Tehnica ADN-ului recombinant

Modelarea genomului unui organism vegetal, prin introducerea uneia sau mai multor
gene străine este posibilă cu ajutorul unui complex de metode, care aparţin ingineriei
genetice şi au ca rezultat transformarea genetică a plantelor sau, altfel spus,
obţinerea plantelor transgenice

Aspectele practice ale tehnologiei ADN- ului recombinant reprezintă o etapă nouă în
cercetare, cea de “hibridare moleculară”, prin care sursele materialului genetic
transferat sunt nelimitate, depăşind cu mult posibilităţile oferite de hibridarea sexuată
sau somatică.

Transformarea genetică a plantelor presupune o serie de tehnici ale biologiei

moleculare, care vizează izolarea genelor, utilizarea unor vectori, caracterizarea
moleculară a plantelor transformate

Plantele transgenice sunt obţinute în urma experimentelor „in vitro” de transfer de

material genetic exogen: la nivelul lor se integrează în mod stabil secvenţe de ADN
provenite de la alte organisme, care le conferă anumite însuşi fenotipice noi sau
modificate.

Transferul de gene la plante a devenit posibil datorită descoperirii şi a utilizării

sistemului de transformare genetică prin intermediul bacteriilor din genul
Agrobacterium (A. tumefaciens şi A. rhizogenes).

Rezultatele cercetărilor din domeniul geneticii vegetale, se bazeaza în primul rând pe

folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens.
 Particularităţile bacteriilor din genul Agrobacterium

A.tumefaciens şi A.rhizogenes sunt bacterii ce trăiesc în sol, ele fiind capabile de a

produce boli unor specii de plante dicotiledonate şi gimnosperme. S-a dovedit că
A.tumefaciens determină apariţia unor tumori de tip "crown gall" pe tulpinile rănite ale
unor plante (în special la nivelul coletului), în timp ce A.rhizogenes induce formarea
de rădăcini adventive (de tip "hairy") la nivelul ţesuturilor vegetale rănite.

Modificările morfogenetice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de

A.tumefaciens sau A.rhizogenes se datorează transferului unor gene de origine
bacteriană în celulele vegetale.

Bacteriile din genul Agrobacterium prezintă un sistem genetic organizat care permite
introducerea de gene noi în celula vegetală, graţie prezenţei în celula lor a unei
plasmide Ti ("tumor inducing") sau Ri ("root inducing"), ce reprezintă factorul
determinant al producerii tumorilor, respectiv rădăcinilor anormale, la plante.

Transferul unei porţiuni din aceste plasmide în genomul celulei vegetale determină
modificări funcţionale, ce se concretizează prin apariţia fenomenului tumoral. Aceste
plasmide constituie, aşadar, un sistem organizat şi complex de transfer de informaţie
genetică naturală în celula vegetală.
În principiu, plasmidul Ti (un mic fragment circular de ADN necromosomal cu
replicare independentă faţă de cea a cromosomului) conţine mai multe regiuni, cu
funcţii distincte:
regiunea T-ADN (conţinând genele de tumorigeneză),
regiunea de virulenţă (genele vir), ambele fiind cele mai importante pentru procesul
de transformare a celulelor vegetale.
 Regiunea de virulenţă cuprinde gene esenţiale pentru transferul de ADN bacterian
în celulele vegetale, fără a fi însă ele însele transferate. Regiunea vir cuprinde un
segment de aproximativ 30-40 kb (în funcţie de tulpina bacteriană), fiind formată din
mai mult de 20 gene organizate în cel puţin 6 unităţi transcripţionale (operoni): virA (o
genă), virB (11 gene), virC (2 gene), virD (4 gene), virE (2 gene) şi virG (o genă).
Dintre aceste unităţi transcripţionale, virA, virB, virD şi virG sunt esenţiale pentru
transferul ADN-T, iar virC şi virE asigură o creştere a eficienţei transferului. Toţi aceşti
operoni sunt induşi în prezenţa celulelor vegetale rănite (care produc o serie de
compuşi fenolici cu rol inductor), funcţiile lor fiind următoarele:

• virA şi virG codifică proteine responsabile de recunoaşterea celulelor vegetale rănite

şi de inducerea celorlalte funcţii vir;

• - virC şi vir D codifică proteine ce asigură formarea unei copii de ADN-T

monocatenar, transferabil în celula vegetală;

