se fac o serie de incercari:
Metode de studiu in silico in scopul prezicerii epitopilor celulelor B.Acest mod de abordare
are la baza studierea interactiunilor anticorp-antigen(potrivirea situsului de combinare al
moleculei anticorp cu epitopul specific) .Desi metodele sunt studiate frecvent, inca nu s-a
ajuns la rezultate spectaculoase;
Evaluarea raspunsului limfocitelor in prezenta unui antigen prin utilizarea testelor in vitro pe
linii de celule T umane;
Modificarea profilului farmacocinetic
Pentru a atinge un anumit obiectiv terapeutic este necesara uneori modificarea
profilului terapeutic prin:
Alterarea secventei aminoacide;
Modificari post translationale;
Atasarea unor grupari chimice pe lantul proteic;
Farmacodinamia
Desi pentru majoritatea proteinelor farmaceutice sunt cunoscute
caile de actiune, mecanismul molecular in detaliu al multor
medicamente din aceasta categorie este inca in curs de elucidare;
Proteinele terapeutice au mecanisme de actiune diferite:
Hormonii: se leaga de receptorii de suprafata si determina initierea unor
semnale intracelulare;
Anticorpii:majoritatea se leaga de moleculele tinta si pot activa/inactiva
distrugerea celulei tinta;in cazul in care acestia sunt folositi in diagnostic
ei pot marca anumite molecule sau celule tinta;
Studii de toxicitate
Se efectueaza pentru toate medicamentele noi , scopul lor fiind
stabilirea daca produsul testat manifesta toxicitate pe termen scurt
sau lung;
Toxicitatea acuta este determinata in regimul de administrare
unidoza pe rozatoare, astfel :
Administrarea unei doze mici si monitorizarea animalului 7-14 zile;
Calcularea dozei letale LD50; aceste studii necesita un numar mare de
animale , sunt de aceea scumpe si supuse in general atentiei gruparilor
de protejare a animalelor
Studiile de toxicitate cronica ,necesita de asemenea un
numar relativ mare de animale realizandu-se pe durate
de pana la doi ani;
Constau in administrarea zilnica a produsului testat:
Studii initiale cu durate de pana la 1-4 saptamani , pentru a evalua
nivelul necesar inducerii inui efect toxic observabil;
Studii toxice ce constau in administrarea medicamentului la trei doze
diferite(nivelul cel mai inalt al dozei ar trebui sa induca un usor efect
toxic , observabil in timp nivelul de jos nu trebuie sa induca un eventual
efect advers)
Testele sunt efectuate pe doua specii de animale diferite(sobolani si
caini), iar durata lor variaza de la o tara la alta(in SUA FDA recomanda
o durata de 2 ani, intimp ce in Europa se desfasoara pe 1 an).
Studiile de toxicitate efectuate pe proteinele terapeutice sunt mai
complicate decat ce efectuate pe medicamentele clasice , deoarece are
loc o stimulare a sistemului imunitar al animalelor testate;
Teste de mutagenicitate, carcinogenicitate
Mutagenicitate:urmaresc daca medicamentul testat este capabil sa
induca modificari ale ADN-ului atat prin inducerea unor alterari in structura
cromozomilor si/sau prin producerea unor modificari ale secventelor
nucleotidice.
Ele sunt necesare in special in cazul moleculelor de masa moleculara mica
, in cazul BP fiind orientate in special in directia testarii eventualilor
excipienti din produsul terapeutic.Ele se realizeaza de regula in vitro sau in
vivo si utilizeaza adesea organisme eukariote si prokariote;
Carcinogenicitate: se efectueaza in cazul in care indicatiile terapeutice
recomanda utilizarea MD pe termen lung sau daca existe motive de a
suspecta o serie de substante din substantele auxiliare existente in
formulare.
Se efectueaza prin administrarea MD la rozatoare si au o durata de pana
la 2 ani.
De asemenea se efectueaza si teste de imunotoxicitate.Chiar daca aceste
teste sunt aparent inutile in cazul BP , agentiile de reglementare
recomanda efectuarea lor, numai daca proteina terapeutica este capabila
sa induca un raspuns imun.