OBŢINEREA METABOLIŢILOR SECUNDARI PRIN

METODA CULTURILOR “IN VITRO “

Initierea culturilor submerse (suspensii celulare)
• Exploatarea chimico-farmaceutică a plantelor, prin aplicarea tehnicilor de cultivare “in vitro”,
asigură obţinerea la scară industrială a unor compuşi utili în industria alimentară (coloranţi,
indulcitori), chimică, farmaceutică (alcaloizi, glicozide cardiotonice.steroizi), cosmetică (pigmenţi,
uleiuri eterice).
• Metoda cultivării “in vitro”s-a diversificat şi a cunoscut o amplă dezvoltare, fiind aplicată
preponderent la plantele medicinale. Japonia şi Germania sunt cele mai implicate ţări în
dezvoltarea acestor biotehnologii.
• Acumularea biomasei vegetale “in vitro”, pe baza căreia sunt extraşi metaboliţii secundari, este
rezultatul multiplicării celulelor; cinetica multiplicării populaţiilor celulare presupune derularea
aceloraşi faze ca şi în cazul populaţiilor bacteriene.
• Cultivarea în regim industrial a celulelor vegetale, ca şi în cazul culturilor microbiene, se bazează
pe utilizarea unor sisteme de cultivare discontinue (mediul de cultură nu este reînnoit) sau
continue ( mediul de cultură se reînnoieşte continuu).
• Culturile discontinue sunt sisteme închise (batch-culture) de cultivare, în care multiplicarea
celulară se desfăşoară într.un volum fix de mediu. Într-un astfel de sistem, creşterea este limitată
la un volum fix de mediu, acumularea produşilor de metabolism putând deveni nefavorabilă
acestui proces.
• Rata de creştere a celulelor în unitatea de volum (r) este diferită în dinamica multiplicării
populaţiilor celulare ( aza de latenţă sau lag, faza de accelerare, faza de creştere exponenţială,
faza de încetinire, faza staţionară, faza de declin).
Dinamica multiplicarii celulelor in culturi submerse
• Faza de latenţă sau de lag ( engl. to lag = a întârzia ) sau de creştere 0 este cuprinsă între
momentul introducerii celulelor în mediu (momentul inoculării) şi momentul când acestea încep să
se multiplice. În cursul acestei faze, numărul celulelor din inocul rămâne neschimbat.

• Faza de multiplicare exponenţială sau de creştere logaritmică apare după o scurtă perioadă
de accelerare a ritmului de creştere, în care multiplicarea se produce cu o viteză progresiv mărită
şi se caracterizează prin ritm constant şi maxim ( r = maxim). Fiecare celulă se divide pentru a
forma două celule surori, fiecare, la rândul său se divide şi produce alte două celule noi, deci în
momentul fiecărei diviziuni populaţia se dublează.

• Faza de încetinire sau faza lineară corespunde perioadei în care concentraţia factorului limitant
al creşterii scade sub nivelul care asigură creşterea maximă. Orice factor a cărui lipsă din mediu
opreşte creşterea devine un dfactor limitant. Creşterea lineară este limitată şi este direct
proporţională cu timpul, adică aritmetică.

• Faza staţionară urmează perioadei de încetinire a ritmului de creştere, în care multiplicarea nu se

mai produce în progresie geometrică, ci într-un ritm care scade progresiv. În condiţiile în care
nutrienţii nu sunt reînnoiţi, rata de creştere scade progresiv, până când încetează complet, ca
urmare a epuizării nutrienţilor cât şi a acumulării produşilor toxici. În faza staţionară, rata de
creştere este 0, numărul celulelor viabile este maxim şi rămâne constant o perioadă de timp, a
cărei durată variază, funcţie de natura factorilor care limitează creşterea.
• Faza de declin şi moarte celulară se instalează atunci când populaţia celulară
descreşte numeric. Producerea metaboliţilor secundari în culturile celulare este în
strânsă dependenţă de utilizarea unui substrat nutritiv adecvat.

În consecinţă, cultivarea celulelor pe medii speciale, care asigură condiţii optime de

creştere permite producerea metaboliţilor secundari , de obicei în faza staţionară, când
mediul este sărăcit în componenţii lui nutriţionali.