• - virD şi virE codifică proteine ce formează un complex împreună cu ADN-T

ghidându-l spre nucleul celulei vegetale; ele se pare că sunt implicate şi în procesul
de integrare al ADN-T în genomul noii gazde;

• - virB codifică proteine care răspund de transportul complexului ADN-T-proteine prin

membrana plasmatică bacteriană.
 Exprimarea genelor localizate în regiunea de virulenţă a plasmidelor Ti este
inductibilă, fiind reglată de acţiunea unor factori din exterior. Experimental s-a
demonstrat că, sub acţiunea unor molecule semnal din exudatele plantelor sau la
nivelul rănilor produse la plante, are loc o puternică activare a acestor gene. Aceste
molecule semnal sunt compuşi fenolici, de tipul acetosiringonei sau a α-
hidroxiacetosiringonei.
Regiunea T-ADN reprezintă o porţiune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferată
în celula vegetală, integrându-se stabil în genomul celular. Această regiune T-ADN(de
la ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (în funcţie de tulpina bacteriană
gazdă) şi conţine toate genele (oncogenele) care transferate în celula vegetală vor
determina fenotipul caracteristic al celulelor transformate. Genele localizate pe T-
ADN determină două proprietăţi caracteristice pentru celulele vegetale tumorale:
creşterea pe medii de cultură în absenţa fitohormonilor; sinteza şi secreţia de opine,
substanţe specifice pentru aceste tipuri de celule.
• Nester şi colab. (1984) au reuşit identificarea şi cartarea a opt gene aflate la nivelul
T-ADN : gene implicate în codificarea sintezei de auxine, de citochinine, de opine.
• De remarcat că, T-ADN conţinut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte
secvenţe de nucleotide, de aproximativ 25 pb, repetate direct, esenţiale pentru
procesul de transfer în celulele vegetale. Analiza acestor secvenţe terminale a arătat
că acestea sunt conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium, ele fiind
recunoscute de echipamentul enzimatic implicat în transferul ADN-T din celula
bacteriană în celula vegetală.

• În cazul plasmidelor Ri, analiza regiunii T-ADN a dovedit că aceasta conţine o serie
de gene, responsabile de fenotipul de tip "hairy" al ţesuturilor vegetale transformate.

• De remarcat că, genele ce se transferă în celulele vegetale sunt grupate la marginile

regiunii T-ADN. Astfel, în partea stângă a T-ADN sunt localizate genele rolA, B, C şi D
care sensibilizează celulele vegetale la acţiunea auxinelor. S-a dovedit că, la anumite
specii vegetale, simpla prezenţă a genelor rol, chiar în absenţa celorlalte gene din
ADN-T, determină apariţia fenotipului caracteristic ("hairy root").
 Mecanismul transferului T-ADN în celula vegetală

Mecanismul mobilizării şi transferului T-ADN din celula bacteriană în celula vegetală

a fost intens studiat în ultimii ani fiind clarificate multe dintre etapele acestui proces.

Primele etape ale interacţiunii dintre plante şi celulele de Agrobacterium sunt

următoarele:

• -celulele vegetale rănite eliberează o serie de compuşi fenolici (cum este

acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic),
care servesc drept chemoatractanţi pentru agrobacterii;
• - recunoaşterea celulelor rănite şi ataşarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a
exprimării constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare
bacteriană;
• - inducerea funcţiilor vir plasmidiale şi începerea procesului de transfer al T-ADN

• Procesul de transfer al T-ADN poate fi împărţit în două etape: una ce se desfăşoară

în celula bacteriană şi o alta ce are loc în celula vegetală
 Etapa bacteriană include toate evenimentele ce conduc la producerea şi exportul T-
ADN, începând cu activarea funcţiilor vir plasmidiale de către compuşii fenolici sau
glucidici eliberaţi din celulele vegetale rănite.

• Primele gene vir ce intră în acţiune sunt cele din operonii virA şi virG, fiind sintetizate
proteinele corespunzătoare, VirA şi VirG.

• Se pare că proteina VirA este produsă într-o formă inactivă ce este activată
(fosforilată) de inductorii vegetali (compuşii fenolici sau glucidici).

