Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
OGM
Odata cu inceputul anilor 1970, o serie de tehnici de manipulare directa a genelor de catre
om permit extragerea unei gene din genomul unui organism si reimplantarea ei in genomul unui
alt organism, apartinand unei alte specii sau chiar altui regn, spre exemplu: o gena umana
transferata in genomul unei bacterii, unei plante sau unui animal, o gena bacteriana transferata in
genomul unei plante sau al unui animal s.a.m.d.
Acest transfer de gene este numit transgeneza, pentru ca el presupune traversarea
barierelor care, pana nu demult, impiedicau schimburile de gene intre specii diferite, mai ales
intre cele apartinand unor regnuri diferite. Gena care codifica un caracter pe care dorim sa il
transferam unui alt organism se numeste gena de interes, devenita in momentul transferului
efectiv transgena, iar organismul receptor va fi denumit organism transgenic.
OGM desemneaza, asadar, orice organism al carui patrimoniu genetic a fost modificat
prin mecanismele specifice . Practic, obtinerea unui OGM implica urmatoarele etape principale:
identificarea si pregatirea (multiplicarea) genei de interes;
introducerea ei (prin diversi vectori) in celula gazda;
selectarea celulelor gazda care au integrat transgena in genomul lor;
obtinerea, in cazul organismelor pluricelulare, a unui nou organism pornind de la o
singura celula transgenizata;
verificarea transmiterii ereditare a caracterului codat de transgena, la descendentii
organismului transgenic.
Cea mai utilizata tehnica pentru multiplicarea unei gene este cunoscuta tehnica PCR,
care porneste de la o solutie de nucleotide obtinuta dintr-o cantitate mica de ADN purificat
(continand gena de interes), in care se adauga ADN-polimeraza. Gena de interes trebuie sa fie
integrata intr-un vector molecular, caci singura un este capabila sa strabata membranele celulare.
Cei mai utilizati vectori sunt plasmidele si, mai rar, virusurile. Pentru selectarea celulelor care au
integrat in genomul lor gena de interes se introduce si o gena marker, a carei expresie fenotipica
este mai usor de verificat comparativ cu cea a genei de interes. Cele mai utilizate in acest sens
sunt genele care codifica rezistenta la un anumit antibiotic (genele Bla). Pentru ca transgena sa se
poate exprima in genomul celulei gazda, ea trebuie sa detina reglatori de expresie (promotor si
terminator) adaptati noului mediu genomic. In fapt, chiar daca codul genetic este universal,
expresia unei gene la un organism dat depinde de promotorul la care se asociaza.
Instrumentele care permit izolarea genei de interes, pornind de la ADN-ul donatorului,
deschiderea plasmidelor si atasarea genei de interes si a genei marker, apoi reinchiderea lor sunt
reprezentate de enzimele bacteriene numite endonucleaze de restrictie sau restrictaze. Acestea
taie molecula de ADN in portiunile pe care le recunosc, apoi ligazele favorizeaza sudarea
fragmentelor de ADN intre ele. Aceste enzime (deseori denumite si ,,foarfeci”, respectiv
,,cleiuri’’ moleculare) permit obtinerea unor noi molecule de ADN, denumit ADN-recombinant.
Pentru introducerea transgenelor in celule exista doua mari tipuri de metode: metode
indirecte, care fac apel la anumite bacterii capabile de a introduce, in mod natural, o parte din
ADN-ul lor in celule gazda si metode directe. Acestea din urma folosesc o serie de tehnici, cum
ar fi microinjectia celulara, electroperforarea membranelor celulare (prin socuri electrice care
produc micro-pori), biolistica (,,gene gun’’, utilizarea unui tun de gene, in care proiectilele sunt
micro particole de aur sau tungsten invelite de genele de interes).
In mod clasic, tehnica obtinerii unui animal transgenic presupune microinjectarea unei solutii
continand numeroase copii ale genei de interes intr-un ovocit, imediat dupa fecundare sa, ca si
transferul celulei ou in oviductul sau uterul unei femele receptive. Desi principiul metodei este
foarte simple, ea necesita numeroase incercari, deoarece rata reusitei este foarte scazuta: intre 10
si 15% pentru formarea embrionilor si intre 1-5% pentru obtinerea indivizilor.
Clonajul reproductive este o tehnica ce permite obtinerea nasterii unui organism nou, fara a face
apel la reproducerea sexuata. Individul clonat se naste dintr-un ovocit enucleate si nucleul unei
celule somatice. El presupune urmatoarele etape:
extragerea nucleului dintr-un ovocit matur;
activarea electrica a acestui ovocit;
punerea in contact a acestui ovocit cu celula somatica;
fuzionarea celor doua celule prin aplicarea de descarcari electrice;
cultivarea zigotului in vivo (in oviductul legat al unei femei, timp de 4-5 zile);
implantarea embrionului in uterul unei female receptoare.