Din aceste considerente, se practică sistemul culturilor duble: care presupune într-o primă
etapă producerea de biomasă într-un mediu adecvat pentru proliferarea celulelor (mediul
de creştere), iar în a doua etapă, transferarea celulelor pe un alt mediu, cel de biosinteză.

Zenk şi colaboratorii (1977) au iniţiat sistemul culturilor în două trepte, obţinând alcaloizi
indolici în suspensii celulare de Catharanthus roseus.
Aceeaşi strategie a fost utilizată mai târziu de Fujita (1982) în scopul obţinerii la scară
industrială a shikoninei, în suspensii celulare de Lythospermum erythrorhizon.

Cele mai frecvente modificări ale compoziţiei mediului de cultură în scopul biosintezei
metaboliţilor secundari sunt:
• 1.Reducerea sau eliminarea acidului 2,4 D (acidul 2,4- diclorfenoxiacetic) sau a altor
fitohormoni; nivelul ridicat al auxinelor din me-diul de cultură stimulează proliferarea
celulară, dar afectează biosinteza metaboliţilor secundari, de aceea auxinele sunt
adăugate în mediul de creştere, dar lipsesc din mediul de biosinteză;
• 2. Reducerea cantităţii de fosfaţi.
• 3. Creşterea cantităţii de zaharoză sau a altor carbohidraţi.
• În alte cazuri este posibilă utilizarea aceluiaşi mediu, atât pentru acumularea de biomasă, cât şi
pentru inducerea biosintezei. De exemplu, utilizarea mediului bazal MS cu o concentraţie ridicată
de zaharoză a permis atât multiplicarea celulară, cât şi biosinteza alcaloizilor în suspensii celulare
de Catharanthus roseus.

• Comparativ cu metoda tradiţională, care are la bază extracţia compuşilor utili din plantele de
cultură, metoda culturilor “in vitro” oferă posibilitatea obţinerii unor produşi naturali noi, pe care
planta întreagă nu-i sintetizează. De pildă, compusul rutacultin este obţinut exclusiv în culturile
celulare de Ruta graveolens , iar compusul tarenosid este sintetizat doar în culturile celulare de
Gardenia jasminoides. Condiţiile “in vitro” pot fi foarte diverse, astfel încât celulele pot să-şi
exprime un potenţial biosintetic inedit, pe care planta întreagă nu şi-l exprimă în condiţiile
ecologice normale.

• Un alt aspect, care conferă acestei metode neconvenţionale de valorificare a principiilor active un
avantaj în plus este posibilitatea obţinerii "in vitro"a unor compuşi naturali, în cantităţi mult mai
mari decât prin metodele clasice.
• Primele culturi celulare cu un înalt potenţial de biosinteză a metaboliţilor secundari au fost
obţinute la Daucus carota, caracterizată prin producerea de antociani , Beta vulgaris,
caracterizate prin productivitatea ridicată în betalaine, Morinda citrifolia, care produce
antrachinone. În cazul speciei Morinda citrifolia, productivitatea calusului în antrachinone este
superioară, (de peste 20 de ori) celei pe care o etalează rădăcina plantei intacte., S-a reuşit să se
izoleze mai multe linii celulare de Catharanthus roseus înalt producătoare de serpentină şi
ajmalicină, alcaloizii de bază pe care-I găsim în rădăcinile plantei intacte. Aceste linii celulare sunt
apte să producă 162 mg/l serpentină şi 164 mg/l ajmalicină.
• Explantele utilizate pentru iniţierea culturilor celulare sunt foarte heterogene sub aspectul
capacităţii de biosinteză a metaboliţilor secundari, heterogenitate care sporeşte în condiţiile
cultivării “in vitro”, fiind o consecinţă a variaţiilor genetice şi epigenetice, înregistrate mult mai
frecvent în această ipostază. În consecinţă, celulele şi agregatele celulare etalează o mare
variabilitate în producerea şi acumularea metaboliţilor secundari , sursă de selectare şi perpetuare
a unor linii celulare înalt producătoare.