• La rândul său, proteina VirG este activată (fosforilată) de proteina VirA. Cele două
proteine interacţionează şi determină activarea celorlalţi operoni vir (virB, virC, virD,
virE).
• In esenţă, pentru ca T-ADN să fie transferat este necesară prezenţa secvenţelor
marginale de 25 pb (notate de obicei TL sau TR) şi, cel puţin în cazul unor anumite
plasmide Ti, existenţa unui element suplimentar localizat în afara T-ADN (în partea
dreaptă). Acest element stimulează procesul de transformare (are funcţie de
"enhancer").
• Excizia T-ADN este iniţiată de acţiunea combinată a proteinelor VirD1 şi VirD2,
codificate de operonul virD precum şi a proteinelor VirC1 şi VirC2, codificate de
operonul virC .
• Dintre aceste proteine, rolul cel mai important îl are proteina VirD2 care este o
endonuclează de restricţie (situs-specifică). Ea recunoaşte marginile T-ADN şi le
clivează (de obicei are loc mai întâi secţionarea uneia dintre catenele T-ADN la
nivelul marginii din dreapta) generând un segment de ADN monocatenar lung de
aproximativ 20kb, simultan având loc sinteza catenei lipsă.
• Proteina VirD2 rămâne ataşată la nivelul capătului 5' al T-ADN monocatenar
protejându-l, probabil, de acţiunea exonucleazelor. De asemenea, la T-ADN se
ataşează proteina VirE2), care nu numai că protejează segmentul monocatenar ci îl
şi converteşte la o formă corespunzătoare pentru transport
• Pentru a ajunge în nucleul celulei vegetale, complexul T-ADN-proteine trebuie să
traverseze cinci bariere majore: membrana plasmatică şi spaţiul periplasmic
bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale şi membrana
nucleară. In etapa transportului prin membrana plasmatică bacteriană sunt implicate
cele 11 gene ale operonului virB dar mecanismul exact al acestui proces nu este încă
elucidat. Rolul proteinelor este complex: pe de o parte, protejează T-ADN de atacul
exonucleazelor şi asigură transportul într-o formă corespunzătoare.

• Se pare că proteina bacteriană virE2 însoţeşte complexul virD2-T-ADN. La procesul

de translocare ar mai participa şi proteinele codificate de operonii suplimentari virF şi
virH al căror rol ar fi legat de direcţionarea complexului T-ADN spre nucleul celulei
vegetale şi de specificitatea de gazdă a tulpinilor bacteriene implicate în procesul de
transfer de ADN.

• Se consideră doar că, odată pătruns în citoplasma celulelor vegetale, complexul T

(ADN şi proteine) este preluat de proteinele vegetale şi transportat în nucleu, unde T-
ADN este integrat în genom
Tehnicile de transformare genetică cuprind mai multe etape:
1. Identificarea şi clonarea secvenţei codante a genei de interes de la un alt organism (
virus, bacterie, drojdie, plantă, celulă animală sau umană ). Metodele clasice se
bazează pe două strategii:
a. Fragmentarea ADN ului nuclear sau extranuclear cu ajutorul enzimelor de restricţie,
localizarea secvenţei de interes şi excizia ei din genom.
b. Identificarea ARN ului mesager specific pentru proteina de interes şi obţinerea unei
molecule de ADNc prin reverstranscripţie.