Primele clonaje au fost realizate folosind drept celule somatice culele embrionare foarte tinere,
deci totipotente. Prin tratamente adaptate, cercetatorii au reusit sa restaureze totipotenta unor
celule pe cale de diferentiere, dar chiar si a unor celule adulte specializate. Asa este cazul
celulelor din glandele mamare ale unei oi gestante, care au permis clonarea lui Dolly (dupa 434
incercari de fuziune celulara nereusite). Animalele astfel obtinute poseda acelasi petrimoniu
genetic, dar ele nu sunt copii exacte ale animalului clonat datorita rolului pe care-l joaca
citoplasma ovocitului in dezvoltarea embrionului.
Tranferul nuclear
Transferul nuclear este o forma de clonare. Procedura de bază, prin care un nucleu celular viu
este transplantat la un ou sau ovocit, a fost stabilită de Briggs și King (1952). Ei au folosit Rana
pipiens și au aspirat o blastulă (a doua faza in dezvoltarea unui embrion) într-o micropipetă,
astfel încât peretele celular a fost rupt, dar nucleul a rămas intact și acoperit de citoplasmă.
Întreaga celulă a fost injectată într-un ou nefertilizat în a doua metafază meiotică (M2). Oul a
fost enucleat manual prin indepartarea axului metafazic cu cromozomi. Aceeasi procedura a fost
folosita si pentru ouale de Xenopus, cu exceptia faptul ca cromozomii au fost distrusi prin
iradiere cu ultraviolete. Dimensiunea mare a oului de la amfibieni si puterea scazuta de penetrare
a radiantii ultraviolete asigura ca nu se produc daune semnificative restului oului. Nucleul
donator poate fi introdus in oul enucleat cu o micropipeta avand loc fuziunea lor, in unele cazuri
aceasta fuziune se realizeaza prin aplicarea unui soc electric. Socul electric activeaza dezvoltarea
embrionara prin stimularea mobilizarii ionilor de calciu.
Principul acestui procesc este ca celulele somatice isi urmeaza ireversibil dezvoltarea normala in
timp ce nucleul care contine informatia genetica, in anumite circumstante, poate fi reprogramat
de catre citoplasma oului pentru a reincepe dezvoltarea. Transferul nuclear este folosit pentru a
genera animale clonate care au acelasi genotip prin transferul nucleilor somatici de la acelasi
individ in oua enucleate. Acesta tehnica permite animalelor care au calitati superioare sa fie
programate, cu implicatii evidente in agricultura.
Un progres major a fost realizat in 1995 cand s-au obtinut prin transfer nuclear din cultura de
celule embrionare 2 miei, Megan si Morgan.
Acelasi grup de cercetatori, a raportat nasterea oii Dolly (5 iulie 1996) in urma transferului
nuclear de la o linie de celule adulte din glanda mamara. Este primul animal obtinut prin transfer
nuclear plecand de la o celula adulta specializata. S-a sugerat ca pentru reusita experimentului
este necesar ca celulele din cultura sa fie intre stare de stagnare, astfel incat sa se realizeze o
sincronizare intre ciclurile celulare ale celulelor donatoare si cele receptoare. Producerea lui
Dolly a fost realizata prin scaderea nivelului de ser din cultura, cauzand stoparea ciclului celular
din cauza lipsei factorilor de crestere. Cu toate acestea, rata de succes a fost foarte scazuta, din
250 de transferuri doar unul produce un miel viabil, fenomen cauzat de lipsa de intelegere a
evenimentelor de reprogramare nucleara ca apar in urma transferului.
Dolly are trei ,,mame’’: una de la care a provenit oul, una de la care provine ADN-ul si cea care
a dus embrionul pana la termen. Producerea lui Dolly a demonstrate genele din nucleul unei
celule somatice mature diferantiate au capacitatea de a reveni la statiul embrionar totiponet,
rezultand celule nespecializate. Dolly a produs 6 miei in total, Bonnie nascut in 1998, gemenii
Sally si Rosie in 1999 si tripletii Lucy, Darcy si Cotton in 2000. Dolly a fost eutanasiata in 14
februarie 2003 deoarece suferea de o boala pulmonara si artrita severa. Prima clonare de succes a
unei specii de primate folosind aceeași metodă pentru producerea Dolly a fost raportată în
ianuarie 2018. Două clone identice ale unei maimuțe macaque, Zhong Zhong și Hua Hua, au fost
create de cercetătorii din China și s-au născut la sfârșitul anului 2017.
În ianuarie 2019, oamenii de știință din China au raportat crearea a cinci maimuțe clonate
identice, editate de gene, folosind aceeași tehnică de clonare folosită cu Zhong Zhong și Hua
Hua - primele maimuțe clonate vreodată - și Dolly oaia, și aceeași genă - editarea tehnicii Crispr-
Cas9, presupusă folosită de He Jiankui în crearea primilor copii umani modificați de gene Lulu și
Nana. Clonele maimuței au fost făcute pentru a studia mai multe boli medicale. [44] [45]