• În majoritatea cazurilor, suspensiile celulare s-au dovedit incapabile de a produce metaboliţi

secundari în cantităţi comparabile cu cele produse în plantele intacte. Prin urmare, se impune o
reexaminare a conceptului de totipotenţă celulară, cu necesara disjuncţie pentru totipotenţa
biochimică şi totipotenţa morfologică. Există totuşi câteva exemple în care, printr-un screen-ing
adecvat la nivelul suspensiilor celulare, s-a reuşit să se obţină linii celulare înalt producătoare.
Este cazul speciilor Catharanthus roseus şi Digitalis lanata

• Selectarea unor linii celulare înalt producătoare de pigmenţi( berberina, shikonina, betalaina)
constă în izolarea sectoarelor intens colorate ale agregatelor celulare, urmată de cultivarea lor
separată, pe medii adecvate. În cazul compuşilor fără culoare, un criteriu al selectării îl reprezintă
reacţiile specifice ale celulelor sau aplicarea unor teste imunologice ale extractelor.

• Atât izolarea unor linii celulare înalt producătoare, cât şi perpetuarea nealterată a acestora
necesită efectuarea unor selecţii repetate. Yamamoto şi colaboratorii (1982) au efectuat 30 de
clonări consecutive ale agregatelor celulare cu conţinut mare de antociani, obţinând linii celulare
stabile la Euphorbia millii.
• Conservarea unor linii celulare înalt producătoare se realizează prin criostocare (conservare în
azot lichid).
• Pentru evitareea distrugerii biomasei prin metodele de extracţie, unii cercetători au elaborat un
procedeu de includere a celulelor într-un gel (alginat) sau fixarea în diverşi polimeri
(poliacrilamida, poliuretan), aşa numita metodă de imobilizare a celulelor.
• Brodelius şi colaboratorii (1979) au fost primii care au imobilizat celule de Catharantus roseus şi
Daucus carota în granule de alginat.
• Valorificarea potenţialului bioproductiv este limitată nu numai de instabilitatea genetică, dar şi de
lipsa proceselor regenerative, care în multe cazuri este semnificativă pentru biosinteza
metaboliţilor secundari. De pildă, la Mentha piperita, uleiurile esenţiale sunt stocate la suprafaţa
frunzelor, la Papaver somniferum, alcaloizii sunt acumulaţi în laticifere.

• Pe de altă parte, producerea unui metabolit presupune un echilibru între sinteză şi acumulare,
degradare. Aceste procese presupun o compartimentare spaţială şi temporală a expresiei genice.

• De pildă, producerea alcaloizilor chinolizidinici(lupanina) de către lupin se realizează "in vivo" în

frunze, apoi aceştia sunt transportaţi prin floem în celulele epidermice. “In vitro”, alcaloidul este
produs, dar este rapid degradat deoarece nu există celule epidermice care să-l acumuleze. Acest
exemplu ilustrează importanţa coordonării funcţiilor de sinteză, transport şi stocare desfăşurate" in
vivo". Este dificil de reprodus acest tip de coordonare “in vitro” fără intermediul unui proces de
diferenţiere celulară. Nu este de mirare că exemplele spectaculoase, cum ar fi producerea
shikoninei, berberinei, antocianilor, corespund situaţiei în care sinteza şi acumularea produşilor se
realizează în aceeaşi celulă.
Aloe vera Antrachinone Antimicrobian, antifungic, citotoxic

Capsicum annuum Capsaicina Antitumoral

Curcuma longa Curcumina Antitumoral, anti Alzheimer

Digitalis purpurea Digoxina, digitoxina Glicozide cardiotonice

Ephedra sinica Efedrina Stimulator al SNS

Ginkgo biloba Ginkgolide Antitumoral, anti Alzheimer

Glycyrrhiza glabra Glycirrhizin Antiviral, antimicrobian, antifungic,

anti HIV
Hypericum perforatum Hipericina Antidepresiv

Linum usitatissimum Phytoestrogen Antidiabetic

Momordica charantia Charantin, momordicin Hipoglicemiant

Panax ginseng Ginsenozide Antitumoral

Rosmarinus officinalis acidul caffeic , carnosic ,rosmarinic Antitumoral, antiinflamator

Taxus brevifolia Paclitaxel Antitumoral