VALORIFICAREA METABOLIȚILOR SECUNDARI PRIN METODE ”IN VITRO”

Plantele - sintetizează nu numai compuşii de bază necesari supravieţuirii lor

(hidraţilor de carbon, proteine, lipide), ci şi o gamă largă de substanţe organice care
pot fi extrase în cantităţi suficiente = METABOLIŢI SECUNDARI

Regnul vegetal reprezintă principalul furnizor de compuşi fitochimici utilizaţi în

diferite ramuri industriale cum sunt cele ale produselor farmaceutice, alimentare,
cosmetice, agrochimice, cu valori comerciale exprimate în miliarde de dolari.
• Clasificarea substanţelor din plante:

1. substanţe fundamentale (primare):

rezultă direct din fotosinteză, joacă un rol primordial în viaţa plantelor:

– subtanţele de rezervă,
– substanţele energetice glucide, protide, lipide
– substanţele din structura (prezente în toate plantele)
membranei celulare.

2. substanţe secundare = specifice regnului vegetal.

- heterozide (tioglicozide, saponozide, flavonozide, antraglicozide)

- uleiuri volatile,
- alcaloizi,
-antibiotice,
- taninuri
 • Substanţele secundare

 reprezintă compuşi "cap de serie" (nu mai suferă degradări ulterioare şi se acumulează în
planta întreagă sau în anumite organe)

 sunt sintetizati in cantitate mica de celule specializate ale unor organe vegetale =extractia
lor – dificila si scumpa

 majoritatea principiilor active = substanţe secundare

 de multe ori = caracteristice unui grup de plante sau numai unei anumite specii

 reprezinta criterii de identificare a diferitilor chemotaxoni

 Dezavantajele valorificarii plantelor din flora spontană:

Randamentul la recoltare poate fi redus din cauza densităţii scăzute a

plantelor în diverse bazine naturale;

Anumite specii cresc pe terenuri greu accesibile → dificilă recoltarea lor;

Cantităţile de material biologic furnizate de flora spontană sunt influenţate de

condiţiile climatice, fiind deci necontrolabile, nesigure;

Recoltarea neraţională a unor specii, mai ales a celor cu înmulţire vegetativă,

poate conduce la epuizarea bazinelor lor naturale şi chiar la punerea în pericol
a existenţei lor în flora spontană etc.
 Dezavantajele valorificarii plantelor
medicinale si aromatice din cultura

nu toate plantele medicinale pot fi introduse din flora spontană în cultură;

numărul de plante medicinale cultivate este mult mai mic decât al celor solicitate pe
piaţa de profil;

trecerea în cultură a unor plante medicinale se soldează uneori cu pierderea sau

reducerea capacităţii de biosinteză a principiilor active specifice, ceea ce impune
eforturi serioase de ameliorare a lor;

monocultura - proliferarea unor boli şi dăunători specifici, ceea ce impune folosirea

de pesticide etc, contraindicate pentru obţinerea unui drog de calitate;
Importanta compusilor bioactivi identificati in plantele medicinale si aromatice a
impus dezvoltarea unor metode neconventionale de obtinere a acestora:

Cultura in vitro de celule vegetale (cultura de calus)

 Cultura celulelor vegetale in bioreactoare similar cu
microorganismele
 Cultura in vitro de radacini firoase
 Biotransformarea
 Imobilizarea celulelor vegetale pe substraturi solide

Progresele înregistrate în domeniul biologiei moleculare şi al manipulărilor

genetice oferă perspective promiţătoare pentru intensificarea biosintezei unor
compuşi secundari, acţionând la nivelul genelor reglatoare.

Prin sporirea numărului de copii ale acestora sau prin ataşarea genelor respective la un
promotor cu capacitate superioară de expresie, se poate realiza intensificarea activităţii
enzimelor implicate în procesul biosintetic (M. HOLDEN, 1989).
 I. Obţinerea compuşilor bioactivi în culturi de celule în suspensie

 În 1952 J.B. ROUTIEN şi L.G. NICKEL au obţinut brevetul "Cultivarea celulelor

vegetale" demonstrând că celulele vegetale pot să crească în medii lichide şi pot fi
utilizate pentru obţinerea de compuşi chimici utili.

 30 de ani mai târziu -Y. FUJITA şi colab. au raportat producerea primului produs
natural la scară comercială - shikoninul din culturi celulare de Lithospernum
erythrorhizon.

În ultimii ani numeroase cercetări au fost dedicate producerii de compuşi utili
prin culturi de ţesuturi vegetale

 Sinteza lor nu constituie o parte indispensabilă a programului expresiei genice şi

dezvoltării, aceasta poate fi modelată atât prin:
- modificări ale materialului genetic
- modificări ale mediului
- utilizarea unor substanţe cu rol de semnal
pentru declanşarea căii biosintetice respective (M. LUCKNER, 1982; K. LINDSAY şi
M.G.K. JONES, 1989).
 Etapele tehnologiei de producere a metaboliţilor secundari prin cultura în
suspensie a celulelor vegetale

1.Obţinerea inoculului de calus pentru cultura în suspensie

2. Cultivarea calusului în mediu lichid pe agitator şi stimularea capacitatii

biosintetice pentru metabolitul dorit

- Inoculul - să fie constituit din celule libere (neagregate), pentru asigurarea nutriţiei,
creşterii şi multiplicarii lor normale;

- sincronizarea fazelor lor de diviziune, proces asigurat prin tratamentul lor cu o

serie de substanţe (5-aminouracil, hidroxiluree, fluordezoxiuridină etc)

-asigurarea unei densitati optime a celulelor după inoculare, (cca 0,5 - 2,5 x 105
celule/ml de mediu nutritiv.