2. Realizarea unui construct genetic, care poate conţine gene marker de selecţie sau
gene raportoare.
3. Transferul genei în celula vegetală, prin metode directe sau indirecte de transfer.
4. Regenerarea plantelor transformate.
5. Multiplicarea şi analiza plantelor transgenice.
 Transgeneza indirectă
Vectori de clonare pentru celula vegetală
Pentru realizarea transferului eficient de gene în celulele vegetale ţintă au fost
construiţi vectori de clonare specifici, de obicei derivaţi de la plasmidele Ti sau Ri sau
de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale.
Vectori plasmidiali
• Sistemul natural de transfer descris mai sus este impropriu pentru a fi utilizat, ca
atare, în scopul ameliorării plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost
modificate drastic, prin eliminarea genelor ce determină producerea tumorilor, prin
menţinerea şi clonarea în alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale şi a
unor promotori ce sunt recunoscuţi de echipamentul de transcriere al celulelor
vegetale. De asemenea, între extremităţile T-ADN prelucrat, au fost introduse gene
marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunzători,
obţinându-se vectori de clonare foarte eficienţi.
• Pornindu-se de la constatarea că, pentru a se realiza transferul de material genetic în
celula vegetală este suficient să existe extremităţile de 25 pb ale T-ADN, au fost
făcute diferite încercări de înlocuire a genelor din interiorul T-ADN cu alte gene, de
provenienţă străină.
Vectori virali
• În ultimii ani, pentru obţinerea de plante transgenice au fost testaţi şi vectori derivaţi
de la diferite virusuri specifice plantelor. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se
numără: virusul mozaicului conopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV),
virusul piticismului la grâu (WDV), virusul mozaicului galben al tomatelor (TGMV).
Vector plasmidial
 Transgeneza directă
• Metoda chimică- se bazează pe utilizarea unor substanţe ca: poliaminele (
poliornitina, polilisina), dextran sulfatul, polietilenglicolul, care stimulează preluarea
ADN-ului de către protoplaşti. Principalul dezavantaj al acestei metode este efectul
toxic al acestor substanţe, reflectat în reducerea viabilităţii protoplaştilor.
• Electroporarea- este o metodă fizică care permite introducerea genelor în protoplaşti,
prin utilizarea unui câmp electric. Protoplaştii vegetali sunt suspendaţi într-o soluţie
ionică, ce conţine ADN. Aplicarea unor pulsuri de intensitate mare, prin intermediul
electrozilor produce o permeabilizare a plasmalemei, permiţând astfel pătrunderea
ADN-ului în celulă. Este o metodă frecvent utilizată în obţinerea plantelor transgenice
la cereale.
• Microinjecţiile cu ajutorul unor micropipete prin care ADN-ul este injectat direct în
protoplaşti sau celule, imobilizate pe un suport solid de agaroză.
• Bombardamentul cu microparticule- constă în utilizarea unor particule microscopice
de aur (microcarrieri) (1-3 μm), purtători ai fragmentelor de ADN. Particulele pătrund
prin peretele celulelor explantului eliberând ADN-ul care asigură transformarea
genetică a celulelor. Eficienţa acestei metode decurge din faptul că ţinta
bombardamentului cu microparticule o constituie explantele de tipul seminţelor,
embrionilor sau meristemelor.
Plantele transgenice de Triticum aestivum, Oryza sativa, Zea mays au fost obţinute
prin utilizarea acestei metode.
Electrofuziunea
 Markeri genetici pentru selecţia şi caracterizarea celulelor vegetale transformate
Pentru a se putea evalua rapid transferul şi, mai ales, integrarea genelor clonate în
celulele vegetale, este absolut necesar ca, odată cu gena de interes, în celulele
vegetale să se integreze şi anumite gene marker specifice. In prezent, genele
utilizate drept markeri pentru celulele vegetale transformate sunt de două tipuri:
markeri de selecţie care asigură doar diferenţierea între celulele vegetale normale şi
cele modificate genetic şi markeri cuantificabili (gene raportoare) care permit şi
determinarea nivelului exprimării genelor clonate.
Dintre cele mai utilizate gene marker de selecţie pentru celulele vegetale
transformate menţionăm:
• gena pentru neomicin fosfotransferază (gena nptII ce determină rezistenţă la
kanamicină,
• gena pentru cloramfenicol-acetiltransferază (gena cat ce conferă rezistenţă la
cloramfenicol);
• gene care conferă rezistenţa la erbicide: gena bar, izolată de la bacteria
Streptomyces hygroscopicus şi gena pat, izolată de la S. viridochromogenes, ambele
codifică enzima fosfinotricinacetiltransferaza.

Gene raportoare :
• gena pentru luciferază (gena luc ce determină sinteza luciferazei care, în prezenţa
substratului specific, luciferina, produce lumină; plantele transgenice ce conţin o
asemenea genă au primit denumirea de plante "lampion"); gena pentru β-
glucuronidaza bacteriană (gena gus); gena pentru proteina cu fluorescenţă verde
(gena gfp = "green fluorescence protein").
Selecţia celulelor vegetale transformate se poate realiza, fie prin cultivarea acestora
pe medii de cultură specifice ce conţin antibioticele corespunzătoare (kanamicină,
cloramfenicol, higromicină), prin teste histochimice aplicate celulelor vegetale (pentru
evidenţierea produsului genei luc) sau prin teste fluorimetrice (pentru produsul
genelor gus sau gfp).