- stimularea capacitatii biosintetice prin adaugarea in mediul nutritiv a unor elicitori

sau a precursorilor necesari biosintezei

3. Selecţia liniilor celulare stabile genetic şi cu capacitate biosintetică ridicată în

anumite principii active
Impedimente

Variabilitate genetică a celulele nediferenţiate cultivate in vitro

(variaţie somaclonlă)
în privinţa biosintezei

nu toate
sintetizează le produc Ori sintetizează
principiile active în cantităţi alte substanţe
decât cele de
specifice unei mici
plante întregi interes
Exemplu

458 clone
Catharanthus Toate celulele unei plante ce produce
roseus
un compus farmaceutic posedă aceeaşi
informaţie genetică, numai că la unele
dintre ele aceasta este parţial sau total
represată.

146 clone nu 312 capacitate

produceau de sinteză între
0,1 şi 1,5 % din
alcaloizi
s. u. Prezenţa inductorului specific este
probabil legată de un anumit angrenaj
metabolic, care se realizează într-o anumită
etapă a creşterii şi dezvoltării plantei şi care
depinde totodată de condiţiile de mediu
oferit.
alcaloizii
sintetizaţi în
culturile in vitro nu
fuseseră semnalaţi
în planta iniţială
Capacitatea de biosinteză a unui calus variaza functie de originea lui, de tipul si concentratia
regulatorilor de creştere folosiţi, în mediul de cultură, de compoziţia mediului nutritiv.

In culturile de celule în suspensie la C. roseus

scoaterea din mediul nutritiv a 2,4-D a asigurat o
intensificare de 5 ori a sintezei de ajmalicină

In culturile de Nicotina tabacum diminuarea

concentraţiei de fosfat a determinat o creştere a
productivităţii lor în cinamoil-putresceine de 3 ori

Mărirea cantităţii de zaharoză în culturile de Eschscholtzia

californica a asigurat o productivitate a celulelor de 10 ori
mai mare în benzofenantridine

Suplimentarea mediului nutritiv cu CaSO4 în culturile în suspensie de

Peganum harmala a sporit producţia de alcaloizi  -carbolinici de 8 ori.
4. Transferul celulelor vegetale selectate în bioreactor
(tip Airlift – cu bule de aer)

în sistem deschis
în sistem închis  se intervine în proces prin
scoaterea la anumite intervale
 situaţie în care nu se de timp a unei cantităţi de
intervine pe parcursul mediu + celule din bioreactor şi
procesului, introducerea unei cantităţi
echivalente de mediu proaspăt.
volumul de mediu nutritiv
este fix, iar creşterea şi  permite reglarea creşterii şi
multiplicarea celulelor multiplicării celulelor, a
încetează odată cu metabolismului celular şi a
epuizarea mediului în nivelului de sinteză a unor
nutrienţi; metaboliţi secundari

Ciclul de cultivare al celulelor

- durează, funcţie de specie, 10-28 de zile.

- la fiecare 24-72 de ore se dublează numărul de celule.

-faţă de microorganisme necesită mai puţin oxigen

Suspensiile celulare vegetale produc metaboliţi secundari după mai multe modele:

Sinteza şi acumularea are loc

paralel cu creşterea şi
nicotina, alcaloizii tropanici,
multiplicarea activă a celulelor. antrachinonele de tip morindin

Sinteza metaboliţilor se sinteza

produce în faza de declin sau polifenolilor
de încetare a creşterii

Curba de sinteză este diafazică,

creşterea celulelor precedând sinteza de diosgenină
sinteza metaboliţilor secundari
Rezultate privind conţinutul unor substanţe biologic active în
planta intactă şi în cultura de celule în suspensie

Conţinutul produsului integral,

Substanţa % din substanţa uscată
Planta
(produs integral)
culturi celule plantă intactă

Ajmalicină Catharanthus roseus 1,0 0,3

Antrachinonă Morinda citrifolia 18,0 2,2
Visnagină Ammi visnaga 0,31 0,1
Ginsengozidă Panax ginseng 27,0 4,5
Glutation Nicotiana tabacum 1,0 0,1
Diosgenină Dioscorea deltoidea 2,0 2,0
Cofeină Coffea arabica 1,6 1,6
Acid rozmarinic Coleus blumei
15,0 3,0

Serpentină Catharanthus roseus 0,8 0,5

Ubichinonă – Nicotiana tabacum
0,036 0,003
10
shikonină Lithospermum erythrouhizon
12,0 1,5